Summary
I denne protokol blev ny svinevene bypass podning udført gennem et lille snit i venstre brystvæg uden kardiopulmonal bypass. En postoperativ patologiundersøgelse blev udført, som viste intim fortykkelse.
Abstract
Venøs graft sygdom (VGD) er den førende årsag til koronararterie bypass graft (CABG) fiasko. Store dyremodeller af CABG-VGD er nødvendige til undersøgelse af sygdomsmekanismer og udvikling af terapeutiske strategier.
For at udføre operationen kommer vi ind i hjertekammeret gennem det tredje interkostale rum og dissekerer omhyggeligt den indre brystvene og nedsænker den i normal saltvand. Den højre hovedkranspulsåre behandles derefter for iskæmi. Målbeholderen skæres, en shuntprop placeres, og den distale ende af transplantatvenen anastomoseres. Den stigende aorta er delvist blokeret, og den proksimale ende af transplantatvenen anastomoseres efter perforering. Transplantatvenen kontrolleres for patency, og den proksimale højre koronararterie er ligeret.
CABG-kirurgi udføres hos minigrise for at høste den venstre indre brystvene til brug som vaskulært transplantat. Serumbiokemiske tests bruges til at evaluere dyrenes fysiologiske status efter operationen. Ultralydundersøgelse viser, at den proksimale, midterste og distale ende af transplantatbeholderen er uhindret. I den kirurgiske model observeres turbulent blodgennemstrømning i transplantatet ved histologisk undersøgelse efter CABG-operationen, og venøs graftastenose forbundet med intim hyperplasi observeres i transplantatet. Undersøgelsen her giver detaljerede kirurgiske procedurer til etablering af en gentagelig CABG-induceret VGD-model.
Introduction
Selvom dødeligheden af koronar hjertesygdom er faldet betydeligt i de senere år, udvikler halvdelen af middelaldrende voksne i USA iskæmiske hjerterelaterede symptomer hvert år, og en tredjedel af ældre voksne dør af koronar hjertesygdom1. Koronararterie bypass podning (CABG) er en effektiv kirurgisk modalitet til forbedring af myokardieiskæmi, og endnu vigtigere er det en uerstattelig kirurgisk modalitet til behandling af multivessel koronararteriesygdom2. Over tid udvikler vaskulære transplantater imidlertid betændelse, intim hyperplasi og progressiv aterosklerose, som vides at føre til venetransplantatsvigt eller venegraftsygdom (VGD)3. Hos patienter efter CABG, hvis restenose opstår, kan kun det syge blodkar udskiftes i nogle tilfælde2. Ældre patienter og tilføjede comorbiditeter gør omdannelse af koronararterie bypass podning ganske udfordrende. Forsinkelse eller kontrol af de patologiske problemer forbundet med podede blodkar er et presserende problem, der skal løses. Store dyremodeller af CABG-VGD er nødvendige til undersøgelse af sygdomsmekanismer og udvikling af terapeutiske strategier. Forskere har med succes etableret VV-modeller for dyr i små og store dyr som mus4, rotter5, kaniner6 og svin7. Sammenlignet med små dyr har store dyr som svin anatomiske strukturer og fysiologiske egenskaber svarende til mennesker og har længere levetid 8,9. Således er store dyr mere egnede til at udforske langsigtede patologiske ændringer i venøs graftsygdom og til præklinisk test af lægemidler eller enheder. Vi og vores samarbejdsteam har med succes anvendt kirurgiske teknikker til at etablere en hjertesvigtsmodel for svin og beskrevet de hjertepatologiske ændringer i denne model10.
CABG-kirurgi er blevet standardiseret i klinisk praksis, men når det anvendes til etablering af VGD-dyremodeller, er forskellene mellem arter, erhvervelse af dyreudstyr og faciliteter, dyrekirurgiske operationer og dyrefoder og sygepleje enorme udfordringer for forskere. Som i klinisk praksis omfatter tilgangene til CABG-kirurgi, der anvendes til at etablere VGD-dyremodeller, midterlinjesternotomi11 og venstre lateral thoracotomi12. Midline sternotomi er mere almindeligt anvendt13,14. Denne tilgang har imidlertid store risici for både mennesker og dyr. I undersøgelsen rapporteret af Thankam et al. døde to af de seks grise, der blev brugt til modellering, under operation15. Høj modeldødelighed øger undersøgelsesomkostningerne og påvirker resultaternes nøjagtighed. En undersøgelse viste tidligere, at et snit i venstre brystvæg var muligt for at etablere CABG-induceret VGD hos svin11. Her har denne undersøgelse til formål at beskrive en trin-for-trin protokol til etablering af en reproducerbar operation for en CABG-induceret VGD-model i minigrise og at evaluere fænotypen af denne model. Den eksperimentelle protokol blev designet i fællesskab af hjertekirurgi og anæstesihold. Den kirurgiske tilgang til det venstre tredje interkostale rum blev bestemt i henhold til kadavere af andre minipigs i laboratoriet før operationen, og anæstesimetoden blev udført i overensstemmelse med den metode, der blev anvendt i midten16. Blodbiokemiske tests, ultralydsundersøgelse og histologiundersøgelse blev udført for at evaluere dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurerne for pleje og brug af forsøgsdyr blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee under Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8. udgave, 2011, National Research Council, USA). Den kirurgiske procedure er vist i figur 1.
1. Præoperativ tilberedning af dyr
- Opdel tilfældigt 10 3 måneder gamle mandlige minigrise, der vejer 30-35 kg, i shamgruppen (n = 5) og VGD-gruppen (n = 5).
- Evaluer svinernes præoperative og postoperative sundhedsforhold ved hjælp af body mass index (BMI). Beregn BMI som følger:
BMI = kropsvægt (kg)/(kropslængde [cm] × kropslængde [cm])
BEMÆRK: Kropslængden måles fra grisens næse til bunden af halen. - Hurtig dyrene i 12 timer før operationen for at undgå aspiration efter anæstesi. Forbered anæstesiapparater og kirurgiske instrumenter, herunder en anæstesimaskine, gas, anæstetiske lægemidler, en anæstesirørledning, et specielt laryngoskop og kirurgiske instrumenter, en ribbenholder, suturer, en skjoldbruskkirtelretraktor, kirurgisk tang osv. Steriliser alle instrumenter, der skal bruges i operationen.
2. Forberedelse af dyrene til operation
- Væg dyrene og beregn bedøvelsesdosis. Administrer intramuskulært anæstesiblandingen bestående af 2 mg/kg 1:1 Tiletamin og Zolazepam, 0,2 mg/kg diazepam og 0,02 mg/kg atropin17. Brug fentanyl (50 mg/kg) til intraoperativ smertelindring30.
- Sørg for, at der opnås et korrekt bedøvelsesplan, og indsæt et indbygget venekateter (20G) i den marginale ørevene for at etablere øreadgang. Overfør grisen til operationsbordet og læg den i liggende stilling. Immobiliser lemmerne med bandager og løft hovedet med en steril drapering.
BEMÆRK: Anæstesitilstanden blev overvåget ved central fiksering af øjeæblet, miosis, tab af pupilrefleks og tab af smerterefleks. Hjertefrekvensen og blodtrykket blev opretholdt på et lavere niveau end baseline. Kirurgen bør overvåge HR, BP og andre parametre under lammelse og øge anæstesidosis, hvis HR stiger > 20% over baseline. - Udsæt epiglottis og glottis ved hjælp af et veterinær laryngoskop. Udfør trakeal intubation med et 7,0-7,5Fr rør og tilslut det til anæstesiens vejrtrækningskredsløb.
BEMÆRK: Ventilatoren anvendes til kontinuerlig overtryksventilation med tidevandsvolumen 280 ml, inspiratorisk/ekspiratorisk forhold 1:2, respirationsfrekvens 20 gange/min og positivt slutekspiratorisk tryk (5 cm H2O). - Intravenøst injicere vecuroniumbromid (0,1 mg / kg) for at slappe af musklerne under de kirurgiske procedurer og bruge 2% isofluran til at opretholde anæstesi ved en respirationsfrekvens på 16-20 bpm og et tidevandsvolumen på 10 ml / kg.
BEMÆRK: Vecuronium gives for at sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi hos lammede dyr, især da dosis af induktionslægemiddel og isofluran er i den nedre ende af den anbefalede. - Brug dyrlægesalve på grisens øjne for at forhindre tørhed under anæstesi. Brug elektriske tæpper til at holde grisens kropstemperatur på 38 °C ± 5 °C.
- Brug et elektrokardiogram til at overvåge puls, iltindhold i blodet og kropstemperatur.
3. Kirurgiske procedurer
- Barber venstre brystvæg og påfør tre vekslende runder med 0,7% jod og 75% alkohol for aseptisk at forberede det kirurgiske område op til venstre mandibulær vinkel, ned til navlestrengen, venstre til den bageste aksillære linje og højre til den aksillære front. Placer en steril kirurgisk drapering omkring det kirurgiske område.
- Lav et 7-10 cm tværgående snit med en elektrisk kniv i det tredje venstre interkostale rum og adskil det subkutane væv lag for lag (figur 2A). Fjern et 5-6 cm segment af den tredje ribben med knoglesaks og udsæt den indre brystvene med en retraktor efter at have udsat det tredje ribben-brystled (figur 2B).
- Find den indre brystvene sammen med den venstre indre brystarterie på venstre side af brystbenet. Udfør en stump dissektion af den indre brystvene med vaskulære tang.
- Udfør hæmostase ved elektrokoagulation af grenene i den venstre indre brystvene med en elektrisk kniv. Hvis hæmostase er ufuldstændig, skal du bruge bomuldstrådligering til hæmostase. Ligate og markere de to ender af venen, mens den høstes (figur 2C).
- Forbered heparin normal saltvand ved at tilsætte 2 ml heparinnatriumopløsning og 98 ml normal saltvand. Efter fjernelse af venen injiceres heparin normalt saltvand i venen til forbehandling (figur 2D). Sæt derefter venen i normal saltvand og opbevar den til sikkerhedskopiering.
- Lav et lignende snit som beskrevet ovenfor og fjern den indre brystvene i skamgruppen. Åbn perikardiet, og luk derefter brystvæggen i skamgruppen. Brug den indre brystvene i shamgruppen til patologisk kontrol uden koronararterie bypass podning.
- Lav et ~ 7 cm snit med en elektrisk kniv på perikardiet for at udsætte højre koronararteriestamme. Suspender perikardiet og sy på huden på den ipsilaterale side med 1-0 kirurgiske suturer (figur 2E). Adskil højre koronararteriestamme fra det omgivende væv (figur 2E).
- Omgå blokeringsbåndet under den proksimale ende af den isolerede højre koronararterie nær aorta med en trådkrog og behandl myokardiet med tre cyklusser på 2 minutters iskæmi og 5 minutters reperfusion ved at stramme og slappe af blokeringsbåndet (figur 2F). Overvåg hjertets elektriske aktivitet med elektrokardiogrammonitoren under iskæmi/reperfusionsforkonditionering (figur 2G).
BEMÆRK: Når højre koronararterie er blokeret, viser elektrokardiogrammet en øget hjertefrekvens og ST-segmentforhøjelse. - Stram båndet for at blokere den rigtige koronar blodgennemstrømning. Skær epikardiet, der dækker blodkarrene. Udsæt koronararterievæggen, og skær i længderetningen med spidsen af et kirurgisk blad mod midten af blodkarens forreste væg.
- Efter skæring af lumen skal du forstørre snittet med en saks og placere en koronar shunt. Indsæt den ene ende af shunten med en spole i den distale koronararterie gennem tåren. Shunt blodet i koronararterierne ind i den hule koronar shunt for at sikre et klart operativt felt (figur 2H).
- Udfør en ende-til-side kontinuerlig sutur mellem den indre brystvene og højre koronarstamme med 7-0 polypropylensuturen (figur 2I). I midten af den stigende aorta okkluderes den venstre anterolaterale væg af den stigende aorta med en halvokklusionsklemme.
- Brug et kirurgisk blad til at lave et lille snit i aortavæggen, hvor adventitia er blevet skåret, indsæt hovedenden af glideakslen i hovedenden af stansen i aortakhulen gennem dette snit, kontrakt glideakslen udad, og den cirkulære kniv over den skærer et stykke af arterievæggen. Vævsblokken, der er skåret ud af stansen, er ca. 3 mm i diameter (figur 2J).
- Træk shunten ud. Udfør en ende-til-side kontinuerlig sutur mellem den indre brystvene og aortavæggen med 6-0 polypropylensuturen (figur 2K). Åbn halvokklusionsklemmen.
- Optag bypassstrømmen af højre koronararteriestamme proksimalt til anastomosestedet ved hjælp af ultralyd. Overvåg hjertets elektriske aktivitet ved hjælp af elektrokardiogrammet (figur 2L).
- Indbo et midlertidigt drænrør (Fr: 16) i brysthulen for at lade blodet og væskerne dræne. Sy perikardiesnittet ved hjælp af en 1-0 bomuldstråd og luk brystet lag for lag (fra indersiden til ydersiden: Pleura-lag, muskellag, subkutant vævslag, hudlag), mens du placerer penicillin (ca. 0,5 g) pulver på hvert lag. Fjern drænrøret efter syning af hudsnittet ved hjælp af en 1-0 bomuldstråd.
4. Pleje efter operationen
- Fjern endotrachealrøret, efter at dyrene vendte tilbage til spontan vejrtrækning. Anæstesiologen skal vurdere dyrets vitalitet (f.eks. Respirationsfrekvens, puls, iltmætning osv.) og fjerne EKG, når dyrene vågner op og vender tilbage til spontan aktivitet. Send dyrene tilbage til fodringsrummet og læg skindyrene i en anden fold i avlsrummet. Hold dyrene varme med et elektrisk tæppe. Overhold dyrene hver time efter operationen (mindst 4 gange).
- Foder dyret dagen efter operationen. Tilsæt aspirin (200 mg) 2x dagligt i 7 dage til dyrefoderet for at forhindre postoperativ trombose og reducere sårsmerter.
BEMÆRK: Undgå at fodre dyr på operationsdagen for at forhindre aspiration. - Administrer dyret med en intramuskulær injektion af penicillin 1x dagligt i 7 på hinanden følgende dage for at forhindre postoperativ infektion (14.000 enheder pr. Kg).
5. Ultralydsundersøgelse
- Efter CABG-kirurgi skal du bruge en steril ultralydssondehylster til at pakke den højfrekvente lineære array-sonde. Placer sonden på overfladen af det venøse transplantat.
- Vis omridset af transplantatet i den todimensionelle ultralydstilstand, og skift derefter til farvedopplertilstand for at registrere blodgennemstrømningen i transplantatet.
6. Opsamling af venøst transplantatvæv
- Saml 10 ml blodprøve fra venøs kredsløb i ørevenen til biokemisk testning. (Tabel 1). Centrifuger blodprøven ved 1.000 x g i 5 min og udfør biokemiske tests med en automatisk biokemisk analysator.
- Bedøv dyret som beskrevet tidligere. Efter bekræftelse af anæstesidybde injiceres 10% kaliumchlorid 0,5 ml / kg legemsvægt fra øremarginalvenen eller forbenvenen. Lav derefter et 10 cm median brystsnit med en elektrisk kniv for at høste venetransplantatet 30 dage efter operationen. Fastgør kropspositionen som i trin 2.2., og efter sterilisering og placering af en drapering, lav et median brystbensnit for at opdele brystbenet. Under adskillelsen skal du undgå de vigtigste blodkar og hjertet og adskille de podede blodkar lag for lag.
- Afskær hurtigt de store blodkar, der forbinder hjertet, placer hjertet og stigende aorta på isflis, og fjern transplantatets vaskulære bro, den tilsluttede aorta og den højre koronararterie. Alle prøverne skylles med normalt saltvand ved 4 °C.
- Tag hele transplantatbeholderen på ca. 3-4 cm i størrelse, del den i 4-5 lige store dele og overfør til kryopræserveringsrør. Sæt hurtigt rørene i flydende nitrogen for at flashfryse og flytte til en -80 °C fryser med ultralav temperatur til opbevaring.
- Til analyse skylles transplantatet med iskold 0,9% saltvand og fastgøres i 4% paraformaldehydopløsning. Oprethold et forhold mellem vævsblokstørrelse og fikseringsopløsning på 1:10 og fastgør vævet i mere end 12 timer.
- Plet sektionerne i 50 ml vandig opløsning af hæmatoxylin i 3 min. Adskil sektionerne ved at vaske med 50 ml 0,5% saltsyreethanol og 50 ml 0,2% ammoniakvand i 10 s hver.
- Skyl med rindende vand i 1 time og rengør derefter i destilleret vand ved blødning i 3 min. Dehydrer i 70% og 90% ethanol i 10 min hver. Anbring i 50 ml 0,5% alkohol eosin farvningsopløsning i 2-3 min.
- Dehydrer de farvede sektioner med ren ethanol i 10 minutter og blød derefter i ren xylen i 10 minutter for at gøre prøverne gennemsigtige. Dryp de gennemsigtige sektioner med neutral lim og dæk med en dæksel. Overhold patologiske sektioner under et lysmikroskop ved 40x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BMI og serum biokemiske indekser
BMI mellem sham- og VGD-grupperne var ikke signifikant forskellig (humbug vs. VGD, 22,05 kg/cm2 ± 0,46 kg/cm2 vs. 21,14 kg/cm2 ± 0,39 kg/cm2, p = 0,46). De biokemiske serumresultater er anført i tabel 1. Statistisk signifikante ændringer mellem grupperne blev fundet i fire biokemiske indekser, herunder aspartataminotransferase (AST, sham vs. VGD, 25,25 IE / L ± 1,88 IE / L vs. 31,5 IE / L ± 2,58 IE / L), serumbilirubin (sham vs. VGD, 2,5 μmol / L ± 0,47 μmol / L vs. 4,5 μmol / L ± 0,14 μmol / L), total bilirubin (sham vs. VGD, 0,025 μmol / L ± 0,14 μmol / L vs. 0,92 μmol / L ± 0,33 μmol / L), og kreatinin (humbug vs. VGD, 92,75 μmol/L ± 4,15 μmol/L vs. 141,75 μmol/L ± 12,65 μmol/l).
Ultralydsundersøgelse
Alle dyr i sham (n = 5) og VGD grupper (n = 5) overlevede. De kirurgiske procedurer for CABG er vist i figur 1. Den gennemsnitlige driftstid var 105 min ± 25 min (interval: 90-160 min), og det gennemsnitlige intraoperative blødningsvolumen var 85 ml ± 35 ml (interval: 50-200 ml). Indflydelsen af driftstid er hovedsageligt overgangen af operatørens færdigheder fra menneske til svin og har ingen særlig betydning. Den gennemsnitlige varighed fra anastomose efter indsnit til trakealekstubation var 17 min ± 5 min (interval: 15-30 min). Ultralydundersøgelse viste, at blodforsyningen af det podede kar havde delvis regurgitation sammenlignet med den normale koronararterie, og den samlede blodgennemstrømningsretning var generelt normal (figur 3). Pneumothorax, tamponade, infektion eller andre alvorlige komplikationer blev ikke observeret postoperativt. Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel i vægt eller BMI mellem sham- og VGD-grupperne, 1 måned postoperativt.
Ultralydundersøgelse blev udført på den proksimale ende (figur 3A, B), vaskulære hulrum (figur 3C, D) og distale ende (figur 3E, F) af transplantatbeholderen. Den retrograde strømning blev observeret i de proksimale og distale ender af transplantatbeholderen; Der blev imidlertid ikke observeret nogen ekstravasation af blod.
Patologiske ændringer i venerne
Hvert venøst transplantat blev jævnt opdelt i tre segmenter efter længde, og en sektion blev udvalgt fra hvert segment til evaluering og klassificeret i henhold til den modificerede Proudilit-klassifikation for koronararteriestenose18. Gennemsnitsværdier fra de tre sektioner blev vedtaget som resultater for okklusionsgraden. Den specifikke klassifikation var som følger: grad I = 0-punkt, normal uden restenose; grad II = 1-punkts, mild stenose <30%; grad III = 2-point, stenose mellem 30% og 50%; grad IV = 3-point, alvorlig stenose mellem 50% og 90%; klasse V = 4-point, subtotal okklusion >90%; og grad VI = 5-point, total okklusion, uden blodgennemstrømning til det venøse transplantat. Den modificerede Proudilit-klassifikation for koronararteriestenose blev vedtaget for at vurdere de kvantificerede resultater. Resultatet for skingruppen var 0,00 ± 0,00, hvilket indikerer ingen vaskulær okklusion, mens resultatet for CABG-gruppen var 3,12 ± 1,22. Derfor var forskellen signifikant mellem de to grupper (p < 0,05, tabel 2).
Under mikroskopet, i sham-gruppen, syntes tunica intima, tunica media og venøs væg af det venøse transplantat normal. I VGD-gruppen blev tunica intima og tunikamediet i de venøse transplantater signifikant fortykket 30 dage efter CABG-operationen. Tunica intima blev tvetydigt afgrænset fra tunikamedierne. Det elastiske lag af tunikamediet forsvandt (figur 4). Lumen i det venøse transplantat blev fyldt med hyperplastisk væv (figur 4). Der blev ikke observeret nogen signifikant ændring i beholderdiameteren.
Figur 1: Oversigt over proceduren. (A-C) Før operation: Vej minigrisene, kontroller defibrillatorens og ventilatorens ydeevne, og tilslut ventilationsrøret. (D-F) Anæstesi: Administrer en intramuskulær injektion af anæstesi til minipigerne, fastgør minipigen på operationsbordet, udsæt luftvejen fuldt ud for trakeal intubation, tilslut ventilatoren og brug inhalationsanæstesi for at opretholde anæstesi. (G-I) Under drift: Udfør en præoperativ ultralydsvurdering af hjertefunktionen hos minigrisene og fuldfør koronararterie bypass-podning gennem et snit i venstre brystvæg. (J-L) Efter operation: Anastomose sårene og være opmærksom på den postoperative pleje og fodring af minigrisene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Den kirurgiske procedure. (A) Skær brystvæggen, (B) isoler den indre brystvene, (C) fjern den indre brystvene, (D) udfør heparinforkonditionering, (E) suspender perikardiet, (F) udfør myokardieiskæmireperfusion, (G) overvåg EKG-ændringerne, (H) bloker koronar blodgennemstrømning, (I) anastomose den proksimale ende af transplantatbeholderen, (J ) distalt koronar anastomosested, (K) anastomoser distale til koronararterier, (L) komplet koronararterie bypass podning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ultralydsundersøgelse. Efter afslutningen af koronararterie bypass podning vurderes blodgennemstrømningspatency af det podede kar ved ultralyd. (A, C, E) Normale koronar blodgennemstrømningsbilleder. Kontinuerlige blodgennemstrømningssignaler ses i de (B) proksimale, (D) midterste og (F) distale ender af de podede kar. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Histologisk analyse . (A) Den normale patologiske sektion i den indre brystvene viste et klart vaskulært hierarki og ingen lumenstenose. (B,C) Patologien i den indre brystvene 30 dage efter koronararterietransplantation viste, at karrets intima blev fortykket i varierende grad, og lumen var tydeligvis indsnævret. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Indikatorer | Falsk gruppe (n = 5) | Transplantatgruppe (n=5) |
| Alt: (IE/L) | 46 ±5.11 | 47.75±7.88 |
| AST (IE/L) | 25.25 ±1.88 | 31.5±2.58* |
| Samlet proteinindhold (IE/L) | 63.12 ±.138 | 60.17±1.91 |
| Albumin (IE/L) | 32.25 ±0.77 | 23.77±5.61 |
| Globulin (g/l) | 30.87 ±.136 | 36.4±6.03 |
| Serumbilirubin (μmol/l) | 2,5 ±0,47 | 4.5±0.14* |
| Total Bilirubin (μmol/L) | 0,025 ±0,14 | 0,92±0,33* |
| Alkalisk fosfatase (IE/L) | 103 ±19,3 | 104±16.04 |
| Glucosamin (mmol / L) | 4.44 ±0.36 | 5.96±0.42 |
| Urea kvælstof (mmol / L) | 2,46 ±0,17 | 2,89±0,65 |
| Serumkreatinin μmol/l | 92,75 ±4,15 | 141.75±12.65* |
| Total kolesterol (mmol / L) | 2.37 ±0.12 | 2.16±0.06 |
| Triglycerid (mmol / L) | 0,48 ±0,10 | 0,25±0,05 |
| Lipoprotein mmol/l med høj densitet | 1,05 ±0,07 | 1.03±0.07 |
| Meget lav densitet lipoprotein (mmol / L) | 1,43 ±0,06 | 1.29±0.04 |
| Lactat dehydrogenase (mmol / L) | 384,75 ±26,8 | 478.25±49.58* |
Tabel 1. Serum biokemiske indikatorer. Statistisk analyse software blev brugt til analyse. Data blev udtrykt som gennemsnit ± standardfejl (n = 5). Sammenligninger af måledata blev analyseret ved hjælp af elevens t-test. En p-værdi mindre end 0,05 indikerede statistisk signifikans. *p < 0,05, CABG vs. humbug.
| Proudilit klassifikation | ||||||
| S. Nr. af stikprøven | Score umiddelbart efter CABG operation | Score 30 dage efter CABG operation | ||||
| 1 | 0, 0, 0 | 2, 2, 2 | ||||
| 2 | 0, 0, 0 | 1, 2, 2 | ||||
| 3 | 0, 0, 0 | 2, 3, 2 | ||||
| 4 | 0, 0, 0 | 3, 2, 2 | ||||
| 5 | 0, 0, 0 | 2, 1, 2 | ||||
Tabel 2. Statistiske resultater af graftokklusionsgraderne umiddelbart efter operationen og 30 dage postoperativt. Den modificerede Proudilit klassifikationsskala blev anvendt til vaskulær okklusionsgrad: grad I = 0-punkt, normal uden restenose; grad II = 1-punkts, mild stenose <30%; grad III = 2-point, stenose mellem 30% og 50%; grad IV = 3-point, alvorlig stenose mellem 50% og 90%; klasse V = 4-point, subtotal okklusion >90%; og grad VI = 5-point, total okklusion, uden blodgennemstrømning til det venøse transplantat. Dataene omfatter resultater fra fem venøse transplantater jævnt opdelt i tre sektioner efter længde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse beskrev vi detaljeret protokollen for dyreudvælgelse, instrumentforberedelse, kirurgiske procedurer og postoperativ evaluering, når vi udviklede en CABG-induceret VGD-model. Vi udførte ultralydsundersøgelse af det venøse transplantat før og efter CABG-operationen og histologisk undersøgelse af transplantatet 30 dage efter operationen. Blodgennemstrømningen i den indre brystvene var normal før CABG-operationen, mens retrograd strømning blev observeret i transplantatet af den indre brystvene. Sammenlignet med skinoperationsgruppen blev lever- og nyrefunktionen hos dyrene i operationsgruppen til en vis grad beskadiget. I betragtning af forekomsten af koronar graftsygdom resulterede svækkelsen af myokardiekontraktilitet i utilstrækkelig perfusion af perifere væv. Det venøse transplantat viste intim hyperplasi og vaskulær remodellering 30 dage efter CABG-operationen (figur 4). Fibrotiske ændringer omkring blodkarrene er forbundet med sårheling, fibroblastproliferation forekommer tidligt i sårheling på dag 1 til dag 3 19, produktionen af aktivt type I kollagen og fibronectin sker på dag 4 til dag 6, og cytoplasmatisk α-SM actinfibrilaggregering forekommer på dag 7 til dag 1419. Stressfibre indebærer dannelsen af myofibroblaster, hvilket falder sammen med sårkontraktion20. Det er uklart, om perivaskulær fibrose påvirker kirurgiske resultater.
Her udvalgte vi minigrise til at etablere venetransplantatsygdomsmodellen. Mens små dyr som rotter er blevet brugt til at studere de patologiske mekanismer i VGD21, er svin ens i størrelse, anatomi og fysiologi til mennesker og er derfor mere egnede til at studere patogenesen af menneskelig hjertesygdom eller som et værktøj til enhedsudvikling22. Indre brystårer vælges også ofte som transplantater klinisk. Kliniske undersøgelser fra to uafhængige grupper viste, at indre brystvenetransplantater har karakteristikken af høj forekomst af venetransplantatlæsioner, og de samme patologiske ændringer blev observeret i vores undersøgelse (figur 4)23,24. Som i klinisk praksis er valget af en passende kirurgisk tilgang i dyrekirurgi afgørende for operationens succes; her henviste vi til Hocums venstre thoracotomi11. Vi fandt ud af, at venstre thoracotomi tydeligt kunne eksponere det operative felt, anatomien omkring snittet var let at identificere, og mængden af blødning var lav. Desuden kræver den laterale thoracotomi sammenlignet med median thoracotomi ikke savning af brystbenet, så kirurgisk stress kan reduceres.
Anæstesi er afgørende for succesen med en kirurgisk model. I denne undersøgelse blev protokollen modificeret fra Kotani et al., Med kombinationen af ketamin og diazepam anvendt som anæstesiinduktion og isofluraninhalation som vedligeholdelsesanæstesi25. Derudover viste en forskergruppe, at intravenøse lægemidler også var egnede til vedligeholdelsesbedøvelse26. Endotracheal intubation hos svin kan være svært for et dyr kirurgisk team. Sammenlignet med den menneskelige luftvej gør svinens trakeale anatomi eksponering af glottis vanskelig27. Her, for bedre at eksponere glottis pressede vi grisens overkæbe ned for at hjælpe med at afsløre grisens glottis (figur 1D). På den anden side vil brugen af en direkte laryngoskopi eller en fiberoptisk bronkoskopi hjælpe med at visualisere glottis i endotracheal intubation28.
Den patologiske tilstand af venøs graftsygdom er hovedsageligt opdelt i tre faser: 1) akut stadium (inden for 1 måned) trombose; 2) subakut stadium (1-12 måneder) intim hyperplasi; 3) sen fase (mere end 12 måneder) dannelse af åreforkalkning, som er årsag til graftastenose og okklusion29. De fleste af ændringerne i den akutte fase af VGD er relateret til operationelle faktorer, og aterosklerose dannet i det sene stadium er irreversibel. Undersøgelsen af subakut endometriefortykkelse er meget vigtig for patogenesen, behandlingen og forebyggelsen af VGD. Det er også kritisk, at de valgte transplantatbeholdere er forskellige fra de lodrette kar i den store saphenøse vene. Den indre brystvene bærer normalt mindre hydrostatisk tryk, og de patologiske ændringer er hurtigere efter transplantation end for den store saphenøse vene. I vores model blev typisk intim hyperplasi, der okkluderede lumen i det podede kar, set i den histologiske undersøgelse 30 dage efter operationen, og de samme patologiske ændringer er blevet observeret i andre kliniske studier23,24. Modelleringsresultaterne ved valg af den indre brystvene hos minipigs er stabile i fænotype, modelleringstiden er kort, og graden af reduktion af de patologiske ændringer af VGD er høj, hvilket bidrager til udviklingen af opfølgningsforskning.
Modellen har også nogle begrænsninger. Nogle fine operationer i modelleringsprocessen for store dyr, intraoperativ overvågning af dyrevitale tegn og postoperativ genoplivning kræver alle visse praktiske erfaringer, hvilket kræver professionelle kirurger og anæstesiologer til at guide træningen og i høj grad reducere dyrs utilsigtede dødelighed. Store dyrekirurgi kræver specifikke forsøgssteder, professionel bemanding og tilstrækkelig økonomisk støtte, hvilket kan være en tungere byrde for mindre institutter.
Afslutningsvis kan veludstyrede laboratorier under ledelse af fagfolk yderligere studere de patologiske ændringer af VGD ved at etablere denne minipig VGD-model, som er af stor betydning for behandlingen af VGD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute for teknisk support, dyrepleje og prøveindsamling. De takker også Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd, for teknisk support i ultralydsundersøgelsen. Dette arbejde blev støttet af Guangdong Science and Technology Program, Kina og Jinan University Central Universities Basic Scientific Research Business Expenses Project (2017A020215076, 2008A08003 og 21621409).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aortic Punch | Medtronic Inc. , America | 3.0mm, 3.5mm, 4.0mm | Used for proximal coronary bridge anastomosis |
| Automatic biochemical analyzer | IDEXX Laboratories, Inc. America | Catalyst One | |
| Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit | LANDANGER, France | ||
| Cardiogram monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd | MEC-1000 | |
| Coronary Shunt | AXIUS | OF-1500, OF-2500, OF-3000 | The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis. The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis. |
| Defibrillator | MEDIANA | Mediana D500 | |
| Diazepam | Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China | H37023039 | Narcotic inducer |
| Disposable manual electric knife | Covidien, America | E2516H | |
| Electric negative pressure suction machine | Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd | YX932D | |
| Esmolol | Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD | H20055990 | Emergency drugs |
| Ice machine | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Lidocaine | Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD | H51021662 | Emergency drugs |
| Luxtec headlight system | Luxtec, America | AX-1375-BIF | Used for lighting fine parts during operation |
| Medical operation magnifier (glasses) | Germany Lista co, LTD | SuperVu Galilean 3.5× | Used for fine site operation during operation |
| Multi-function high-frequency electrotome | Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd | GD350-B | |
| Nitrogen canister | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture) | Johnson & Johnson, America | 6-0, 7-0 | Used to suture blood vessels. |
| Nonabsorbable suture (cotton thread) | Covidien, America | 1-0 | Used for skin and muscle tissue tugging |
| Open heart surgery instrument kit | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD | ||
| Propofol injection | Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD | H19990282 | Anesthetic sedative |
| Refrigerator | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Respiratory anesthesia machine for animal | Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China | R620-S1 | |
| Semi-occlusion clamp | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZL1701RB | Temporarily cut off the aortic flow |
| vecuronium bromide | Richter, Hungary | JX20090127 | Muscle relaxant |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips, Netherlands | CX50 | |
| Zoletil | Virbac, France | Zoletil 50 | Animal narcotic |
References
- Lloyd-Jones, D., et al. Executive summary: Heart disease and stroke statistics--2010 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 121 (7), 948-954 (2010).
- Taggart, D. P. Contemporary coronary artery bypass grafting. Frontiers of Medicine. 8, 395-398 (2014).
- Wolny, R., Mintz, G. S., Pregowski, J., Witkowski, A. Mechanisms, prevention and treatment of saphenous vein graft disease. The American Journal of Cardiology. 154, 41-47 (2021).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 30 (3), 451-463 (2006).
- Suggs, W. D., et al. Antisense oligonucleotides to c-fos and c-jun inhibit intimal thickening in a rat vein graft model. Surgery. 126 (2), 443-449 (1999).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: Adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), H240-H245 (2004).
- O'Brien, J. E., et al. Early injury to the media after saphenous vein grafting. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (5), 1273-1278 (1998).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. The American Journal of Pathology. 153 (4), 1301-1310 (1998).
- Klyachkin, M. L., et al. Postoperative reduction of high serum cholesterol concentrations and experimental vein bypass grafts. Effect on the development of intimal hyperplasia and abnormal vasomotor function. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 108 (3), 556-566 (1994).
- Tan, W., et al. A porcine model of heart failure with preserved ejection fraction induced by chronic pressure overload characterized by cardiac fibrosis and remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 677727 (2021).
- Hocum Stone,, L, L., et al. Magnetic resonance imaging assessment of cardiac function in a swine model of hibernating myocardium 3 months following bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (3), 582-590 (2017).
- Gedik, N., et al. Proteomics/phosphoproteomics of left ventricular biopsies from patients with surgical coronary revascularization and pigs with coronary occlusion/reperfusion: Remote ischemic preconditioning. Scientific Reports. 7 (1), 7629 (2017).
- Tsirikos Karapanos,, N,, et al. The impact of competitive flow on distal coronary flow and on graft flow during coronary artery bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 12 (6), 993-997 (2011).
- Meng, X., et al. Competitive flow arising from varying degrees of coronary artery stenosis affects the blood flow and the production of nitric oxide and endothelin in the internal mammary artery graft. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the. 43 (5), 1022-1027 (2013).
- Thankam, F. G., et al. Association of hypoxia and mitochondrial damage associated molecular patterns in the pathogenesis of vein graft failure: A pilot study. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. , 38-52 (2021).
- Li, X., et al. A surgical model of heart failure with preserved ejection fraction in Tibetan minipigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 180 (180), 63526 (2022).
- Rueda, A. lcalá, I,, et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology: Official Journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies (EUFOS): Affiliated with the German Society for Oto-Rhino-Laryngology - Head and Neck Surgery. 278 (8), 3081-3090 (2021).
- Proudfit, W. L.
- Clark, R. A. Regulation of fibroplasia in cutaneous wound repair. TheAmerican Journal of the Medical Sciences. 306 (1), 42-48 (1993).
- Darby, I., Skalli, O., Gabbiani, G. Alpha-smooth muscle actin is transiently expressed by myofibroblasts during experimental wound healing. Laboratory Investigation. 63 (1), 21-29 (1990).
- Sterpetti, A. V., et al. Formation of myointimal hyperplasia and cytokine production in experimental vein grafts. Surgery. 123 (4), 461-469 (1998).
- Shannon, A. H., et al. Porcine model of infrarenal abdominal aortic aneurysm. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 153 (153), (2019).
- Langille, B. L., O'Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231 (4736), 405-407 (1986).
- Zwolak, R. M., Adams, M. C., Clowes, A. W. Kinetics of vein graft hyperplasia: Association with tangential stress. Journal of Vascular Surgery. 5 (1), 126-136 (1987).
- Kotani, K., et al. A subacute hypoxic model using a pig. Surgery Today. 35 (11), 951-954 (2005).
- Liu, D., et al. Comparison of ketamine-pentobarbital anesthesia and fentanyl-pentobarbital anesthesia for open-heart surgery in minipigs. Lab Animal. 38 (7), 234-240 (2009).
- Geovanini, G. R., Pinna, F. R., Prado, F. A., Tamaki, W. T., Marques, E. Standardization of anesthesia in swine for experimental cardiovascular surgeries. Revista Brasileira de Anestesiologia. 58 (4), 363-370 (2008).
- Alhomary, M., Ramadan, E., Curran, E., Walsh, S. R. Videolaryngoscopy vs. fibreoptic bronchoscopy for awake tracheal intubation: A systematic review and meta-analysis. Anaesthesia. 73 (9), 1151-1161 (2018).
- Parang, P., Arora, R. Coronary vein graft disease: Pathogenesis and prevention. Canadian Journal of Cardiology. 25 (2), e57-e62 (2009).
- Egan, T. D., et al. Fentanyl pharmacokinetics in hemorrhagic shock: a porcine model. Anesthesiology. 91 (1), 156-166 (1999).
