Summary
Studien der Zellwandbiomechanik sind essentiell für das Verständnis des Pflanzenwachstums und der Morphogenese. Das folgende Protokoll wird vorgeschlagen, um dünne primäre Zellwände in den inneren Geweben junger Pflanzenorgane mittels Rasterkraftmikroskopie zu untersuchen.
Abstract
Die mechanischen Eigenschaften der primären Zellwände bestimmen die Richtung und Geschwindigkeit des Pflanzenzellwachstums und damit die zukünftige Größe und Form der Pflanze. Viele ausgeklügelte Techniken wurden entwickelt, um diese Eigenschaften zu messen; Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist jedoch nach wie vor am besten geeignet, um die Elastizität der Zellwand auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Eine der wichtigsten Einschränkungen dieser Technik war, dass nur oberflächliche oder isolierte lebende Zellen untersucht werden können. Hier wird die Verwendung der Rasterkraftmikroskopie zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von primären Zellwänden vorgestellt, die zu den inneren Geweben eines Pflanzenkörpers gehören. Dieses Protokoll beschreibt Messungen des scheinbaren Elastizitätsmoduls von Zellwänden in Wurzeln, aber die Methode kann auch auf andere Pflanzenorgane angewendet werden. Die Messungen werden an vibratom-abgeleiteten Abschnitten von Pflanzenmaterial in einer flüssigen Zelle durchgeführt, was (i) die Verwendung von Plasmolyselösungen oder Probenimprägnierung mit Wachs oder Harz vermeidet, (ii) die Experimente schnell macht und (iii) eine Austrocknung der Probe verhindert. Je nachdem, wie die Probe geschnitten wurde, können sowohl antiklinale als auch periklinale Zellwände untersucht werden. Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften verschiedener Gewebe können in einem einzigen Abschnitt untersucht werden. Das Protokoll beschreibt die Prinzipien der Studienplanung, Probleme bei der Probenvorbereitung und den Messungen sowie die Methode zur Auswahl von Kraft-Verformungskurven, um den Einfluss der Topographie auf die erhaltenen Werte des Elastizitätsmoduls zu vermeiden. Die Methode ist nicht durch die Stichprobengröße begrenzt, sondern empfindlich gegenüber der Zellgröße (dh Zellen mit einem großen Lumen sind schwer zu untersuchen).
Introduction
Die mechanischen Eigenschaften der pflanzlichen Zellwand bestimmen die Form der Zelle und ihre Wachstumsfähigkeit. Zum Beispiel ist die wachsende Spitze des Pollenschlauches weicher als die nicht wachsenden Teile derselben Röhre1. Der Primordia-Bildung auf Arabidopsis meristem geht eine lokale Abnahme der Zellwandsteifigkeit an der Stelle des zukünftigen Primordiums 2,3 voraus. Die Zellwände von Arabidopsis hypocotyl, die parallel zur Hauptwachstumsachse verlaufen und schneller wachsen, sind weicher als diejenigen, die senkrecht zu dieser Achse stehen und langsamer wachsen 4,5. In der Maiswurzel ging der Übergang der Zellen von der Teilung zur Dehnung mit einer Abnahme der Elastizitätsmodule in allen Geweben der Wurzel einher. Die Module blieben in der Dehnungszone niedrig und nahmen in der späten Dehnungszone6 zu.
Trotz der Verfügbarkeit verschiedener Methoden werden die großen biochemischen und genetischen Informationen zur Zellwandbiologie, die jährlich gewonnen werden, selten mit den mechanischen Eigenschaften der Zellwände verglichen. Zum Beispiel haben Mutanten auf Zellwand-verwandten Genen oft verändertes Wachstum und Entwicklung 4,7,8, werden aber selten biomechanisch beschrieben. Einer der Gründe dafür ist die Schwierigkeit, Messungen auf zellulärer und subzellulärer Ebene durchzuführen. Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist derzeit der primäre Ansatz für solche Analysen9.
In den letzten Jahren wurden zahlreiche AFM-basierte Studien zur Biomechanik pflanzlicher Zellwände durchgeführt. Die mechanischen Eigenschaften der Zellwände der äußeren Gewebe von Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 und Zwiebel 12 sowie von kultivierten Zellen 13,14,15 wurden untersucht. Die oberflächlichen Zellen einer Pflanze können jedoch Zellwände aufweisen, deren mechanische Eigenschaften sich von denen der inneren Gewebe unterscheiden6. Darüber hinaus werden Pflanzenzellen durch Turgor unter Druck gesetzt, was sie steifer macht. Um den Einfluss des Turgordrucks loszuwerden, müssen die Forscher Plasmolyselösungen 2,3,4,5,10,11 verwenden oder die erhaltenen Werte in Turgor- und Zellwandbeiträgezerlegen 12. Der erste Ansatz führt zur Dehydratisierung der Probe und verändert die Dicke und Eigenschaften der Zellwand16, während der zweite Ansatz zusätzliche Messungen und komplizierte Mathematik erfordert und nur für Zellen der relativ einfachen Form12 gilt. Die Zellwandeigenschaften von inneren Geweben können an Kryosektionen17 oder mitHarz 8 imprägnierten Pflanzenmaterialabschnitten bewertet werden. Beide Methoden beinhalten jedoch eine Dehydratisierung und/oder Imprägnierung von Proben, was unweigerlich zu Veränderungen der Eigenschaften führt. Die Eigenschaften isolierter oder kultivierter Zellen lassen sich schwer mit der Physiologie der gesamten Pflanze in Verbindung bringen. Sowohl die Kultivierung als auch die Isolierung von Pflanzenzellen können die mechanischen Eigenschaften ihrer Zellwände beeinflussen.
Die hier vorgestellte Methode ergänzt die oben genannten Ansätze. Damit können die primären Zellwände jedes Gewebes und in jedem Stadium der Pflanzenentwicklung untersucht werden. Schnitt- und AFM-Beobachtungen wurden in Flüssigkeit durchgeführt, wodurch eine Austrocknung der Probe vermieden wird. Das Problem des Turgors wurde gelöst, wenn die Zellen geschnitten werden. Das Protokoll beschreibt die Arbeit mit Mais- und Roggenwurzeln, aber jede andere Probe kann untersucht werden, ob sie für das Schneiden von Vibratomen geeignet ist.
Die hier beschriebenen AFM-Studien wurden mit der Kraft-Volumen-Technik durchgeführt. Verschiedene Instrumente verwenden unterschiedliche Namen für diese Methode. Das Grundprinzip ist jedoch dasselbe; Eine Kraft-Volumen-Karte der Probe wird durch eine sinusförmige oder dreieckige Bewegung des Cantilevers (oder der Probe) erhalten, um an jedem analysierten Punkt eine bestimmte Belastungskraft zu erreichen, während die Cantilever-Auslenkung18 aufgezeichnet wird. Das Ergebnis kombiniert ein topographisches Bild der Oberfläche und die Anordnung von Kraft-Weg-Kurven. Jede Kurve wird verwendet, um die Verformung, Steifigkeit, Elastizitätsmodul, Adhäsion und Energiedissipation an einem bestimmten Punkt zu berechnen. Ähnliche Daten können durch Punkt-für-Punkt-Kraftspektroskopie nach dem Scannen im Kontaktmodus19 gewonnen werden, obwohl dies zeitaufwendiger ist.
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Protocol
1. Probenvorbereitung für AFM-Messungen
- Pflanzenmaterial: Die Samen von Mais (Zea mays L.) und Roggen (Secale cereale L.) mit einer 0,35%igen NaOCl-Lösung für 10 min sterilisieren, 3x mit destilliertem Wasser waschen und dann hydroponisch im Dunkeln bei 27 °C für 4 bzw. 2 Tage anbauen. Für das Experiment wurden Primärwurzeln verwendet.
- Vorbereitung von Lösungen und Proben für die Vibratomsektion
- Agaroselösung für die Wurzeleinbettung vorbereiten, indem 3% (w/w) Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in Wasser mit einem Mikrowellenofen gelöst werden.
HINWEIS: Alle Experimente wurden in Wasser durchgeführt. Wenn für die Untersuchung ein Puffer oder eine andere Art von Medium erforderlich ist, ist es besser, dasselbe Medium für die Agarosezubereitung, während des Schneidens und in der flüssigen Zelle des AFM zu verwenden, um eine Beschädigung der Probe zu vermeiden. - Gießen Sie eine 4 mm dicke Schicht geschmolzener 3%iger Agarose auf den Boden der Petrischale (Durchmesser = 35 mm) und lassen Sie sie leicht abkühlen, um thermische Schäden an der Probe zu vermeiden.
- Legen Sie drei oder vier kleine Stücke (etwa 5 mm lang) des untersuchten Pflanzenorgans horizontal auf die Agarose.
HINWEIS: Die Proben sollten halb eingetaucht, aber nicht in die Agaroseschicht eingetaucht sein. Wenn die Probe nicht eingetaucht wird, kann sie während des Vibratomschnitts aus der Agarose ausbrechen. Wenn die Probe auf den Boden sinkt, befindet sie sich zu nahe am Rand des Abschnitts und wird für weitere Schritte unbequem. - Wenn ein dünner, halbfester Film auf der ersten Agaroseschicht erscheint (30-60 s), gießen Sie vorsichtig eine zweite Schicht darauf.
HINWEIS: Die untere Schicht der Agarose sollte sich nicht vollständig verfestigen. Andernfalls können sich die beiden Schichten während der weiteren Arbeit voneinander trennen. - Nachdem die Agarose vollständig erstarrt ist, schneiden Sie den Block mit der Probe aus. Formen Sie den Block zu einer sechseckigen Pyramidenstumpfe, um seine Stabilität während des weiteren Schneidens zu gewährleisten (Abbildung 1A).
HINWEIS: Die Probe kann je nach Art des erforderlichen Abschnitts vertikal oder horizontal innerhalb dieses Blocks ausgerichtet werden. Wenn Sie den Block vorbereiten, lassen Sie 2-3 mm Agarose um die Probe. In diesem Fall wird der Probenabschnitt von der 3%igen Agaroseschicht zurückgehalten, was seine weitere Immobilisierung erleichtert (Abbildung 1B).
- Agaroselösung für die Wurzeleinbettung vorbereiten, indem 3% (w/w) Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in Wasser mit einem Mikrowellenofen gelöst werden.
- Schneiden der Probe mit dem Vibratom
- Kleben Sie den Block mit Cyanacrylatkleber auf die Vibratomstufe. Platzieren Sie die Bühne im Vibratom so, dass eine der Pyramidenecken der Klinge des Vibratoms zugewandt ist. Gießen Sie Wasser in das Vibratombad.
- Stellen Sie die Schnittparameter (Schnittdicke, Schaufelgeschwindigkeit und Vibrationsfrequenz) ein und schneiden Sie die Probe.
HINWEIS: Verwenden Sie die Profildicken zwischen 200 und 400 μm. Ein zu dünner Abschnitt kann zu Fehlern bei der Bewertung der mechanischen Eigenschaften führen, während ein zu dicker Abschnitt bruchanfällig ist. Für Roggen- und Maiswurzeln wurde eine Schaufelgeschwindigkeit von 1,3 mm·s-1 und eine Schwingungsfrequenz von 90 Hz verwendet. - Bewegen Sie den Abschnitt mit einer feinen Bürste aus dem Wasserbad auf einen Glasschieber und legen Sie einen Tropfen Wasser auf den Abschnitt, um ein Austrocknen zu verhindern. Überprüfen Sie die Qualität des Schnitts unter einem Lichtmikroskop.
HINWEIS: Schräge Schnitte können nicht zur Messung des Elastizitätsmoduls verwendet werden. Die Zellwände müssen senkrecht zur Schnittebene stehen, da sie sich sonst unter der AFM-Spitze biegen oder knicken können.
- Immobilisieren des Abschnitts für AFM-Messungen (Abbildung 1B)
- Gießen Sie eine Schicht geschmolzener 1% (w / w) Agarose (~ 1 ml) mit einer Pipette auf den Boden der Petrischalenkappe.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Seiten der Petrischalenkappe nicht verhindern, dass sich die Spitze der Probe nähert. Die Agaroseschicht sollte 1 mm dick sein und den gesamten Boden der Kappe bedecken. - Nachdem die 1%ige Agarose erstarrt ist, entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Abschnitt, indem Sie Filterpapier an den Rand bringen.
HINWEIS: Berühren Sie den Pflanzenabschnitt nicht mit dem Papier, um Beschädigungen und ein vollständiges Austrocknen der Probe zu vermeiden. - Übertragen Sie den Abschnitt vom Objektträger vorsichtig mit einem Pinsel in die Mitte der Petrischalenkappe. Geben Sie mit einer 20-μL-Pipette vorsichtig 1% Agarose um den Abschnitt herum hinzu (Abbildung 1B).
HINWEIS: Die 1%ige Agarose sollte nicht auf die Probe selbst gelangen. Es sollte nur die Ränder der 3% igen Agaroseschicht bedecken, die das Pflanzenexemplar zurückhält. Die 1%ige Agarose sollte an den Rändern dieser 3%igen Agaroseschicht kleine Hügel bilden. Große Hügel können verhindern, dass sich der Ausleger der Probe nähert. - Gießen Sie das Wasser oder eine andere Lösung, die für das AFM verwendet werden soll, in die Petrischale mit dem immobilisierten Abschnitt.
- Gießen Sie eine Schicht geschmolzener 1% (w / w) Agarose (~ 1 ml) mit einer Pipette auf den Boden der Petrischalenkappe.
2. AFM-Vorbereitung und Kalibrierung
ANMERKUNG: Die Kraft-Volumen-Methode von AFM erzeugt ein räumlich aufgelöstes Array von Kraft-Weg-Kurven, die an jedem Punkt der untersuchten Fläche erhalten werden. Ermitteln Sie alle Parameter für den Kraft-Volumen-Modus (Cantilever-Steifigkeit, IOS usw.) im Kontaktmodus. Ähnliche Verfahren für Geräte anderer Hersteller wurden bereits10,20 beschrieben.
- Wählen Sie den entsprechenden Auslegertyp aus.
ANMERKUNG: Die Cantilever-Steifigkeit muss mit der Probensteifigkeit21 vergleichbar sein. Ein Ausleger, der viel steifer ist als die Probe, wird nicht viel ablenken, während ein zu weicher Cantilever die Probe nicht genug verformt. Eine typische Resonanzfrequenz sollte ausreichen, um den Cantilever in der Flüssigkeit zu schwingen (d.h. mindestens einige zehn kHz). Die Kontaktfläche sollte im Vergleich zur Größe der Zellwand klein sein, da die in den Berechnungen des Elastizitätsmoduls untersuchte Probe als unendlicher Halbraum angenommen wird. Für Roggen- und Maiswurzeln wurden folgende Ausleger verwendet: scharfe Ausleger mit einer typischen Resonanzfrequenz von 60 kHz, einer mittleren Federkonstante von 1,5 N·m-1 und einem Scheitelradius von 10 nm oder sphärische Ausleger mit einer typischen Resonanzfrequenz von 75 kHz, einer mittleren Federkonstante von 2,8 N·m-1, und einem Scheitelradius von 150 nm. - Schalten Sie das AFM-Gerät und die zugehörige Software (Table of Materials) ein. Montieren Sie den Ausleger auf dem Spitzenhalter für die Flüssigkeitszelle. Legen Sie einen Tropfen Flüssigkeit auf die Spitze, um zu vermeiden, dass sich Luftblasen auf der Spitze bilden, während Sie sie in die Flüssigkeit eintauchen.
HINWEIS: Im Falle einer Blasenbildung kann die Flüssigkeit mit einem Präzisionstuch entfernt und dann ein neuer Tropfen platziert werden. - Montieren Sie den Spitzenhalter am Scankopf.
- Eine harte Probe (frischer Glasobjektträger) in eine Petrischalenkappe geben. Gießen Sie die Flüssigkeit hinein und stellen Sie sicher, dass sie den Objektträger bedeckt. Stellen Sie den Scankopf auf den Tisch und heben Sie die Probe so an, dass die Flüssigkeit den Ausleger bedeckt.
- Wählen Sie im Dropdown-Menü Extras die Registerkarte Köpfe. Stellen Sie sicher, dass der Scankopf für die Flüssigkeitszelle ausgewählt ist.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Zielen , um das Fenster Laserzielen zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kamera , um das Fenster Optisches Mikroskop zu öffnen. Positionieren Sie den Laser an der Spitze des Auslegers und verwenden Sie die Schrauben am AFM-Kopf und das Fenster des Lichtmikroskops zur Orientierung.
- Wählen Sie den Semicontact-Modus aus dem Dropdown-Menü im Hauptfenster des Programms.
- Öffnen Sie die Registerkarte Resonanz und wählen Sie im Menü Sonden den Typ des Auslegers aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auto , um die Resonanzfrequenz zu bestimmen.
HINWEIS: Wenn der verwendete Ausleger nicht aufgeführt ist, öffnen Sie Tools > Probe Passport. Erstellen Sie eine neue Datei, geben Sie die Cantilever-Parameter ein und speichern Sie sie. Wählen Sie es dann im Dropdown-Menü Probes aus. - Wählen Sie den Kontaktmodus aus dem Dropdown-Menü im Hauptfenster des Programms.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche N_Force Cal , um das Cantilever-Kalibrierungsfenster zu öffnen. Wählen Sie den verwendeten Ausleger aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Sweep und dann auf die Schaltfläche Spect Meas , um die Cantilever-Federkonstante mit dem Thermal-Tune-Verfahren zu bestimmen. Schließen Sie das Fenster.
- Legen Sie den Sollwert auf 1 nA fest. Öffnen Sie die Registerkarte Anflug und klicken Sie auf die Schaltfläche Lande , um sich dem Beispiel zu nähern.
- Öffnen Sie die Registerkarte Scannen . Stellen Sie die Scanrate auf 0,5 Hz ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bereich und stellen Sie die Scangröße auf 10 μm x 10 μm und den Scanpunkt auf 256 x 256 ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen und scannen Sie etwa 20 Zeilen, um sicherzustellen, dass das Glas nicht verunreinigt ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp , um den Scan ohne Datenverlust zu beenden.
- Öffnen Sie die Registerkarte Kurven . Stellen Sie die Parameter für den Rückzug und die Annäherung an 500 nm bzw. -100 nm ein.
- Wählen Sie den letzten Scan im Dropdown-Menü Rahmen auswählen aus, um die Oberfläche zu beobachten.
- Suchen Sie einen sauberen Bereich auf dem Glas und geben Sie den Punkt an, an dem die Kraft-Verformungskurve aufgenommen werden soll, und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um die Kurve zu erhalten. Zeichnen Sie drei bis fünf Kraftkurven an verschiedenen Stellen des Scans auf.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Daten , um das Analysefenster zu öffnen, und wählen Sie den Rahmen mit der Kraft-Verformungskurve aus.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Paarmarkierungen und geben Sie den linearen Teil der Rückzugskurve an, um das Verhältnis des DFL-Signals zur Verschiebung zu berechnen, das der inversen optischen Empfindlichkeit (IOS, nA nm-1) oder der Durchbiegungsempfindlichkeit entspricht.
- Wiederholen Sie Schritt 2.17 für alle aufgezeichneten Kurven und notieren Sie sich alle berechneten Werte des DFL-Signal-Weg-Verhältnisses. Sie sollten gleich sein.
- Schließen Sie das Analysefenster, klicken Sie auf die Registerkarte Ansatz und dann auf die Schaltfläche Entfernen , um die Sonde aus der Probe zurückzuziehen.
3. Datenerfassung
- Führen Sie die Probe mit dem Lichtmikroskop unter den AFM-Cantilever. Klicken Sie auf die Registerkarte Anflug und dann auf die Schaltfläche Lande , um sich der Probe im Kontaktmodus mit einem Sollwert von 1 nA zu nähern.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Scannen und dann auf die Schaltfläche Bereich . Wählen Sie die zu scannende Bereichsgröße von 70 μm x 70 μm aus.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Move Probe und überprüfen Sie den gesamten Scanbereich, indem Sie den Scanner darüber bewegen. Ermitteln Sie anhand des Grades des Scannervorsprungs den höchsten Punkt.
- Öffnen Sie die Registerkarte Ansatz und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Entfernen , um das Beispiel zurückzuziehen. Wenn Sie den höchsten Punkt als Ziel verwenden, klicken Sie auf die Schaltfläche Landing , um sich der Probe erneut zu nähern. Überprüfen Sie dann die Oberfläche erneut, indem Sie auf die Schaltfläche Move Probe klicken und den Scanner darüber bewegen. Keiner der Punkte im Bereich sollte erfordern, dass der Scanner vollständig angehoben wird.
HINWEIS: Idealerweise sollte der Z-Bereich des Scanners die Höhendifferenz der Probe überschreiten. Es ist jedoch akzeptabel, wenn einige Punkte im Scanbereich unter der Kapazität des Scanners liegen. Gleichzeitig sollte es nicht viele solcher Punkte geben. Große Bereiche, die vom Scanner nicht erreicht werden können, können den Scanabbruch verursachen. - Stellen Sie die Scanrate auf 0,5 Hz ein. Stellen Sie die Scangröße auf 70 μm x 70 μm und den Scanpunkt auf 64 x 64 ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen und scannen Sie, um die Oberfläche der Probe und ihre mögliche Kontamination mit Agarose zu überprüfen.
HINWEIS: Wenn die Probe Zellen mit einem großen Lumen enthält, kann die Größe des Scanbereichs reduziert werden, oder er sollte so verschoben werden, dass mehr Zellwände auf dem Scan vorhanden sind. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Ein oben im Hauptfenster, um die Rückkopplungsschleife auszuschalten.
- Wählen Sie den HDPlus-Modus (Force-Volume-Methode) im Dropdown-Menü im Hauptfenster des Programms. Ein zusätzliches Fenster (HD-Fenster) erscheint.
- Stellen Sie den SetPoint im Hauptprogrammfenster auf 0,1 nA ein.
- Stellen Sie auf der Registerkarte Main des HD-Fensters die Scanparameter (Amplitude und Frequenz der sinusförmigen Cantileverbewegung) entsprechend der untersuchten Probe ein.
HINWEIS: Jede Art von Probe und Cantilever erfordert die Auswahl von Scanparametern. Einige Vorversuche sind notwendig. Für Mais- oder Roggenwurzeln wurden scharfe und kugelförmige Ausleger mit einer Amplitude von 400 nm und einer Frequenz von 300 Hz verwendet. - Öffnen Sie die Registerkarte Geräusche im HD-Fenster und geben Sie die Resonanzfrequenz des Auslegers ein.
- Öffnen Sie die Registerkarte Quant des HD-Fensters und geben Sie IOS, Cantilever-Steifigkeit sowie Spitzenradius und -winkel ein. Wählen Sie das Kontaktmodell aus, das für Berechnungen in Abhängigkeit von der Spitzengeometrie verwendet werden soll.
ANMERKUNG: Das DMT-Modell berücksichtigt die zwischen der Sonde und der Probe bestehende Adhäsionskraft und wird am häufigsten in der Mechanobiologie21 verwendet. - Öffnen Sie die Registerkarte Scan des HD-Fensters und wählen Sie die Signale aus, die aufgezeichnet werden sollen. Wählen Sie die Richtung, in der das Signal aufgezeichnet wird. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Kraftvolumen, um eine Aufzeichnung aller Kraftkurven zu erhalten.
HINWEIS: Zeichnen Sie das Elastizitätsmodulsignal sowohl vorwärts als auch rückwärts auf. Es wird mehr Punkte zum Berechnen liefern. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Aus oben im Hauptprogrammfenster, um die Feedbackschleife einzuschalten.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche PhaseCorr im HD-Hauptfenster, um die Empfindlichkeit des optischen Systems zu korrigieren.
- Die Registerkarte "Zeit" des HD-Hauptfensters zeigt die Funktion des DFL-Signals im Vergleich zur Zeit in Echtzeit an. Wählen Sie die Teile dieser Funktion aus, die für die Ermittlung des Basisplans verwendet werden und das Kontaktmodell für weitere Berechnungen anpassen.
- Stellen Sie den Scanpunktwert im Hauptfenster des Programms auf 256 x 256 ein. Stellen Sie die Scanrate auf 0,2 Hz ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um die Probe zu scannen.
- Nachdem der Scanvorgang beendet ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Ein oben im Hauptfenster, um die Rückkopplungsschleife auszuschalten.
- Wählen Sie im Dropdown-Menü Kontaktmodus , öffnen Sie die Registerkarte Ansatz und klicken Sie auf die Schaltfläche Entfernen , um das Beispiel zurückzuziehen.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Daten , um die Analysesoftware zu öffnen und die Ausgabe zu speichern.
- Nehmen Sie am Ende des Messtages den Cantilever-Spitzenhalter vom Kopf und spülen Sie ihn mehrmals vorsichtig mit Reinstwasser ab. Entfernen Sie das Wasser jedes Mal mit einem Präzisionstuch.
4. Datenauswertung und Nachbearbeitung
HINWEIS: Verlassen Sie sich nicht auf automatisch berechnete Elastizitätsmodulwerte. Da die Oberfläche stark in der Höhe variiert, sollten viele Artefaktkurven ausgestoßen werden.
- Öffnen Sie die gespeicherte Datei in der Analysesoftware.
- Wählen Sie den HDForceVolume-Frame aus.
- Halten Sie die Strg-Taste gedrückt und wählen Sie einen visuellen Rahmen aus, der in derselben Scanrichtung erhalten wurde. Klicken Sie auf die Schaltfläche Externe Karte laden , um zu sehen, wo sich die Zellwände befinden.
HINWEIS: Jede Signalkarte kann als visueller Rahmen verwendet werden, aber die Verwendung der DFL-Signalkarte (verschiedene Instrumente können sie als Umlenksignal oder Fehlersignal bezeichnen) kann der einfachste Weg sein. - Überprüfen Sie die Werte für InvOptSens (IOS) und Cantilever-Steifigkeit auf der Registerkarte Haupt.
- Öffnen Sie die Registerkarte Erweitert und überprüfen Sie die Tippparameter und das Kontaktmodell.
- Klicken Sie auf verschiedene Punkte an den Zellwänden des visuellen Rahmens und wählen Sie nur die Kurven aus, die vom Modell gut beschrieben werden. Weitere Informationen finden Sie unter Repräsentative Ergebnisse.
- Notieren Sie sich die erhaltenen Werte.
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Representative Results
Typische Elastizitätsmodul- und DFL-Kennfelder sowie Kraftkurven, die nach dem beschriebenen Verfahren an Roggen- und Maiswurzeln ermittelt wurden, sind in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 2A zeigt Elastizitätsmodul- und DFL-Karten, die auf dem Querschnitt der Roggenprimärwurzel erhalten wurden. Die weißen Bereiche in der Modulkarte (Abbildung 2A, links) entsprechen einer fehlerhaften Überschätzung des Elastizitätsmoduls, da der Scanner seine Grenze in z-Richtung erreicht. Dieses Bild eignet sich nicht als externe Karte für eine weitere Auswahl zufriedenstellender Kraftkurven. Hierfür ist die rechts dargestellte DFL-Signalkarte (Deflection/Error Map) (Bild 2A) besser geeignet.
Die Modulkarten der Quer- und Längsschnitte der Maiswurzel sind in Abbildung 2B,C dargestellt. Der Scanner, der beim Versuch, den Boden der Probe zu erreichen, vollständig ausgefahren wurde, kann zu fehlerhaften Messungen und sogar zu unterbrochenen Scans führen (oberer Teil von Abbildung 2C). Manchmal, nach einem guten Scan im Kontaktmodus, zieht das Instrument den Scanner plötzlich vollständig zusammen, was alarmiert, dass es die maximale Z-Richtungsgrenze erreicht hat, wenn es in den Kraft-Volumen-Modus wechselt. Es bedeutet, dass die Probe nicht richtig immobilisiert und nach oben geschwebt wurde. Eine neue Probe sollte vorbereitet werden.
Die Agarosekontamination kann auch ein Grund sein, eine neue Probe vorzubereiten (Abbildung 2D,E). Das Vorhandensein der Agarose kann überprüft werden, während der erste Scan im Kontaktmodus durchgeführt wird (Schritt 3.5). Idealerweise sollten die Zellwände und einige Zellböden auf solchen Scans sichtbar sein (Abbildung 2D); Im Falle einer ungenauen Immobilisierung kann die Oberfläche jedoch mit Agarose bedeckt sein (Abbildung 2E), die die Probentopographie maskiert.
Abbildung 2F zeigt vier verschiedene Kraftkurven, die an verschiedenen Punkten derselben Zellwand aufgezeichnet wurden. Die an Punkt 1 aufgezeichnete Kurve zeigt keine Basislinie. Es bedeutet, dass es keine Trennung der Cantilever-Spitze von der Zellwand gab. Der aus dieser Kurve berechnete Modul wurde überschätzt. Die bei Punkt 3 aufgezeichnete Kurve zeigt eine Schulter auf dem sich nähernden Teil. Dieses Artefakt kann darauf hinweisen, dass die Zellwand gebogen wurde. Beide an den Punkten 1 und 3 aufgezeichneten Kurven sollten ausgestoßen werden. Die Punkte 2 und 4 zeigen zufriedenstellende Kraftkurven mit ähnlichen Modulwerten. Die folgenden Kriterien können verwendet werden, um geeignete Kurven zu unterscheiden: (i) Das Basislinienniveau sollte sowohl bei sich nähernden als auch bei einfahrenden Teilen der Kurve ersichtlich sein; (ii) es dürfen keine Unregelmäßigkeiten wie Schultern oder Ausfälle auftreten (erscheint als konstante Kraftwerte bzw. eine plötzliche Abnahme der Kraftwerte in der Mitte des Gefälles); (iii) Das ausgewählte Modell sollte gut in die Kurve passen. Für alle ausgewählten Kurven sollten die maximal aufgebrachten Kraftwerte ähnlich sein. Eine maximal aufgebrachte Kraft, die deutlich höher oder niedriger als der Erwartungswert ist, kann auch als Kriterium für den Kurvenausstoß herangezogen werden. Die Verwendung neuronaler Netze zum Verwerfen von Kurvenschlechter Qualität 19 kann die Verarbeitung von Ergebnissen beschleunigen.
Abbildung 1: Kritische Schritte in der Probenvorbereitung . (A) Wurzelfragment, eingebettet in einen Agaroseblock und montiert auf der Vibratomstufe. (B) Probenabschnitt auf eine Schicht von 1% Agarose gelegt und mit zusätzlicher Agarose in einer Petrischalenkappe immobilisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Typische AFM-Bilder und Messungen an Primärwurzeln . (A) Elastizitätsmodul und DFL-Karten eines Querschnitts der Roggenwurzel. Vollständig aufgezeichnete (B) und unterbrochene (C) Karten des Elastizitätsmoduls auf Längs- und Querabschnitten der Maiswurzel. 3D-Ansicht von sauberen (D) und mit Agarose überzogenen (E) Abschnitten von Maiswurzeln. (F) Eine DFL-Karte eines Querschnitts der Maiswurzel. Die Punkte 1-4 an der Zellenwand zeigen die Positionen, an denen die auf der rechten Seite des Bildes dargestellten Kraftkurven aufgezeichnet wurden. Die rote Linie ist für die Annäherung, die blaue Linie für das Zurückziehen und die schwarze Linie zeigt die Anpassung des Kontaktmechanikmodells an. Die an den Punkten 1 und 3 aufgezeichneten Kurven weisen Artefakte auf und können nicht für Berechnungen verwendet werden. Roggenwurzeln wurden mit scharfen Spitzen und Maiswurzeln mit kugelförmigen Spitzen untersucht. Abkürzungen: Rhiz = Rhizodermis, Exo = Exodermis, OC = äußerer Kortex, IC = innerer Kortex, Ende = Endodermis, Per = Perizyklus und VP = vaskuläres Parenchym. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die mechanischen Eigenschaften der primären Zellwände bestimmen die Richtung und Geschwindigkeit des Pflanzenzellwachstums und damit die zukünftige Größe und Form der Pflanze. Die hier vorgestellte AFM-basierte Methode ergänzt bestehende Techniken, mit denen die Eigenschaften pflanzlicher Zellwände untersucht werden. Es ermöglicht es, die Elastizität von Zellwänden zu untersuchen, die zu den inneren Geweben der Pflanze gehören. Mit der vorgestellten Methode wurden die mechanischen Eigenschaften von Zellwänden in verschiedenen Geweben der wachsenden Maiswurzel kartiert und ein mathematisches Modell basierend auf diesen Eigenschaften konstruiert6. Die simulierte Wurzel reagierte auf die Anwendung von druckimitierendem Turgor durch Änderungen der linearen Größe. Diese Veränderungen lagen im gleichen Bereich und in entgegengesetzter Richtung wie eine frisch ausgeschnittene Wurzel im Plasmolysemedium6.
Die Probenvorbereitung ist für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung. Das Austrocknen der Probe sollte während der gesamten Präparation vermieden werden. Die korrekte Platzierung des zu trennenden Pflanzenmaterials ist ein wichtiges Thema; Die Zellwände müssen streng senkrecht zur zukünftigen Abtastebene ausgerichtet sein. Andernfalls werden unbefriedigende Kraft-Verformungskurven erhalten, weil die Zellwand gebogen oder geknickt wurde. Der in Agarose eingebettete Abschnitt sollte mit zusätzlicher Agarose fest fixiert werden (Abbildung 2B). Letztere sollten nicht auf die Probe gelangen, da sonst die Agaroseeigenschaften gemessen werden. Der wichtigste Teil dieses Protokolls besteht darin, die resultierenden Kraftkurven zu filtern. Selbst die Untersuchung von Modellobjekten, wie z. B. AFM-Kalibriergittern, kann zu einem signifikanten Anteil fehlerhafter Kraft-Verformungskurvenführen 22. Die direkte Verwendung der berechneten Modulwerte ohne Analyse der zugrunde liegenden Kraft-Verformungskurven kann zu falschen Schlussfolgerungen führen (Abbildung 2F).
Die Technik ist nicht durch die Lokalisation der Zelle oder die Größe der Pflanzenorgane begrenzt. Zu kleine Objekte sind jedoch schwer zu schneiden, zu orientieren und zu immobilisieren. Zellen mit einem großen Lumen sind schwierig zu bearbeiten, da eine hohe Wahrscheinlichkeit einer Scanunterbrechung besteht (Abbildung 2C).
Bei allen Vorteilen der Verwendung von nicht fixierten Pflanzenabschnitten, die mit einem Vibratom vorbereitet wurden, gibt es mindestens zwei entscheidende Probleme: die Möglichkeit, nach dem Schneiden von Pflanzenmaterial eine Stressreaktion zu entwickeln, und die Möglichkeit der partiellen Solubilisierung von Material aus den geschnittenen Zellwänden. Beides kann zu Veränderungen in der Zusammensetzung und den Eigenschaften von Zellwänden führen. Das Vorhandensein einer sofortigen Stressreaktion auf den Schnitt wurde an Arabidopsis apices10 getestet. Es wurde kein signifikanter Einfluss auf die beobachteten Eigenschaften berichtet. Es wurden Experimente durchgeführt, um Veränderungen in den Eigenschaften von geschnittenen Zellwänden während ihrer Inkubation in Wasserzu testen 19. Es gab keinen stabilen Trend bei den scheinbaren Elastizitätsmodulwerten, die mindestens eine halbe Stunde lang an derselben Maiswurzelwand gemessen wurden19. Es ist jedoch besser, die Zeit der Experimente so kurz wie möglich zu halten und jede Probe während der Inkubation der Probe in Wasser auf solche Veränderungen zu überprüfen.
AFM ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung pflanzlicher Zellwände. Es ist jedoch offensichtlich, dass Berechnungen von Elastizitätsmodul, Steifigkeit und Adhäsion auf mehreren Annahmen basieren, die von pflanzlichen Zellwänden nicht erfüllt werden. Alle von AFM verwendeten Modelle der Kontaktmechanik betrachten die untersuchte Probe als unendlichen Halbraum isotropen Materials, was für pflanzliche Zellwände nicht zutrifft. Gleichzeitig wird angenommen, dass die Geometrie und die Eigenschaften des Eindringkörpers genau gemessen und über die Lebensdauer des Cantilevers konstant sind, was ebenfalls fehlerhaft sein kann. Darüber hinaus zeigen pflanzliche Zellwände ein komplexes mechanisches Verhalten mit elastischen, viskoelastischen und plastischen Komponenten, von denen in der Regel nur eine in einem einzigen Experiment gemessen werden kann. Dennoch korrelieren die mit AFM-basierten Methoden gewonnenen Daten zuverlässig mit dem Wachstum und der mechanischen Leistung von Pflanzenzellen in verschiedenen Organen und Spezies 3,4,5,6. All dies bedeutet, dass sowohl die Technik selbst als auch das Verständnis der damit gewonnenen Daten verbessert werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Dmitry Suslov (Staatliche Universität Sankt Petersburg, Sankt Petersburg, Russland) und Prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Russland) für die Bereitstellung von Maissaatgut bzw. Roggensaatgut. Die vorgestellte Methode wurde im Rahmen des an LK vergebenen Projekts der Russian Science Foundation Nr. 18-14-00168 entwickelt. Der Teil der Arbeit (Einholung der vorgestellten Ergebnisse) wurde von AP mit finanzieller Unterstützung des Regierungsauftrags für das FRC Kazan Scientific Center der RAS durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
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