Summary
세포벽 생체 역학에 대한 연구는 식물 성장과 형태 형성을 이해하는 데 필수적입니다. 다음 프로토콜은 원자력 현미경을 사용하여 젊은 식물 기관의 내부 조직에서 얇은 1 차 세포벽을 조사하기 위해 제안됩니다.
Abstract
일차 세포벽의 기계적 특성은 식물 세포 성장의 방향과 속도를 결정하므로 식물의 미래 크기와 모양을 결정합니다. 이러한 특성을 측정하기 위해 많은 정교한 기술이 개발되었습니다. 그러나 원자력 현미경 (AFM)은 세포 수준에서 세포벽 탄성을 연구하는 데 가장 편리합니다. 이 기술의 가장 중요한 한계 중 하나는 표면 또는 분리 된 살아있는 세포 만 연구 할 수 있다는 것입니다. 여기에서는 식물체의 내부 조직에 속하는 일차 세포벽의 기계적 특성을 조사하기 위해 원자력 현미경을 사용합니다. 이 프로토콜은 뿌리의 세포벽의 명백한 영률 측정을 설명하지만이 방법은 다른 식물 기관에도 적용될 수 있습니다. 측정은 액체 셀에서 식물 재료의 비브라톰 유래 절편에서 수행되므로 (i) 플라즈마 분해 용액의 사용 또는 왁스 또는 수지 샘플 함침을 피하고 (ii) 실험을 빠르게 수행하며 (iii) 샘플의 탈수를 방지 할 수 있습니다. 항음핵 세포벽과 주위 세포벽 모두 표본이 어떻게 절편되었는지에 따라 연구할 수 있습니다. 다른 조직의 기계적 특성의 차이는 단일 섹션에서 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구 계획의 원리, 시편 준비 및 측정 문제, 얻은 탄성 계수 값에 대한 지형의 영향을 피하기 위해 힘 변형 곡선을 선택하는 방법을 설명합니다. 상기 방법은 샘플 크기에 의해 제한되지 않지만, 세포 크기에 민감하다(즉, 큰 내강을 갖는 세포는 검사하기 어렵다).
Introduction
식물 세포벽의 기계적 성질은 세포의 모양과 성장 능력을 결정합니다. 예를 들어, 꽃가루 튜브의 성장 팁은 동일한 튜브1의 성장하지 않는 부분보다 부드럽습니다. Arabidopsis 분열 조직의 원시 형성은 미래의 원시 2,3 부위에서 세포벽 강성의 국부적 감소가 선행됩니다. 주 성장 축과 평행하고 더 빨리 성장하는 Arabidopsis 배축의 세포벽은이 축에 수직이고 느리게 성장하는 세포벽보다 부드럽습니다 4,5. 옥수수 뿌리에서 분열에서 신장으로의 세포 전이는 뿌리의 모든 조직에서 탄성 계수의 감소를 동반했다. 탄성률은 연신율 영역에서 낮게 유지되었고 후기 신장 영역6에서 증가했습니다.
다양한 방법의 가용성에도 불구하고, 매년 얻어지는 세포벽 생물학에 대한 생화학 적 및 유전 적 정보의 큰 배열은 세포벽의 기계적 특성과 거의 비교되지 않습니다. 예를 들어, 세포벽 관련 유전자의 돌연변이는 종종 성장 및 발달을 변경했지만 4,7,8 생체 역학 측면에서 거의 설명되지 않습니다. 그 이유 중 하나는 세포 및 세포 수준에서 측정을 수행하기가 어렵 기 때문입니다. 원자력 현미경 (AFM)은 현재 이러한 분석을위한 주요 접근법입니다9.
최근 몇 년 동안 식물 세포벽 생체 역학에 대한 수많은 AFM 기반 연구가 수행되었습니다. Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 및 양파 12의 외부 조직의 세포벽과 배양 된 세포13,14,15의 기계적 특성이 조사 되었습니다. 그러나, 식물의 표면 세포는 내부 조직6의 기계적 성질과 상이한 세포벽을 가질 수있다. 또한 식물 세포는 팽창에 의해 가압되어 더 뻣뻣 해집니다. 팽창 압력의 영향을 제거하기 위해 연구자들은 플라즈마 분해 용액 2,3,4,5,10,11 을 사용하거나 얻은 값을 팽창 및 세포 벽 기여 12로 분해해야합니다. 제 1 접근법은 샘플 탈수로 이어지고 세포벽(16)의 두께 및 특성을 변화시키는 반면, 제 2 접근법은 추가적인 측정 및 복잡한 수학을 필요로 하며, 비교적 단순한 형상(12)의 세포에만 적용된다. 내부 조직의 세포벽 특성은 냉동 절편17 또는 수지8이 함침 된 식물 재료의 절편에서 평가할 수 있습니다. 그러나 두 방법 모두 샘플의 탈수 및/또는 함침을 포함하며, 이는 필연적으로 특성의 변화로 이어집니다. 분리되거나 배양 된 세포의 특성은 전체 식물의 생리학과 관련되기가 어렵습니다. 식물 세포의 배양과 분리는 모두 세포벽의 기계적 특성에 영향을 줄 수 있습니다.
여기에 제시된 방법은 앞서 언급 한 접근 방식을 보완합니다. 이를 사용하여 모든 조직의 기본 세포벽과 식물 발달의 모든 단계를 검사 할 수 있습니다. 절편 및 AFM 관찰은 샘플 탈수를 피하는 액체에서 수행되었습니다. 팽창의 문제는 세포가 절단됨에 따라 해결되었습니다. 이 프로토콜은 옥수수와 호밀 뿌리에 대한 작업을 설명하지만 다른 샘플은 비브라톰 절단에 적합한 경우 검사 할 수 있습니다.
여기에 설명 된 AFM 연구는 힘-부피 기술을 사용하여 수행되었습니다. 악기마다 이 메서드에 대해 다른 이름을 사용합니다. 그러나 기본 원칙은 동일합니다. 샘플의 힘-체적 맵은 캔틸레버 편향(18)을 기록하면서 각각의 분석된 지점에서 특정 하중을 달성하기 위해 캔틸레버(또는 샘플)의 정현파 또는 삼각형 운동에 의해 얻어진다. 결과는 표면의 지형 이미지와 힘-거리 곡선의 배열을 결합합니다. 각 곡선은 특정 지점에서의 변형, 강성, 영률, 접착력 및 에너지 소산을 계산하는 데 사용됩니다. 유사한 데이터는 접촉 모드19에서 스캐닝 한 후 점별 힘 분광법에 의해 얻어 질 수 있지만, 더 많은 시간이 소요된다.
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Protocol
1. AFM 측정을 위한 샘플 준비
- 식물 재료 : 옥수수 (Zea mays L.)와 호밀 (Secale cereale L.)의 씨앗을 0.35 % NaOCl 용액으로 10 분 동안 살균하고 증류수로 3 배 씻은 다음 27 °C의 어둠 속에서 각각 4 일 및 2 일 동안 수경법으로 자랍니다. 1차 루트를 실험에 사용하였다.
- 비브라톰 절단을 위한 용액 및 샘플 준비
- 3%(w/w) 저융점 아가로스를 전자레인지를 사용하여 물에 용해시켜 뿌리 포매용 아가로스 용액을 준비합니다.
참고: 모든 실험은 물에서 수행되었습니다. 연구에 완충액 또는 다른 유형의 배지가 필요한 경우 샘플 손상을 방지하기 위해 아가 로스 준비, 절단 중 및 AFM의 액체 셀에 동일한 배지를 사용하는 것이 좋습니다. - 페트리 접시 바닥(직경 = 35mm)에 녹은 3% 아가로스의 4mm 층을 붓고 샘플의 열 손상을 방지하기 위해 약간 식힙니다.
- 연구 된 식물 기관의 3-4 개의 작은 조각 (약 5mm 길이)을 아가 로스에 수평으로 놓습니다.
알림: 샘플은 반쯤 잠겨 있어야 하지만 아가로스 층에 잠기지 않아야 합니다. 샘플이 침지되지 않으면 비브라톰 절단 중에 아가로스에서 벗어날 수 있습니다. 샘플이 바닥으로 가라 앉으면 섹션의 가장자리에 너무 가까워 추가 단계가 불편해집니다. - 얇은 반고체 필름이 아가 로스의 첫 번째 층 (30-60 초) 위에 나타나면 조심스럽게 두 번째 층을 위에 붓습니다.
알림: 아가 로스의 바닥층이 완전히 응고되어서는 안됩니다. 그렇지 않으면 추가 작업 중에 두 레이어가 서로 분리 될 수 있습니다. - 아가 로스가 완전히 응고 된 후, 시편이 들어있는 블록을 잘라냅니다. 블록을 육각형 잘린 피라미드로 만들어 추가 절단 중에 안정성을 보장합니다(그림 1A).
참고: 샘플은 필요한 섹션 유형에 따라 이 블록 내에서 수직 또는 수평 방향으로 향할 수 있습니다. 블록을 준비 할 때 시편 주위에 2-3mm의 아가 로스를 남겨 두십시오. 이 경우, 샘플 섹션은 3 % 아가 로스 층에 의해 유지되어 추가 고정화를 용이하게합니다 (그림 1B).
- 3%(w/w) 저융점 아가로스를 전자레인지를 사용하여 물에 용해시켜 뿌리 포매용 아가로스 용액을 준비합니다.
- 비브라톰으로 샘플 절편
- 시아노아크릴레이트 접착제로 블록을 비브라톰 스테이지에 붙입니다. 피라미드 모서리 중 하나가 비브라톰의 블레이드를 향하도록 무대를 비브라톰에 배치합니다. 비브라톰 욕조에 물을 붓습니다.
- 단면 매개변수(단면 두께, 블레이드 속도 및 진동 주파수)를 설정하고 샘플을 절단합니다.
알림: 200에서 400 μm 사이의 단면 두께를 사용하십시오. 너무 얇은 섹션은 기계적 특성 평가에 오류를 일으킬 수 있으며 너무 두꺼운 섹션은 파손되기 쉽습니다. 1.3mm·s-1 의 블레이드 속도와 90Hz의 진동 주파수가 호밀과 옥수수 뿌리에 사용되었습니다. - 가는 솔을 사용하여 수조에서 유리 슬라이드로 섹션을 옮기고 건조를 방지하기 위해 섹션에 물 한 방울을 놓습니다. 광학 현미경으로 섹션의 품질을 확인하십시오.
참고: 경사 단면은 탄성 계수를 측정하는 데 사용할 수 없습니다. 세포벽은 단면면에 수직이어야하며, 그렇지 않으면 AFM 팁 아래에서 구부러 지거나 구부러 질 수 있습니다.
- AFM 측정을 위한 섹션 고정(그림 1B)
- 피펫을 사용하여 페트리 접시 캡의 바닥에 용융된 1%(w/w) 아가로오스(~1mL) 층을 붓습니다.
알림: 페트리 접시 캡의 측면이 팁이 샘플에 접근하는 것을 방해하지 않는지 확인하십시오. 아가 로스 층은 두께가 1mm 여야하며 뚜껑의 바닥 전체를 덮어야합니다. - 1 % 아가 로스가 고형화 된 후 여과지를 가장자리로 가져와 섹션에서 과도한 물을 제거하십시오.
알림: 샘플의 손상과 완전한 건조를 방지하기 위해 종이로 식물 부분을 만지지 마십시오. - 브러시를 사용하여 슬라이드에서 페트리 접시 캡의 중앙으로 섹션을 조심스럽게 옮깁니다. 20 μL 피펫을 사용하여 섹션 주위에 1% 아가로스를 조심스럽게 추가합니다(그림 1B).
참고: 1% 아가로스는 시편 자체에 묻지 않아야 합니다. 식물 표본을 유지하는 3 % 아가 로스 층의 가장자리 만 덮어야합니다. 1% 아가로스는 이 3% 아가로오스 층의 가장자리에 작은 놀을 형성해야 합니다. 큰 놀은 캔틸레버가 샘플에 접근하는 것을 막을 수 있습니다. - AFM에 사용할 물 또는 기타 용액을 고정 섹션이있는 페트리 접시 캡에 붓습니다.
- 피펫을 사용하여 페트리 접시 캡의 바닥에 용융된 1%(w/w) 아가로오스(~1mL) 층을 붓습니다.
2. AFM 준비 및 교정
참고 : AFM의 힘-부피 방법은 연구 된 영역의 각 지점에서 얻은 힘-거리 곡선의 공간적으로 해결 된 배열을 생성합니다. 접촉 모드에서 힘-볼륨 모드(캔틸레버 강성, IOS 등)에 대한 모든 매개변수를 가져옵니다. 다른 제조업체의 기기에 대한 유사한 절차는 이전에10,20에 설명되어 있습니다.
- 적절한 유형의 캔틸레버를 선택하십시오.
참고: 캔틸레버 강성은 시편 강성21과 비슷해야 합니다. 시편보다 훨씬 뻣뻣한 캔틸레버는 많이 편향되지 않는 반면, 너무 부드러운 캔틸레버는 샘플을 충분히 변형시키지 않습니다. 전형적인 공진 주파수는 액체에서 캔틸레버를 스윙하기에 충분해야합니다 (즉, 적어도 수십 kHz 여야합니다). 접촉 면적은 세포벽의 크기에 비해 작아야 하는데, 이는 영률 계산에서 연구 중인 샘플이 무한 반쪽 공간으로 가정되기 때문입니다. 호밀과 옥수수 뿌리에는 다음과 같은 캔틸레버가 사용되었습니다 : 일반적인 공진 주파수 60kHz, 평균 스프링 상수 1.5N·m-1, 정점 반경 10nm의 날카로운 캔틸레버 또는 일반적인 공진 주파수가 75kHz, 평균 스프링 상수 2.8N·m-1인 구형 캔틸레버, 및 정점 반경 150nm. - AFM 장치 및 관련 소프트웨어(재료 표)를 켭니다. 액체 셀의 팁 홀더에 캔틸레버를 장착하십시오. 팁에 액체를 담그는 동안 팁에 기포가 형성되지 않도록 팁에 액체 한 방울을 놓습니다.
알림: 기포가 형성되는 경우 정밀 닦기로 액체를 제거한 다음 새 방울을 놓을 수 있습니다. - 팁 홀더를 스캐닝 헤드에 장착합니다.
- 단단한 샘플(신선한 유리 슬라이드)을 페트리 접시 뚜껑에 넣습니다. 액체를 부어 슬라이드를 덮도록하십시오. 스캐닝 헤드를 스테이지에 놓고 액체가 캔틸레버를 덮도록 표본을 들어 올립니다.
- 드롭다운 도구 메뉴에서 헤드 탭을 선택합니다. 액체 셀의 스캐닝 헤드가 선택되었는지 확인하십시오.
- 조준 버튼을 클릭하여 레이저 조준 창을 엽니다. 카메라 버튼을 클릭하여 광학 현미경 창을 엽니다. AFM 헤드의 나사와 방향을 위한 광학 현미경 창을 사용하여 캔틸레버 끝에 레이저를 놓습니다.
- 선택 세미 컨택트 모드 프로그램의 기본 창에 있는 드롭다운 메뉴에서.
- 공진 탭을 열고 프로브 메뉴에서 사용 중인 캔틸레버 유형을 선택합니다. 자동 버튼을 클릭하여 공진 주파수를 결정합니다.
참고: 사용 중인 캔틸레버가 목록에 없으면 도구 > 프로브 패스포트를 엽니다. 새 파일을 만들고 캔틸레버 매개 변수를 입력한 다음 저장합니다. 그런 다음 프로브 드롭다운 메뉴에서 선택합니다. - 프로그램의 기본 창에 있는 드롭다운 메뉴에서 접촉 모드를 선택합니다.
- N_Force Cal 버튼을 클릭하여 캔틸레버 보정 창을 엽니다. 사용 중인 캔틸레버를 선택하고 스윕 버튼을 클릭한 다음 Spect Meas 버튼을 클릭하여 열 조정 절차를 사용하여 캔틸레버 스프링 상수를 결정합니다. 창을 닫습니다.
- 설정값을 1nA로 설정합니다. 접근 탭을 열고 랜딩 버튼을 클릭하여 샘플에 접근합니다.
- 스캔 탭을 엽니다. 스캔 속도를 0.5Hz로 설정합니다. 영역 버튼을 클릭하고 스캔 크기를 10μm x 10μm로 설정하고 스캔 포인트를 256 x 256으로 설정합니다. 실행 버튼을 클릭하고 약 20줄을 스캔하여 유리에 오염이 없는지 확인합니다. 중지 버튼을 클릭하여 데이터 손실없이 스캔을 종료하십시오.
- 곡선 탭을 엽니다. 리트랙트 및 접근에 대한 매개 변수를 각각 500nm 및 -100nm로 설정합니다.
- 드롭다운 메뉴에서 마지막 스캔을 선택하고 프레임을 선택하여 표면을 관찰합니다.
- 유리에서 깨끗한 영역을 찾아 힘 변형 곡선을 가져와야하는 지점을 표시하고 실행 버튼을 클릭하여 곡선을 가져옵니다. 스캔의 다른 위치에 3-5개의 힘 곡선을 기록합니다.
- 데이터 버튼을 클릭하여 분석 창을 열고 힘-변형 곡선이 있는 프레임을 선택합니다.
- 페어 마커 버튼을 클릭하고 후퇴 곡선의 선형 부분을 표시하여 역 광학 감도(IOS, nA nm-1) 또는 편향 감도인 변위에 대한 DFL 신호의 비율을 계산합니다.
- 기록된 모든 곡선에 대해 2.17단계를 반복하고 DFL 신호 대 변위 비율의 모든 계산된 값을 기록합니다. 그들은 동일해야합니다.
- 분석 창을 닫고 접근 탭을 클릭한 다음 제거 버튼을 클릭하여 샘플에서 프로브를 집어넣습니다.
3. 데이터 수집
- 광학 현미경을 사용하여 AFM 캔틸레버 아래에 샘플을 안내합니다. 접근 탭을 클릭한 다음 랜딩 버튼을 클릭하여 1nA의 SetPoint로 접촉 모드에서 샘플에 접근합니다.
- 스캔 탭을 클릭 한 다음 영역 버튼을 클릭하십시오. 스캔할 영역 크기를 70μm x 70μm로 선택합니다.
- Move Probe 버튼을 클릭하고 스캐너를 그 위로 이동하여 전체 스캔 영역을 확인합니다. 스캐너 돌출 정도에 따라 가장 높은 지점을 찾으십시오.
- Approach 탭을 열고 제거 버튼을 클릭하여 샘플에서 철회합니다. 가장 높은 지점을 대상으로 사용하여 랜딩 버튼을 클릭하여 샘플에 다시 접근합니다. 그런 다음 프로브 이동 버튼을 클릭하고 스캐너를 그 위로 이동하여 표면을 다시 확인하십시오. 해당 영역의 어떤 지점도 스캐너를 완전히 올릴 필요가 없습니다.
참고: 이상적으로는 스캐너 z 범위가 샘플의 높이 차이를 초과해야 합니다. 그러나 스캔 영역의 일부 지점이 스캐너 용량보다 낮은 경우에는 허용됩니다. 동시에 그러한 점이 많지 않아야합니다. 스캐너로 접근할 수 없는 넓은 영역은 스캔 낙태의 원인이 될 수 있습니다. - 스캔 속도를 0.5Hz로 설정합니다. 스캔 크기를 70μm x 70μm로 설정하고 스캔 포인트를 64 x 64로 설정합니다. 실행 버튼을 클릭하고 스캔하여 샘플의 표면과 아가로스로 인한 오염 가능성을 확인하십시오.
참고: 샘플에 큰 루멘이 있는 셀이 있는 경우 스캔 영역의 크기를 줄이거나 스캔에 더 많은 세포벽이 있도록 이동해야 합니다. - 메인 창 상단의 On 버튼을 클릭하여 피드백 루프를 끕니다.
- 프로그램의 기본 창에있는 드롭 다운 메뉴에서 HDPlus 모드 (강제 볼륨 방법)를 선택하십시오. 추가 창(HD 창)이 나타납니다.
- 메인 프로그램 창에서 SetPoint 를 0.1nA로 설정합니다.
- HD 창의 Main 탭에서 연구 된 샘플에 적합한 스캐닝 매개 변수 (정현파 캔틸레버 운동의 진폭 및 주파수)를 설정합니다.
알림: 각 유형의 샘플과 캔틸레버는 스캐닝 매개변수를 선택해야 합니다. 몇 가지 예비 실험이 필요합니다. 옥수수 또는 호밀 뿌리의 경우, 400 nm의 진폭 및 300 Hz의 주파수에서 날카 롭고 구형의 캔틸레버가 사용되었습니다. - HD 창에서 소음 탭을 열고 캔틸레버의 공진 주파수를 입력합니다.
- HD 창의 퀀트 탭을 열고 IOS, 캔틸레버 강성, 팁 반경 및 각도를 입력합니다. 팁 형상에 따라 계산에 사용할 접촉 모델을 선택합니다.
참고 : DMT 모델은 프로브와 샘플 사이에 존재하는 접착력을 고려하며 기계 생물학21에서 가장 일반적으로 사용됩니다. - HD 창의 스캔 탭을 열고 기록할 신호를 선택합니다. 신호가 기록되는 방향을 선택합니다. 힘 볼륨 상자를 선택하여 모든 힘 곡선의 기록을 얻으십시오.
알림: 탄성 계수 신호를 정방향 및 역방향 방향으로 기록합니다. 계산할 더 많은 포인트를 제공합니다. - 기본 프로그램 창 상단의 Off 버튼을 클릭하여 피드백 루프를 켭니다.
- 메인 HD 창에서 PhaseCorr 버튼을 클릭하여 광학 시스템의 감도를 수정합니다.
- 메인 HD 창의 대 시간 탭은 실시간으로 DFL 신호 대 시간의 기능을 제공합니다. 기준 수준 결정에 사용할 이 함수의 부분을 선택하고 추가 계산을 위해 접촉 모델을 피팅합니다.
- 프로그램의 주 창에서 스캔 포인트 값을 256 x 256으로 설정합니다. 스캔 속도를 0.2Hz로 설정하고 실행 버튼을 클릭하여 샘플을 스캔합니다.
- 스캔이 중지되면 기본 창 상단의 On 버튼을 클릭하여 피드백 루프를 끕니다.
- 드롭다운 메뉴에서 접촉 모드를 선택하고 접근 탭을 연 다음 제거 버튼을 클릭하여 샘플에서 철회합니다.
- 데이터 버튼을 클릭하여 분석 소프트웨어를 열고 출력을 저장합니다.
- 측정일이 끝나면 캔틸레버 팁 홀더를 머리에서 제거하고 초순수로 여러 번 조심스럽게 헹굽니다. 매번 정밀 닦음으로 물을 제거하십시오.
4. 데이터 평가 및 후처리
참고: 자동으로 계산된 탄성 계수 값에 의존하지 마십시오. 표면의 높이가 크게 다르기 때문에 많은 인공물 곡선을 배출해야합니다.
- 분석 소프트웨어에서 저장된 파일을 엽니다.
- HDForceVolume 프레임을 선택합니다.
- Ctrl 키를 누른 상태에서 동일한 스캔 방향으로 얻은 하나의 시각적 프레임을 선택합니다. 외부 맵 로드 버튼을 클릭하여 셀 벽이 어디에 있는지 확인합니다.
참고: 모든 신호 맵을 시각적 프레임으로 사용할 수 있지만 DFL 신호 맵(다른 계측기에서는 편향 신호 또는 오류 신호라고 할 수 있음)을 사용하는 것이 가장 쉬운 방법일 수 있습니다. - 기본 탭에서 InvOptSens(IOS) 및 캔틸레버 강성 값을 확인합니다.
- 추가 탭을 열고 팁 매개변수와 접촉 모델을 확인합니다.
- 시각적 프레임의 셀 벽에있는 다양한 점을 클릭하고 모델에 잘 설명 된 곡선 만 선택하십시오. 자세한 내용은 대표 결과를 참조하십시오.
- 얻은 값을 기록해 둡니다.
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Representative Results
일반적인 탄성률 및 DFL 맵과 설명된 방법으로 호밀 및 옥수수 뿌리에서 얻은 힘 곡선이 그림 2에 나와 있습니다. 도 2A 는 호밀 1차 뿌리의 횡단면에서 얻어진 탄성률 및 DFL 맵을 나타낸다. 모듈러스 맵(그림 2A, 왼쪽)의 흰색 영역은 스캐너가 z 방향으로 한계에 도달하여 영률의 잘못된 과대 평가에 해당합니다. 이 이미지는 만족스러운 힘 곡선을 추가로 선택하기 위한 외부 맵으로 사용하기에 편리하지 않습니다. 오른쪽에 표시된 DFL 신호 맵(편향/오차 맵)(그림 2A)이 이 목적에 더 적합합니다.
옥수수 뿌리의 가로 및 세로 섹션의 모듈러스지도는 그림 2B, C에 나와 있습니다. 샘플의 하단에 도달하려고 시도하는 동안 완전히 확장된 스캐너는 잘못된 측정과 심지어 스캔 중단을 초래할 수 있습니다( 그림 2C의 상단 부분). 때로는 접촉 모드에서 양호한 스캔을 얻은 후 기기가 갑자기 스캐너를 완전히 수축시켜 강제 볼륨 모드로 전환 할 때 최대 z 방향 제한에 도달했음을 경고합니다. 이는 샘플이 제대로 고정되지 않고 떠올랐음을 의미합니다. 새로운 샘플을 준비해야합니다.
아가로스 오염은 또한 새로운 샘플을 준비하는 이유가 될 수 있습니다(그림 2D, E). 아가로스 존재는 접촉 모드에서 제1 스캔을 획득하는 동안 체크될 수 있다(단계 3.5). 이상적으로, 세포벽과 일부 세포 바닥은 이러한 스캔에서 볼 수 있어야합니다 (그림 2D). 그러나 부정확 한 고정화의 경우 표면은 샘플 지형을 가리는 아가 로스 (그림 2E)로 덮일 수 있습니다.
그림 2F 는 동일한 세포벽의 서로 다른 지점에서 기록된 4개의 서로 다른 힘 곡선을 보여줍니다. 점 1에 기록된 곡선에는 기준선이 표시되지 않습니다. 이는 캔틸레버 팁이 세포벽에서 분리되지 않았 음을 의미합니다. 이 곡선에서 계산 된 모듈러스는 과대 평가되었습니다. 포인트 3에 기록된 곡선은 접근하는 부분의 숄더를 보여줍니다. 이 인공물은 세포벽이 구부러졌음을 나타낼 수 있다. 포인트 1과 3에 기록 된 두 곡선은 모두 배출되어야합니다. 점 2와 4는 유사한 계수 값을 갖는 만족스러운 힘 곡선을 보여줍니다. 적절한 곡선을 구별하기 위해 다음 기준을 사용할 수 있습니다 : (i) 곡선의 접근 및 수축 부분 모두에서 기준선 수준이 분명해야합니다. (ii) 어깨 또는 고장과 같은 불규칙성이 없어야합니다 (각각 일정한 힘 값과 경사면의 중간에 힘 값이 갑자기 감소하는 것으로 나타남). (iii) 선택한 모델이 곡선에 잘 맞아야합니다. 선택한 모든 커브에 대해 적용된 최대 힘 값은 비슷해야 합니다. 예상 값보다 훨씬 높거나 낮은 최대 적용된 힘도 곡선 배출의 기준으로 사용할 수 있습니다. 뉴럴 네트워크를 사용하여 품질이 낮은 곡선(19 )을 버리는 것은 결과의 처리 속도를 높일 수 있다.
그림 1: 시료 전처리의 중요한 단계 . (A) 아가로스 블록에 매립되고 비브라톰 스테이지에 장착된 뿌리 조각. (b) 샘플 섹션을 1% 아가로스의 층 위에 놓고, 페트리 접시 캡에 추가의 아가로스로 고정화한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 기본 루트에 대한 일반적인 AFM 이미지 및 측정 . (A) 호밀 뿌리의 횡단면의 탄성 계수 및 DFL 맵. 옥수수 뿌리의 세로 및 가로 섹션에서 얻은 탄성 계수의 완전히 기록 된 (B) 및 중단 된 (C)지도. 옥수수 뿌리의 깨끗한 (D) 및 아가 로스로 덮인 (E) 섹션의 3D보기. (F) 옥수수 뿌리의 횡단면에 대한 DFL 지도. 세포벽의 점 1-4는 이미지의 오른쪽에 제시된 힘 곡선이 기록 된 위치를 보여줍니다. 빨간색 선은 접근, 파란색 선은 후퇴, 검은색 선은 접촉 역학 모델 피팅을 나타냅니다. 점 1과 3에 기록된 곡선에는 아티팩트가 있으므로 계산에 사용할 수 없습니다. 호밀 뿌리는 날카로운 팁으로, 옥수수 뿌리는 구형 팁으로 검사했습니다. 약어 : Rhiz = 근피, Exo = 외피질, OC = 외부 피질, IC = 내부 피질, End = 내피, Per = pericycle, VP = 혈관 실질. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
1 차 세포벽의 기계적 특성은 식물 세포 성장의 방향과 속도를 결정하므로 식물의 미래 크기와 모양을 결정합니다. 여기에 제시된 AFM 기반 방법은 식물 세포벽의 특성을 연구하는 데 사용되는 기존 기술을 보완합니다. 그것은 식물의 내부 조직에 속하는 세포벽의 탄력성을 조사 할 수있게합니다. 제시된 방법을 사용하여, 성장하는 옥수수 뿌리의 상이한 조직에서의 세포벽의 기계적 성질을 매핑하고, 이들 특성6에 기초하여 수학적 모델을 구성하였다. 시뮬레이션 된 루트는 선형 크기의 변화에 의해 팽창을 모방하는 압력의 적용에 반응했습니다. 이러한 변화는 플라스몰라이징 배지6에서 새로 절제된 뿌리에 의해 나타나는 것과 동일한 범위 및 반대 방향에 있었습니다.
샘플 준비는 이 프로토콜에 매우 중요합니다. 전체 준비 과정에서 샘플의 건조를 피해야합니다. 절편화 할 식물 재료의 올바른 배치는 중요한 문제입니다. 세포벽은 미래의 스캐닝 평면에 엄격하게 수직으로 향해야합니다. 그렇지 않으면 세포벽이 구부러지거나 구부러졌기 때문에 만족스럽지 않은 힘-변형 곡선이 얻어집니다. 아가 로스 내장 섹션은 추가 아가 로스로 단단히 고정되어야합니다 (그림 2B). 후자는 샘플에 들어 가지 않아야하며, 그렇지 않으면 아가 로스 특성이 측정됩니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 부분은 결과 힘 곡선을 필터링하는 것입니다. AFM 교정 그리드와 같은 모델 객체를 연구하는 것조차도, 잘못된 힘-변형 곡선(22)의 상당한 비율을 초래할 수 있다. 기본 힘-변형 곡선을 분석하지 않고 계산된 모듈러스 값을 직접 사용하면 잘못된 결론이 나올 수 있습니다(그림 2F).
이 기술은 세포의 국소화 또는 식물 기관의 크기에 의해 제한되지 않습니다. 그러나 너무 작은 물체는 절단, 방향 지정 및 고정이 어렵습니다. 큰 루멘을 가진 세포는 스캔 중단 가능성이 높기 때문에 작업하기가 어렵습니다(그림 2C).
비브라톰으로 준비된 고정되지 않은 식물 섹션을 사용하는 모든 이점과 함께 식물 재료 절단 후 응력 반응이 발생할 가능성과 절단 된 세포벽에서 재료를 부분적으로 가용화 할 가능성이라는 두 가지 중요한 문제가 있습니다. 둘 다 세포벽의 구성과 특성을 변화시킬 수 있습니다. 절단에 대한 즉각적인 응력 반응의 존재는 애기장대 apices10에서 테스트되었습니다. 관찰된 특성에 대한 유의한 영향은 보고되지 않았다. 실험은 물19에서 배양하는 동안 절단 된 세포벽의 특성 변화를 테스트하기 위해 수행되었습니다. 적어도 30 분 동안 옥수수 뿌리의 동일한 벽에서 측정 된 명백한 영률 값에는 안정적인 경향이 없었습니다19. 그러나 실험 시간을 가능한 한 짧게 유지하고 물에서 샘플을 배양하는 동안 각 표본에 이러한 변화가 있는지 확인하는 것이 좋습니다.
AFM은 식물 세포벽을 연구하는 강력한 기술입니다. 그러나 탄성 계수, 강성 및 접착력의 계산은 식물 세포벽에 의해 충족되지 않는 몇 가지 가정을 기반으로한다는 것이 분명합니다. AFM에서 사용하는 접촉 역학의 모든 모델은 조사 된 표본을 식물 세포벽에는 해당되지 않는 등방성 물질의 무한한 반쪽 공간으로 간주합니다. 동시에, 압자의 형상과 특성은 캔틸레버 수명 동안 정확하게 측정되고 일정하다고 가정하며, 이는 또한 오류 일 수 있습니다. 또한 식물 세포벽은 탄성, 점탄성 및 플라스틱 구성 요소와 관련된 복잡한 기계적 거동을 나타내며 일반적으로 단일 실험에서 이들 중 하나만 측정할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, AFM 기반 방법을 사용하여 얻은 데이터는 다양한 기관 및 종 3,4,5,6에서 식물 세포 성장 및 기계적 성능과 신뢰성있게 상관 관계가 있습니다. 이 모든 것은 기술 자체와 그것으로 얻은 데이터에 대한 이해가 모두 향상 될 수 있음을 의미합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
옥수수와 호밀 씨앗을 각각 제공한 드미트리 수슬로프 박사(러시아 상트페테르부르크 상트페테르부르크 주립대학교)와 미라 포노마레바 교수(타타르 농업 연구소, FRC KazSC RAS, 카잔, 러시아)에게 감사를 표합니다. 제시된 방법은 LK에 수여 된 러시아 과학 재단 프로젝트 번호 18-14-00168의 틀 내에서 개발되었습니다. 작업의 일부 (제시된 결과 획득)는 RAS의 FRC 카잔 과학 센터에 대한 정부 할당의 재정 지원으로 AP에 의해 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
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