Summary
Ganaspis brasiliensis- un parassitoide larvale di Drosophila suzukii (un parassita invasivo globale delle colture da frutto) - è stato approvato o è considerato per l'introduzione in Europa e negli Stati Uniti per il controllo biologico di questo parassita. Questo articolo fornisce protocolli per l'allevamento su piccola scala e su larga scala di questo parassitoide.
Abstract
Originaria dell'Asia orientale, la drosophila ad ala maculata, Drosophila suzukii (Matsumura) (Ditteri: Drosophilidae), si è diffusa nelle Americhe, in Europa e in alcune parti dell'Africa nell'ultimo decennio, diventando un devastante parassita di vari frutti dalla pelle morbida nelle sue regioni invase. Il controllo biologico, in particolare per mezzo di parassitoidi auto-perpetuanti e specializzati, dovrebbe essere un'opzione praticabile per una gestione sostenibile a livello di area di questo parassita altamente mobile e polifago. Ganaspis brasiliensis Ihering (Hymenoptera: Figitidae) è un parassitoide larvale ampiamente distribuito in Asia orientale, ed è stato trovato per essere uno dei parassitoidi più efficaci di D. suzukii.
A seguito di rigorose valutazioni pre-introduzione della sua efficacia e dei potenziali rischi non bersaglio, uno dei gruppi genetici più specifici dell'ospite di questa specie (G1 G. brasiliensis) è stato recentemente approvato per l'introduzione e il rilascio sul campo negli Stati Uniti e in Italia. Un altro gruppo genetico (G3 G. brasiliensis), che è stato anche comunemente trovato per attaccare D. suzukii in Asia orientale, potrebbe essere considerato per l'introduzione nel prossimo futuro. Attualmente c'è un enorme interesse nell'allevamento di G. brasiliensis per la ricerca o nella produzione di massa per il rilascio sul campo contro D. suzukii. Questo protocollo e l'articolo video associato descrivono metodi di allevamento efficaci per questo parassitoide, sia su piccola scala per la ricerca che su larga scala per la produzione di massa e il rilascio sul campo. Questi metodi possono beneficiare di ulteriori ricerche a lungo termine e l'uso di questo parassitoide nativo asiatico come promettente agente di controllo biologico per questo parassita invasivo globale.
Introduction
Originaria dell'Asia orientale, la drosophila ad ala maculata, Drosophila suzukii (Matsumura) (Ditteri: Drosophilidae), si è diffusa nelle Americhe, in Europa e in alcune parti dell'Africa 1,2. La mosca è estremamente polifaga, essendo in grado di utilizzare vari frutti coltivati e selvatici con pelli morbide e sottili nelle sue regioni native e invase 1,2,3. Le attuali strategie di gestione per questo parassita si basano fortemente sull'uso frequente di insetticidi che colpiscono le mosche adulte nei campi coltivati quando i frutti sensibili stanno maturando. Vengono spesso utilizzati spray ripetuti, probabilmente a causa della costante ricaduta di popolazioni di mosche da giacimento provenienti da habitat non coltivati e della mancanza di nemici naturali efficaci residenti nelle regioni invase 1,4. Il controllo biologico, in particolare per mezzo di parassitoidi specializzati che si auto-perpetuano, può aiutare a sopprimere le popolazioni di mosche a livello paesaggistico e svolgere un ruolo fondamentale per la gestione sostenibile a livello di area di questo parassita altamente mobile e polifago 4,5,6.
Negli ultimi dieci anni, i ricercatori hanno concentrato gli sforzi per scoprire parassitoidi co-evoluti di Drosophila suzukii negli areali nativi della mosca in Asia orientale 7,8,9, così come parassitoidi efficaci ma recentemente associati nelle regioni invase della mosca nelle Americhe e in Europa 4,5,6. Nelle regioni appena invase della mosca, i parassitoidi larvali Drosophila comunemente presenti, come Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera: Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.), e L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera: Figitidae), non sono in grado di svilupparsi o avere bassi livelli di parassitismo su D. suzukii a causa della forte resistenza immunitaria della mosca10. Solo alcuni parassitoidi pupali cosmopoliti e generalisti come Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hymenoptera: Pteromalidae) e Trichopria drosophilae (Perkins) (Hymenoptera: Diapriidae) in Nord America e in Europa, e Trichopria anastrephae Lima in Sud America possono facilmente svilupparsi da questa mosca4. Al contrario, le esplorazioni in Asia orientale hanno scoperto un certo numero di parassitoidi larvali da D. suzukii 4,5,6. Tra questi, Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering e Leptopilina japonica Novković & Kimura sono i parassitoidi larvali dominanti 7,8,9,11. In particolare, i due figitidi (L. japonica e G. brasiliensis) erano i principali parassitoidi presenti prevalentemente nella frutta fresca infestata da D. suzukii e/o altri drosofilidi strettamente imparentati nella vegetazione naturale 7,8,9. Questi tre parassitoidi larvali asiatici sono stati importati in strutture di quarantena negli Stati Uniti e in Europa e valutati per la loro efficienza relativa 12,13,14,15,16,17, adattabilità climatica18, potenziali interazioni competitive interspecifiche 19 e, soprattutto, specificità dell'ospite 8,20,21 ,22.
Le valutazioni di quarantena hanno mostrato che Ganaspis brasiliensis era più specifico per l'ospite di Drosophila suzukii rispetto ad altri parassitoidi larvali asiatici testati, sebbene probabilmente consiste di diversi biotipi o specie criptiche con specificità dell'ospite variabile 8,21,22,23,24. Nomano et al.22 hanno raggruppato individui Ganaspis provenienti da diverse regioni geografiche in cinque gruppi genetici (denominati G1-G5) sulla base di analisi molecolari del frammento del gene della citocromo ossidasi I mitocondriale. I gruppi G2 e G4 sono segnalati solo da alcune località tropicali dell'Asia meridionale, e il gruppo G5 è stato segnalato dall'Asia e da altre regioni (ad esempio, Argentina, Brasile, Hawaii e Messico) da ospiti sconosciuti (Buffington, osservazione personale). Collezioni sul campo di frutti selvatici infestati da D. suzukii in Corea del Sud7, Cina8 e Giappone 9,23,25 hanno trovato G1 da solo o una miscela di esemplari che rappresentano i gruppi G1 e G3. I due gruppi sembrano essere simpatrici e coesistono sulle stesse piante ospiti abitate da D. suzukii e altre mosche ospiti strettamente correlate. Tuttavia, sono state osservate alcune differenze tra i due gruppi, con G1 che sembra avere un grado più elevato di specificità dell'habitat ospite o ospite rispetto a G3, sebbene entrambi attacchino un certo numero di specie strettamente correlate nei test di quarantena21,22. Ulteriori analisi molecolari dettagliate possono aiutare a determinare lo stato delle specie, in particolare per i gruppi G1 e G3. Questo studio si riferisce a loro come G1 G. brasiliensis e G3 G. brasiliensis. Alcuni primi studi hanno anche chiamato il G1 G. brasiliensis come G. cf. brasiliensis 14,21,22. Il G1 G. brasiliensis è stato recentemente approvato per il rilascio sul campo contro D. suzukii negli Stati Uniti e in Italia (diversi altri paesi europei stanno attualmente considerando la sua introduzione), mentre il G3 G. brasiliensis potrebbe essere considerato per il rilascio sul campo nel prossimo futuro. Recenti indagini hanno anche trovato popolazioni avventive di L. japonica e G1 G. brasiliensis nella Columbia Britannica, Canada26, e nello Stato di Washington, USA (Beers et al., dati non pubblicati), e popolazioni avventive di L. japonica nella provincia di Trento, Italia27.
Dato il significativo interesse per lo sviluppo di programmi di controllo biologico per la gestione della Drosophila suzukii e il sostanziale potenziale di controllo biologico delle introduzioni avventive e deliberate di Ganaspis brasiliensis, vi è la necessità di sviluppare metodi di allevamento efficienti per questo parassitoide larvale per future ricerche a lungo termine e / o rilascio sul campo. Questo protocollo e l'articolo video associato descrivono due serie di metodi di allevamento per questo parassitoide: (1) allevamento di laboratorio su piccola scala in palloni utilizzando una miscela di frutta ospite (mirtillo) e dieta artificiale per la coltura di D. suzukii. I metodi sono stati sviluppati utilizzando materiale G3 originariamente raccolto da Kunming, Cina8. (2) Allevamento di massa per il rilascio in campo in grandi gabbie utilizzando frutta ospite (mirtillo) per la coltura di D. suzukii. Il gruppo genetico utilizzato per l'allevamento su larga scala era lo stock G1 originario di Tokyo, in Giappone 9,22. Altre scale di metodi di allevamento, come l'uso di fiale o piccoli contenitori per entrambi i gruppi, sono anche brevemente discusse.
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Protocol
1. Metodi per l'allevamento in laboratorio su piccola scala di G3 Ganaspis brasiliensis
- Prepara la dieta dell'ospite.
- Aggiungere 600 ml di acqua distillata in un contenitore di vetro da 1.500 ml e riscaldare l'acqua su una piastra calda.
- Aggiungere 88,6 g di dieta secca disponibile in commercio (a base di agar, lievito di birra, farina di mais, metil parabene e saccarosio) o preparare la dieta utilizzando la formula pubblicata da Dalton et al.28 (vedere il passaggio 2.1.2).
- Aggiungere 300 ml di acqua distillata nella dieta secca e mescolare accuratamente la miscela dietetica.
- Aggiungere la miscela all'acqua bollente.
- Lasciare bollire la dieta liquida sulla piastra calda per 10 minuti mescolando periodicamente la miscela per evitare che si bruci.
- Lasciare raffreddare la dieta a temperatura ambiente per 30 minuti mescolando di tanto in tanto per distribuire uniformemente il rilascio di calore e impedire alla dieta di solidificarsi sulla superficie.
- Misurare 6,7 mL di EtOH al 95% in un contenitore e 3,5 mL di soluzione di acido propionico da 1 M in un altro contenitore.
- Una volta che la dieta si è raffreddata, aggiungere l'EtOH e poi la soluzione di acido propionico, mescolando accuratamente dopo ogni aggiunta.
- Preparare i mirtilli (acquistati dal mercato locale) risciacquandoli in acqua fredda, quindi in una soluzione di candeggina all'ipoclorito di sodio (diluita al 5%) e di nuovo acqua fredda.
- Asciugare i frutti con un tovagliolo di carta e schiacciarli manualmente fino a quando la buccia di ciascun frutto è rotta e i succhi e la polpa del frutto sono esposti.
- Aggiungere 25-30 g di purè di mirtilli a ogni pallone da 250 ml. Toccare i lati del pallone per assicurarsi che il fondo interno del pallone sia coperto da uno strato uniforme di purè di mirtilli.
- Versare la dieta preparata in ogni pallone in modo che copra solo la parte superiore del purè di mirtilli.
- Aggiungere tappi di schiuma al collo dei palloni e lasciare che la dieta si solidifichi a temperatura ambiente (Figura 1).
- Una volta che la dieta si è solidificata, utilizzarla immediatamente o conservare a 5 °C per un massimo di 3 settimane.
- Ospite posteriore Drosophila suzukii.
- Rimuovere la dieta immagazzinata dal frigorifero e lasciarla equilibrare alla temperatura ambiente o utilizzare una dieta appena fatta.
- Tagliare un pezzo di carta assorbente (ad esempio, 5 cm x 20 cm) e ruotarlo al centro. Posizionare la sezione centrale attorcigliata del tovagliolo di carta nel matraccio (Figura 1).
- Bagnare il tovagliolo di carta e la superficie della dieta con acqua distillata per trattenere l'umidità.
- Trasferire le mosche adulte sessualmente mature dalle attuali fiasche della colonia a una nuova fiaschetta dietetica rimuovendo con cura il tappo sul vecchio pallone e invertendo rapidamente il pallone e allineando l'apertura del vecchio pallone con il nuovo pallone.
- Picchiettare delicatamente sul lato del vecchio pallone per indurre le mosche a cadere nel nuovo pallone. Assicurati che ci siano ~ 25-30 coppie di accoppiamento di D. suzukii nel nuovo pallone. Una volta che ci sono abbastanza mosche nel nuovo pallone, capovolgere rapidamente il vecchio pallone in posizione verticale e sostituire i tappi su entrambi i palloni.
- Ripeti i trasferimenti di mosche fino a quando non rimangono mosche nelle vecchie fiasche. Se necessario, unire o raccogliere le mosche da più di un vecchio pallone in un nuovo pallone per assicurarsi che ci siano abbastanza mosche (20-30 paia) per pallone.
- Tenere i nuovi palloni dopo una settimana di esposizione alle mosche adulte in condizioni adeguate (21 °C, 16 L: 8 D fotoperiodo, 60%-80% di umidità relativa [RH%]) in una camera ambientale per 3 settimane per l'emergenza della mosca.
- Esporre le larve dell'ospite ai parassitoidi.
- Prendere un pallone (vedi punto 1.2.7) contenente uova di mosca e larve dopo aver rimosso eventuali mosche adulte e il tovagliolo di carta attorcigliato dal pallone.
- Piegare un pezzo di carta assorbente a metà e metterlo nel pallone come substrato di pupa per le larve parassitate.
- Aspirare sei coppie femminili e maschili di G3 G. brasiliensis in ciascun pallone (Figura 1). Strisciare un sottile strato di miele sul fondo del tappo di schiuma.
- Lasciare i parassitoidi nel pallone per 5 giorni.
- Dopo un'esposizione di 5 giorni, rimuovere i parassitoidi e tenere i palloni nelle condizioni sopra descritte in una camera ambientale per 35 giorni fino all'emergenza prevista della vespa.
- Raccogli e conserva i parassitoidi adulti.
- Durante la seconda e la terza settimana di incubazione, controllare i palloni settimanalmente per l'emergenza precoce dell'ospite e rimuovere le mosche adulte.
- Una volta che i parassitoidi adulti iniziano ad emergere, aspirarli tre volte alla settimana e tenerli in flaconcini di drosophila (ad esempio, 2,5 cm x 9,5 cm) (Figura 1).
- Posizionare un piccolo pezzo di carta assorbente inumidito, ma non saturo, con acqua distillata sul fondo del flaconcino.
- Aggiungere ~60 parassitoidi a ciascun flaconcino ed etichettare il flaconcino con le date di emergenza. Strisciare un sottile strato di miele sul fondo del tappo di schiuma, due volte a settimana. Conservare i flaconcini con parassitoidi adulti nelle condizioni sopra descritte nella camera ambientale per un massimo di un mese se non utilizzati prima.
- Rimostrare la carta nel flaconcino una volta ogni 4-7 giorni o sostituire il tovagliolo di carta se ci sono segni di muffa.
2. Metodi per l'allevamento su larga scala di G1 Ganaspis brasiliensis
- Implementare un allevamento su larga scala dell'ospite Drosophila suzukii.
- D. suzukii posteriore all'interno di grandi gabbie ricoperte di maglie a maglia (ad esempio, 50 cm x 50 cm x 100 cm) contenenti ciascuna 1.500-2.000 mosche adulte sessualmente mature (rapporto tra i sessi 50:50) (Figura 2).
- Preparare la Drosophila Medium Standard (SDM) facendo bollire tutti gli ingredienti (6 g di agar batteriologico, 75 g di farina di mais, 17 g di lievito alimentare, 15 g di saccarosio, 10 g di farina di soia, 10 ml di acido propionico) in 1 L di acqua distillata per 10 minuti mescolando periodicamente la miscela per evitare che si bruci28.
- Lasciare raffreddare il composto per 5 minuti e aggiungere 5 g di acido ascorbico.
- Versare l'SDM appena cotto in piastre di Petri da 9 cm e lasciare che il mezzo si solidifichi a temperatura ambiente prima di chiudere le piastre.
- Impilare le piastre di Petri SDM, avvolgere la pila con un foglio di alluminio e conservare le piastre a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- All'interno di ogni gabbia di allevamento, posizionare un piatto con cotone imbevuto d'acqua e da quattro a sei piastre di Petri con SDM (Figura 2).
- Due volte a settimana, sostituire le piastre di Petri SDM infestate con quelle fresche.
- Posizionare le piastre di Petri SDM infestate senza coperchio singolarmente in bicchieri di plastica (13,3 cm di diametro o 800 ml), chiudere ogni tazza con un rivestimento di rete fine (<0,5 mm) e incubare per 12-15 giorni a 23 °C e 75% RH (Figura 2).
- Trasferire gli adulti D. suzukii appena nati dai bicchieri di plastica alle gabbie di allevamento.
- Preparare le larve dell'ospite.
- Risciacquare i mirtilli in acqua fredda per 1 minuto e immergere i frutti in una bacinella riempita con una soluzione di candeggina (diluita al 5%) per 3 minuti.
- Scolare la soluzione di candeggina e riempire la bacinella con acqua fredda per risciacquare i mirtilli. Mescolare delicatamente a mano per almeno 30 s.
- Ripetere il passaggio 2.2.2 con acqua dolce almeno tre volte per rimuovere i residui di candeggina e altri artropodi (ad esempio acari, tripidi) che possono essere presenti sul frutto.
- Posizionare il frutto su un vassoio con diversi strati di carta assorbente e inclinare con cura il vassoio avanti e indietro, arrotolando le bacche per asciugarle.
- Preparare diverse piastre di Petri da 9 cm (la metà superiore o inferiore, rivolta verso l'alto) e riempire ciascuna con i mirtilli lavati (15-25 frutti per piatto a seconda delle dimensioni del frutto).
- Durante le ore del tardo pomeriggio, esporre le piastre di Petri a mosche adulte sessualmente mature all'interno delle gabbie di allevamento dell'ospite (vedere il punto 2.1) e lasciarle durante la notte.
- La mattina successiva, rimuovere le piastre di Petri dalle gabbie di allevamento dell'ospite soffiandole delicatamente o picchiettandole per rimuovere le mosche sui frutti e utilizzare il frutto infestato per l'allevamento di parassitoidi (vedere il punto 2.4).
- Implementare un allevamento di parassitoidi su larga scala.
- Usa due tipi di gabbie per allevare il parassitoide: una per il parassitismo e un'altra per l'emergenza della vespa.
- Assicurarsi che la gabbia per parassitismo sia cubica (ad esempio, 45 cm per lato) con un pannello di plastica trasparente sul davanti per osservare l'attività degli insetti, due aperture per maniche da 18 cm nel pannello frontale per l'aggiunta o la rimozione di insetti e la sostituzione di materiale alimentare e una rete in poliestere fine (ad esempio, rete 96 x 26) sulla parte superiore e sui lati per la ventilazione.
- Rendere la gabbia di emergenza più piccola (ad esempio, 30 cm per lato), con una singola apertura del manicotto su due lati opposti e un pannello di plastica trasparente sul davanti per la visibilità (Figura 2).
- Assicurarsi che entrambi i tipi di gabbia abbiano una corda sottile appesa sotto il soffitto da cui sospendere uno o più alimentatori (Figura 2).
NOTA: Un alimentatore è costituito da un grande tappo cilindrico in schiuma (diametro 9 cm) ricoperto da goccioline di miele sparse e può essere posizionato sul pavimento della gabbia o appeso al soffitto della gabbia (Figura 2). - All'interno di ogni gabbia, fornire acqua in un flaconcino di drosophila a parete diritta (2,5 cm x 9,5 cm) sigillato con un tappo di acetato di cellulosa (diametro 2,5 cm) ogni 5-7 giorni a seconda dell'RH. Appendere il flaconcino capovolto al soffitto della gabbia (Figura 2).
- Esporre le larve dell'ospite ai parassitoidi.
- Esporre il frutto infestato dall'ospite all'interno delle piastre di Petri a G1 G. brasiliensis immediatamente dopo l'infestazione notturna di D. suzukii (vedere passo 2.2.7).
- Lasciare le 10-15 piastre di Petri di frutta infestata nella gabbia di parassitizzazione contenente 1.500-2.000 vespe per 2-3 giorni.
- Utilizzare bicchieri di plastica (13,3 cm di diametro o 800 ml) con strati di carta assorbente sul fondo per raccogliere il frutto contenente gli ospiti parassitizzati (Figura 2).
- Posizionare le coppette aperte nella gabbia di eclosione e incubare per almeno 28 giorni a 21 °C e 65% di umidità relativa (Figura 2).
- Durante la seconda e la terza settimana di incubazione, controllare settimanalmente la gabbia per l'eclosione precoce dell'ospite e rimuovere le mosche adulte per facilitare la successiva raccolta di parassitoidi.
- Alla fine della quarta settimana di incubazione, aggiungere un alimentatore e una fonte d'acqua alla gabbia.
- Raccogli e conserva i parassitoidi adulti.
- Una volta iniziata l'emergenza parassitoide, raccogli una porzione (10%-15%) degli adulti e trasferiscili nella gabbia del parassitismo per sostituire i vecchi individui improduttivi.
- Raccogliere e conservare i restanti parassitoidi in bicchieri di plastica (diametro 13,3 cm o 800 ml) (Figura 3A).
- Posizionare un tubo (2 ml) riempito d'acqua e sigillato con un rotolo di cotone dentale (1 cm x 3,8 cm) sul fondo della tazza (Figura 3A).
- Chiudere la tazza con un coperchio modificato dotato di un tappo in schiuma rimovibile (diametro 3,5 cm) come substrato di alimentazione e di un foro coperto di rete per la ventilazione (Figura 3B).
- Aggiungere fino a 700 adulti a ciascuna tazza (rapporto tra i sessi 50:50), etichettare la tazza con la data di emergenza e conservarla in una camera ambientale (17 °C; 65% RH) fino all'uso o per un massimo di 1 mese (Figura 3B).
- Spedisci i parassitoidi adulti.
- Utilizzare tubi conici (50 ml) per spedire i parassitoidi adulti.
- Forare un foro di ventilazione (diametro 8 mm) sul cappuccio e coprirlo con una rete a maglie sottili (Figura 3C).
- Aggiungere un anello di alimentazione in acetato di cellulosa all'interno del cappuccio (Figura 3C).
- Preparare una soluzione di saccarosio saturo usando acqua distillata, applicare alcune gocce sull'anello di alimentazione e lasciare che assorba il liquido.
- Posizionare un tovagliolo di carta assorbente a forma di ventaglio all'interno del tubo (Figura 3D).
- Aggiungi ~ 200 parassitoidi adulti a ciascun tubo e posiziona i tubi in un contenitore di spedizione isolato insieme a impacchi di ghiaccio.
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Representative Results
La Figura 4 mostra i risultati rappresentativi dell'allevamento in laboratorio su piccola scala di G3 Ganaspis brasiliensis utilizzando due diverse densità parassitoidi (sei o 10 coppie) e due diversi tempi di esposizione (5 o 10 giorni) presso la struttura di quarantena dell'USDA-ARS Beneficial Insects Introduction Unit (Newark, Delaware). Ci sono state 14 repliche per ogni combinazione di densità parassitoide e tempo di esposizione. In totale, i 64 palloni hanno prodotto 4.018 vespe (71,7 ± 4,9 prole per pallone) con il 49,5% di ± l'1,9% di prole femminile. A 21 °C, i parassitoidi adulti sono emersi circa 30-35 giorni dopo l'ovodeposizione. La densità parassitoide e il tempo di esposizione non hanno influenzato in modo significativo il numero totale di prole prodotta per replicazione (pallone) (ANOVA unidirezionale, F3,52 = 0,379, P = 0,769) e hanno avuto solo un effetto marginale sulla percentuale di prole femminile (ANOVA unidirezionale, i dati sono stati trasformati in logit prima dell'analisi secondo necessità per stabilizzare la variazione, F3,52 = 2,796, P = 0,049), sebbene l'efficienza produttiva pro capite femminile (ANOVA unidirezionale, F3,52 = 3,576, P = 0,020) sia diminuita ad alta densità parassitoide. Il tempo di esposizione superiore a 5 giorni non sembra aumentare la produttività. L'aumento della densità parassitoide allo stesso modo non sembra aumentare la produttività. Pertanto, la combinazione di sei coppie e tempi di esposizione di 5 giorni sembra essere più adatta per l'allevamento in laboratorio.
La figura 5 mostra una tendenza alla produttività a 6 mesi dell'allevamento su larga scala di G1 Ganaspis brasiliensis presso la struttura di quarantena della Fondazione Edmund Mach (Trento, Italia) nel 2021. L'allevamento è stato avviato utilizzando 150 vespe femmine accoppiate di tre giorni derivate da un allevamento su piccola scala presso il laboratorio di quarantena del CABI a Delémont, in Svizzera. Altre vespe dall'allevamento sono state gradualmente aggiunte alla gabbia del parassitismo, fino a raggiungere 1.500-2.000 individui (rapporto tra i sessi 50:50) alla settimana 5. L'occupazione della gabbia per parassitismo è stata successivamente mantenuta allo stesso livello aggiungendo nuove vespe prodotte nell'allevamento su larga scala stesso. Durante l'intero periodo, la gabbia del parassitismo è stata fornita con frutta appena infestata ogni 2-3 giorni. Il frutto (mirtilli) è stato offerto a G1 G. brasiliensis subito dopo l'esposizione notturna a Drosophila suzukii. La produzione di parassitoidi è iniziata 5 settimane dopo l'esposizione iniziale dell'ospite (Figura 5A). Dalla settimana 8 alla settimana 22, la produzione di parassitoidi è stata proporzionale alla quantità di frutta esposta, con una media di 0,44 ± 0,03 g / parassitoide (media ± SE; Figura 5B). Sono stati raccolti un totale di 53.736 parassitoidi, con una progenie femminile media del 45,9% (range: 32,4%-79,0%).
Figura 1: Diagramma di flusso per le procedure di allevamento in laboratorio su piccola scala di Drosophila suzukii e G3 Ganaspis brasiliensis. Il lato sinistro mostra le procedure di allevamento della mosca ospite mentre il lato destro illustra il ciclo di allevamento dei parassitoidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diagramma di flusso per le procedure di allevamento su larga scala di Drosophila suzukii e G1 Ganaspis brasiliensis. Il lato sinistro mostra le procedure di allevamento della mosca ospite mentre il lato destro illustra il ciclo di allevamento dei parassitoidi. Abbreviazione: SDM = standard Drosophila medium. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Contenitori e tubi utilizzati per immagazzinare e spedire G1 Ganaspis brasiliensis dall'allevamento su larga scala. (A) Una vista orizzontale del contenitore di stoccaggio che mostra un tubo dell'acqua all'interno del contenitore, (B) una vista verticale del contenitore che mostra un coperchio ventilato e un tappo di schiuma, e (C) un coperchio ventilato e un pezzo di carta assorbente per (D) il tubo di spedizione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempio rappresentativo per l'allevamento in laboratorio su piccola scala di G3 Ganaspis brasiliensis. (A) Numero di prole prodotta per pallone, (B) numero di prole prodotta per vespa femmina e (C) percentuale di prole femmina, sotto due diverse densità parassitoidi e tempi di esposizione. I valori sono medi ± SE e le barre con lettere diverse sono significativamente diverse (ANOVA, HSD di Tukey, P < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Andamento della produttività dell'allevamento su larga scala dal suo inizio fino alla settimana 23. (A) Le barre indicano il numero di prole G1 Ganaspis brasiliensis raccolte settimanalmente dalle gabbie di eclosione per sostituire i vecchi individui nella gabbia del parassitismo (verde scuro) e per essere immagazzinati o spediti (verde chiaro). La linea arancione indica la quantità di frutta infestata dall'ospite (kg di mirtilli) fornita ogni settimana ai parassitoidi all'interno della gabbia del parassitismo. (B) Rapporto settimanale tra il peso del frutto infestato dall'ospite e il numero di prole parassitoide prodotta 5 settimane dopo l'esposizione (cioè grammi di frutta necessari per produrre un singolo parassitoide adulto). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La ricerca a lungo termine e le successive emissioni sul campo di un agente di controllo biologico dipendono dalla disponibilità di tecniche di allevamento efficaci ed economiche. I metodi descritti in questo studio hanno dimostrato di essere protocolli efficienti sia per l'allevamento su piccola scala che su larga scala di Ganaspis brasiliensis. Il protocollo di allevamento su piccola scala è stato sviluppato nel corso di diversi anni per ottimizzare la quantità di manodopera e ridurre le attrezzature specializzate necessarie per mantenere contemporaneamente le colonie parassitoidi e ospiti. È adatto per mantenere una colonia per ricerche di laboratorio o saggi biologici. Metodi simili sono stati utilizzati dagli autori per allevare questo parassitoide per le valutazioni di quarantena di questo parassitoide. Il protocollo di allevamento su larga scala consentirà di produrre un gran numero di vespe per il rilascio sul campo, come sono stati recentemente condotti in Italia. Queste tecnologie possono essere facilmente trasferite ad altri laboratori, produttori o aziende per l'allevamento su larga scala nel prossimo futuro, oltre a servire come base per ulteriori miglioramenti nelle metodologie.
Questi protocolli possono anche essere utilizzati per allevare Leptopilina japonica, poiché sia Ganaspis brasiliensis che L. japonica sono simili in termini di preferenza per l'habitat ospite 7,8, preferenza dello stadio ospite o biologia riproduttiva15, prestazioni termiche18 ed efficienza del foraggiamento nei biosaggi di laboratorio13,15, nonché risposte comportamentali verso i segnali associati all'ospite12, tranne che L. japonica sembra avere una gamma di ospiti più ampia di quella anche di G3 G. brasiliensis20. Entrambi i parassitoidi sono stati allevati utilizzando metodi simili a quelli descritti nel presente documento. Per l'allevamento su piccola scala, entrambi i parassitoidi possono anche essere allevati in fiale di drosophila, in genere trasferendo 20 giovani (1-2 giorni) larve di Drosophila suzukii in una fiala di drosophila riempita con 2 cm di dieta artificiale, o posizionando due frutti infestati, ciascuno contenente 5-10 giovani larve di D. suzukii, ed esponendole a due vespe femmine accoppiate per 2-3 giorni, entrambi producono ~10 prole perfiala 13,15,22.
Come discusso in precedenza, il G1 e G3 Ganaspis brasiliensis utilizzati in questo protocollo possono differire leggermente in alcuni comportamenti di ricerca dell'host e nella specificità dell'host21,22. Girod et al.21 riferiscono che il G1 G. brasiliensis giapponese era più strettamente specifico per Drosophila suzukii e non sembrava funzionare bene nella dieta artificiale pura in fiale rispetto alle sue prestazioni sul frutto ospite. Matsuura et al.25 hanno anche riferito che le popolazioni di G1 G. brasiliensis raccolte da ciliegie infestate da D. suzukii in Giappone sono specializzate in D. suzukii. Il metodo di allevamento su piccola scala che utilizza la dieta mista con mirtilli è stato sviluppato inizialmente per l'allevamento di G3 G. brasiliensis perché G1 G. brasiliensis non era disponibile in quel momento. Successivamente, questo metodo non ha funzionato bene per l'allevamento di G1 G. brasiliensis (Wang et al. dati non pubblicati).
Pertanto, per l'allevamento su piccola scala di G1 G. brasiliensis, si suggerisce di modificare il substrato ospite (1) esponendo le mosche direttamente ai mirtilli (o ad altri frutti ospiti) per raccogliere le larve ospiti nel frutto e (2) trasferendo il frutto esposto a un terreno di coltura standard di Drosophila affinché le larve si sviluppino in un ambiente a bassa competizione posizionando i frutti infestati contenenti le larve ospiti nella dieta nei palloni per l'esposizione ai parassitoidi. Ciò consentirà alle larve parassitate di nutrirsi della dieta, specialmente ad alte densità dell'ospite, e alle pupe ospiti parassitate di essere raccolte dal tovagliolo di carta. In alternativa, G1 G. brasiliensis può essere allevato sulla frutta direttamente in contenitori di plastica (varie dimensioni) esponendo 5-10 vespe femmine a 10-20 mirtilli infestati per 4-5 giorni, che hanno prodotto fino a 80 prole per contenitore, a seconda della densità dell'ospite (Wang et al., dati non pubblicati). Per questo metodo, si consiglia di posizionare il frutto infestato su una rete metallica rialzata ("panno hardware") per consentire ai parassitoidi di accedere al frutto infestato da tutte le direzioni, soprattutto se troppi frutti sono posti in un contenitore. Idealmente, uno o due strati di frutta infestata dovrebbero essere collocati in ogni contenitore per questo metodo di allevamento. Questi metodi alternativi su piccola scala dovrebbero funzionare bene anche per l'allevamento di G3 G. brasiliensis.
Indipendentemente dai metodi di allevamento e dalle squame (fiala, pallone, contenitore o gabbia), è fondamentale mantenere una temperatura, un'umidità adeguate, nonché controllare l'età, la densità e il tempo di esposizione dell'ospite o della vespa femmina per l'allevamento di G1 Ganaspis brasiliensis e G3 G. brasiliensis. Le larve di Drosophila suzukii si sono sviluppate in circa 1 settimana in normali condizioni di laboratorio (ad esempio, 22 ± 2 °C) 15. La femmina di G. brasiliensis preferiva attaccare le larve ospiti più giovani (1-2 giorni) rispetto a quelle più anziane (3-4 giorni), anche se varie età delle larve ospiti potevano essere attaccate15. A 22 ± 2 °C, le femmine di G. brasiliensis sono emerse con una percentuale sostanzialmente elevata (~ 50%) del loro complemento di vita di uova mature e il carico di uova mature ha raggiunto un picco dopo 2-3 giorni15. Le femmine adulte sono sopravvissute a circa 20 giorni quando è stato fornito un accesso illimitato agli ospiti e hanno iniziato l'ovodeposizione entro 2 giorni dall'emergenza, raggiungendo un picco di ovodeposizione entro 5-10 giorni e successivamente riducendo gradualmente l'ovodeposizione15. Pertanto, le giovani (<10 giorni) vespe femmine dovrebbero essere utilizzate nell'allevamento, ma le vespe femmine potrebbero essere riutilizzate per l'allevamento quando scarseggiano. Il parassitoide potrebbe facilmente svilupparsi a 21-25 °C, ma temperature inferiori a 17,2 °C sembravano innescare una diapausa facoltativa17. Si raccomanda pertanto di utilizzare un intervallo di temperatura di 21-25 °C per uno sviluppo ottimale sia della mosca che del parassitoide.
Inoltre, il tempo di esposizione superiore a 5 giorni probabilmente non aumenterà la produttività del parassitoide. L'aumento della densità parassitoide basata sull'allevamento su piccola scala per G3 G. brasiliensis sembra non aumentare la produttività, probabilmente a causa dell'interferenza reciproca tra le vespe femmine foraggiatrici. Sei coppie maschio-femmina e un tempo di esposizione di 5 giorni sembrano essere una combinazione ideale per l'allevamento su piccola scala in laboratorio, anche se i metodi di allevamento potrebbero essere migliorati in futuro ottimizzando ulteriormente il rapporto tra ospite e parassitoide. Un importante fattore di mortalità per il parassitoide sembra essere correlato alla bassa umidità, poiché molti parassitoidi sono stati osservati per non essere in grado di eclose con condizioni di substrato secco. L'aggiunta di un pezzo di tovagliolo di carta assorbente sotto il frutto non solo assorbe i succhi mentre il frutto si degrada, ma fornisce anche un substrato che può essere inumidito per aumentare l'umidità o fornire un substrato di pupa per la mosca.
Per l'allevamento su piccola scala, un pallone può mantenere l'umidità meglio di una fiala perché il primo ha un collo stretto. È stato anche scoperto in questo studio che i mirtilli freschi ricoperti da una spolverata di lievito secco attivo hanno contribuito a prevenire la formazione di muffe e hanno migliorato l'attrazione del frutto per le mosche. Altri aspetti dell'allevamento parassitoide che rimangono da esplorare includono (1) la possibilità di allevare questo parassitoide su ospiti alternativi o frutti ospiti e come ospiti alternativi o frutti ospiti influenzerebbero l'efficienza del parassitoide, (2) fattori che influenzano l'idoneità della prole e il rapporto tra i sessi del parassitoide, (3) la capacità di questo parassitoide (sia G1 che G3 ) di adattarsi alle condizioni di dieta artificiale, e (4) i cambiamenti genetici o comportamentali che potrebbero verificarsi con l'adattamento.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Lukas Seehausen e Marc Kenis (CABI, Svizzera) per aver gentilmente fornito G1 G. brasiliensis. I finanziamenti in Italia sono stati forniti dalla Provincia Autonoma di Trento, Trento, Italia, e negli Stati Uniti dal National Institute of Food and Agriculture, dal premio USDA Specialty Crops Research Initiative (# 2020-5118-32140), dall'USDA Animal and Plant Health Inspection Service (Farm Bill, fondo 14-8130-0463) e dai fondi di base USDA ARS CRIS (progetto 8010-22000-033-00D). L'USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro e non approva i prodotti menzionati in questa pubblicazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA | None | Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies |
| Bacteriological agar | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | A1296 - 5KG | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Bleach solution | Clorox Company, Oakland, CA, USA | None | Used to disinfect flesh fruit |
| Blue stopper | Azer Scientific, Morgantown, PA, USA | ES3837 | Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects |
| Blueberries | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used) |
| BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E3030 | Used for rearing parasitoids (parasitism cage) |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4590 | Used for rearing flies |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4545 | Used for rearing parasitoids (eclosion cage) |
| Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge) | Everbilt, OH, USA | 308231EB | Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition |
| Cornmeal | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Dental cotton roll (1 x 3.8 cm) | Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy | 35000 | Used for providing water to the parasitoids within the storage container |
| Drosophila diet | Frontier Scientific, Newark, DE, USA | TF1003 | Custom diet used to rear flies |
| Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 75813-160 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 89168-886 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Erlenmeyer flask (250 mL) | Carolina Biological, Burlington, NC, USA | 731029 | Used for rearing flies and parasitoids |
| Falcon-style centrifuge tube (50 mL) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | VWRI525-0611 | Modified to ship adult parasitoids |
| Foam stopper | Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA | L800-C | Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects |
| Honey | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as food for parasitoids |
| Identi-Plug plastic foam stopper | Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US | 14-127-40E | Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container |
| Industrial paper towel | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture |
| Micron mesh fabric (250 mL) | Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA | WN0250-72 | Used to make ventilation lid for insects |
| Nutritional yeast (flakes) | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Paper coaster (10.2 cm) | Hoffmaster, WI, USA | 35NG26 | Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae |
| Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | Unipak 5134 | Modified to store adult parasitoids |
| Plastic lid (Ø 13.3 cm) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | PP 2830 | Modified to store adult parasitoids |
| Propionic acid | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | P1386 - 1L | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Saccharose | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Soup cup with lid (475 mL) | StackMan, Vietnam | DC1648 | Used for parasitized larvae to pupate |
| Soybean flour | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD) | Quiklok, Lincoln, NH, US | WFW/.25 x 5 x 20 mm | Used as feeding ring for parasitoids |
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