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Biology

Electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético del ratón

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63916
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Summary

La electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético es un método viable para modular la expresión génica sin comprometer la contractilidad muscular en ratones.

Abstract

La modulación transitoria de la expresión génica en el músculo esquelético murino por electroporación de plásmidos es una herramienta útil para evaluar la fisiología normal y patológica. La sobreexpresión o derribo de genes diana permite a los investigadores manipular eventos moleculares individuales y, por lo tanto, comprender mejor los mecanismos que afectan la masa muscular, el metabolismo muscular y la contractilidad. Además, la electroporación de plásmidos de ADN que codifican etiquetas fluorescentes permite a los investigadores medir los cambios en la localización subcelular de proteínas en el músculo esquelético in vivo. Una evaluación funcional clave del músculo esquelético incluye la medición de la contractilidad muscular. En este protocolo, demostramos que los estudios de contractilidad muscular completa aún son posibles después de la inyección de ADN plásmido, la electroporación y la modulación de la expresión génica. El objetivo de este procedimiento de instrucción es demostrar el método paso a paso de electroporación de plásmidos de ADN en el músculo esquelético del ratón para facilitar la absorción y expresión en las miofiberes de los músculos tibial anterior y extensor digitorum longus, así como demostrar que la contractilidad del músculo esquelético no se ve comprometida por la inyección y la electroporación.

Introduction

La electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético in vivo es una herramienta importante para evaluar los cambios en la fisiología del músculo esquelético y la señalización molecular mediante la modulación de la expresión génica en una variedad de condiciones fisiológicas y fisiopatológicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . La transferencia experimental de genes al músculo esquelético fue demostrada ya en 1990 por Wolff et al., donde tanto el ARN como el ADN se transfirieron con éxito sin electroporación, y la expresión de luciferasa se mantuvo durante al menos 2 meses10. La eficiencia de transfección relativamente baja con solo inyección es problemática, y Aihara y Miyazaki demostraron una mayor transferencia de genes con electroporación en 1998 al electroporar una construcción de pCAGGS-IL-5 en el músculo tibial anterior (TA) y medir la expresión sérica de IL-511. Desde entonces, muchos estudios han investigado la eficacia de diferentes concentraciones de ADN, volúmenes y parámetros de electroporación para garantizar la máxima eficiencia de transferencia de genes. Mir et al. probaron diferentes parámetros de electroporación, incluyendo voltaje, número de pulso, duración del pulso y frecuencia, así como la concentración de ADN, y determinaron que un mayor voltaje, número de pulso y concentración de ADN contribuyeron a aumentar la eficiencia de la electroporación12. Una advertencia importante para el alto voltaje de electroporación es que, si bien facilita una mayor absorción de ADN en las miofiberes, también causa daño muscular, lo que puede confundir los resultados. Schertzer et al. demostraron que la electroporación a 200 V causó daño en alrededor del 50% de las miofiberes 3 días después de la electroporación, mientras que solo el 10% de las miofiberes se dañaron a 50 V13. Hemos tenido en cuenta las variables que afectan la transferencia eficiente de ADN frente al daño muscular y hemos encontrado que un voltaje de 125 V por centímetro de ancho de pinza es suficiente para lograr una transferencia genética efectiva.

El análisis del área transversal de la fibra muscular y la contractilidad de todo el músculo después de la electroporación son aspectos importantes del método para medir los cambios en el tamaño y la función muscular debido a la modulación génica. Nosotros y otros hemos demostrado previamente que la electroporación de vectores de control por sí sola no causa una disminución en el área de miofibra. El constructo de proteína verde fluorescente (EGFP) fue un indicador fluorescente útil de la transfección de ADN en estos estudios13,14. Varios estudios han investigado la contractilidad in situ de la AT después de la electroporación y han encontrado resultados variables. Un estudio mostró que la electroporación de 75 V / cm causó una reducción de aproximadamente el 30% en la fuerza tetánica 3 días después de la electroporación, y a los 7 días posteriores a la electroporación, la fuerza tetánica volvió al nivel de control, mientras que la electroporación de 50 V / cm no comprometió la fuerza13,15. Otro estudio mostró que hubo una pérdida del 30% de la fuerza tetánica 3 h después de la electroporación de 180 V / cm, que se recuperó a los niveles de fuerza simulada después de 7 días16.

En el siguiente procedimiento detallado, demostramos la inyección y electroporación de un plásmido pcDNA3-EGFP en los músculos TA y extensor digitorum longus (EDL) de ratones. También demostramos que este método no afecta la contractilidad de todo el músculo EDL. El objetivo es demostrar una absorción eficiente de plásmidos en las miofibras sin causar pérdida de función.

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Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron en la Facultad de Medicina de Penn State, aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Penn, y se realizaron de acuerdo con los estándares éticos establecidos en la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores. Se utilizaron ratones C57BL/6 hembra de 12 semanas de edad para este procedimiento. Todas las herramientas quirúrgicas fueron esterilizadas en autoclave para la esterilidad antes de la experimentación.

1. Preparación de inyección/electroporación de TA y EDL

NOTA: Estos pasos son idénticos para la preparación de inyección/electroporación de TA y EDL.

  1. El plásmido de expresión purificada se construye a una concentración de 1 μg/μL diluido en PBS estéril antes del experimento. Para este procedimiento, se utilizó un kit de purificación libre de endotoxinas disponible en el mercado para purificar el vector vacío pcDNA3-EGFP (GFP) o pcDNA3 (control).
  2. Calcular la concentración de plásmidos para asegurar un volumen de inyección adecuado (TA 50 μg de ADN en 50 μL de PBS estéril; EDL 10 μg de ADN en 10 μL de PBS estéril) y muestras alícuotas.
  3. Programe la configuración del electroporador utilizando la rueda de selección y presionando la rueda para elegir los parámetros de la siguiente manera: Modo - LV, Voltaje - 12.5 V / mm (que se ajustará en el momento de la inyección), longitud del pulso - 20 ms, número de pulsos - 5, intervalo - 200 ms, polaridad - unipolar.
  4. Anestesiar a los ratones usando gas isoflurano. Coloque los ratones en una caja de inducción con 5% de isoflurano. Confirmar el plano quirúrgico de la anestesia por la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie utilizando fórceps y reducir el isoflurano al 2% de la dosis de mantenimiento. Transfiera los ratones a un cono nasal apropiado que descanse sobre una placa de agua circulante a 37 ° C durante el resto del procedimiento.
  5. Retire el vello de ambas extremidades posteriores con pequeños cortapelos. Frote las extremidades inferiores con etanol / betadina alterna al 70% para desinfectar el área de inyección.

2. Inyección/electroporación de TA

  1. Con el ratón en posición supina, localice el tendón TA visible a través de la piel en el lado lateral de la parte inferior de la pierna. Usando una microjeringuaria de 50 μL con una aguja desmontable de 30 G, inserte la aguja 1-2 mm superior a la unión miotendinosa en un ángulo poco profundo de 5 ° hasta que la aguja alcance el extremo superior del músculo.
    NOTA: La inyección en el centro del músculo es el objetivo.
  2. Presione lentamente el émbolo mientras retrae lentamente la aguja a lo largo de la ruta de inyección para administrar 50 μL de solución de plásmido. El músculo debe hincharse.
  3. Ajuste el temporizador durante 1 minuto y mida el grosor de la pierna en el TA. Dependiendo del tamaño del mouse, esto puede ser de 5-10 mm. Ajuste los electrodos de la pinza al grosor medido y ajuste el voltaje del electroporador a 12.5 V / mm.
  4. Después de 1 min, coloque los electrodos de la pinza alrededor de la extremidad inferior. Los electrodos deben estar ajustados pero no demasiado apretados. Entregue 5 pulsos de onda cuadrada, con una duración de 20 ms e intervalos de 200 ms (el músculo debe contraerse con cada pulso).
  5. Repetir con la extremidad alternativa utilizando el vector de control.
  6. Retire el ratón de la anestesia y deje que se recupere en una almohadilla térmica a 37 °C. Una vez recuperado, devuelva el ratón a su jaula.

3. Inyección/electroporación de EDL

  1. Con el ratón en posición supina, localice la cresta anterior del hueso de la tibia visualmente y a través de una palpación suave.
    1. Usando un bisturí, haga una incisión poco profunda a través de la piel en el lado lateral de la cresta anterior de la tibia 5 mm inferior a la rodilla a 2 mm superior a la unión miotendinosa TA.
    2. Usando tijeras pequeñas, diseccionar la fascia con romo, exponiendo el músculo TA.
    3. Una vez más, usando la disección contundente con tijeras, separe el músculo TA de la tibia suavemente tirando del músculo lateralmente, exponiendo el EDL. Se pueden usar fórceps pequeños y curvos para mantener la TA libre del EDL durante el procedimiento.
  2. Usando una microjeringuaria de 50 μL con una aguja desmontable de 30 G, inserte la aguja en el EDL longitudinalmente hasta que la aguja llegue al extremo superior del músculo.
  3. Presione lentamente el émbolo mientras retrae lentamente la aguja a lo largo de la ruta de inyección para inyectar 10 μL de la solución de plásmido (el músculo debe hincharse).
  4. Ajuste un temporizador durante 1 minuto y mida el grosor de la pierna en el EDL. Dependiendo del tamaño del mouse, esto puede ser de 5-10 mm. Ajuste los electrodos de la pinza al grosor medido y ajuste el voltaje del electroporador a 12.5 V / mm.
  5. Después de 1 min, coloque los electrodos de la pinza alrededor de la extremidad inferior. Los electrodos deben estar ajustados pero no demasiado apretados. Entregue 5 pulsos de onda cuadrada, con una duración de 20 ms e intervalos de 200 ms (el músculo debe contraerse con cada pulso).
  6. Cierre la incisión con suturas de nylon desechables 4/0 no absorbibles.
  7. Repita con la extremidad alternativa o deje la extremidad intacta como control absoluto.
  8. Retire el ratón de la anestesia y deje que se recupere en una almohadilla térmica a 37 °C. Administrar un analgésico subcutáneo apropiado inmediatamente después de la cirugía y 12-24 h después de la cirugía. Una vez recuperado, devuelva el ratón a su jaula.
    NOTA: Estudios previos han demostrado un déficit de contractilidad muscular en la AT inmediatamente después de la electroporación y que la recuperación contráctil ocurre en el transcurso de 3 días13,15. Por esta razón, el análisis de los músculos TA y EDL para histología, expresión de proteínas o contractilidad muscular se realiza de 3 a 10 días después de la electroporación. Se ha observado una expresión prolongada de EGFP hasta 3 semanas después del procedimiento13.

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Representative Results

La electroporación para facilitar la transferencia de genes en el músculo esquelético es una técnica útil utilizada para evaluar los cambios en la fisiología muscular. Hemos demostrado un procedimiento detallado paso a paso para lograr una transferencia de genes eficiente tanto en los músculos TA como en los EDL. Las diferencias en la eficiencia de la transfección se producen debido a una serie de variables. Entre estas variables se encuentran los parámetros de electroporación (pulsos, voltaje, duración del pulso, etc.), el tamaño de la construcción del gen y la concentración / volumen de ADN inyectado. Hemos demostrado previamente que los parámetros de electroporación de 5 pulsos a 125 V/cm, con una duración de 20 ms separada por intervalos de 200 ms, son suficientes para lograr una transferencia génica eficiente en el TA14. También demostramos en el estudio actual que la inyección/electroporación de ADN no causa pérdida de contractilidad muscular en la EDL 3 días después de la experimentación.

Para visualizar la transferencia de genes, se electroporó una construcción pcDNA3-EGFP o pcDNA3 (control) en el músculo TA o EDL del ratón. 3 días después del procedimiento, el TA o EDL se diseccionó cuidadosamente, se colocó en medios de temperatura de corte óptima (OTC) y se congeló al presión en isopentano líquido refrigerado por nitrógeno (2-metilbutano), como se describió anteriormente 14,17,18,19. Se obtuvieron secciones musculares de 10 μm utilizando un criostato tomado de la parte media del vientre de cada músculo. Las secciones se incubaron en paraformaldehído al 1% durante 5 min, seguido de lavados de 3-5 min en PBS. Las secciones se incubaron en aglutinina de germen de trigo conjugada con Texas Red diluido 1:100 en PBS durante 90 minutos en la oscuridad. Las secciones se lavaron nuevamente en PBS 3 veces durante 5 minutos cada una. Las secciones musculares se cubrieron en medios de montaje acuosos y se tomaron imágenes en la longitud de onda de 594 nm (rojo) para visualizar las fibras musculares individuales y en la longitud de onda de 480 nm para detectar GFP (Figura 1A). Los músculos de control inyectados con pcDNA3 se tomaron imágenes en ambos canales con los mismos ajustes de exposición para controlar la posible autofluorescencia. Los músculos inyectados/electroporados con EGFP mostraron fibras verdes positivas, demostrando la absorción de la construcción pcDNA3-EGFP, mientras que los músculos inyectados/electroporados con pcDNA3 (control) no mostraron fibras verdes positivas. Nosotros y otros hemos demostrado previamente que el área de la sección transversal de miofibra no se ve comprometida por la expresión de GFP al comparar las fibras positivas de GFP (verde) con las fibras que no expresan GFP (negro) dentro de las mismas secciones musculares 4,6,19. Cuando se toman imágenes con un aumento más bajo, la eficiencia de la transfección muscular EDL se visualiza a través de la aparición de fibras verdes (positivas) frente a fibras negras (negativas) (Figura 1B). La eficiencia de transfección utilizando este procedimiento fue del 56,6% ± 4,7%, medida en 3 músculos EDL. Estos datos muestran que la inyección y electroporación del músculo TA es suficiente para una transferencia eficiente de genes. Además, la inyección y electroporación del EDL provoca una absorción eficiente de las construcciones genéticas.

Una herramienta importante para la evaluación de la fisiología del músculo esquelético es la medición de la contractilidad muscular. Investigadores anteriores han demostrado que la contractilidad de la AT medida in situ puede verse comprometida tempranamente después de la inyección y electroporación de la extremidad posterior13. Para probar si la contractilidad de EDL se ve comprometida después de la inyección y la electroporación, expusimos quirúrgicamente el EDL, lo inyectamos con pcDNA3-EGFP o construct, y electroporamos la extremidad posterior. Como control, la extremidad alternativa se dejó intacta para la comparación. Los ratones fueron sacrificados 3 días después, y la contractilidad muscular total de EDL se midió utilizando estimulación de campo en un baño fisiológico, como se describió anteriormente 14,19,20,21. Brevemente, el EDL fue diseccionado, y los tendones fueron atados a través de sutura de seda 4/0 a ganchos de acero inoxidable y suspendidos entre un transductor de fuerza y una base estática. Los músculos se bañaron en tampón Tyrode, que es una solución de baño fisiológico (121 mM NaCl, 5.0 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.4 mM NaH2PO4, 24 mM NaHCO3, 0.1 mM EDTA, 5.5 mM glucosa) y burbujearon con oxígeno al 100% durante todo el procedimiento. La contracción muscular se estimuló utilizando electrodos de platino para entregar un estímulo supramáximo. La longitud óptima del músculo (Lo) se ajustó para producir la fuerza máxima al comienzo del procedimiento. La relación fuerza-frecuencia se determinó utilizando frecuencias de estimulación entre 1-150 Hz (pulsos de 0,5 ms a voltaje supramáximo). Se dejó que el músculo se relajara durante 3 minutos entre cada estimulación. Después de completar el procedimiento de estimulación, se midió el peso y la longitud del músculo. La fuerza específica se calculó normalizando la fuerza absoluta a toda el área de la sección transversal del músculo, que se calcula como el peso dividido por la longitud y utilizando la constante de densidad muscular previamente determinada (1.056 kg/m−3)21. Hemos demostrado que los EDLs inyectados y electroporados representativos tienen respuestas tetánicas similares a 100 Hz en comparación con los músculos de control no inyectados o electroporados (Figura 2A y Figura 2B). Encontramos que la fuerza tetánica muscular, la fuerza tetánica específica, el tiempo hasta la tensión máxima y el tiempo de relajación media no se vieron comprometidos en el EDL inyectado y electroporado en comparación con el control intacto (Tabla 1). Nuestros datos demuestran que la expresión de proteínas que afecta la contractilidad puede ser modulada mediante electroporación en el EDL sin causar efectos adversos.

Figure 1
Figura 1: La electroporación de pcDNA3-EGFP es suficiente para la absorción de ADN en el músculo TA y EDL. A) Secciones transversales representativas de los controles TA y EDL (inyectados con vector de control y electroporados 125 V/cm) y GFP (inyectados con pcDNA3-EGFP y electroporados 125 V/cm). Barra de escala 50 μm. B) Sección transversal representativa del EDL que demuestra la eficiencia de la transfección. Barra de escala 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La inyección y la electroporación no comprometen la función muscular. Curvas de fuerza tetánica representativas a 100 Hz de A) EDL no inyectado/electroporado (control) y B) EDL inyectado/electroporado (GFP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Control (n=3) GFP (n=3) p-valor
FO g) 34,13 ± 1,15 35,87 ± 1,55 0.1918
sFO (kN/m2) 691,56 ± 45,80 660,00 ± 33,61 0.3917
TTP (seg) 0,249 ± 0,0203 0,247 ± 0,0197 0.9084
RT1/2 (seg) 0,035 ± 0,0035 0,033 ± .0031 0.6458
Control -no inyectado/no electroporado; GFP-inyectado con pcDNA3-EGFP y electroporado. Los valores son medios ± SD. p=0,05 considerados significativos. F0- Fuerza tetánica bruta a 100Hz, sF0-Fuerza específica tetánica a 100Hz, TTP- Tiempo hasta el pico a 1Hz, RT1/2- Tiempo a la mitad de relajación a 1Hz.

Tabla 1: Contractilidad muscular total desde el control versus EDL electroporados. Tabla que muestra que los diferentes parámetros de fuerza muscular no se ven comprometidos en los EDL inyectados / electroporados (GFP) en comparación con los controles no inyectados / no electroporados. F0 = fuerza tetánica a 100 Hz, sF0 = fuerza tetánica específica a 100 Hz, TTP = tiempo hasta la tensión máxima a 1 Hz, RT1/2 = medio tiempo de relajación. Prueba t del estudiante; Significancia en p = 0,05. n = 3.

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Discussion

La transferencia de genes in vivo en el músculo esquelético mejorada por electroporación es una herramienta útil y relativamente simple para modular la expresión de proteínas en el músculo. Hemos demostrado los pasos necesarios para lograr una transferencia de genes eficiente en los músculos EDL y TA y hemos demostrado que la medición de la contractilidad del EDL es viable después del procedimiento. Esta técnica no requiere vectores virales más complicados y permite la comparación del área transversal de fibra muscular transfectada y no transfectada en un solo músculo. Una limitación de este procedimiento es que la eficiencia de absorción de constructo no fue completa y algunas miofiberes permanecieron no transfectadas.

Los procedimientos discutidos no se limitan a la electroporación de vectores de expresión. Hemos demostrado previamente que la eliminación de proteínas se puede lograr siguiendo los mismos procedimientos, pero utilizando construcciones de siRNA o shRNA in vivo14. Además, se pueden utilizar construcciones reporteras para medir la actividad transcripcional de los genes diana 2,4,22. Estas herramientas permiten la manipulación de múltiples proteínas simultáneamente en un solo músculo esquelético, al tiempo que brindan al investigador la opción de medir fácilmente los cambios transcripcionales. El músculo esquelético también puede ser co-transfectado con un vector de expresión o sh/siRNA y un reportero fluorescente. Los estudios han demostrado que más del 95% de las fibras musculares que toman un vector también tomarán otro vector23. Esto es útil cuando las construcciones etiquetadas no son viables. Se pueden realizar experimentos similares en varios músculos, incluyendo el sóleo, el gastrocnemio, el cuádriceps y el flexor digitorum brevis, entre otros24. El procedimiento no se limita a los ratones. Las ratas se han utilizado ampliamente para la transferencia de genes musculares, pero se deben considerar los cambios en el volumen de inyección, la concentración de ADN y los parámetros de electroporación. Es importante destacar que la eficiencia de transferencia de genes disminuye cuando la electroporación se aplica a áreas grandes, y los músculos más grandes pueden requerir múltiples inyecciones24.

Los animales de transferencia posterior al gen se pueden utilizar para estudiar una variedad de condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Los principales determinantes de la eficacia de este procedimiento a tener en cuenta son la eficiencia de transfección del constructo deseado y la duración del estudio. Si bien se ha observado un aumento en la expresión de proteínas hasta 270 días después de la electroporación12, los estudios han demostrado que hay una reducción en la expresión a lo largo del tiempo13,25. La simplicidad y eficacia de este procedimiento lo hacen altamente aplicable al estudio de la fisiología del músculo esquelético.

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Disclosures

B.A.H. y D.L.W afirman que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Ninguno

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

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Biología Número 182
Electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético del ratón
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