Summary
将质粒DNA电穿孔到骨骼肌中是一种在不损害小鼠肌肉收缩力的情况下调节基因表达的可行方法。
Abstract
通过质粒电穿孔在小鼠骨骼肌中瞬时基因表达调节是评估正常和病理生理学的有用工具。靶基因的过表达或敲低使研究人员能够操纵单个分子事件，从而更好地了解影响肌肉质量，肌肉代谢和收缩力的机制。此外，编码荧光标签的DNA质粒的电穿孔使研究人员能够测量 体内骨骼肌中蛋白质亚细胞定位的变化。骨骼肌的关键功能评估包括肌肉收缩力的测量。在该协议中，我们证明在质粒DNA注射，电穿孔和基因表达调节后，整个肌肉收缩力研究仍然是可能的。该指导程序的目的是演示DNA质粒电穿孔到小鼠骨骼肌中的分步方法，以促进胫骨前伸肌肌的摄取和表达，以及证明骨骼肌收缩力不会受到注射和电穿孔的影响。
Introduction
体内骨骼肌质粒DNA电穿孔是通过调节各种生理和病理生理条件下的基因表达来评估骨骼肌生理学和分子信号传导变化的重要工具1，2，3，4，5，6，7，8，9.Wolff等人早在1990年就证明了向骨骼肌的实验性基因转移，其中RNA和DNA在没有电穿孔的情况下成功转移，并且荧光素酶表达维持至少2个月10。仅注射的转染效率相对较低是有问题的，爱原和宫崎骏在1998年通过将pCAGGS-IL-5构建体电穿孔到胫骨前肌中并测量血清IL-5表达11来证明电穿孔增加了基因转移。从那时起，许多研究已经研究了不同DNA浓度，体积和电穿孔参数的功效，以确保最大的基因转移效率。Mir等人测试了不同的电穿孔参数，包括电压，脉冲数，脉冲持续时间和频率，以及DNA浓度，并确定更大的电压，脉冲数和DNA浓度都有助于提高电穿孔效率12。高电穿孔电压的一个主要警告是，虽然它有助于增加对肌纤维的DNA摄取，但它也会导致肌肉损伤，从而混淆结果。Schertzer等人表明，在电穿孔后3天，200 V的肌电穿孔对约50%的肌纤维造成损害，而在50 V13下，只有10%的肌纤维受损。我们已经考虑了影响高效DNA转移与肌肉损伤的变量，发现每厘米卡钳宽度125 V的电压足以实现有效的基因转移。
电穿孔后肌肉纤维横截面积和整个肌肉收缩力的分析是测量由于基因调节引起的肌肉大小和功能变化的方法的重要方面。我们和其他人之前已经证明，单独对照载体的电穿孔不会导致肌纤维面积的减少。在这些研究中，绿色荧光蛋白（EGFP）构建体是DNA转染的有用荧光指示剂13，14。许多研究已经调查了电穿孔后TA的 原位 收缩力，并发现了不同的结果。一项研究表明，75 V/cm电穿孔在电穿孔后3天导致破伤风力降低约30%，到电穿孔后7天，破伤风力恢复到控制水平，而50 V/cm电穿孔不影响力13，15。另一项研究表明，在180 V / cm电穿孔后3小时，破伤风力损失了30%，7天后恢复到假力水平16。
在下面的详细程序中，我们演示了pcDNA3-EGFP质粒在小鼠的TA和长指伸肌（EDL）肌肉中的注射和电穿孔。我们还证明这种方法不影响EDL全肌收缩力。目的是证明质粒有效地摄取到肌纤维中，而不会引起功能丧失。
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Protocol
所有使用动物的实验都是在宾夕法尼亚州立大学医学院进行的，该学院由宾夕法尼亚州立大学的机构动物护理和使用委员会批准，并按照1964年赫尔辛基宣言及其后来的修正案中规定的道德标准进行。使用12周龄雌性C57BL / 6小鼠进行该程序。在实验之前，所有手术工具都经过高压灭菌以进行无菌。
1. TA和EDL注射/电穿孔制备
注意：对于 TA 和 EDL 注射/电穿孔制备，这些步骤是相同的。
- 在实验前将表达质粒构建体纯化至在无菌PBS中稀释的1μg/ μL浓度。对于该过程，使用市售的无内毒素纯化试剂盒来纯化pcDNA3-EGFP（GFP）或pcDNA3空载体（对照）。
- 计算质粒浓度以确保足够的注射体积（TA 50μg DNA在50μL无菌PBS中;EDL 10微克DNA在10微升无菌PBS）和等分试样中。
- 通过使用选择轮并按下轮来编程电脉冲器设置以选择参数，如下所示：模式 - LV，电压 - 12.5 V / mm（在注射时进行调整），脉冲长度 - 20 ms，脉冲数 - 5，间隔 - 200 ms，极性 - 单极性。
- 使用异氟醚气体麻醉小鼠。将小鼠置于含有5%异氟醚的诱导盒中。通过使用镊子没有脚趾捏反射来确认麻醉的手术平面，并将异氟醚降低至2%的维持剂量。将小鼠转移到适当的鼻锥中，在37°C的循环水板上停留，以进行其余的程序。
- 使用小理发器去除两个后肢的毛发。用交替的70%乙醇/甜菜碱擦洗下肢，对注射区域进行消毒。
2. TA注射/电穿孔
- 当鼠标处于仰卧位时，找到通过小腿外侧皮肤可见的TA肌腱。使用带有可拆卸30G针头的50μL微量注射器，以较浅的5°角插入肌腱连接处上方1-2mm的针头，直到针头到达肌肉的上端。
注意：注射到肌肉中间是目标。 - 缓慢按下柱塞，同时沿注射路径缓慢缩回针头以递送50μL质粒溶液。肌肉应该肿胀。
- 将计时器设置为1分钟，并在TA处测量支腿的厚度。根据鼠标的大小，这可以是5-10毫米。将卡钳电极设置为测量的厚度，并将电穿孔器电压设置为12.5 V/mm。
- 1分钟后，将卡钳电极放在下肢周围。电极应紧贴，但不要过于紧绷。提供 5 个方波脉冲，持续时间为 20 ms，间隔为 200 ms（肌肉应随每个脉冲一起抽搐）。
- 使用对照载体对交替肢体重复上述步骤。
- 将鼠标从麻醉中取出，并使其在设置为37°C的加热垫上恢复。 恢复后，将鼠标放回笼子。
3. EDL注射/电穿孔
- 将鼠标置于仰卧位，通过视觉和轻柔触诊定位胫骨前嵴。
- 使用手术刀，在胫骨前嵴外侧的皮肤上做一个浅切口，该切口位于膝关节下方 5 mm 至 TA 肌腱交界处上方 2 mm 处。
- 使用小剪刀，钝解筋膜，暴露TA肌肉。
- 同样，使用剪刀钝性解剖，通过横向拉动肌肉，暴露EDL，轻轻地将TA肌肉与胫骨分开。在手术过程中，可以使用小的弯曲镊子使TA与EDL保持透明。
- 使用带有可拆卸30G针头的50μL微注射器，将针头纵向插入EDL，直到针头到达肌肉的上端。
- 缓慢按下柱塞，同时沿注射路径缓慢缩回针头以注射10μL质粒溶液（肌肉应肿胀）。
- 将计时器设置为1分钟，并在EDL处测量腿的厚度。根据鼠标的大小，这可以是5-10毫米。将卡钳电极设置为测量的厚度，并将电穿孔器电压设置为12.5 V/mm。
- 1分钟后，将卡钳电极放在下肢周围。电极应紧贴，但不要过于紧绷。提供 5 个方波脉冲，持续时间为 20 ms，间隔为 200 ms（肌肉应随每个脉冲一起抽搐）。
- 使用一次性4/0不可吸收尼龙缝合线关闭切口。
- 用交替肢体重复上述步骤，或将肢体原封不动地保留为绝对控制。
- 将鼠标从麻醉中取出，并使其在设置为37°C的加热垫上恢复。 手术后立即给予适当的皮下镇痛药，手术后12-24小时。恢复后，将鼠标放回笼子。
注意：先前的研究表明，电穿孔后立即出现TA的肌肉收缩力缺陷，并且收缩恢复发生在3天的过程中13，15。因此，在电穿孔后3-10天对TA和EDL肌肉的组织学，蛋白质表达或肌肉收缩力进行分析。在手术13后长达3周观察到EGFP的长时间表达。
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Representative Results
电穿孔以促进骨骼肌中的基因转移是一种用于评估肌肉生理学变化的有用技术。我们已经展示了一个详细的分步程序，可以在TA和EDL肌肉中实现有效的基因转移。转染效率的差异是由许多变量引起的。这些变量包括电穿孔参数（脉冲，电压，脉冲持续时间等），基因构建体大小以及注入的DNA的浓度/体积。我们之前已经证明，5个脉冲在125 V/cm的电穿孔参数，20 ms持续时间间隔200 ms，足以在TA14中完成有效的基因转移。我们还在目前的研究中证明，DNA的注射/电穿孔不会导致实验后3天EDL中肌肉收缩力的丧失。
为了可视化基因转移，将pcDNA3-EGFP或pcDNA3（对照）构建体电穿孔到小鼠TA或EDL肌肉中。手术后3天，仔细解剖TA或EDL，置于最佳切割温度（OTC）介质中，并在液氮冷却的异戊烷（2-甲基丁烷）中速冻，如前所述14，17，18，19。使用从每块肌肉中腹部取出的低温恒温器获得10μm肌肉切片。然后将切片在1%多聚甲醛中孵育5分钟，然后在PBS中洗涤3-5分钟。然后将切片在小麦胚芽凝集素结合到德州红中孵育，在PBS中以1：100稀释在黑暗中90分钟。再次在PBS中洗涤切片3次，每次5分钟。然后将肌肉切片覆盖在水性安装介质中，并以594nm波长（红色）成像以可视化单个肌肉纤维，并在480nm波长下检测GFP（图1A）。在具有相同暴露设置的两个通道中对注射pcDNA3的对照肌进行成像，以控制潜在的自发荧光。用EGFP注射/电穿孔的肌肉显示绿色纤维阳性，表明pcDNA3-EGFP构建体的摄取，而用pcDNA3（对照）注射/电穿孔的肌肉没有绿色阳性纤维。我们和其他人之前已经证明，通过比较GFP阳性纤维（绿色）和非GFP表达纤维（黑色）在同一肌肉部分4，6，19中，肌纤维横截面积不会受到GFP表达的影响。当以较低的放大倍率成像时，EDL肌肉转染效率通过绿色纤维（阳性）与黑色纤维（阴性）的外观可视化（图1B）。在3 EDL肌肉中测量，使用该程序的转染效率为56.6%±4.7%。该数据表明，TA肌肉的注射和电穿孔足以实现有效的基因转移。此外，EDL的注射和电穿孔可有效摄取基因构建体。
评估骨骼肌生理学的一个重要工具是肌肉收缩力的测量。先前的研究人员已经表明，在注射和电穿孔后 ，原位测量的 TA的收缩力可能在后肢的早期受到损害13。为了测试注射和电穿孔后EDL收缩力是否受损，我们手术暴露EDL，注射pcDNA3-EGFP或构建体，并对后肢进行电穿孔。作为对照，备用肢体保持不变以进行比较。3天后对小鼠实施安乐死，并在生理浴中使用现场刺激测量EDL全肌肉收缩力，如前所述14，19，20，21。简短地，解剖EDL，肌腱通过4/0丝线绑在不锈钢钩上，并悬浮在力传感器和静态底座之间。将肌肉沐浴在Tyrode缓冲液中，这是一种生理浴溶液（121 mM NaCl，5.0 mM KCl，1.8 mM钙2，0.5 mM MgCl2，0.4 mM NaH2PO4，24 mM NaHCO3，0.1 mM EDTA，5.5 mM葡萄糖），并在整个过程中用100%氧气鼓泡。使用铂电极刺激肌肉收缩以提供上轴刺激。调整肌肉最佳长度（Lo）以在手术开始时产生最大力。使用1-150 Hz之间的刺激频率（超轴电压下为0.5 ms脉冲）确定力 - 频率关系。在每次刺激之间让肌肉放松3分钟。刺激程序完成后，测量肌肉的重量和长度。通过将绝对力归一化到整个肌肉横截面积来计算比力，其计算方法是重量除以长度并使用先前确定的肌肉密度常数（1.056 kg / m−3）21。我们已经表明，与对照非注射或电穿孔肌肉相比，代表性注射和电穿孔EDL在100 Hz处具有相似的破伤风反应（图2A 和 图2B）。我们发现，与未触及的对照组相比，注射和电穿孔EDL中的肌肉破伤风力，比破伤风力，峰值张力时间和一半松弛时间没有受到影响（表1）。我们的数据表明，影响收缩性的蛋白质表达可以在EDL中使用电穿孔进行调节，而不会引起不良影响。
图 1：pcDNA3-EGFP 的电穿孔足以使 TA 和 EDL 肌肉中的 DNA 摄取。A） 来自 TA 和 EDL 对照（注入对照载体并电穿孔 125 V/cm）和 GFP（注入 pcDNA3-EGFP 并电穿孔 125 V/cm）的代表性横截面。比例尺 50 μm . B） EDL 的代表性横截面，展示转染效率。比例尺 100 μm 请点击此处查看此图的大图。
图2：注射和电穿孔不会影响肌肉功能。 100 Hz 时的代表性破伤风力曲线，从 A） 非注入/电穿孔 EDL（对照）和 B） 注入/电穿孔 EDL （GFP）。 请点击此处查看此图的大图。
| 控制 （n=3） | 通用生产总成 （n=3） | p 值 | |
| FO （g） | 34.13 ± 1.15 | 35.87 ± 1.55 | 0.1918 |
| 顺丰O （千牛/米2） | 691.56 ± 45.80 | 660.00 ± 33.61 | 0.3917 |
| 北京时间（秒） | 0.249 ± 0.0203 | 0.247 ± 0.0197 | 0.9084 |
| RT1/2 （秒） | 0.035 ± 0.0035 | 0.033 ± .0031 | 0.6458 |
| 控制 - 非注射/非电穿孔;用聚甲基二甲基硅氧烷3-EGFP注射并电穿孔。值是平均值± SD. p=0.05 被视为显著值。F0- 100Hz 时的原始破伤风力，100Hz 时的 sF 0-破伤风比力，1Hz 时的 TTP- 峰值时间，1Hz 时 RT1/2- 半松弛时间。 | |||
表 1：控制下的整个肌肉收缩力与电穿孔 EDL 的比较。 表显示，与非注射/非电穿孔对照组相比，注射/电穿孔EDL（GFP）中的不同肌肉力量参数不受影响。F0 = 100 Hz 时的破伤风力，sF0 = 100 Hz 时的特定破伤风力，TTP = 1 Hz 处的峰值张力时间，RT1/2 = 一半松弛时间。学生的 t 检验;p = 0.05 时的显著性。n = 3。
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Discussion
通过电穿孔增强的骨骼肌体内基因转移是调节肌肉中蛋白质表达的有用且相对简单的工具。我们已经展示了在EDL和TA肌肉中实现有效基因转移所需的步骤，并证明EDL的收缩性测量在手术后是可行的。该技术不需要更复杂的病毒载体，并允许比较单个肌肉中转染和非转染的肌肉纤维横截面积。该程序的局限性在于构建摄取效率不完整，并且一些肌纤维仍未转染。
所讨论的程序不限于表达载体的电穿孔。我们之前已经证明，蛋白质敲低可以通过遵循相同的程序来实现，但是使用siRNA或shRNA在体内构建14。此外，报告基因构建体可用于测量靶基因2，4，22的转录活性。这些工具允许在单个骨骼肌中同时操作多种蛋白质，同时也使研究人员可以选择轻松测量转录变化。骨骼肌也可以与表达或sh / siRNA载体和荧光报告基因共转染。研究表明，超过95%的肌肉纤维占据一个向量也会占用另一个向量23。当标记的构造不可行时，这很有用。类似的实验可以在各种肌肉中进行，包括足底肌，腓肠肌，股四头肌和短指屈肌，其中包括24。该过程不仅限于小鼠。大鼠已被广泛用于肌肉基因转移，但应考虑注射体积、DNA浓度和电穿孔参数的变化。重要的是，当电穿孔应用于大面积时，基因转移效率会降低，较大的肌肉可能需要多次注射24。
基因转移后动物可用于研究各种生理和病理生理状况。该程序有效性的主要决定因素是所需构建体的转染效率和研究的持续时间。虽然在电穿孔12后270天就观察到蛋白表达增加，但研究表明，随着时间的推移，蛋白表达量会减少13，25。该手术的简单性和有效性使其非常适合骨骼肌生理学的研究。
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Disclosures
B.A.H.和D.L.W.没有声称存在利益冲突。
Acknowledgments
没有
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
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