Summary
Studies van celwandbiomechanica zijn essentieel voor het begrijpen van plantengroei en morfogenese. Het volgende protocol wordt voorgesteld om dunne primaire celwanden in de interne weefsels van jonge plantenorganen te onderzoeken met behulp van atoomkrachtmicroscopie.
Abstract
De mechanische eigenschappen van de primaire celwanden bepalen de richting en snelheid van de groei van plantencellen en dus de toekomstige grootte en vorm van de plant. Er zijn veel geavanceerde technieken ontwikkeld om deze eigenschappen te meten; atoomkrachtmicroscopie (AFM) blijft echter het handigst voor het bestuderen van celwandelasticiteit op cellulair niveau. Een van de belangrijkste beperkingen van deze techniek is dat alleen oppervlakkige of geïsoleerde levende cellen kunnen worden bestudeerd. Hier wordt het gebruik van atoomkrachtmicroscopie gepresenteerd om de mechanische eigenschappen van primaire celwanden te onderzoeken die behoren tot de interne weefsels van een plantenlichaam. Dit protocol beschrijft metingen van de schijnbare Young's modulus van celwanden in wortels, maar de methode kan ook worden toegepast op andere plantenorganen. De metingen worden uitgevoerd op van vibratomen afgeleide delen van plantaardig materiaal in een vloeibare cel, waardoor (i) het gebruik van plasmolyserende oplossingen of monsterimpregnatie met was of hars kan worden vermeden, (ii) de experimenten snel kunnen worden gemaakt en (iii) uitdroging van het monster kan worden voorkomen. Zowel anticlinale als periclinale celwanden kunnen worden bestudeerd, afhankelijk van hoe het monster werd gesneden. Verschillen in de mechanische eigenschappen van verschillende weefsels kunnen in één sectie worden onderzocht. Het protocol beschrijft de principes van studieplanning, problemen met specimenvoorbereiding en metingen, evenals de methode voor het selecteren van kracht-vervormingscurven om de invloed van topografie op de verkregen waarden van elastische modulus te voorkomen. De methode is niet beperkt door de steekproefgrootte, maar is gevoelig voor de celgrootte (d.w.z. cellen met een groot lumen zijn moeilijk te onderzoeken).
Introduction
De mechanische eigenschappen van de celwand van de plant bepalen de vorm van de cel en het vermogen om te groeien. Zo is de groeipunt van de stuifmeelbuis zachter dan de niet-groeiende delen van dezelfde buis1. De primordiavorming op Arabidopsis meristeem wordt voorafgegaan door een lokale afname van de celwandstijfheid op de plaats van het toekomstige primordium 2,3. De celwanden van Arabidopsis hypocotyl, die parallel lopen aan de hoofdgroeias en sneller groeien, zijn zachter dan die loodrecht op deze as en groeien langzamer 4,5. In de maïswortel ging de overgang van cellen van deling naar rek gepaard met een afname van elastische moduli in alle weefsels van de wortel. De moduli bleef laag in de rekzone en nam toe in de late rekzone6.
Ondanks de beschikbaarheid van verschillende methoden, worden de grote reeksen biochemische en genetische informatie over celwandbiologie die jaarlijks wordt verkregen, zelden vergeleken met de mechanische eigenschappen van celwanden. Mutanten op celwandgerelateerde genen hebben bijvoorbeeld vaak een veranderde groei en ontwikkeling 4,7,8, maar worden zelden beschreven in termen van biomechanica. Een van de redenen hiervoor is de moeilijkheid om metingen uit te voeren op cellulair en subcellulair niveau. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) is momenteel de primaire benadering voor dergelijke analyses9.
In de afgelopen jaren zijn tal van AFM-gebaseerde studies naar biomechanica van plantencellen uitgevoerd. De mechanische eigenschappen van celwanden van de buitenste weefsels van Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 en ui12, evenals van gekweekte cellen 13,14,15, zijn onderzocht. De oppervlakkige cellen van een plant kunnen echter celwanden hebben waarvan de mechanische eigenschappen verschillen van die van de binnenste weefsels6. Bovendien worden plantencellen onder druk gezet door turgor waardoor ze stijver worden. Om zich te ontdoen van de invloed van turgordruk, moeten onderzoekers plasmolyserende oplossingen 2,3,4,5,10,11 gebruiken of de verkregen waarden ontleden in turgor- en celwandbijdragen12. De eerste benadering leidt tot uitdroging van monsters en verandert de dikte en eigenschappen van de celwand16, terwijl de tweede benadering aanvullende metingen en gecompliceerde wiskunde vereist en alleen van toepassing is op cellen van relatief eenvoudige vorm12. De celwandeigenschappen van inwendige weefsels kunnen worden geëvalueerd op cryosecties17 of delen van plantaardig materiaal geïmpregneerd met hars8. Beide methoden omvatten echter uitdroging en /of impregnatie van monsters, wat onvermijdelijk leidt tot veranderingen in eigenschappen. De eigenschappen van geïsoleerde of gekweekte cellen zijn moeilijk te relateren aan de fysiologie van de hele plant. Zowel de teelt als de isolatie van plantencellen kunnen de mechanische eigenschappen van hun celwanden beïnvloeden.
De hier gepresenteerde methode vormt een aanvulling op de bovengenoemde benaderingen. Hiermee kunnen de primaire celwanden van elk weefsel en in elk stadium van de ontwikkeling van de plant worden onderzocht. Sectie- en AFM-observaties werden uitgevoerd in vloeistof die uitdroging van monsters voorkomt. Het probleem van turgor werd opgelost toen de cellen worden gesneden. Het protocol beschrijft het werk met maïs- en roggewortels, maar elk ander monster kan worden onderzocht of het geschikt is voor vibratomsectie.
De hier beschreven AFM-onderzoeken zijn uitgevoerd met behulp van de kracht-volumetechniek. Verschillende instrumenten gebruiken verschillende namen voor deze methode. Het basisprincipe is echter hetzelfde; een kracht-volumekaart van het monster wordt verkregen door een sinusvormige of driehoekige beweging van de cantilever (of het monster) om een bepaalde belastingskracht op elk geanalyseerd punt te bereiken, terwijl de cantileverafbuigingwordt geregistreerd 18. Het resultaat combineert een topografisch beeld van het oppervlak en de reeks kracht-afstandscurven. Elke curve wordt gebruikt om de vervorming, stijfheid, Young's modulus, adhesie en energiedissipatie op een specifiek punt te berekenen. Vergelijkbare gegevens kunnen worden verkregen door punt-voor-punt krachtspectroscopie na het scannen in contactmodus19, hoewel het tijdrovender is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monstervoorbereiding voor AFM-metingen
- Plantmateriaal: Steriliseer de zaden van maïs (Zea mays L.) en rogge (Secale cereale L.) met een 0,35% NaOCl-oplossing gedurende 10 minuten, was 3x met gedestilleerd water en groei vervolgens hydroponisch in het donker bij respectievelijk 4 dagen en 2 dagen hydroponisch. Primaire wortels werden gebruikt voor het experiment.
- Bereiding van oplossingen en monster voor vibratome sectie
- Bereid agarose-oplossing voor wortelinbedding door 3% (w / w) laagsmeltpunt agarose in water op te lossen met behulp van een magnetron.
OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in water. Als buffer of een ander type medium nodig is voor het onderzoek, is het beter om hetzelfde medium te gebruiken voor agarosebereiding, tijdens het snijden en in de vloeibare cel van de AFM om beschadiging van het monster te voorkomen. - Giet een laag van 4 mm gesmolten 3% agarose op de bodem van de petrischaal (diameter = 35 mm) en laat deze iets afkoelen om thermische schade aan het monster te voorkomen.
- Plaats drie of vier kleine stukjes (ongeveer 5 mm lang) van het bestudeerde plantenorgel horizontaal op de agarose.
OPMERKING: Monsters moeten half worden ondergedompeld, maar niet ondergedompeld in de agarose-laag. Als het monster niet wordt ondergedompeld, kan het tijdens de vibratomsectie uit de agarose breken. Als het monster naar de bodem zinkt, bevindt het zich te dicht bij de rand van het gedeelte en wordt het onhandig voor verdere stappen. - Wanneer een dunne, halfvaste film bovenop de eerste laag agarose (30-60 s) verschijnt, giet er dan voorzichtig een tweede laag op.
OPMERKING: De onderste laag agarose mag niet volledig stollen. Anders kunnen de twee lagen tijdens verder werk van elkaar scheiden. - Nadat de agarose volledig is gestold, knipt u het blok met het monster uit. Vorm het blok in een zeshoekige afgeknotte piramide om de stabiliteit ervan tijdens verdere secties te garanderen (figuur 1A).
OPMERKING: Het monster kan verticaal of horizontaal binnen dit blok worden georiënteerd, afhankelijk van het type sectie dat vereist is. Laat bij het voorbereiden van het blok 2-3 mm agarose rond het monster. In dit geval wordt de monstersectie behouden door de laag van 3% agarose, wat de verdere immobilisatie ervan zal vergemakkelijken (figuur 1B).
- Bereid agarose-oplossing voor wortelinbedding door 3% (w / w) laagsmeltpunt agarose in water op te lossen met behulp van een magnetron.
- Het monster doorsnijden met het vibratoom
- Lijm het blok op het vibratoomstadium met cyanoacrylaatlijm. Plaats het podium in het vibratoom zodat een van de piramidehoeken naar het blad van het vibratoom is gericht. Giet water in het vibratome bad.
- Stel de sectieparameters in (sectiedikte, bladsnelheid en trillingsfrequentie) en snijd het monster.
OPMERKING: Gebruik de sectiediktes tussen 200 en 400 μm. Een sectie die te dun is, kan fouten veroorzaken in de evaluatie van mechanische eigenschappen, terwijl een sectie die te dik is, gevoelig is voor breuk. Voor rogge- en maïswortels werd een bladsnelheid van 1,3 mm·s-1 en een oscillatiefrequentie van 90 Hz gebruikt. - Verplaats met een fijne borstel het gedeelte van het waterbad naar een glazen glijbaan en plaats een druppel water op het gedeelte om te voorkomen dat het uitdroogt. Controleer de kwaliteit van de sectie onder een lichtmicroscoop.
OPMERKING: Schuine secties kunnen niet worden gebruikt om de elasticiteitsmodulus te meten. Celwanden moeten loodrecht op het sectievlak staan, anders kunnen ze buigen of knikken onder de AFM-punt.
- Immobiliseren van het gedeelte voor AFM-metingen (figuur 1B)
- Giet een laag gesmolten 1% (w / w) agarose (~ 1 ml) op de bodem van de petrischaaldop met behulp van een pipet.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de zijkanten van de petrischaaldop niet verhinderen dat de punt het monster nadert. De agaroselaag moet 1 mm dik zijn en moet de hele onderkant van de dop bedekken. - Nadat de 1% agarose is gestold, verwijdert u overtollig water uit de sectie door filterpapier naar de rand te brengen.
OPMERKING: Raak het plantengedeelte niet aan met het papier om beschadiging en volledige droging van het monster te voorkomen. - Breng het gedeelte voorzichtig over van de dia naar het midden van de petrischaaldop met een borstel. Gebruik een pipet van 20 μL en voeg voorzichtig 1% agarose toe rond de sectie (figuur 1B).
OPMERKING: De 1% agarose mag niet op het exemplaar zelf komen. Het mag alleen de randen bedekken van de 3% agarose-laag die het plantenmonster vasthoudt. De 1% agarose moet kleine knollen vormen aan de randen van deze 3% agarose laag. Grote knollen kunnen voorkomen dat de cantilever het monster nadert. - Giet het water of een andere oplossing die voor de AFM moet worden gebruikt in de petrischaaldop met het geïmmobiliseerde gedeelte.
- Giet een laag gesmolten 1% (w / w) agarose (~ 1 ml) op de bodem van de petrischaaldop met behulp van een pipet.
2. AFM voorbereiding en kalibratie
OPMERKING: De kracht-volumemethode van AFM genereert een ruimtelijk opgeloste array van kracht-afstandscurven die op elk punt van het bestudeerde gebied worden verkregen. Verkrijg alle parameters voor de kracht-volumemodus (cantileverstijfheid, IOS, enz.) in de contactmodus. Soortgelijke procedures voor instrumenten van andere fabrikanten zijn eerder beschreven10,20.
- Selecteer het juiste type uitkraging.
OPMERKING: De vrijdragende stijfheid moet vergelijkbaar zijn met de stijfheid van het monster21. Een cantilever die veel stijver is dan het specimen zal niet veel afbuigen, terwijl een te zachte cantilever het monster niet genoeg zal vervormen. Een typische resonantiefrequentie moet voldoende zijn om de cantilever in de vloeistof te slingeren (d.w.z. ten minste enkele tientallen kHz). Het contactoppervlak moet klein zijn in vergelijking met de grootte van de celwand, omdat het monster dat in de modulusberekeningen van Young wordt bestudeerd, wordt verondersteld een oneindige halve ruimte te zijn. Voor rogge- en maïswortels werden de volgende cantilevers gebruikt: scherpe cantilevers met een typische resonantiefrequentie van 60 kHz, een gemiddelde veerconstante van 1,5 N·m-1 en een topradius van 10 nm, of bolvormige uitkragingen met een typische resonantiefrequentie van 75 kHz, een gemiddelde veerconstante van 2,8 N·m-1, en een apexradius van 150 nm. - Schakel het AFM-apparaat en de bijbehorende software in (Materiaalopgave). Monteer de uitkraging op de tiphouder voor de vloeistofcel. Plaats een druppel vloeistof op de punt om te voorkomen dat er luchtbellen op de punt ontstaan terwijl u deze in de vloeistof dompelt.
OPMERKING: In geval van bubbelvorming kan de vloeistof worden verwijderd met een precisiedoekje en vervolgens kan een nieuwe druppel worden geplaatst. - Monteer de tiphouder op de scankop.
- Doe een hard monster (vers glas glijd) in een petrischaaldop. Giet de vloeistof erin en zorg ervoor dat deze de glijbaan bedekt. Plaats de scankop op het podium en til het monster op zodat de vloeistof de cantilever bedekt.
- Kies het tabblad Hoofden in het vervolgkeuzemenu Extra . Zorg ervoor dat de scankop voor de vloeistofcel is geselecteerd.
- Klik op de knop Richten om het venster Laser richten te openen. Klik op de cameraknop om het venster Optische microscoop te openen. Plaats de laser op de punt van de cantilever, met behulp van de schroeven op de AFM-kop en het optische microscoopvenster voor oriëntatie.
- Kies de Semicontact-modus in het vervolgkeuzemenu in het hoofdvenster van het programma.
- Open het tabblad Resonantie en kies het type uitkraging dat wordt gebruikt in het menu Probes . Klik op de knop Auto om de resonantiefrequentie te bepalen.
OPMERKING: Als de cantilever die wordt gebruikt niet in de lijst staat, opent u Tools > Probe Passport. Maak een nieuw bestand, voer de vrijdragende parameters in en sla het op. Kies het vervolgens in het vervolgkeuzemenu Probes . - Kies de contactmodus in het vervolgkeuzemenu in het hoofdvenster van het programma.
- Klik op de knop N_Force Cal om het kalibratievenster van de cantilever te openen. Kies de cantilever die wordt gebruikt en klik op de Sweep-knop en vervolgens op de Spect Meas-knop om de cantileverveerconstante te bepalen met behulp van de thermische tune-procedure. Sluit het venster.
- Stel het setpoint in op 1 nA. Open het tabblad Nadering en klik op de landingsknop om het voorbeeld te benaderen.
- Open het tabblad Scannen . Stel de scansnelheid in op 0,5 Hz. Klik op de knop Gebied en stel de scangrootte in op 10 μm x 10 μm en het scanpunt op 256 x 256. Klik op de knop Uitvoeren en scan ongeveer 20 lijnen om te controleren of er geen vervuiling op het glas is. Klik op de knop Stoppen om de scan te beëindigen zonder gegevens te verliezen.
- Open het tabblad Curven . Stel parameters in voor terugtrekking en nadering tot respectievelijk 500 nm en -100 nm.
- Kies de laatste scan in het vervolgkeuzemenu Frame selecteren om het oppervlak te observeren.
- Zoek een schoon gebied op het glas en geef het punt aan waar de krachtvervormingscurve moet worden genomen en klik op de knop Uitvoeren om de curve te krijgen. Noteer drie tot vijf krachtcurves op verschillende plaatsen op de scan.
- Klik op de knop Gegevens om het analysevenster te openen en selecteer het frame met de krachtvervormingscurve.
- Klik op de knop Paarmarkeringen en geef het lineaire deel van de retractiecurve aan om de verhouding van het DFL-signaal tot de verplaatsing te berekenen, wat de inverse optische gevoeligheid (IOS, nA nm-1) of afbuigingsgevoeligheid is.
- Herhaal stap 2.17 voor alle opgenomen curven en noteer alle berekende waarden van de DFL-signaal-verplaatsingsverhouding. Ze zouden hetzelfde moeten zijn.
- Sluit het analysevenster, klik op het tabblad Nadering en vervolgens op de knop Verwijderen om de sonde uit het monster in te trekken.
3. Data-acquisitie
- Leid het monster onder de AFM-cantilever met behulp van de optische microscoop. Klik op het tabblad Nadering en vervolgens op de landingsknop om het voorbeeld in de contactmodus te benaderen met een setpoint van 1 nA.
- Klik op het tabblad Scannen en vervolgens op de knop Gebied . Selecteer de gebiedsgrootte van 70 μm x 70 μm om te scannen.
- Klik op de knop Probe verplaatsen en controleer het hele scangebied door de scanner eroverheen te bewegen. Zoek op basis van de mate van uitsteeksel van de scanner het hoogste punt.
- Open het tabblad Nadering en klik vervolgens op de knop Verwijderen om het voorbeeld in te trekken. Gebruik het hoogste punt als doel en klik op de knop Landing om het monster opnieuw te benaderen. Controleer vervolgens het oppervlak opnieuw door op de knop Sonde verplaatsen te klikken en de scanner eroverheen te bewegen. Geen van de punten in het gebied zou vereisen dat de scanner volledig omhoog wordt gebracht.
OPMERKING: Idealiter overschrijdt het z-bereik van de scanner het hoogteverschil van het monster. Het is echter acceptabel als sommige punten in het scangebied zich onder de capaciteit van de scanner bevinden. Tegelijkertijd zouden er niet veel van dergelijke punten moeten zijn. Grote gebieden die niet door de scanner kunnen worden bereikt, kunnen de scanabortus veroorzaken. - Stel de scansnelheid in op 0,5 Hz. Stel de scangrootte in op 70 μm x 70 μm en het scanpunt op 64 x 64. Klik op de knop Uitvoeren en scan om het oppervlak van het monster en de mogelijke besmetting met agarose te controleren.
OPMERKING: Als het monster cellen met een groot lumen heeft, kan de grootte van het scangebied worden verkleind of moet het worden verplaatst zodat er meer celwanden op de scan zijn. - Klik op de knop Aan boven in het hoofdvenster om de feedbacklus uit te schakelen.
- Kies de HDPlus-modus (force-volume-methode) in het vervolgkeuzemenu in het hoofdvenster van het programma. Er verschijnt een extra venster (HD-venster).
- Stel het SetPoint in op 0,1 nA in het hoofdvenster van het programma.
- Stel op het tabblad Hoofd van het HD-venster de scanparameters (amplitude en frequentie van sinusoïdale cantileverbeweging) in die geschikt zijn voor het bestudeerde monster.
OPMERKING: Elk type monster en cantilever vereist de selectie van scanparameters. Enkele voorbereidende experimenten zijn nodig. Voor maïs- of roggewortels werden scherpe en bolvormige uitkragingen gebruikt met een amplitude van 400 nm en een frequentie van 300 Hz. - Open het tabblad Geluiden in het HD-venster en voer de resonantiefrequentie van de cantilever in.
- Open het tabblad Quant van het HD-venster en voer de IOS, cantileverstijfheid en tipradius en hoek in. Selecteer het contactmodel dat wordt gebruikt voor berekeningen afhankelijk van de tipgeometrie.
OPMERKING: HET DMT-model houdt rekening met de adhesiekracht tussen de sonde en het monster en wordt het meest gebruikt in de mechanobiologie21. - Open het tabblad Scannen van het HD-venster en selecteer de signalen die moeten worden opgenomen. Selecteer de richting waarin het signaal wordt opgenomen. Schakel het selectievakje Volume forceren in om een record van alle krachtcurven te krijgen.
OPMERKING: Noteer het elasticiteitsmodulussignaal in zowel voorwaartse als achterwaartse richting. Het levert meer punten op om te berekenen. - Klik op de knop Uit boven aan het hoofdvenster van het programma om de feedbacklus in te schakelen.
- Klik op de PhaseCorr-knop in het hoofdvenster van HD om de gevoeligheid van het optische systeem te corrigeren.
- Het tabblad vs Time van het hoofdvenster van HD presenteert de functie van het DFL-signaal versus tijd in realtime; selecteer de delen van deze functie die worden gebruikt voor de bepaling van het basislijnniveau en om in het contactmodel te passen voor verdere berekeningen.
- Stel de scanpuntwaarde in op 256 x 256 in het hoofdvenster van het programma. Stel de scansnelheid in op 0,2 Hz en klik op de knop Uitvoeren om het voorbeeld te scannen.
- Nadat het scannen is gestopt, klikt u op de knop Aan boven aan het hoofdvenster om de feedbacklus uit te schakelen.
- Kies Contactmodus in het vervolgkeuzemenu, open het tabblad Nadering en klik op de knop Verwijderen om het voorbeeld in te trekken.
- Klik op de knop Gegevens om de analysesoftware te openen en de uitvoer op te slaan.
- Verwijder aan het einde van de meetdag de vrijdragende tiphouder van het hoofd en spoel deze meerdere keren voorzichtig af met ultrapuur water. Verwijder het water elke keer met een precisieveeg.
4. Evaluatie en nabewerking van gegevens
OPMERKING: Vertrouw niet op elastische moduluswaarden die automatisch worden berekend. Omdat het oppervlak sterk in hoogte varieert, moeten veel artefactcurven worden uitgestoten.
- Open het opgeslagen bestand in de analysesoftware.
- Selecteer het HDForceVolume-frame .
- Houd de Ctrl-toets ingedrukt en selecteer één visueel frame dat in dezelfde scanrichting is verkregen. Klik op de knop Externe kaart laden om te zien waar de celwanden zich bevinden.
OPMERKING: Elke signaalkaart kan worden gebruikt als een visueel frame, maar het gebruik van de DFL-signaalkaart (verschillende instrumenten kunnen ernaar verwijzen als een afbuigingssignaal of foutsignaal) kan de gemakkelijkste manier zijn. - Controleer de waarden voor InvOptSens (IOS) en cantilever stijfheid op het tabblad Hoofd .
- Open het tabblad Extra en controleer de tipparameters en het contactmodel.
- Klik op verschillende punten op de celwanden in het visuele kader en selecteer alleen die curven die goed worden beschreven door het model. Zie Representatieve resultaten voor meer informatie.
- Noteer de verkregen waarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typische elastische modulus- en DFL-kaarten, evenals krachtcurven verkregen op rogge- en maïswortels volgens de beschreven methode, zijn weergegeven in figuur 2. Figuur 2A toont elastische modulus- en DFL-kaarten verkregen op het dwarsdoorsnede van de primaire wortel van rogge. De witte gebieden in de moduluskaart (figuur 2A, links) komen overeen met een onjuiste overschatting van Young's modulus omdat de scanner zijn limiet in de z-richting bereikt. Deze afbeelding is niet handig om te worden gebruikt als een externe kaart voor een verdere selectie van bevredigende krachtcurven. De DFL-signaalkaart (deflection/error map) die rechts wordt gepresenteerd (figuur 2A) is hiervoor beter geschikt.
De moduluskaarten van dwars- en lengtesecties van de maïswortel zijn weergegeven in figuur 2B,C. De scanner die volledig is uitgeschoven terwijl u de bodem van het monster probeert te bereiken, kan leiden tot foutieve metingen en zelfs onderbroken scans (bovenste deel van figuur 2C). Soms, na het verkrijgen van een goede scan in de contactmodus, trekt het instrument de scanner plotseling volledig samen, wat alarmeert dat het de maximale z-richtingslimiet heeft bereikt wanneer het overschakelt naar de krachtvolumemodus. Het betekent dat het monster niet goed is geïmmobiliseerd en omhoog is drijven. Er moet een nieuw monster worden voorbereid.
De agarosebesmetting kan ook een reden zijn om een nieuw monster te bereiden (figuur 2D,E). De aanwezigheid van agarose kan worden gecontroleerd tijdens het verkrijgen van de eerste scan in de contactmodus (stap 3.5). Idealiter zouden de celwanden en sommige celbodems zichtbaar moeten zijn op dergelijke scans (figuur 2D); in geval van onnauwkeurige immobilisatie kan het oppervlak echter bedekt zijn met agarose (figuur 2E), die de topografie van het monster maskeert.
Figuur 2F toont vier verschillende krachtcurven die op verschillende punten van dezelfde celwand zijn geregistreerd. De curve die in punt 1 is geregistreerd, toont geen basislijn. Het betekent dat er geen scheiding was van de uitkragingspunt van de celwand. De modulus berekend op basis van deze curve werd overschat. De curve die in punt 3 is geregistreerd, toont een schouder op het naderende deel. Dit artefact kan erop wijzen dat de celwand gebogen was. Beide in de punten 1 en 3 geregistreerde curven moeten worden uitgewist. De punten 2 en 4 vertonen bevredigende krachtcurven met vergelijkbare moduliwaarden. De volgende criteria kunnen worden gebruikt om de juiste curven te onderscheiden: i) het basisniveau moet duidelijk zijn op zowel naderende als terugtrekkende delen van de curve; ii) er mogen geen onregelmatigheden zijn zoals schouders of storingen (verschijnt als respectievelijk constante krachtwaarden en een plotselinge daling van de krachtwaarden in het midden van de helling); iii) het gekozen model moet goed in de curve passen. Voor alle geselecteerde curven moeten de maximale toegepaste krachtwaarden vergelijkbaar zijn. Een maximaal uitgeoefende kracht die aanzienlijk hoger of lager is dan de verwachte waarde kan ook worden gebruikt als criterium voor het uitdrijven van curven. Het gebruik van neurale netwerken om curves van slechte kwaliteitte verwijderen 19 kan de verwerking van resultaten versnellen.
Figuur 1: Kritische stappen in de monstervoorbereiding. (A) Wortelfragment ingebed in een blok agarose en gemonteerd op het vibratoomstadium. (B) Monstersectie geplaatst op een laag van 1% agarose en geïmmobiliseerd met extra agarose in een petrischaaldop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Typische AFM-beelden en -metingen op primaire wortels. (A) Elasticiteitsmodulus en DFL-kaarten van een dwarsdoorsnede van de roggewortel. Volledig geregistreerde (B) en onderbroken (C) kaarten van elasticiteitsmodulus verkregen op longitudinale en transversale secties van maïswortel. 3D-weergave van schone (D) en met agarose bedekte (E) secties van maïswortels. (F) Een DFL-kaart van een dwarsdoorsnede van maïswortel. Punten 1-4 op de celwand tonen de posities waar de krachtcurven aan de rechterkant van het beeld werden geregistreerd. De rode lijn is voor naderen, de blauwe lijn is voor terugtrekking en de zwarte lijn toont de contactmechanica model fit. De curven die op punt 1 en 3 zijn geregistreerd, hebben artefacten en kunnen niet worden gebruikt voor berekeningen. Roggewortels werden onderzocht met scherpe uiteinden en maïswortels werden onderzocht met bolvormige uiteinden. Afkortingen: Rhiz = rhizodermis, Exo = exodermis, OC = buitenste cortex, IC = binnenste cortex, Einde = endodermis, Per = pericycle en VP = vasculair parenchym. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mechanische eigenschappen van de primaire celwanden bepalen de richting en snelheid van de groei van plantencellen, en dus de toekomstige grootte en vorm van de plant. De hier gepresenteerde AFM-gebaseerde methode is een aanvulling op bestaande technieken die worden gebruikt om de eigenschappen van plantencelwanden te bestuderen. Hiermee kan de elasticiteit van celwanden, die behoren tot de binnenste weefsels van de plant, worden onderzocht. Met behulp van de gepresenteerde methode werden de mechanische eigenschappen van celwanden in verschillende weefsels van de groeiende maïswortel in kaart gebracht en op basis van deze eigenschappen werd een wiskundig model geconstrueerd6. De gesimuleerde wortel reageerde op de toepassing van druk die turgor imiteerde door veranderingen in lineaire grootte. Deze veranderingen lagen in hetzelfde bereik en in de tegenovergestelde richting als die van een vers weggesneden wortel in plasmolyserende medium6.
De monstervoorbereiding is van cruciaal belang voor dit protocol. Het drogen van het monster moet tijdens de gehele bereiding worden vermeden. De juiste plaatsing van het te snijden plantmateriaal is een belangrijke kwestie; de celwanden moeten strikt loodrecht op het toekomstige scanvlak worden georiënteerd. Anders zullen onbevredigende kracht-vervormingscurven worden verkregen omdat de celwand is gebogen of geknikt. Het in agarose ingebedde gedeelte moet stevig worden bevestigd met extra agarose (figuur 2B). Dit laatste mag niet op het monster komen, anders worden de agarose-eigenschappen gemeten. Het belangrijkste onderdeel van dit protocol is het filteren van de resulterende krachtcurves. Zelfs het bestuderen van modelobjecten, zoals AFM-kalibratierasters, kan resulteren in een aanzienlijk deel van de foutieve kracht-vervormingscurven22. Direct gebruik van de berekende moduluswaarden zonder de onderliggende kracht-vervormingscurven te analyseren, kan tot onjuiste conclusies leiden (figuur 2F).
De techniek wordt niet beperkt door de lokalisatie van de cel of de grootte van plantenorganen. Objecten die te klein zijn, zijn echter moeilijk te snijden, te oriënteren en te immobiliseren. Cellen met een groot lumen zijn moeilijk om mee te werken omdat er een grote kans is op scanonderbreking (figuur 2C).
Met alle voordelen van het gebruik van niet-vaste plantensecties bereid met een vibratoom, zijn er ten minste twee cruciale kwesties: de mogelijkheid om een stressreactie te ontwikkelen na het snijden van plantmateriaal en de mogelijkheid van gedeeltelijke oplosbaarheid van materiaal uit de gesneden celwanden. Beide kunnen leiden tot veranderingen in de samenstelling en eigenschappen van celwanden. De aanwezigheid van onmiddellijke stressrespons op de snee werd getest op Arabidopsis apices10. Er werd geen significant effect op de waargenomen eigenschappen gemeld. Experimenten werden uitgevoerd om veranderingen in de eigenschappen van gesneden celwanden tijdens hun incubatie in water te testen19. Er was geen stabiele trend in de schijnbare moduluswaarden van Young gemeten op dezelfde wand van maïswortel gedurende ten minste een periode van een half uur19. Het is echter beter om de tijd van experimenten zo kort mogelijk te houden en elk monster op dergelijke veranderingen te controleren tijdens de incubatie van het monster in water.
AFM is een krachtige techniek voor het bestuderen van plantencelwanden. Het is echter duidelijk dat berekeningen van elasticiteitsmodulus, stijfheid en hechting gebaseerd zijn op verschillende aannames die niet worden vervuld door plantencelwanden. Alle modellen van contactmechanica die door AFM worden gebruikt, beschouwen het onderzochte monster als een oneindige halve ruimte van isotroop materiaal, wat niet geldt voor plantencelwanden. Tegelijkertijd wordt aangenomen dat de geometrie en eigenschappen van het indruklichaam nauwkeurig worden gemeten en constant zijn gedurende de levensduur van de cantilever, wat ook onjuist kan zijn. Bovendien vertonen plantencelwanden complex mechanisch gedrag met elastische, visco-elastische en plastic componenten, en meestal kan slechts één van deze in één experiment worden gemeten. Niettemin correleren de gegevens die zijn verkregen met behulp van afm-gebaseerde methoden betrouwbaar met de groei van plantencellen en mechanische prestaties in verschillende organen en soorten 3,4,5,6. Dit alles betekent dat zowel de techniek zelf als het begrip van de gegevens die ermee worden verkregen, kan worden verbeterd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We willen dr. Dmitry Suslov (Sint-Petersburg Staatsuniversiteit, Sint-Petersburg, Rusland) en prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Rusland) bedanken voor het leveren van respectievelijk maïs- en roggezaden. De gepresenteerde methode is ontwikkeld in het kader van het Russian Science Foundation Project No. 18-14-00168 toegekend aan LK. Het deel van het werk (het verkrijgen van de gepresenteerde resultaten) werd uitgevoerd door AP met de financiële steun van de overheidsopdracht voor het FRC Kazan Scientific Center van RAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al.
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
