Summary
Les études de la biomécanique de la paroi cellulaire sont essentielles pour comprendre la croissance et la morphogenèse des plantes. Le protocole suivant est proposé pour étudier les parois cellulaires primaires minces dans les tissus internes des jeunes organes végétaux à l’aide de la microscopie à force atomique.
Abstract
Les propriétés mécaniques des parois cellulaires primaires déterminent la direction et le taux de croissance des cellules végétales et, par conséquent, la taille et la forme futures de la plante. De nombreuses techniques sophistiquées ont été développées pour mesurer ces propriétés; Cependant, la microscopie à force atomique (AFM) reste la plus pratique pour étudier l’élasticité de la paroi cellulaire au niveau cellulaire. L’une des limites les plus importantes de cette technique a été que seules les cellules vivantes superficielles ou isolées peuvent être étudiées. Ici, l’utilisation de la microscopie à force atomique pour étudier les propriétés mécaniques des parois cellulaires primaires appartenant aux tissus internes d’un corps végétal est présentée. Ce protocole décrit les mesures du module apparent de Young des parois cellulaires dans les racines, mais la méthode peut également être appliquée à d’autres organes végétaux. Les mesures sont effectuées sur des coupes de matériel végétal dérivées de vibratomes dans une cellule liquide, ce qui permet (i) d’éviter l’utilisation de solutions plasmolysantes ou d’imprégnation d’échantillons avec de la cire ou de la résine, (ii) de rendre les expériences rapides et (iii) de prévenir la déshydratation de l’échantillon. Les parois cellulaires anticlinales et périclinales peuvent être étudiées, selon la façon dont le spécimen a été sectionné. Les différences dans les propriétés mécaniques des différents tissus peuvent être étudiées dans une seule section. Le protocole décrit les principes de planification de l’étude, les problèmes liés à la préparation et aux mesures des éprouvettes, ainsi que la méthode de sélection des courbes force-déformation pour éviter l’influence de la topographie sur les valeurs obtenues du module d’élasticité. La méthode n’est pas limitée par la taille de l’échantillon, mais est sensible à la taille des cellules (c.-à-d. que les cellules avec une grande lumière sont difficiles à examiner).
Introduction
Les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire végétale déterminent la forme de la cellule et sa capacité à se développer. Par exemple, l’extrémité en croissance du tube pollinique est plus molle que les parties non en croissance du même tube1. La formation de primordia sur le méristème d’Arabidopsis est précédée d’une diminution locale de la rigidité de la paroi cellulaire sur le site du futur primordium 2,3. Les parois cellulaires d’Arabidopsis hypocotyle, qui sont parallèles à l’axe de croissance principal et se développent plus rapidement, sont plus molles que celles qui sont perpendiculaires à cet axe et se développent plus lentement 4,5. Dans la racine de maïs, la transition des cellules de la division à l’élongation s’est accompagnée d’une diminution des modules élastiques dans tous les tissus de la racine. Les modules sont restés faibles dans la zone d’allongement et ont augmenté dans la zone d’allongement tardif6.
Malgré la disponibilité de diverses méthodes, les grands réseaux d’informations biochimiques et génétiques sur la biologie de la paroi cellulaire obtenus chaque année sont rarement comparés aux propriétés mécaniques des parois cellulaires. Par exemple, les mutants sur les gènes liés à la paroi cellulaire ont souvent une croissance et un développement altérés 4,7,8, mais sont rarement décrits en termes de biomécanique. L’une des raisons en est la difficulté d’effectuer des mesures aux niveaux cellulaire et subcellulaire. La microscopie à force atomique (AFM) est actuellement la principale approche pour de telles analyses9.
Au cours des dernières années, de nombreuses études basées sur l’AFM sur la biomécanique de la paroi cellulaire végétale ont été réalisées. Les propriétés mécaniques des parois cellulaires des tissus externes d’Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 et de l’oignon 12, ainsi que des cellules cultivées13,14,15, ont été étudiées. Cependant, les cellules superficielles d’une plante peuvent avoir des parois cellulaires dont les propriétés mécaniques diffèrent de celles des tissus internes6. De plus, les cellules végétales sont pressurisées par la turgescence, ce qui les rend plus rigides. Pour se débarrasser de l’influence de la pression de turgescence, les chercheurs doivent utiliser des solutions plasmolysantes 2,3,4,5,10,11 ou décomposer les valeurs obtenues en apports de turgescence et de paroi cellulaire 12. La première approche conduit à la déshydratation de l’échantillon et modifie l’épaisseur et les propriétés de la paroi cellulaire16, tandis que la seconde approche nécessite des mesures supplémentaires et des mathématiques compliquées, et ne s’applique qu’aux cellules de forme relativement simple12. Les propriétés de la paroi cellulaire des tissus internes peuvent être évaluées sur des cryosections17 ou des sections de matériel végétal imprégnées de résine8. Cependant, les deux méthodes impliquent la déshydratation et / ou l’imprégnation des échantillons, ce qui entraîne inévitablement des changements dans les propriétés. Les propriétés des cellules isolées ou cultivées sont difficiles à relier à la physiologie de la plante entière. La culture et l’isolement des cellules végétales peuvent affecter les propriétés mécaniques de leurs parois cellulaires.
La méthode présentée ici complète les approches susmentionnées. En l’utilisant, les parois cellulaires primaires de n’importe quel tissu et à n’importe quel stade du développement de la plante peuvent être examinées. Les observations de sectionnement et d’AFM ont été effectuées dans un liquide, ce qui évite la déshydratation de l’échantillon. Le problème de la turgescence a été résolu au fur et à mesure que les cellules sont coupées. Le protocole décrit le travail avec les racines de maïs et de seigle, mais tout autre échantillon peut être examiné s’il convient à la section des vibratomes.
Les études AFM décrites ici ont été réalisées à l’aide de la technique force-volume. Différents instruments utilisent des noms différents pour cette méthode. Cependant, le principe de base est le même; Une carte force-volume de l’échantillon est obtenue par un mouvement sinusoïdal ou triangulaire du porte-à-faux (ou échantillon) pour atteindre une certaine force de charge à chaque point analysé, tout en enregistrant la déviation en porte-à-faux18. Le résultat combine une image topographique de la surface et le tableau des courbes force-distance. Chaque courbe est utilisée pour calculer la déformation, la rigidité, le module de Young, l’adhérence et la dissipation d’énergie en un point spécifique. Des données similaires peuvent être obtenues par spectroscopie de force point par point après balayage en modecontact 19, bien que cela prenne plus de temps.
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Protocol
1. Préparation des échantillons pour les mesures AFM
- Matériel végétal: Stériliser les graines de maïs (Zea mays L.) et de seigle (Secale cereale L.) avec une solution de NaOCl à 0,35% pendant 10 min, laver 3x avec de l’eau distillée, puis cultiver en hydroponie dans l’obscurité à 27 °C pendant 4 jours et 2 jours, respectivement. Des racines primaires ont été utilisées pour l’expérience.
- Préparation des solutions et de l’échantillon pour la section des vibratomes
- Préparer la solution d’agarose pour l’encastrement des racines en dissolvant 3 % (p/p) d’agarose à bas point de fusion dans de l’eau à l’aide d’un four à micro-ondes.
NOTE: Toutes les expériences ont été effectuées dans l’eau. Si un tampon ou tout autre type de milieu est nécessaire pour l’étude, il est préférable d’utiliser le même milieu pour la préparation de l’agarose, pendant la section, et dans la cellule liquide de l’AFM pour éviter d’endommager l’échantillon. - Versez une couche de 4 mm d’agarose à 3% fondu sur le fond de la boîte de Petri (diamètre = 35 mm) et laissez-la refroidir légèrement pour éviter d’endommager l’échantillon par la chaleur.
- Placer trois ou quatre petits morceaux (environ 5 mm de long) de l’organe végétal étudié horizontalement sur l’agarose.
REMARQUE : Les échantillons doivent être à moitié immergés, mais pas immergés dans la couche d’agarose. Si l’échantillon n’est pas immergé, il peut sortir de l’agarose pendant la section du vibratome. Si l’échantillon coule au fond, il sera trop près du bord de la section et deviendra gênant pour les étapes ultérieures. - Lorsqu’un film mince et semi-solide apparaît sur la première couche d’agarose (30-60 s), versez soigneusement une deuxième couche sur le dessus.
REMARQUE : La couche inférieure d’agarose ne doit pas se solidifier complètement. Sinon, les deux couches peuvent se séparer l’une de l’autre lors de travaux ultérieurs. - Une fois l’agarose complètement solidifiée, découpez le bloc contenant le spécimen. Façonnez le bloc en une pyramide tronquée hexagonale pour assurer sa stabilité lors d’une section ultérieure (Figure 1A).
Remarque : L’échantillon peut être orienté verticalement ou horizontalement dans ce bloc selon le type de section requis. Lors de la préparation du bloc, laissez 2-3 mm d’agarose autour du spécimen. Dans ce cas, la section de l’échantillon sera retenue par la couche d’agarose à 3%, ce qui facilitera son immobilisation ultérieure (Figure 1B).
- Préparer la solution d’agarose pour l’encastrement des racines en dissolvant 3 % (p/p) d’agarose à bas point de fusion dans de l’eau à l’aide d’un four à micro-ondes.
- Sectionnement de l’échantillon avec le vibratome
- Collez le bloc à l’étage de vibratome avec un adhésif cyanoacrylate. Placez la scène dans le vibratome de sorte que l’un des coins de la pyramide fasse face à la lame du vibratome. Versez de l’eau dans le bain de vibratome.
- Réglez les paramètres de sectionnement (épaisseur de section, vitesse de la lame et fréquence de vibration) et coupez l’échantillon.
REMARQUE : Utilisez les épaisseurs de section comprises entre 200 et 400 μm. Une section trop mince peut introduire des erreurs dans l’évaluation des propriétés mécaniques, tandis qu’une section trop épaisse est sujette à la rupture. Une vitesse de lame de 1,3 mm·s-1 et une fréquence d’oscillation de 90 Hz ont été utilisées pour les racines de seigle et de maïs. - À l’aide d’une brosse fine, déplacez la section du bain-marie sur une lame de verre et placez une goutte d’eau sur la section pour l’empêcher de se dessécher. Vérifiez la qualité de la section au microscope optique.
REMARQUE : Les sections obliques ne peuvent pas être utilisées pour mesurer le module d’élasticité. Les parois cellulaires doivent être perpendiculaires au plan de section, sinon elles peuvent se plier ou se déformer sous la pointe AFM.
- Immobilisation de la section pour les mesures AFM (Figure 1B)
- Verser une couche d’agarose fondue à 1 % (p/p) (~1 mL) sur le fond du capuchon de la boîte de Petri à l’aide d’une pipette.
REMARQUE: Assurez-vous que les côtés du capuchon de la boîte de Petri n’empêchent pas la pointe de s’approcher de l’échantillon. La couche d’agarose doit avoir une épaisseur de 1 mm et couvrir tout le fond du chapeau. - Une fois que l’agarose à 1 % s’est solidifiée, enlever l’excès d’eau de la section en amenant le papier filtre sur son bord.
REMARQUE: Ne touchez pas la section de la plante avec le papier pour éviter d’endommager et de sécher complètement l’échantillon. - Transférez délicatement la section de la lame au centre du capuchon vaisselle de Petri à l’aide d’un pinceau. À l’aide d’une pipette de 20 μL, ajouter délicatement 1 % d’agarose autour de la section (figure 1B).
REMARQUE : L’agarose à 1 % ne doit pas se retrouver sur l’échantillon lui-même. Il ne doit couvrir que les bords de la couche d’agarose à 3% qui retient le spécimen de la plante. L’agarose à 1% devrait former de petites buttes sur les bords de cette couche d’agarose à 3%. De grandes buttes peuvent empêcher le porte-à-faux de s’approcher de l’échantillon. - Verser l’eau ou toute autre solution à utiliser pour l’AFM dans le bouchon de la boîte de Petri avec la section immobilisée.
- Verser une couche d’agarose fondue à 1 % (p/p) (~1 mL) sur le fond du capuchon de la boîte de Petri à l’aide d’une pipette.
2. Préparation et étalonnage de l’AFM
NOTE: La méthode force-volume de l’AFM génère un tableau spatialement résolu de courbes force-distance obtenues en chaque point de la zone étudiée. Obtenez tous les paramètres du mode force-volume (rigidité en porte-à-faux, IOS, etc.) en mode contact. Des procédures similaires pour les instruments d’autres fabricants ont été décrites précédemment10,20.
- Sélectionnez le type de porte-à-faux approprié.
NOTE: La rigidité en porte-à-faux doit être comparable à la rigidité de l’échantillon21. Un porte-à-faux beaucoup plus rigide que l’échantillon ne déviera pas beaucoup, tandis qu’un porte-à-faux trop mou ne déformera pas suffisamment l’échantillon. Une fréquence de résonance typique devrait être suffisante pour faire basculer le porte-à-faux dans le liquide (c.-à-d. être d’au moins quelques dizaines de kHz). La surface de contact doit être petite par rapport à la taille de la paroi cellulaire puisque l’échantillon étudié dans les calculs de module de Young est supposé être un demi-espace infini. Les porte-à-faux suivants ont été utilisés pour les racines de seigle et de maïs: des porte-à-faux pointus avec une fréquence de résonance typique de 60 kHz, une constante de ressort moyenne de 1,5 N·m-1 et un rayon d’apex de 10 nm, ou des porte-à-faux sphériques avec une fréquence de résonance typique de 75 kHz, une constante de ressort moyenne de 2,8 N·m-1, et un rayon d’apex de 150 nm. - Allumez l’appareil AFM et le logiciel associé (Table des matériaux). Montez le porte-à-faux sur le support de pointe de la cellule liquide. Placez une goutte de liquide sur l’embout pour éviter la formation de bulles d’air sur l’embout tout en l’immergeant dans le liquide.
REMARQUE: En cas de formation de bulles, le liquide peut être retiré avec une lingette de précision, puis une nouvelle goutte peut être placée. - Montez le porte-pointe sur la tête de numérisation.
- Placez un échantillon dur (lame de verre frais) dans un capuchon de boîte de Pétri. Versez-y le liquide, en veillant à ce qu’il couvre la lame. Placez la tête de balayage sur la scène et soulevez l’échantillon de sorte que le liquide recouvre le porte-à-faux.
- Choisissez l’onglet Têtes dans le menu déroulant Outils . Assurez-vous que la tête de balayage de la cellule liquide est sélectionnée.
- Cliquez sur le bouton Visée pour ouvrir la fenêtre Visée laser. Cliquez sur le bouton Appareil photo pour ouvrir la fenêtre Microscope optique. Positionnez le laser à l’extrémité du porte-à-faux, en utilisant les vis sur la tête AFM et la fenêtre du microscope optique pour l’orientation.
- Choisissez le mode Semi-contact dans le menu déroulant de la fenêtre principale du programme.
- Ouvrez l’onglet Résonance et choisissez le type de porte-à-faux utilisé dans le menu Sondes . Cliquez sur le bouton Auto pour déterminer la fréquence de résonance.
REMARQUE: Si le porte-à-faux utilisé n’est pas répertorié, ouvrez Outils > Probe Passport. Créez un nouveau fichier, entrez les paramètres cantilever et enregistrez-le. Ensuite, choisissez-le dans le menu déroulant Sondes . - Choisissez le mode Contact dans le menu déroulant de la fenêtre principale du programme.
- Cliquez sur le bouton N_Force Cal pour ouvrir la fenêtre d’étalonnage en porte-à-faux. Choisissez le porte-à-faux utilisé et cliquez sur le bouton Sweep , puis sur le bouton Spect Meas pour déterminer la constante de ressort en porte-à-faux à l’aide de la procédure de réglage thermique. Fermez la fenêtre.
- Définissez le point de consigne sur 1 nA. Ouvrez l’onglet Approche et cliquez sur le bouton Atterrissage pour vous approcher de l’échantillon.
- Ouvrez l’onglet Analyse . Réglez la fréquence de balayage sur 0,5 Hz. Cliquez sur le bouton Zone et définissez la taille de numérisation sur 10 μm x 10 μm et le point de numérisation sur 256 x 256. Cliquez sur le bouton Exécuter et scannez environ 20 lignes pour vérifier qu’il n’y a pas de contamination sur le verre. Cliquez sur le bouton Arrêter pour terminer l’analyse sans perdre de données.
- Ouvrez l’onglet Courbes . Définissez les paramètres de rétraction et d’approche à 500 nm et -100 nm, respectivement.
- Choisissez le dernier balayage dans le menu déroulant Sélectionnez Image pour observer la surface.
- Trouvez une zone propre sur le verre et indiquez le point où la courbe force-déformation doit être prise, puis cliquez sur le bouton Exécuter pour obtenir la courbe. Enregistrez trois à cinq courbes de force à différents endroits sur le scan.
- Cliquez sur le bouton Données pour ouvrir la fenêtre d’analyse et sélectionnez le cadre avec la courbe force-déformation.
- Cliquez sur le bouton Pair Markers et indiquez la partie linéaire de la courbe de rétraction pour calculer le rapport du signal DFL au déplacement, qui est la sensibilité optique inverse (IOS, nA nm-1) ou la sensibilité de déflexion.
- Répétez l’étape 2.17 pour toutes les courbes enregistrées et notez toutes les valeurs calculées du rapport signal / déplacement DFL. Ils devraient être les mêmes.
- Fermez la fenêtre d’analyse, cliquez sur l’onglet Approche , puis sur le bouton Supprimer pour retirer la sonde de l’échantillon.
3. Acquisition des données
- Guidez l’échantillon sous le porte-à-faux AFM à l’aide du microscope optique. Cliquez sur l’onglet Approche , puis sur le bouton Atterrissage pour approcher l’échantillon en mode contact avec un point de consigne de 1 nA.
- Cliquez sur l’onglet Numérisation , puis sur le bouton Zone . Sélectionnez la taille de zone de 70 μm x 70 μm à numériser.
- Cliquez sur le bouton Déplacer la sonde et vérifiez toute la zone de numérisation en déplaçant le scanner dessus. En fonction du degré de saillie du scanner, trouvez le point le plus élevé.
- Ouvrez l’onglet Approche , puis cliquez sur le bouton Supprimer pour vous rétracter de l’échantillon. En utilisant le point le plus élevé comme cible, cliquez sur le bouton Atterrissage pour vous approcher à nouveau de l’échantillon. Ensuite, vérifiez à nouveau la surface en cliquant sur le bouton Déplacer la sonde et en déplaçant le scanner dessus. Aucun des points de la zone ne doit nécessiter que le scanner soit complètement relevé.
REMARQUE: Idéalement, la plage z du scanner devrait dépasser la différence de hauteur de l’échantillon. Cependant, il est acceptable si certains points de la zone de numérisation sont inférieurs à la capacité du scanner. En même temps, il ne devrait pas y avoir beaucoup de points de ce genre. De grandes zones qui ne peuvent pas être atteintes par le scanner peuvent provoquer l’avortement par balayage. - Définissez la fréquence de balayage sur 0,5 Hz. Définissez la taille de numérisation sur 70 μm x 70 μm et le point de numérisation sur 64 x 64. Cliquez sur le bouton Exécuter et scannez pour vérifier la surface de l’échantillon et sa contamination possible par l’agarose.
REMARQUE: Si l’échantillon a des cellules avec une grande lumière, la taille de la zone de balayage peut être réduite, ou il doit être déplacé afin qu’il y ait plus de parois cellulaires sur le scan. - Cliquez sur le bouton On en haut de la fenêtre principale pour désactiver la boucle de rétroaction.
- Choisissez le mode HDPlus (méthode force-volume) dans le menu déroulant de la fenêtre principale du programme. Une fenêtre supplémentaire (fenêtre HD) apparaîtra.
- Définissez le point de consigne sur 0,1 nA dans la fenêtre principale du programme.
- Dans l’onglet Principal de la fenêtre HD, définissez les paramètres de balayage (amplitude et fréquence du mouvement sinusoïdal en porte-à-faux) appropriés à l’échantillon étudié.
REMARQUE: Chaque type d’échantillon et de porte-à-faux nécessite la sélection des paramètres de numérisation. Quelques expériences préliminaires sont nécessaires. Pour les racines de maïs ou de seigle, des porte-à-faux tranchants et sphériques ont été utilisés à une amplitude de 400 nm et à une fréquence de 300 Hz. - Ouvrez l’onglet Bruits dans la fenêtre HD et entrez la fréquence de résonance du porte-à-faux.
- Ouvrez l’onglet Quant de la fenêtre HD et entrez IOS, rigidité en porte-à-faux, rayon et angle de pointe. Sélectionnez le modèle de contact qui sera utilisé pour les calculs en fonction de la géométrie de la pointe.
REMARQUE: Le modèle DMT prend en compte la force d’adhérence existant entre la sonde et l’échantillon, et est le plus couramment utilisé en mécanobiologie21. - Ouvrez l’onglet Scan de la fenêtre HD et sélectionnez les signaux à enregistrer. Sélectionnez la direction dans laquelle le signal est enregistré. Cochez la case Forcer le volume pour obtenir un enregistrement de toutes les courbes de force.
REMARQUE: Enregistrez le signal du module d’élasticité dans les directions avant et arrière. Il fournira plus de points à calculer. - Cliquez sur le bouton Désactivé en haut de la fenêtre principale du programme pour activer la boucle de rétroaction.
- Cliquez sur le bouton PhaseCorr dans la fenêtre HD principale pour corriger la sensibilité du système optique.
- L’onglet vs Time de la fenêtre HD principale présente la fonction du signal DFL par rapport au temps en temps réel; Sélectionnez les parties de cette fonction qui seront utilisées pour la détermination du niveau de référence et pour ajuster le modèle de contact pour d’autres calculs.
- Définissez la valeur du point de balayage sur 256 x 256 dans la fenêtre principale du programme. Réglez la fréquence d’analyse sur 0,2 Hz et cliquez sur le bouton Exécuter pour analyser l’échantillon.
- Une fois la numérisation terminée, cliquez sur le bouton On en haut de la fenêtre principale pour désactiver la boucle de rétroaction.
- Choisissez le mode Contact dans le menu déroulant, ouvrez l’onglet Approche et cliquez sur le bouton Supprimer pour vous retirer de l’échantillon.
- Cliquez sur le bouton Données pour ouvrir le logiciel d’analyse et enregistrer la sortie.
- À la fin de la journée de mesure, retirez le porte-embout en porte-à-faux de la tête et rincez-le soigneusement à l’eau ultrapure plusieurs fois. Chaque fois, retirez l’eau avec une lingette de précision.
4. Évaluation et post-traitement des données
REMARQUE : Ne vous fiez pas aux valeurs de module d’élasticité calculées automatiquement. Étant donné que la surface varie considérablement en hauteur, de nombreuses courbes d’artefacts doivent être expulsées.
- Ouvrez le fichier enregistré dans le logiciel d’analyse.
- Sélectionnez le cadre HDForceVolume .
- Maintenez la touche Ctrl enfoncée et sélectionnez une image visuelle obtenue dans le même sens de numérisation. Cliquez sur le bouton Charger la carte externe pour voir où se trouvent les parois cellulaires.
REMARQUE : Toute carte de signaux peut être utilisée comme cadre visuel, mais l’utilisation de la carte de signaux LDF (différents instruments peuvent l’appeler un signal de déviation ou un signal d’erreur) peut être le moyen le plus simple. - Vérifiez les valeurs de rigidité InvOptSens (IOS) et cantilever dans l’onglet Principal.
- Ouvrez l’onglet Supplémentaire et vérifiez les paramètres de l’astuce et le modèle de contact.
- Cliquez sur différents points des parois cellulaires du cadre visuel et sélectionnez uniquement les courbes bien décrites par le modèle. Voir Résultats représentatifs pour plus de détails.
- Notez les valeurs obtenues.
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Representative Results
Les cartes typiques du module d’élasticité et du LDF, ainsi que les courbes de force obtenues sur les racines de seigle et de maïs par la méthode décrite, sont présentées à la figure 2. La figure 2A montre les cartes du module d’élasticité et du LDF obtenues sur la section transversale de la racine primaire du seigle. Les zones blanches dans la carte des modules (Figure 2A, à gauche) correspondent à une surestimation erronée du module de Young due au fait que le scanner a atteint sa limite dans la direction z. Cette image ne peut pas être utilisée comme carte externe pour une sélection ultérieure de courbes de force satisfaisantes. La carte des signaux LDF (carte de déflexion/erreur) présentée à droite (figure 2A) convient mieux à cette fin.
Les cartes de module des sections transversales et longitudinales de la racine de maïs sont présentées à la figure 2B,C. Le scanner qui a été complètement étendu en essayant d’atteindre le bas de l’échantillon peut entraîner des mesures erronées et même des balayages interrompus (partie supérieure de la figure 2C). Parfois, après avoir obtenu un bon balayage en mode contact, l’instrument contracte soudainement complètement le scanner, l’alarmant qu’il a atteint la limite maximale de direction z lorsqu’il passe en mode force-volume. Cela signifie que l’échantillon n’a pas été immobilisé correctement et a flotté. Un nouvel échantillon doit être préparé.
La contamination par l’agarose peut également être une raison de préparer un nouvel échantillon (figure 2D,E). La présence d’agarose peut être vérifiée lors de l’obtention du premier scan en mode contact (étape 3.5). Idéalement, les parois cellulaires et certains fonds cellulaires devraient être visibles sur ces scans (Figure 2D); cependant, en cas d’immobilisation imprécise, la surface peut être recouverte d’agarose (figure 2E), qui masque la topographie de l’échantillon.
La figure 2F montre quatre courbes de force différentes enregistrées en différents points de la même paroi cellulaire. La courbe enregistrée au point 1 ne montre pas de ligne de base. Cela signifie qu’il n’y avait pas de séparation de la pointe en porte-à-faux de la paroi cellulaire. Le module calculé à partir de cette courbe a été surestimé. La courbe enregistrée au point 3 montre un épaulement sur la partie en approche. Cet artefact peut indiquer que la paroi cellulaire était pliée. Les deux courbes enregistrées aux points 1 et 3 devraient être expulsées. Les points 2 et 4 montrent des courbes de force satisfaisantes avec des valeurs similaires de modules. Les critères suivants peuvent être utilisés pour distinguer les courbes appropriées: i) le niveau de référence doit être évident à la fois sur les parties de la courbe qui approchent et sur les parties rétractées; ii) il ne doit pas y avoir d’irrégularités telles que des accotements ou des défaillances (apparaît comme des valeurs de force constantes et une diminution soudaine des valeurs de force au milieu de la pente, respectivement); iii) le modèle choisi doit bien s’adapter à la courbe. Pour toutes les courbes sélectionnées, les valeurs de force maximale appliquée doivent être similaires. Une force maximale appliquée nettement supérieure ou inférieure à la valeur attendue peut également être utilisée comme critère d’expulsion de la courbe. L’utilisation de réseaux neuronaux pour éliminer les courbes de mauvaise qualité19 peut accélérer le traitement des résultats.
Figure 1 : Étapes critiques de la préparation des échantillons. (A) Fragment de racine encastré dans un bloc d’agarose et monté sur l’étage du vibratome. (B) Section d’échantillon placée sur une couche d’agarose à 1 % et immobilisée avec de l’agarose supplémentaire dans un capuchon de boîte de Pétri. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images et mesures AFM typiques sur les racines primaires. (A) Module d’élasticité et cartes DFL d’une section transversale de la racine de seigle. Cartes entièrement enregistrées (B) et interrompues (C) du module d’élasticité obtenues sur des coupes longitudinales et transversales de racine de maïs. Vue 3D de coupes propres (D) et recouvertes d’agarose (E) de racines de maïs. (F) Une carte DFL d’une coupe transversale de racine de maïs. Les points 1 à 4 sur la paroi cellulaire montrent les positions où les courbes de force présentées sur le côté droit de l’image ont été enregistrées. La ligne rouge est pour l’approche, la ligne bleue est pour la rétraction et la ligne noire montre l’ajustement du modèle de mécanique de contact. Les courbes enregistrées aux points 1 et 3 ont des artefacts et ne peuvent pas être utilisées pour les calculs. Les racines de seigle ont été examinées avec des pointes pointues, et les racines de maïs ont été examinées avec des pointes sphériques. Abréviations : Rhiz = rhizoderme, Exo = exoderme, OC = cortex externe, IC = cortex interne, End = endoderme, Per = péricycle et VP = parenchyme vasculaire. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les propriétés mécaniques des parois cellulaires primaires déterminent la direction et le taux de croissance des cellules végétales, et donc la taille et la forme futures de la plante. La méthode basée sur l’AFM présentée ici complète les techniques existantes qui sont utilisées pour étudier les propriétés des parois cellulaires végétales. Il permet d’étudier l’élasticité des parois cellulaires, qui appartiennent aux tissus internes de la plante. En utilisant la méthode présentée, les propriétés mécaniques des parois cellulaires dans différents tissus de la racine de maïs en croissance ont été cartographiées, et un modèle mathématique a été construit sur la base de ces propriétés6. La racine simulée a répondu à l’application d’une pression imitant la turgescence par des changements de taille linéaire. Ces changements se situaient dans la même gamme et dans la direction opposée à ceux présentés par une racine fraîchement excisée en milieu plasmolysant6.
La préparation de l’échantillon est essentielle pour ce protocole. Le séchage de l’échantillon doit être évité pendant toute la préparation. Le placement correct du matériel végétal à sectionner est une question importante; Les parois cellulaires doivent être orientées strictement perpendiculairement au futur plan de balayage. Sinon, des courbes force-déformation insatisfaisantes seront obtenues parce que la paroi cellulaire a été pliée ou bouclée. La section incrustée d’agarose doit être solidement fixée avec de l’agarose supplémentaire (figure 2B). Ce dernier ne doit pas entrer dans l’échantillon, sinon les propriétés de l’agarose seront mesurées. La partie la plus importante de ce protocole consiste à filtrer les courbes de force résultantes. Même l’étude d’objets modèles, tels que les grilles d’étalonnage AFM, peut entraîner une proportion importante de courbes force-déformationerronées 22. L’utilisation directe des valeurs de module calculées sans analyser les courbes force-déformation sous-jacentes peut conduire à des conclusions erronées (Figure 2F).
La technique n’est pas limitée par la localisation de la cellule ou la taille des organes végétaux. Cependant, les objets trop petits sont difficiles à couper, à orienter et à immobiliser. Il est difficile de travailler avec les cellules avec une grande lumière car il existe une forte probabilité d’interruption du balayage (Figure 2C).
Avec tous les avantages de l’utilisation de sections végétales non fixées préparées avec un vibratome, il y a au moins deux questions cruciales: la possibilité de développer une réaction de stress après la découpe du matériel végétal et la possibilité de solubilisation partielle du matériau des parois cellulaires coupées. Les deux peuvent entraîner des changements dans la composition et les propriétés des parois cellulaires. La présence d’une réponse immédiate au stress sur la coupure a été testée sur les apex d’Arabidopsis 10. Aucun effet significatif sur les propriétés observées n’a été rapporté. Des expériences ont été menées pour tester les changements dans les propriétés des parois cellulaires coupées pendant leur incubation dans l’eau19. Il n’y a pas eu de tendance stable dans les valeurs apparentes du module de Young mesurées sur la même paroi de racine de maïs pendant au moins une demi-heure19. Cependant, il est préférable de maintenir le temps des expériences aussi court que possible et de vérifier chaque échantillon pour de tels changements pendant l’incubation de l’échantillon dans l’eau.
L’AFM est une technique puissante pour étudier les parois cellulaires des plantes. Cependant, il est évident que les calculs du module d’élasticité, de la rigidité et de l’adhérence sont basés sur plusieurs hypothèses qui ne sont pas remplies par les parois cellulaires végétales. Tous les modèles de mécanique de contact utilisés par l’AFM considèrent le spécimen étudié comme un demi-espace infini de matière isotrope, ce qui n’est pas vrai pour les parois cellulaires végétales. Simultanément, on suppose que la géométrie et les propriétés du pénétrateur sont mesurées avec précision et constantes sur la durée de vie en porte-à-faux, ce qui peut également être erroné. En outre, les parois cellulaires végétales présentent un comportement mécanique complexe impliquant des composants élastiques, viscoélastiques et plastiques, et généralement un seul d’entre eux peut être mesuré dans une seule expérience. Néanmoins, les données obtenues à l’aide de méthodes basées sur l’AFM sont corrélées de manière fiable avec la croissance des cellules végétales et les performances mécaniques de divers organes et espèces 3,4,5,6. Tout cela signifie que la technique elle-même et la compréhension des données obtenues avec elle peuvent être améliorées.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Dmitry Suslov (Université d’État de Saint-Pétersbourg, Saint-Pétersbourg, Russie) et le professeur Mira Ponomareva (Institut tatar de recherche scientifique sur l’agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Russie) pour avoir fourni des semences de maïs et de seigle, respectivement. La méthode présentée a été développée dans le cadre du projet de la Fondation scientifique russe n ° 18-14-00168 attribué à LK. La partie du travail (obtention des résultats présentés) a été réalisée par AP avec le soutien financier de la mission gouvernementale pour le FRC Kazan Scientific Center of RAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
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