Summary
Hücre duvarı biyomekaniği çalışmaları, bitki büyümesini ve morfogenezini anlamak için gereklidir. Aşağıdaki protokol, atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak genç bitki organlarının iç dokularındaki ince primer hücre duvarlarının araştırılması için önerilmiştir.
Abstract
Birincil hücre duvarlarının mekanik özellikleri, bitki hücresi büyümesinin yönünü ve hızını ve dolayısıyla bitkinin gelecekteki boyutunu ve şeklini belirler. Bu özellikleri ölçmek için birçok sofistike teknik geliştirilmiştir; Bununla birlikte, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), hücresel düzeyde hücre duvarı elastikiyetini incelemek için en uygun olanı olmaya devam etmektedir. Bu tekniğin en önemli sınırlamalarından biri, sadece yüzeysel veya izole canlı hücrelerin incelenebilmesidir. Burada, bir bitki gövdesinin iç dokularına ait birincil hücre duvarlarının mekanik özelliklerini araştırmak için atomik kuvvet mikroskobunun kullanımı sunulmaktadır. Bu protokol, köklerdeki görünür Young'ın hücre duvarları modülünün ölçümlerini açıklar, ancak yöntem diğer bitki organlarına da uygulanabilir. Ölçümler, (i) plazmolize edici çözeltilerin veya balmumu veya reçine ile numune emprenye edilmesinin önlenmesine, (ii) deneylerin hızlı hale getirilmesine ve (iii) numunenin dehidrasyonunun önlenmesine izin veren sıvı bir hücredeki bitki materyalinin vibratom türevi bölümleri üzerinde gerçekleştirilir. Hem antiklinal hem de periklinal hücre duvarları, numunenin nasıl kesitlendiğine bağlı olarak incelenebilir. Farklı dokuların mekanik özelliklerindeki farklılıklar tek bir bölümde incelenebilir. Protokol, çalışma planlamasının ilkelerini, numune hazırlama ve ölçümlerle ilgili konuları ve ayrıca topografyanın elastik modülün elde edilen değerleri üzerindeki etkisini önlemek için kuvvet-deformasyon eğrilerini seçme yöntemini açıklar. Yöntem, örneklem büyüklüğü ile sınırlı değildir, ancak hücre boyutuna duyarlıdır (yani, büyük lümenli hücrelerin incelenmesi zordur).
Introduction
Bitki hücre duvarının mekanik özellikleri, hücrenin şeklini ve büyüme yeteneğini belirler. Örneğin, polen tüpünün büyüyen ucu, aynı tüpün büyümeyen kısımlarından daha yumuşaktır1. Arabidopsis meristemindeki primordia oluşumundan önce, gelecekteki primordium 2,3 bölgesinde hücre duvarı sertliğinde lokal bir azalma vardır. Arabidopsis hipokotilinin ana büyüme eksenine paralel olan ve daha hızlı büyüyen hücre duvarları, bu eksene dik olanlardan daha yumuşaktır ve 4,5 daha yavaş büyür. Mısır kökünde, hücrelerin bölünmeden uzamaya geçişine, kökün tüm dokularında elastik modülde bir azalma eşlik etti. Modül, uzama zonunda düşük kaldı ve geç uzama bölgesi6'da arttı.
Çeşitli yöntemlerin mevcudiyetine rağmen, hücre duvarı biyolojisi üzerine yıllık olarak elde edilen büyük biyokimyasal ve genetik bilgi dizileri, hücre duvarlarının mekanik özellikleri ile nadiren karşılaştırılmaktadır. Örneğin, hücre duvarı ile ilgili genlerdeki mutantlar genellikle büyüme ve gelişmeyi değiştirmiştir 4,7,8, ancak nadiren biyomekanik olarak tanımlanmaktadır. Bunun nedenlerinden biri, hücresel ve hücre altı seviyelerde ölçüm yapmanın zorluğudur. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) şu anda bu tür analizler için birincil yaklaşımdır9.
Son yıllarda, bitki hücre duvarı biyomekaniği üzerine AFM tabanlı çok sayıda çalışma yapılmıştır. Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 ve soğan 12'nin dış dokularının ve 13,14,15 kültürlü hücrelerin hücre duvarlarının mekanik özellikleri araştırılmıştır. Bununla birlikte, bir bitkinin yüzeysel hücreleri, mekanik özellikleri iç dokularınkinden farklı olan hücre duvarlarına sahip olabilir6. Ek olarak, bitki hücreleri turgor tarafından basınçlandırılır ve bu da onları daha sert hale getirir. Turgor basıncının etkisinden kurtulmak için araştırmacılar 2,3,4,5,10,11 plazmozlama solüsyonlarını kullanmak veya elde edilen değerleri turgor ve hücre duvarı katkılarına ayrıştırmak zorundadır 12. İlk yaklaşım numune dehidrasyonuna yol açar ve hücre duvarının kalınlığını ve özelliklerini değiştirir16, ikinci yaklaşım ise ek ölçümler ve karmaşık matematik gerektirir ve yalnızca nispeten basit şekil12'deki hücreler için geçerlidir. İç dokuların hücre duvarı özellikleri, kriyoseksiyon17 veya reçine8 ile emprenye edilmiş bitki materyali bölümleri üzerinde değerlendirilebilir. Bununla birlikte, her iki yöntem de kaçınılmaz olarak özelliklerde değişikliklere yol açan dehidrasyon ve / veya numunelerin emprenye edilmesini içerir. İzole edilmiş veya kültürlenmiş hücrelerin özelliklerinin, tüm bitkinin fizyolojisi ile ilişkilendirilmesi zordur. Bitki hücrelerinin hem ekimi hem de izolasyonu, hücre duvarlarının mekanik özelliklerini etkileyebilir.
Burada sunulan yöntem yukarıda belirtilen yaklaşımları tamamlamaktadır. Bunu kullanarak, herhangi bir dokunun birincil hücre duvarları ve bitki gelişiminin herhangi bir aşamasında incelenebilir. Kesitleme ve AFM gözlemleri, numune dehidrasyonunu önleyen sıvı içinde gerçekleştirildi. Turgor problemi, hücreler kesildikçe çözüldü. Protokol, mısır ve çavdar kökleri ile çalışmayı tanımlar, ancak vibratom kesiti için uygunsa başka herhangi bir örnek incelenebilir.
Burada anlatılan AFM çalışmaları kuvvet-hacim tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Farklı enstrümanlar bu yöntem için farklı isimler kullanır. Ancak temel ilke aynıdır; Numunenin kuvvet-hacim haritası, konsol sapmasını kaydederken, analiz edilen her noktada belirli bir yükleme kuvveti elde etmek için konsol (veya numunenin) sinüzoidal veya üçgen hareketi ile elde edilir18. Sonuç, yüzeyin topografik görüntüsünü ve kuvvet-mesafe eğrileri dizisini birleştirir. Her eğri, belirli bir noktadaki deformasyonu, sertliği, Young modülünü, yapışmayı ve enerji dağılımını hesaplamak için kullanılır. Benzer veriler, temas modu19'da tarandıktan sonra noktadan noktaya kuvvet-spektroskopi ile elde edilebilir, ancak daha fazla zaman alıcıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. AFM ölçümleri için numune hazırlama
- Bitki materyali: Mısır (Zea mays L.) ve çavdar (Secale tahıl gevrek L.) tohumlarını 10 dakika boyunca% 0.35'lik bir NaOCl çözeltisi ile sterilize edin, 3x'i damıtılmış suyla yıkayın ve daha sonra sırasıyla 4 gün ve 2 gün boyunca 27 ° C'de karanlıkta hidroponik olarak büyüyün. Deney için birincil kökler kullanıldı.
- Vibratom kesitleme için çözeltilerin ve numunelerin hazırlanması
- Bir mikrodalga fırın kullanarak% 3 (w / w) düşük erime noktalı agarozu suda çözerek kök gömme için agaroz çözeltisi hazırlayın.
NOT: Tüm deneyler suda yapılmıştır. Çalışma için tampon veya başka bir ortam türü gerekiyorsa, numuneye zarar vermemek için agaroz hazırlığı için, bölümleme sırasında ve AFM'nin sıvı hücresinde aynı ortamı kullanmak daha iyidir. - Petri kabının dibine 4 mm'lik bir erimiş% 3 agaroz tabakası dökün (çap = 35 mm) ve numuneye termal hasarı önlemek için hafifçe soğumaya bırakın.
- İncelenen bitki organının üç veya dört küçük parçasını (yaklaşık 5 mm uzunluğunda) agaroz üzerine yatay olarak yerleştirin.
NOT: Numuneler yarı daldırılmalı, ancak agaroz tabakasına batırılmamalıdır. Numune daldırılmazsa, vibratom kesiti sırasında agarozdan kopabilir. Numune dibe batarsa, bölümün kenarına çok yakın olacak ve daha sonraki adımlar için elverişsiz hale gelecektir. - İlk agaroz tabakasının (30-60 s) üstünde ince, yarı katı bir film göründüğünde, üstüne dikkatlice ikinci bir tabaka dökün.
NOT: Agarozun alt tabakası tamamen katılaşmamalıdır. Aksi takdirde, iki katman daha fazla çalışma sırasında birbirinden ayrılabilir. - Agaroz tamamen katılaştıktan sonra, örneği içeren bloğu kesin. Daha sonraki kesitleme sırasında stabilitesini sağlamak için bloğu altıgen kesilmiş bir piramit halinde şekillendirin (Şekil 1A).
NOT: Numune, gerekli bölüm tipine bağlı olarak bu blok içinde dikey veya yatay olarak yönlendirilebilir. Bloğu hazırlarken, numunenin etrafında 2-3 mm agaroz bırakın. Bu durumda, örnek bölüm,% 3 agaroz tabakası tarafından tutulacak ve bu da daha fazla hareketsizleştirilmesini kolaylaştıracaktır (Şekil 1B).
- Bir mikrodalga fırın kullanarak% 3 (w / w) düşük erime noktalı agarozu suda çözerek kök gömme için agaroz çözeltisi hazırlayın.
- Numunenin vibratom ile bölümlenmesi
- Bloğu siyanoakrilat yapıştırıcı ile vibratom aşamasına yapıştırın. Sahneyi vibratoma yerleştirin, böylece piramit köşelerinden biri vibratomun bıçağına bakar. Vibratom banyosuna su dökün.
- Kesit parametrelerini (kesit kalınlığı, bıçak hızı ve titreşim frekansı) ayarlayın ve numuneyi kesin.
NOT: 200 ila 400 μm arasındaki kesit kalınlıklarını kullanın. Çok ince bir bölüm, mekanik özelliklerin değerlendirilmesinde hatalara neden olabilirken, çok kalın bir bölüm kırılmaya eğilimlidir. Çavdar ve mısır kökleri için 1,3 mm·s-1 bıçak hızı ve 90 Hz salınım frekansı kullanılmıştır. - İnce bir fırça kullanarak, bölümü su banyosundan bir cam kaydırağa taşıyın ve kurumasını önlemek için bölüme bir damla su yerleştirin. Bölümün kalitesini ışık mikroskobu altında kontrol edin.
NOT: Eğik kesitler elastikiyet modülünü ölçmek için kullanılamaz. Hücre duvarları kesit düzlemine dik olmalıdır, aksi takdirde AFM ucunun altında bükülebilir veya tokalanabilir.
- AFM ölçümleri için bölümün hareketsiz hale getirilmesi (Şekil 1B)
- Bir pipet kullanarak Petri kabı kapağının altına erimiş% 1 (w / w) agaroz (~ 1 mL) tabakası dökün.
NOT: Petri kabı kapağının kenarlarının, ucun numuneye yaklaşmasını engellemediğinden emin olun. Agaroz tabakası 1 mm kalınlığında olmalı ve kapağın tüm tabanını örtmelidir. - % 1 agaroz katılaştıktan sonra, filtre kağıdını kenarına getirerek bölümdeki fazla suyu çıkarın.
NOT: Numunenin zarar görmesini ve tamamen kurumasını önlemek için tesis bölümüne kağıtla dokunmayın. - Bölümü slayttan Petri kabı kapağının ortasına bir fırça kullanarak dikkatlice aktarın. 20 μL'lik bir pipet kullanarak, kesitin etrafına dikkatlice %1 agaroz ekleyin (Şekil 1B).
NOT: %1 agaroz numunenin üzerine girmemelidir. Sadece bitki örneğini tutan% 3 agaroz tabakasının kenarlarını örtmelidir. % 1 agaroz, bu % 3'lük agaroz tabakasının kenarlarında küçük topuzlar oluşturmalıdır. Büyük topuzlar, konsolların numuneye yaklaşmasını engelleyebilir. - AFM için kullanılacak suyu veya başka bir çözeltiyi, hareketsiz bölümle Petri kabı kapağına dökün.
- Bir pipet kullanarak Petri kabı kapağının altına erimiş% 1 (w / w) agaroz (~ 1 mL) tabakası dökün.
2. AFM hazırlığı ve kalibrasyonu
NOT: AFM'nin kuvvet-hacim yöntemi, incelenen alanın her noktasında elde edilen uzamsal olarak çözülmüş bir dizi kuvvet-mesafe eğrisi oluşturur. Temas modunda kuvvet-hacim modu (konsol sertliği, IOS, vb.) için tüm parametreleri edinin. Diğer üreticilerin enstrümanları için benzer prosedürler daha önce10,20 olarak tanımlanmıştır.
- Uygun konsol tipini seçin.
NOT: Konsol sertliği, numune sertliği21 ile karşılaştırılabilir olmalıdır. Numuneden çok daha sert olan bir konsol çok fazla sapmazken, çok yumuşak bir konsol numuneyi yeterince deforme etmeyecektir. Tipik bir rezonans frekansı, konsolu sıvı içinde sallamak için yeterli olmalıdır (yani, en az birkaç on kHz olmalıdır). Temas alanı, hücre duvarının boyutuna kıyasla küçük olmalıdır, çünkü Young'ın modül hesaplamalarında incelenen numunenin sonsuz bir yarı alan olduğu varsayılmaktadır. Çavdar ve mısır kökleri için aşağıdaki konsollar kullanılmıştır: tipik rezonans frekansı 60 kHz, ortalama yay sabiti 1.5 N·m-1 ve tepe yarıçapı 10 nm olan keskin konsollar veya tipik rezonans frekansı 75 kHz, ortalama yay sabiti 2.8 N·m-1 olan küresel konsollar, ve 150 nm'lik bir tepe yarıçapı. - AFM cihazını ve ilgili yazılımı açın (Malzeme Tablosu). Konsolu sıvı hücre için uç tutucuya monte edin. Sıvıya batırırken uçta hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için uca bir damla sıvı yerleştirin.
NOT: Kabarcık oluşumu durumunda, sıvı hassas bir mendille çıkarılabilir ve daha sonra yeni bir damla yerleştirilebilir. - Uç tutucuyu tarama kafasına takın.
- Petri kabı kapağına sert bir numune (taze cam slayt) yerleştirin. Sıvıyı içine dökün ve slaytı örttüğünden emin olun. Tarama kafasını sahneye yerleştirin ve numuneyi, sıvı konsolunu kaplayacak şekilde kaldırın.
- Açılır Araçlar menüsündeki Başlıklar sekmesini seçin. Sıvı hücre için tarama kafasının seçili olduğundan emin olun.
- Lazer Hedefleme penceresini açmak için Hedefleme düğmesine tıklayın. Optik Mikroskop penceresini açmak için Kamera düğmesine tıklayın. AFM kafasındaki vidaları ve yönlendirme için Optik Mikroskop penceresini kullanarak lazeri konsol ucuna yerleştirin.
- Programın ana penceresindeki açılır menüden Semicontact modunu seçin.
- Rezonans sekmesini açın ve Problar menüsünde kullanılan konsol türünü seçin. Rezonans frekansını belirlemek için Otomatik düğmesine tıklayın.
NOT: Kullanılan konsol listede yoksa, Probe Passport> Araçlar'ı açın. Yeni bir dosya oluşturun, konsol parametrelerini girin ve kaydedin. Ardından Problar açılır menüsünden seçin. - Programın ana penceresindeki açılır menüden İletişim modunu seçin.
- Konsol kalibrasyon penceresini açmak için Cal düğmesine N_Force tıklayın. Kullanılan konsolları seçin ve termal ayar prosedürünü kullanarak konsol yay sabitini belirlemek için Süpür düğmesine ve ardından Spect Meas düğmesine tıklayın. Pencereyi kapatın.
- SetPoint'i 1 nA olarak ayarlayın. Yaklaşım sekmesini açın ve örneğe yaklaşmak için Giriş düğmesine tıklayın.
- Tarama sekmesini açın. Tarama Hızını 0,5 Hz'ye ayarlayın. Alan düğmesine tıklayın ve tarama Boyutunu 10 μm x 10 μm ve tarama Noktasını 256 x 256 olarak ayarlayın. Çalıştır düğmesine tıklayın ve camda kirlenme olup olmadığını kontrol etmek için yaklaşık 20 satır tarayın. Veri kaybetmeden taramayı sonlandırmak için Durdur düğmesine tıklayın.
- Eğriler sekmesini açın. Geri çekilme ve sırasıyla 500 nm ve -100 nm'ye yaklaşma parametrelerini ayarlayın.
- Yüzeyi gözlemlemek için Çerçeve Seç açılır menüsünden son taramayı seçin.
- Camda temiz bir alan bulun ve kuvvet-deformasyon eğrisinin alınması gereken noktayı belirtin ve eğriyi almak için Çalıştır düğmesine tıklayın. Taramanın farklı yerlerine üç ila beş kuvvet eğrisi kaydedin.
- Analiz penceresini açmak için Veri düğmesine tıklayın ve kuvvet-deformasyon eğrisine sahip çerçeveyi seçin.
- Çift İşaretçileri düğmesine tıklayın ve DFL sinyalinin Ters Optik Hassasiyet (IOS, nA nm-1) veya sapma hassasiyeti olan yer değiştirmeye oranını hesaplamak için geri çekme eğrisinin doğrusal kısmını belirtin.
- Kaydedilen tüm eğriler için adım 2.17'yi tekrarlayın ve DFL sinyalinin yer değiştirme oranının hesaplanan tüm değerlerini yazın. Aynı olmalılar.
- Analiz penceresini kapatın, Yaklaşım sekmesine tıklayın ve ardından probu örnekten geri çekmek için Kaldır düğmesine tıklayın.
3. Veri toplama
- Optik mikroskop kullanarak numuneyi AFM konsolunun altına yönlendirin. Yaklaşım sekmesine ve ardından Giriş düğmesine tıklayarak örnekle temas modunda 1 nA Ayar Noktası ile yaklaşın.
- Tarama sekmesini ve ardından Alan düğmesini tıklatın. Taranacak Alan Boyutu 70 μm x 70 μm seçin.
- Probu Taşı düğmesine tıklayın ve tarayıcıyı üzerinde hareket ettirerek tüm tarama alanını kontrol edin. Tarayıcı çıkıntısının derecesine bağlı olarak, en yüksek noktayı bulun.
- Yaklaşım sekmesini açın, ardından örnekten geri çekmek için Kaldır düğmesine tıklayın. Hedef olarak en yüksek noktayı kullanarak örneğe tekrar yaklaşmak için Açılış düğmesini tıklayın. Ardından, Probu Taşı düğmesine tıklayarak ve tarayıcıyı üzerinde hareket ettirerek yüzeyi tekrar kontrol edin. Alandaki noktaların hiçbiri tarayıcının tamamen yükseltilmesini gerektirmemelidir.
NOT: İdeal olarak, tarayıcı z aralığı numunenin yükseklik farkını aşmalıdır. Ancak, tarama alanındaki bazı noktaların tarayıcının kapasitesinin altında olması kabul edilebilir. Aynı zamanda, bu tür çok fazla nokta olmamalıdır. Tarayıcı tarafından ulaşılamayan geniş alanlar tarama kürtajına neden olabilir. - Tarama Hızını 0,5 Hz olarak ayarlayın. Tarama Boyutunu 70 μm x 70 μm ve tarama noktasını 64 x 64 olarak ayarlayın. Çalıştır düğmesine tıklayın ve numunenin yüzeyini ve agaroz ile olası kontaminasyonunu kontrol etmek için tarayın.
NOT: Numunede büyük lümenli hücreler varsa, tarama alanının boyutu azaltılabilir veya taramada daha fazla hücre duvarı olacak şekilde hareket ettirilmelidir. - Geri bildirim döngüsünü kapatmak için ana pencerenin üst kısmındaki Açık düğmesine tıklayın.
- Programın ana penceresindeki açılır menüden HDPlus modunu (kuvvet-hacim yöntemi) seçin. Ek bir pencere (HD pencere) görünecektir.
- Ana program penceresinde SetPoint'i 0,1 nA olarak ayarlayın.
- HD penceresinin Ana sekmesinde, incelenen örneğe uygun tarama parametrelerini (sinüzoidal konsol hareketinin genliği ve frekansı) ayarlayın.
NOT: Her numune ve konsol türü, tarama parametrelerinin seçimini gerektirir. Bazı ön deneyler gereklidir. Mısır veya çavdar kökleri için, 400 nm genlikte ve 300 Hz frekansında keskin ve küresel konsollar kullanılmıştır. - HD penceresinde Sesler sekmesini açın ve konsol rezonans frekansını girin.
- HD penceresinin Miktar sekmesini açın ve IOS, konsol Sertliği, uç yarıçapı ve açısını girin. Uç geometrisine bağlı olarak hesaplamalar için kullanılacak temas modelini seçin.
NOT: DMT modeli, prob ile numune arasında var olan yapışma kuvvetini dikkate alır ve en yaygın olarak mekanobiyoloji21'de kullanılır. - HD penceresinin Tara sekmesini açın ve kaydedilecek sinyalleri seçin. Sinyalin kaydedildiği yönü seçin. Tüm kuvvet eğrilerinin kaydını almak için Kuvvet ses seviyesi kutusunu işaretleyin.
NOT: Elastikiyet modülü sinyalini hem ileri hem de geri yönlerde kaydedin. Hesaplanacak daha fazla puan sağlayacaktır. - Geri bildirim döngüsünü açmak için ana program penceresinin üst kısmındaki Kapalı düğmesine tıklayın.
- Optik sistemin hassasiyetini düzeltmek için ana HD penceresindeki PhaseCorr düğmesine tıklayın.
- Ana HD penceresinin vs Time sekmesi, DFL sinyalinin gerçek zamanlı olarak zamana karşı işlevini sunar; Bu işlevin taban çizgisi seviyesi belirleme için kullanılacak parçalarını seçin ve daha sonraki hesaplamalar için temas modeline uyun.
- Programın ana penceresinde tarama noktası değerini 256 x 256 olarak ayarlayın. Tarama Hızını 0,2 Hz olarak ayarlayın ve örneği taramak için Çalıştır düğmesine tıklayın.
- Tarama durduktan sonra, geri bildirim döngüsünü kapatmak için ana pencerenin üstündeki Açık düğmesine tıklayın.
- Açılır menüden Kişi modunu seçin, Yaklaşım sekmesini açın ve örnekten geri çekmek için Kaldır düğmesine tıklayın.
- Analiz yazılımını açmak ve çıktıyı kaydetmek için Veri düğmesine tıklayın.
- Ölçüm gününün sonunda, konsol ucu tutucuyu kafadan çıkarın ve birkaç kez ultra saf suyla dikkatlice durulayın. Her seferinde suyu hassas bir mendille çıkarın.
4. Veri değerlendirme ve işlem sonrası
NOT: Otomatik olarak hesaplanan elastik modül değerlerine güvenmeyin. Yüzeyin yüksekliği büyük ölçüde değiştiğinden, birçok artefakt eğrisi dışarı atılmalıdır.
- Kaydedilen dosyayı analiz yazılımında açın.
- HDForceVolume çerçevesini seçin.
- Ctrl tuşunu basılı tutun ve aynı tarama yönünde elde edilen bir görsel kare seçin. Hücre duvarlarının nerede olduğunu görmek için Dış Haritayı Yükle düğmesine tıklayın.
NOT: Herhangi bir sinyal haritası görsel bir çerçeve olarak kullanılabilir, ancak DFL sinyal haritasını kullanmak (farklı cihazlar bunu sapma sinyali veya hata sinyali olarak adlandırabilir) en kolay yol olabilir. - Ana sekmede InvOptSens (IOS) ve konsol Sertlik değerlerini kontrol edin.
- Ek sekmesini açın ve uç parametrelerini ve temas modelini kontrol edin.
- Görsel çerçevedeki hücre duvarlarındaki çeşitli noktalara tıklayın ve yalnızca model tarafından iyi tanımlanmış eğrileri seçin. Ayrıntılar için Temsili Sonuçlar'a bakın.
- Elde edilen değerleri yazın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tipik elastik modül ve DFL haritalarının yanı sıra çavdar ve mısır köklerinde açıklanan yöntemle elde edilen kuvvet eğrileri Şekil 2'de sunulmuştur. Şekil 2A, çavdar birincil kökünün enine kesitinde elde edilen elastik modül ve DFL haritalarını göstermektedir. Modül haritasındaki beyaz alanlar (Şekil 2A, sol), tarayıcının z yönünde sınırına ulaşması nedeniyle Young modülünün hatalı bir şekilde abartılmasına karşılık gelir. Bu görüntü, tatmin edici kuvvet eğrilerinin daha fazla seçimi için harici bir harita olarak kullanılmak üzere uygun değildir. Sağda sunulan DFL sinyal haritası (sapma/hata haritası) (Şekil 2A) bu amaç için daha uygundur.
Mısır kökünün enine ve boyuna kesitlerinin modül haritaları Şekil 2B,C'de gösterilmiştir. Numunenin altına ulaşmaya çalışırken tamamen genişletilmiş olan tarayıcı, hatalı ölçümlere ve hatta kesintiye uğramış taramalara neden olabilir (Şekil 2C'nin üst kısmı). Bazen, temas modunda iyi bir tarama yaptıktan sonra, cihaz aniden tarayıcıyı tamamen daraltır ve kuvvet-ses moduna geçtiğinde maksimum z yönü sınırına ulaştığı konusunda alarm verir. Bu, numunenin düzgün bir şekilde hareketsiz hale getirilmediği ve yukarı doğru yüzdürülmediği anlamına gelir. Yeni bir örnek hazırlanmalıdır.
Agaroz kontaminasyonu da yeni bir numune hazırlamak için bir neden olabilir (Şekil 2D, E). Agaroz varlığı, temas modunda ilk tarama yapılırken kontrol edilebilir (adım 3.5). İdeal olarak, hücre duvarları ve bazı hücre dipleri bu tür taramalarda görünür olmalıdır (Şekil 2D); Bununla birlikte, yanlış hareketsizlik durumunda, yüzey örnek topografyayı maskeleyen agaroz (Şekil 2E) ile kaplanabilir.
Şekil 2F, aynı hücre duvarının farklı noktalarında kaydedilen dört farklı kuvvet eğrisini göstermektedir. 1. Noktada kaydedilen eğri taban çizgisi göstermez. Bu, konsol ucunun hücre duvarından ayrılmadığı anlamına gelir. Bu eğriden hesaplanan modül abartılmıştır. 3. Noktada kaydedilen eğri, yaklaşan kısımda bir omuz göstermektedir. Bu artefakt, hücre duvarının büküldüğünü gösterebilir. 1. ve 3. Noktalarda kaydedilen her iki eğri de dışarı atılmalıdır. Nokta 2 ve 4, benzer moduli değerlerine sahip tatmin edici kuvvet eğrileri gösterir. Uygun eğrileri ayırt etmek için aşağıdaki kriterler kullanılabilir: (i) taban çizgisi seviyesi, eğrinin hem yaklaşan hem de geri çekilen kısımlarında belirgin olmalıdır; (ii) omuzlar veya arızalar gibi düzensizlikler olmamalıdır (sırasıyla eğimin ortasında sabit kuvvet değerleri ve kuvvet değerlerinde ani bir düşüş olarak görünür); (iii) seçilen model eğriye iyi uymalıdır. Seçilen tüm eğriler için, uygulanan maksimum kuvvet değerleri benzer olmalıdır. Beklenen değerden önemli ölçüde daha yüksek veya daha düşük olan maksimum uygulanan kuvvet, eğri tahliyesi için bir kriter olarak da kullanılabilir. Düşük kaliteli eğrileri atmak için sinir ağlarını kullanmak19 , sonuçların işlenmesini hızlandırabilir.
Şekil 1: Numune hazırlamada kritik adımlar . (A) Bir agaroz bloğuna gömülmüş ve vibratom aşamasına monte edilmiş kök parçası. (B) %1 agaroz tabakasının üzerine yerleştirilen ve Petri kabı kapağında ilave agaroz ile hareketsiz hale getirilen numune bölümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Birincil kökler üzerindeki tipik AFM görüntüleri ve ölçümleri . (A) Çavdar kökünün enine bir bölümünün elastikiyet modülü ve DFL haritaları. Mısır kökünün uzunlamasına ve enine kesitlerinde elde edilen elastikiyet modülünün tam olarak kaydedilmiş (B) ve kesilmiş (C) haritaları. Mısır köklerinin temiz (D) ve agaroz kaplı (E) bölümlerinin 3D görünümü. (F) Mısır kökünün enine bir bölümünün DFL haritası. Hücre duvarındaki 1-4 numaralı noktalar, görüntünün sağ tarafında sunulan kuvvet eğrilerinin kaydedildiği konumları gösterir. Kırmızı çizgi yaklaşmak içindir, mavi çizgi geri çekilmek içindir ve siyah çizgi temas mekaniği modeline uyduğunu gösterir. 1. ve 3. noktalarda kaydedilen eğriler artefaktlara sahiptir ve hesaplamalar için kullanılamaz. Çavdar kökleri keskin uçlarla, mısır kökleri ise küresel uçlarla incelenmiştir. Kısaltmalar: Rhiz = rhizodermis, Exo = exodermis, OC = dış korteks, IC = iç korteks, End = endodermis, Per = pericycle ve VP = vasküler parankim. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birincil hücre duvarlarının mekanik özellikleri, bitki hücresi büyümesinin yönünü ve hızını ve dolayısıyla bitkinin gelecekteki boyutunu ve şeklini belirler. Burada sunulan AFM tabanlı yöntem, bitki hücre duvarlarının özelliklerini incelemek için kullanılan mevcut teknikleri tamamlamaktadır. Bitkinin iç dokularına ait olan hücre duvarlarının elastikiyetinin araştırılmasını sağlar. Sunulan yöntem kullanılarak, büyüyen mısır kökünün farklı dokularındaki hücre duvarlarının mekanik özellikleri haritalandırıldı ve bu özelliklere dayanarak matematiksel bir model oluşturuldu6. Simüle edilen kök, turgoru taklit eden basınç uygulamasına doğrusal boyuttaki değişikliklerle yanıt verdi. Bu değişiklikler, plazmolize edici ortam6'da taze eksize edilmiş bir kök tarafından sergilenenlerle aynı aralıkta ve ters yöndeydi.
Numune hazırlama bu protokol için kritik öneme sahiptir. Tüm hazırlık boyunca numunenin kurumasından kaçınılmalıdır. Kesitlenecek bitki materyalinin doğru yerleştirilmesi önemli bir konudur; hücre duvarları, gelecekteki tarama düzlemine kesinlikle dik olarak yönlendirilmelidir. Aksi takdirde, hücre duvarı büküldüğü veya büküldüğü için tatmin edici olmayan kuvvet-deformasyon eğrileri elde edilecektir. Agaroz gömülü bölüm ek agaroz ile sıkıca sabitlenmelidir (Şekil 2B). İkincisi numuneye girmemelidir, aksi takdirde agaroz özellikleri ölçülecektir. Bu protokolün en önemli kısmı, ortaya çıkan kuvvet eğrilerini filtrelemektir. AFM kalibrasyon ızgaraları gibi model nesnelerini incelemek bile, hatalı kuvvet-deformasyon eğrilerinin önemli bir kısmına neden olabilir22. Altta yatan kuvvet-deformasyon eğrilerini analiz etmeden hesaplanan modül değerlerinin doğrudan kullanımı yanlış sonuçlara yol açabilir (Şekil 2F).
Teknik, hücrenin lokalizasyonu veya bitki organlarının büyüklüğü ile sınırlı değildir. Bununla birlikte, çok küçük nesnelerin kesilmesi, yönlendirilmesi ve hareketsiz hale getirilmesi zordur. Büyük lümenli hücrelerle çalışmak zordur, çünkü tarama kesintisi olasılığı yüksektir (Şekil 2C).
Bir vibratom ile hazırlanan sabit olmayan bitki bölümlerinin kullanılmasının tüm faydaları ile en az iki önemli konu vardır: bitki materyalini kestikten sonra bir stres reaksiyonu geliştirme olasılığı ve malzemenin kesilmiş hücre duvarlarından kısmi çözünmesi olasılığı. Her ikisi de hücre duvarlarının bileşiminde ve özelliklerinde değişikliklere yol açabilir. Kesik üzerinde anında stres yanıtının varlığı Arabidopsis apices 10 üzerinde test edildi. Gözlenen özellikler üzerinde anlamlı bir etki bildirilmemiştir. Sudaki inkübasyonları sırasında kesilmiş hücre duvarlarının özelliklerindeki değişiklikleri test etmek için deneyler yapılmıştır19. En az yarım saatlik bir süre boyunca mısır kökünün aynı duvarında ölçülen Young'ın modül değerlerinde istikrarlı bir eğilim yoktu19. Bununla birlikte, deneylerin süresini mümkün olduğunca kısa tutmak ve numunenin suda inkübasyonu sırasında her bir numuneyi bu tür değişiklikler için kontrol etmek daha iyidir.
AFM, bitki hücre duvarlarını incelemek için güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte, elastikiyet modülü, sertlik ve yapışma hesaplamalarının, bitki hücre duvarları tarafından yerine getirilmeyen çeşitli varsayımlara dayandığı açıktır. AFM tarafından kullanılan tüm temas mekaniği modelleri, araştırılan örneği, bitki hücre duvarları için doğru olmayan izotropik malzemenin sonsuz bir yarı alanı olarak kabul eder. Aynı zamanda, girintinin geometrisinin ve özelliklerinin konsol ömrü boyunca doğru bir şekilde ölçüldüğü ve sabit olduğu varsayılmaktadır, bu da hatalı olabilir. Ek olarak, bitki hücre duvarları elastik, viskoelastik ve plastik bileşenleri içeren karmaşık mekanik davranış sergiler ve genellikle bunlardan sadece biri tek bir deneyde ölçülebilir. Bununla birlikte, AFM tabanlı yöntemler kullanılarak elde edilen veriler, çeşitli organ ve türlerdeki bitki hücresi büyümesi ve mekanik performans ile güvenilir bir şekilde ilişkilidir 3,4,5,6. Bütün bunlar, hem tekniğin kendisinin hem de onunla elde edilen verilerin anlaşılmasının geliştirilebileceği anlamına gelir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Dr. Dmitry Suslov'a (Saint Petersburg Devlet Üniversitesi, Saint Petersburg, Rusya) ve Prof. Mira Ponomareva'ya (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Rusya) sırasıyla mısır ve çavdar tohumu sağladıkları için teşekkür ederiz. Sunulan yöntem, LK'ya verilen 18-14-00168 sayılı Rus Bilim Vakfı Projesi çerçevesinde geliştirilmiştir. Çalışmanın bir kısmı (sunulan sonuçların elde edilmesi), RAS FRC Kazan Bilim Merkezi için hükümet görevinin mali desteğiyle AP tarafından gerçekleştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al.
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
