Summary
Studier av cellväggsbiomekanik är viktiga för att förstå växttillväxt och morfogenes. Följande protokoll föreslås för att undersöka tunna primära cellväggar i de inre vävnaderna hos unga växtorgan med hjälp av atomkraftmikroskopi.
Abstract
De mekaniska egenskaperna hos de primära cellväggarna bestämmer riktningen och hastigheten för växtcelltillväxt och därmed växtens framtida storlek och form. Många sofistikerade tekniker har utvecklats för att mäta dessa egenskaper; atomkraftmikroskopi (AFM) är dock fortfarande den mest praktiska för att studera cellväggselasticitet på cellulär nivå. En av de viktigaste begränsningarna med denna teknik har varit att endast ytliga eller isolerade levande celler kan studeras. Här presenteras användningen av atomkraftmikroskopi för att undersöka de mekaniska egenskaperna hos primära cellväggar som tillhör de inre vävnaderna i en växtkropp. Detta protokoll beskriver mätningar av den uppenbara Youngs modul av cellväggar i rötter, men metoden kan också tillämpas på andra växtorgan. Mätningarna utförs på vibratom-härledda delar av växtmaterial i en flytande cell, vilket gör det möjligt att (i) undvika användning av plasmolyserande lösningar eller provimpregnering med vax eller harts, (ii) göra experimenten snabba och (iii) förhindra uttorkning av provet. Både antikliniska och perikliniska cellväggar kan studeras, beroende på hur provet sektionerades. Skillnader i de mekaniska egenskaperna hos olika vävnader kan undersökas i en enda sektion. Protokollet beskriver principerna för studieplanering, problem med provberedning och mätningar, samt metoden för att välja kraftdeformationskurvor för att undvika påverkan av topografi på de erhållna värdena för elastisk modul. Metoden är inte begränsad av provstorlek utan är känslig för cellstorlek (dvs celler med stor lumen är svåra att undersöka).
Introduction
De mekaniska egenskaperna hos växtcellväggen bestämmer cellens form och dess förmåga att växa. Till exempel är pollenrörets växande spets mjukare än de icke-växande delarna av samma rör1. Primordiabildningen på Arabidopsis meristem föregås av en lokal minskning av cellväggsstyvheten på platsen för det framtida primordium 2,3. Cellväggarna i Arabidopsis hypocotyl, som är parallella med huvudtillväxtaxeln och växer snabbare, är mjukare än de som är vinkelräta mot denna axel och växer långsammare 4,5. I majsroten åtföljdes övergången av celler från delning till förlängning av en minskning av elastisk moduli i alla vävnader i roten. Moduli förblev låg i förlängningszonen och ökade i den sena förlängningszonen6.
Trots tillgången på olika metoder jämförs sällan de stora uppsättningarna av biokemisk och genetisk information om cellväggsbiologi som erhålls årligen med cellväggarnas mekaniska egenskaper. Till exempel har mutanter på cellväggsrelaterade gener ofta förändrad tillväxt och utveckling 4,7,8, men beskrivs sällan i termer av biomekanik. En av anledningarna till detta är svårigheten att genomföra mätningar på cellulär och subcellulär nivå. Atomkraftsmikroskopi (AFM) är för närvarande den primära metoden för sådana analyser9.
Under de senaste åren har många AFM-baserade studier på växtcellväggsbiomekanik genomförts. De mekaniska egenskaperna hos cellväggarna i de yttre vävnaderna i Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 och lök 12, liksom hos odlade celler13,14,15, har undersökts. De ytliga cellerna i en växt kan emellertid ha cellväggar vars mekaniska egenskaper skiljer sig från de inre vävnaderna6. Dessutom trycksätts växtceller av turgor vilket gör dem styvare. För att bli av med påverkan av turgortrycket måste forskare använda plasmolyserande lösningar 2,3,4,5,10,11 eller sönderdela de erhållna värdena i turgor- och cellväggsbidrag 12. Det första tillvägagångssättet leder till provuttorkning och ändrar cellväggens tjocklek och egenskaper16, medan det andra tillvägagångssättet kräver ytterligare mätningar och komplicerad matematik och endast gäller celler med relativt enkel form12. Cellväggsegenskaperna hos inre vävnader kan utvärderas på kryosektioner17 eller delar av växtmaterial impregnerat med harts8. Båda metoderna innebär dock uttorkning och/eller impregnering av prover, vilket oundvikligen leder till förändringar i egenskaper. Egenskaperna hos isolerade eller odlade celler är svåra att relatera till hela växtens fysiologi. Både odling och isolering av växtceller kan påverka de mekaniska egenskaperna hos deras cellväggar.
Metoden som presenteras här kompletterar de ovan nämnda tillvägagångssätten. Med hjälp av det kan de primära cellväggarna i vilken vävnad som helst och vid varje stadium av växtutveckling undersökas. Sektionering och AFM-observationer utfördes i vätska som undviker uttorkning av provet. Problemet med turgor löstes när cellerna skärs. Protokollet beskriver arbete med majs- och rågrötter, men alla andra prover kan undersökas om det är lämpligt för vibratomsektionering.
AFM-studierna som beskrivs här utfördes med hjälp av kraftvolymtekniken. Olika instrument använder olika namn för denna metod. Grundprincipen är dock densamma; En kraftvolymkarta över provet erhålls genom en sinusformad eller triangulär rörelse av utskjutaren (eller provet) för att uppnå en viss belastningskraft vid varje analyserad punkt, samtidigt som den utskjutande böjningen18 registreras. Resultatet kombinerar en topografisk bild av ytan och uppsättningen kraftavståndskurvor. Varje kurva används för att beräkna deformation, styvhet, Youngs modul, vidhäftning och energiavledning vid en specifik punkt. Liknande data kan erhållas genom punkt-för-punkt-kraftspektroskopi efter skanning i kontaktläge19, även om det är mer tidskrävande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provberedning för AFM-mätningar
- Växtmaterial: Sterilisera frön av majs (Zea mays L.) och råg (Secale cereale L.) med en 0,35% NaOCl-lösning i 10 min, tvätta 3x med destillerat vatten och växa sedan hydroponiskt i mörkret vid 27 ° C i 4 dagar respektive 2 dagar. Primära rötter användes för experimentet.
- Beredning av lösningar och prov för vibratomsektionering
- Förbered agaroslösning för rotinbäddning genom att lösa upp 3% (w / w) lågsmältpunktsagaros i vatten med en mikrovågsugn.
OBS: Alla experiment utfördes i vatten. Om buffert eller någon annan typ av medium krävs för studien är det bättre att använda samma medium för agarosberedning, under sektionering och i vätskecellen i AFM för att undvika att skada provet. - Häll ett 4 mm lager smält 3% agaros på botten av petriskålen (diameter = 35 mm) och låt det svalna något för att förhindra termisk skada på provet.
- Placera tre eller fyra små bitar (ca 5 mm långa) av det studerade växtorganet horisontellt på agarosen.
OBS: Proverna ska vara halvt nedsänkta men inte nedsänkta i agarosskiktet. Om provet inte är nedsänkt kan det bryta ut ur agarosen under vibratomsektionering. Om provet sjunker till botten kommer det att vara för nära sektionens kant och bli obekvämt för ytterligare steg. - När en tunn, halvfast film visas ovanpå det första lagret av agaros (30-60 s), häll försiktigt ett andra lager ovanpå.
OBS: Det nedre lagret av agaros bör inte stelna helt. Annars kan de två skikten separeras från varandra under vidare arbete. - När agarosen är helt stelnad, skär ut blocket som innehåller provet. Forma blocket till en sexkantig stympad pyramid för att säkerställa dess stabilitet under ytterligare sektionering (figur 1A).
OBS: Provet kan orienteras vertikalt eller horisontellt inom detta block beroende på vilken typ av sektion som krävs. När du förbereder blocket, lämna 2-3 mm agaros runt provet. I detta fall kommer provsektionen att behållas av skiktet av 3% agaros, vilket underlättar dess ytterligare immobilisering (Figur 1B).
- Förbered agaroslösning för rotinbäddning genom att lösa upp 3% (w / w) lågsmältpunktsagaros i vatten med en mikrovågsugn.
- Sektionering av provet med vibratomen
- Limma blocket på vibratomsteget med cyanoakrylatlim. Placera scenen i vibratomen så att ett av pyramidhörnen vetter mot vibratomens blad. Häll vatten i vibratombadet.
- Ställ in sektionsparametrarna (sektionstjocklek, bladhastighet och vibrationsfrekvens) och skär provet.
OBS: Använd sektionstjocklekarna mellan 200 och 400 μm. En sektion som är för tunn kan medföra fel vid utvärderingen av mekaniska egenskaper, medan en sektion som är för tjock är benägen att gå sönder. En bladhastighet på 1,3 mm·s-1 och en svängningsfrekvens på 90 Hz användes för råg- och majsrötter. - Använd en fin borste, flytta sektionen från vattenbadet till en glasskiva och placera en droppe vatten på sektionen för att förhindra att den torkar ut. Kontrollera kvaliteten på sektionen under ett ljusmikroskop.
OBS: Sneda sektioner kan inte användas för att mäta elasticitetsmodulen. Cellväggar måste vara vinkelräta mot sektionsplanet, annars kan de böjas eller spännas under AFM-spetsen.
- Immobilisering av sektionen för AFM-mätningar (figur 1B)
- Häll ett lager smält 1% (w / w) agaros (~ 1 ml) på botten av petriskålens lock med en pipett.
OBS: Se till att sidorna på petriskålens lock inte hindrar spetsen från att närma sig provet. Agarosskiktet ska vara 1 mm tjockt och ska täcka hela botten av locket. - När 1% agarosen har stelnat, ta bort överflödigt vatten från sektionen genom att föra filterpapper till kanten.
OBS: Rör inte växtdelen med papperet för att undvika skador och fullständig torkning av provet. - Överför försiktigt sektionen från bilden till mitten av petriskålens lock med en borste. Använd en pipett på 20 μL och tillsätt försiktigt 1 % agaros runt sektionen (figur 1B).
OBS: 1% agarosen ska inte komma på själva provet. Det bör bara täcka kanterna på 3% agarosskiktet som behåller växtprovet. 1% agarosen bör bilda små knollar på kanterna av detta 3% agarosskikt. Stora knollar kan hindra cantilever från att närma sig provet. - Häll vattnet eller annan lösning som ska användas för AFM i petriskålens lock med den immobiliserade sektionen.
- Häll ett lager smält 1% (w / w) agaros (~ 1 ml) på botten av petriskålens lock med en pipett.
2. AFM-förberedelse och kalibrering
OBS: Kraftvolymmetoden för AFM genererar en rumsligt upplöst uppsättning kraftavståndskurvor erhållna vid varje punkt i det studerade området. Hämta alla parametrar för kraftvolymläget (utskjutande styvhet, IOS, etc.) i kontaktläge. Liknande förfaranden för instrument från andra tillverkare har tidigare beskrivits10,20.
- Välj lämplig typ av cantilever.
OBS: Den utskjutande styvheten måste vara jämförbar med provstyvheten21. En cantilever som är mycket styvare än provet kommer inte att avböja mycket, medan en cantilever som är för mjuk inte kommer att deformera provet tillräckligt. En typisk resonansfrekvens bör vara tillräcklig för att svänga utskjutaren i vätskan (dvs. vara minst några tiotals kHz). Kontaktytan bör vara liten jämfört med cellväggens storlek eftersom provet som studeras i Youngs modulberäkningar antas vara ett oändligt halvrum. Följande cantilevers användes för råg- och majsrötter: skarpa cantilevers med en typisk resonansfrekvens på 60 kHz, en genomsnittlig fjäderkonstant på 1,5 N · m-1 och en toppradie på 10 nm, eller sfäriska cantilevers med en typisk resonansfrekvens på 75 kHz, en genomsnittlig fjäderkonstant på 2,8 N · m-1, och en toppradie på 150 nm. - Slå på AFM-enheten och tillhörande programvara (materialtabell). Montera cantilever på spetshållaren för vätskecellen. Placera en droppe vätska på spetsen för att undvika att luftbubblor bildas på spetsen medan du sänker ner den i vätskan.
OBS: Vid bubbelbildning kan vätskan avlägsnas med en precisionstorkning och sedan kan en ny droppe placeras. - Montera spetshållaren på skanningshuvudet.
- Lägg ett hårt prov (färskt glas) i en petriskålslock. Häll vätskan i den och se till att den täcker bilden. Placera skanningshuvudet på scenen och lyft upp provet så att vätskan täcker cantileveren.
- Välj fliken Huvuden i rullgardinsmenyn Verktyg . Se till att skanningshuvudet för vätskecellen är valt.
- Klicka på siktknappen för att öppna fönstret Lasersikte . Klicka på kameraknappen för att öppna fönstret Optiskt mikroskop . Placera lasern vid spetsen av cantileveren med skruvarna på AFM-huvudet och det optiska mikroskopfönstret för orientering.
- Välj Semicontact-läget från rullgardinsmenyn i programmets huvudfönster.
- Öppna fliken Resonans och välj vilken typ av utskjutare som ska användas i menyn Prober . Klicka på Auto-knappen för att bestämma resonansfrekvensen.
OBS: Om den fribärande produkten som används inte finns med i listan öppnar du Verktyg > Probe Passport. Skapa en ny fil, ange cantilever-parametrarna och spara den. Välj sedan det i Probes rullgardinsmenyn . - Välj kontaktläge från rullgardinsmenyn i programmets huvudfönster.
- Klicka på knappen N_Force Cal för att öppna cantilever kalibreringsfönstret. Välj den cantilever som används och klicka på Sweep-knappen och sedan Spect Meas-knappen för att bestämma cantileverfjäderkonstanten med hjälp av termisk inställningsprocedur. Stäng fönstret.
- Ställ in börvärdet på 1 nA. Öppna fliken Tillvägagångssätt och klicka på landningsknappen för att närma dig exemplet.
- Öppna fliken Skanning . Ställ in skanningshastigheten till 0,5 Hz. Klicka på knappen Område och ställ in skanningsstorleken till 10 μm x 10 μm och skanningspunkten till 256 x 256. Klicka på knappen Kör och skanna cirka 20 linjer för att kontrollera att det inte finns någon förorening på glaset. Klicka på Sluta för att avsluta skanningen utan att förlora data.
- Öppna fliken Kurvor . Ställ in parametrar för indragning och tillvägagångssätt till 500 nm respektive -100 nm.
- Välj den senaste skanningen i rullgardinsmenyn Välj ram för att observera ytan.
- Hitta ett rent område på glaset och ange den punkt där kraftdeformationskurvan ska tas och klicka på knappen Kör för att få kurvan. Spela in tre till fem kraftkurvor på olika platser på skanningen.
- Klicka på knappen Data för att öppna analysfönstret och välj ramen med kraftdeformationskurvan.
- Klicka på knappen Parmarkörer och ange den linjära delen av indragningskurvan för att beräkna förhållandet mellan DFL-signalen och förskjutningen, vilket är den inversa optiska känsligheten (IOS, nA nm-1) eller avböjningskänsligheten.
- Upprepa steg 2.17 för alla inspelade kurvor och skriv ner alla beräknade värden för DFL-signalen till förskjutningsförhållandet. De borde vara desamma.
- Stäng analysfönstret, klicka på fliken Tillvägagångssätt och sedan på knappen Ta bort för att dra tillbaka sonden från provet.
3. Insamling av uppgifter
- Styr provet under AFM-utskjutaren med hjälp av det optiska mikroskopet. Klicka på fliken Tillvägagångssätt och sedan på landningsknappen för att närma sig exemplet i kontaktläge med börvärdet 1 nA.
- Klicka på fliken Skanning och sedan på knappen Område . Välj areastorleken 70 μm x 70 μm för att skanna.
- Klicka på knappen Flytta sond och kontrollera hela skanningsområdet genom att flytta skannern över den. Baserat på graden av skannerutsprång, hitta den högsta punkten.
- Öppna fliken Tillvägagångssätt och klicka sedan på knappen Ta bort för att dra tillbaka från exemplet. Använd den högsta punkten som mål och klicka på landningsknappen för att närma dig provet igen. Kontrollera sedan ytan igen genom att klicka på knappen Flytta sond och flytta skannern över den. Ingen av punkterna i området bör kräva att skannern höjs helt.
OBS: Helst bör skannerns z-intervall överstiga provets höjdskillnad. Det är dock acceptabelt om vissa punkter på skanningsområdet ligger under skannerns kapacitet. Samtidigt borde det inte finnas många sådana punkter. Stora områden som inte kan nås av skannern kan orsaka skanningsabort. - Ställ in skanningshastigheten till 0,5 Hz. Ställ in skanningsstorleken på 70 μm x 70 μm och skanningspunkten till 64 x 64. Klicka på knappen Kör och skanna för att kontrollera provets yta och dess eventuella förorening med agaros.
OBS: Om provet har celler med ett stort lumen kan storleken på skanningsområdet minskas, eller så bör det flyttas så att det finns fler cellväggar på skanningen. - Klicka på On-knappen högst upp i huvudfönstret för att stänga av feedbackslingan.
- Välj HDPlus-läge (kraftvolymmetod) i rullgardinsmenyn i programmets huvudfönster. Ett extra fönster (HD-fönster) visas.
- Ställ in SetPoint på 0,1 nA i huvudprogramfönstret.
- På huvudfliken i HD-fönstret ställer du in skanningsparametrarna (amplitud och frekvens av sinusformad cantileverrörelse) som är lämpliga för det studerade provet.
OBS: Varje typ av prov och cantilever kräver val av skanningsparametrar. Vissa preliminära experiment är nödvändiga. För majs- eller rågrötter användes skarpa och sfäriska cantilevers vid en amplitud av 400 nm och en frekvens av 300 Hz. - Öppna fliken Ljud i HD-fönstret och ange resonansfrekvensen för cantileveren.
- Öppna fliken Quant i HD-fönstret och ange IOS, cantilever Stiffness och spetsradie och vinkel. Välj den kontaktmodell som ska användas för beräkningar beroende på spetsgeometri.
OBS: DMT-modellen tar hänsyn till den vidhäftningskraft som finns mellan sonden och provet och används oftast i mekanobiologi21. - Öppna fliken Skanna i HD-fönstret och välj de signaler som ska spelas in. Välj i vilken riktning signalen spelas in. Markera rutan Tvinga volym för att få ett register över alla kraftkurvor.
OBS: Registrera elasticitetsmodulsignalen i både framåt- och bakåtriktning. Det kommer att ge fler poäng att beräkna. - Klicka på Av-knappen högst upp i huvudprogramfönstret för att slå på feedbackslingan.
- Klicka på PhaseCorr-knappen i HD-huvudfönstret för att korrigera känsligheten hos det optiska systemet.
- Fliken vs Tid i HD-huvudfönstret visar funktionen för DFL-signalen kontra tiden i realtid; Välj de delar av den här funktionen som ska användas för bestämning av baslinjenivå och för att passa kontaktmodellen för ytterligare beräkningar.
- Ställ in skanningspunktvärdet till 256 x 256 i programmets huvudfönster. Ställ in skanningshastigheten till 0,2 Hz och klicka på knappen Kör för att skanna provet.
- När skanningen har stoppats klickar du på På-knappen högst upp i huvudfönstret för att stänga av återkopplingsslingan.
- Välj kontaktläge i rullgardinsmenyn, öppna fliken Tillvägagångssätt och klicka på knappen Ta bort för att dra tillbaka från provet.
- Klicka på knappen Data för att öppna analysprogramvaran och spara utdata.
- I slutet av mätdagen, ta bort cantilever spetshållaren från huvudet och skölj den försiktigt med ultrarent vatten flera gånger. Ta bort vattnet varje gång med en precisionstorkning.
4. Utvärdering och efterbehandling av data
OBS: Lita inte på elastiska modulvärden som beräknas automatiskt. Eftersom ytan varierar mycket i höjd bör många artefaktkurvor utvisas.
- Öppna den sparade filen i analysprogramvaran.
- Välj HDForceVolume-ramen .
- Håll ner Ctrl-tangenten och välj en visuell ram som erhållits i samma skanningsriktning. Klicka på knappen Ladda extern karta för att se var cellväggarna finns.
OBS: Vilken signalkarta som helst kan användas som en visuell ram, men att använda DFL-signalkartan (olika instrument kan hänvisa till den som en avböjningssignal eller felsignal) kan vara det enklaste sättet. - Kontrollera värdena för InvOptSens (IOS) och cantilever Stiffness på fliken Huvud .
- Öppna fliken Ytterligare och kontrollera tipsparametrarna och kontaktmodellen.
- Klicka på olika punkter på cellväggarna på den visuella ramen och välj bara de kurvor som beskrivs väl av modellen. Se Representativa resultat för mer information.
- Skriv ner de erhållna värdena.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiska elastiska modul- och DFL-kartor, liksom kraftkurvor erhållna på råg- och majsrötter med den beskrivna metoden, presenteras i figur 2. Figur 2A visar elastisk modul och DFL-kartor erhållna på den tvärgående delen av rågens primära rot. De vita områdena i modulkartan (figur 2A, vänster) motsvarar en felaktig överskattning av Youngs modul på grund av att skannern når sin gräns i z-riktningen. Denna bild är inte lämplig att användas som en extern karta för ytterligare val av tillfredsställande kraftkurvor. DFL-signalkartan (avböjnings-/felkarta) som presenteras till höger (figur 2A) är bättre lämpad för detta ändamål.
Modulkartorna över tvärgående och längsgående sektioner av majsroten visas i figur 2B,C. Skannern som har förlängts helt när du försöker nå botten av provet kan resultera i felaktiga mätningar och till och med avbrutna skanningar (övre delen av figur 2C). Ibland, efter att ha fått en bra skanning i kontaktläge, drar instrumentet plötsligt ihop skannern helt, vilket är alarmerande att den har nått den maximala z-riktningsgränsen när den växlar till kraftvolymläget. Det betyder att provet inte immobiliserades ordentligt och flöt upp. Ett nytt prov bör beredas.
Agaroskontamineringen kan också vara en anledning att förbereda ett nytt prov (figur 2D,E). Agarosnärvaron kan kontrolleras när du får den första skanningen i kontaktläget (steg 3.5). Helst bör cellväggarna och vissa cellbottnar vara synliga på sådana skanningar (figur 2D); Vid felaktig immobilisering kan dock ytan täckas med agaros (figur 2E), som maskerar provtopografin.
Figur 2F visar fyra olika kraftkurvor registrerade vid olika punkter i samma cellvägg. Kurvan som registrerats vid punkt 1 visar ingen baslinje. Det betyder att det inte fanns någon separation av cantileverspetsen från cellväggen. Modulen som beräknades från denna kurva överskattades. Kurvan som registrerats vid punkt 3 visar en axel på den annalkande delen. Denna artefakt kan indikera att cellväggen var böjd. Båda kurvorna som registrerats vid punkterna 1 och 3 bör utvisas. Punkterna 2 och 4 visar tillfredsställande kraftkurvor med liknande värden för moduli. Följande kriterier kan användas för att urskilja korrekta kurvor: i) Referensnivån bör vara tydlig på både annalkande och indragna delar av kurvan. ii) Det bör inte förekomma några oegentligheter såsom axlar eller fel (visas som konstanta kraftvärden respektive en plötslig minskning av kraftvärdena i mitten av lutningen). iii) Den valda modellen ska passa kurvan väl. För alla valda kurvor bör de maximala applicerade kraftvärdena vara likartade. En maximal applicerad kraft som är betydligt högre eller lägre än det förväntade värdet kan också användas som ett kriterium för kurvutdrivning. Att använda neurala nätverk för att kasta kurvor av dålig kvalitet19 kan påskynda bearbetningen av resultat.
Figur 1: Kritiska steg i provberedningen . (A) Rotfragment inbäddat i ett block av agaros och monterat på vibratomstadiet. (B) Provsektion placerad ovanpå ett lager av 1% agaros och immobiliserad med ytterligare agaros i en petriskål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Typiska AFM-bilder och mätningar på primära rötter . (A) Elasticitetsmodul och DFL-kartor över en tvärgående sektion av rågroten. Fullständigt registrerade (B) och avbrutna (C) kartor över elasticitetsmodul som erhållits på längsgående och tvärgående sektioner av majsrot. 3D-vy av rena (D) och agarostäckta (E) sektioner av majsrötter. (F) En DFL-karta över ett tvärgående avsnitt av majsrot. Punkterna 1-4 på cellväggen visar positionerna där kraftkurvorna som presenteras på bildens högra sida registrerades. Den röda linjen är för att närma sig, den blå linjen är för indragning och den svarta linjen visar kontaktmekanikens modellpassning. Kurvorna som registreras vid punkterna 1 och 3 har artefakter och kan inte användas för beräkningar. Rågrötter undersöktes med skarpa spetsar och majsrötter undersöktes med sfäriska spetsar. Förkortningar: Rhiz = rhizodermis, Exo = exodermis, OC = yttre cortex, IC = inre cortex, End = endodermis, Per = pericycle och VP = vaskulär parenkym. Skalstänger = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mekaniska egenskaperna hos de primära cellväggarna bestämmer riktningen och hastigheten för växtcelltillväxt, och därmed växtens framtida storlek och form. Den AFM-baserade metoden som presenteras här kompletterar befintliga tekniker som används för att studera egenskaperna hos växtcellväggar. Det gör det möjligt att undersöka elasticiteten hos cellväggar, som tillhör växtens inre vävnader. Med hjälp av den presenterade metoden kartlades de mekaniska egenskaperna hos cellväggar i olika vävnader i den växande majsroten, och en matematisk modell konstruerades baserat på dessa egenskaper6. Den simulerade roten svarade på tillämpningen av tryck som imiterar turgor genom förändringar i linjär storlek. Dessa förändringar var i samma intervall och i motsatt riktning som de som uppvisades av en nyskuren rot i plasmolyserande medium6.
Provberedningen är avgörande för detta protokoll. Torkningen av provet bör undvikas under hela beredningen. Korrekt placering av växtmaterialet som ska sektioneras är en viktig fråga; Cellväggarna måste orienteras strikt vinkelrätt mot det framtida skanningsplanet. Annars kommer otillfredsställande kraftdeformationskurvor att erhållas eftersom cellväggen har böjts eller spänts. Den agaros-inbäddade sektionen ska vara tätt fixerad med ytterligare agaros (figur 2B). Den senare bör inte komma in på provet, annars kommer agarosegenskaperna att mätas. Den viktigaste delen av detta protokoll är att filtrera de resulterande kraftkurvorna. Även studier av modellobjekt, såsom AFM-kalibreringsnät, kan resultera i en betydande andel felaktiga kraftdeformationskurvor22. Direkt användning av de beräknade modulvärdena utan att analysera de underliggande kraftdeformationskurvorna kan leda till felaktiga slutsatser (figur 2F).
Tekniken är inte begränsad av lokaliseringen av cellen eller storleken på växtorganen. Föremål som är för små är dock svåra att klippa, orientera och immobilisera. Celler med stor lumen är svåra att arbeta med eftersom det finns stor sannolikhet för skanningsavbrott (figur 2C).
Med alla fördelar med att använda icke-fasta växtsektioner beredda med ett vibratom, finns det minst två avgörande frågor: möjligheten att utveckla en stressreaktion efter skärning av växtmaterial och möjligheten till partiell solubilisering av material från de skurna cellväggarna. Båda kan leda till förändringar i cellväggarnas sammansättning och egenskaper. Förekomsten av omedelbar stressrespons på snittet testades på Arabidopsis apices10. Ingen signifikant effekt på de observerade egenskaperna rapporterades. Experiment utfördes för att testa förändringar i egenskaperna hos skurna cellväggar under deras inkubation i vatten19. Det fanns ingen stabil trend i Youngs modulvärden uppmätta på samma vägg av majsrot under minst en halvtimme period19. Det är emellertid bättre att hålla experimenttiden så kort som möjligt och kontrollera varje prov för sådana förändringar under inkubation av provet i vatten.
AFM är en kraftfull teknik för att studera växtcellväggar. Det är emellertid uppenbart att beräkningar av elasticitetsmodul, styvhet och vidhäftning baseras på flera antaganden som inte uppfylls av växtcellväggar. Alla modeller av kontaktmekanik som används av AFM betraktar det undersökta provet som ett oändligt halvrum av isotropt material, vilket inte är sant för växtcellväggar. Samtidigt antas det att indenterens geometri och egenskaper mäts noggrant och konstant under den utskjutande livslängden, vilket också kan vara felaktigt. Dessutom uppvisar växtcellväggar komplext mekaniskt beteende som involverar elastiska, viskoelastiska och plastkomponenter, och vanligtvis kan endast en av dessa mätas i ett enda experiment. Icke desto mindre korrelerar de data som erhållits med AFM-baserade metoder tillförlitligt med växtcellens tillväxt och mekaniska prestanda i olika organ och arter 3,4,5,6. Allt detta innebär att både själva tekniken och förståelsen av de data som erhållits med den kan förbättras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill ge ett erkännande till Dr. Dmitry Suslov (Sankt Petersburg State University, Sankt Petersburg, Ryssland) och Prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Ryssland) för att tillhandahålla majs respektive rågfrön. Den presenterade metoden utvecklades inom ramen för den ryska vetenskapsstiftelsens projekt nr 18-14-00168 som tilldelades LK. Den del av arbetet (erhållande av de presenterade resultaten) utfördes av AP med ekonomiskt stöd från regeringsuppdraget för FRC Kazan Scientific Center of RAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
