Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Elektroporasjon av plasmid DNA i mus skjelettmuskulatur

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63916
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Summary

Elektroporasjon av plasmid DNA i skjelettmuskulatur er en levedyktig metode for å modulere genuttrykk uten å gå på kompromiss med muskelkontraktilitet hos mus.

Abstract

Forbigående genuttrykksmodulering i murine skjelettmuskulatur ved plasmid elektroporasjon er et nyttig verktøy for å vurdere normal og patologisk fysiologi. Overekspression eller knockdown av målgener gjør det mulig for etterforskere å manipulere individuelle molekylære hendelser og dermed bedre forstå mekanismene som påvirker muskelmasse, muskelmetabolisme og kontraktilitet. I tillegg tillater elektroporasjon av DNA-plasmider som koder fluorescerende tagger undersøkere å måle endringer i subcellulær lokalisering av proteiner i skjelettmuskulatur in vivo. En viktig funksjonell vurdering av skjelettmuskulaturen inkluderer måling av muskelkontraktilitet. I denne protokollen viser vi at hele muskelkontraktilitetsstudier fortsatt er mulig etter plasmid DNA-injeksjon, elektroporasjon og genuttrykksmodulering. Målet med denne instruksjonsprosedyren er å demonstrere trinnvis metode for DNA-plasmid elektroporasjon i mus skjelettmuskulatur for å lette opptak og uttrykk i myofibers av tibialis fremre og ekstensor digitorum longus muskler, samt å demonstrere at skjelettmuskulatur kontraktilitet ikke er kompromittert av injeksjon og elektroporasjon.

Introduction

Plasmid DNA-elektroporasjon i skjelettmuskulatur in vivo er et viktig verktøy for å vurdere endringer i skjelettmuskulaturfysiologi og molekylær signalering ved å modulere genuttrykk i en rekke fysiologiske og patofysiologiske forhold 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Eksperimentell genoverføring til skjelettmuskulatur ble demonstrert så tidlig som i 1990 av Wolff et al., hvor både RNA og DNA ble overført uten elektroporasjon, og luciferaseuttrykk ble opprettholdt i minst 2 måneder10. Den relativt lave transfeksjonseffektiviteten med injeksjon er bare problematisk, og Aihara og Miyazaki demonstrerte økt genoverføring med elektroporasjon i 1998 ved å elektroporere en pCAGGS-IL-5-konstruksjon i tibialis fremre (TA) muskel og måle serum IL-5 uttrykk11. Siden den gang har mange studier undersøkt effekten av forskjellige DNA-konsentrasjoner, volumer og elektroporasjonsparametere for å sikre maksimal genoverføringseffektivitet. Mir et al. testet forskjellige elektroporasjonsparametere, inkludert spenning, pulsnummer, pulsvarighet og frekvens, samt DNA-konsentrasjon, og fastslo at større spenning, pulsnummer og DNA-konsentrasjon alle bidro til økt elektroporasjonseffektivitet12. En stor advarsel til høy elektroporasjonsspenning er at selv om det letter økt DNA-opptak i myofibers, forårsaker det også muskelskader, noe som kan forvirre resultatene. Schertzer et al. viste at elektroporasjon ved 200 V forårsaket skade hos rundt 50% av myofibers 3 dager etter elektroporasjon, mens bare 10% av myofibers ble skadet ved 50 V13. Vi har tatt hensyn til variablene som påvirker effektiv DNA-overføring kontra muskelskade og funnet ut at en spenning på 125 V per centimeter kaliperbredde er tilstrekkelig til å oppnå effektiv genoverføring.

Analyse av muskelfiber tverrsnittsområde og hele muskelkontraktilitet etter elektroporasjon er viktige aspekter ved metoden for å måle endringer i muskelstørrelse og funksjon på grunn av genmodulering. Vi og andre har tidligere vist at elektroporasjon av kontrollvektorer alene ikke forårsaker en nedgang i myofiberområdet. Den grønne fluorescerende proteinkonstruksjonen (EGFP) var en nyttig fluorescerende indikator på DNA-transfeksjon i disse studiene13,14. En rekke studier har undersøkt in situ kontraktilitet av TA etter elektroporasjon og funnet varierende resultater. En studie viste at 75 V/cm elektroporasjon forårsaket omtrent 30% reduksjon i tetanisk kraft 3 dager etter elektroporasjon, og med 7 dager etter elektroporasjon var tetanisk kraft tilbake til kontrollnivået, mens 50 V / cm elektroporasjon ikke kompromitterte kraft13,15. En annen studie viste at det var et 30% tap av tetanisk kraft 3 timer etter 180 V / cm elektroporasjon, som gjenopprettet til sham force-nivåene etter 7 dager16.

I den følgende detaljerte prosedyren demonstrerer vi injeksjon og elektroporasjon av en pcDNA3-EGFP plasmid i TA og ekstensor digitorum longus (EDL) muskler hos mus. Vi viser også at denne metoden ikke påvirker EDL hele muskel kontraktilitet. Målet er å demonstrere effektivt plasmidopptak i myofibers uten å forårsake tap av funksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter med dyr ble utført ved Penn State College of Medicine, godkjent av Penn State University's Institutional Animal Care and Use Committee, og utført i samsvar med de etiske standardene som ble fastsatt i Helsinki-erklæringen fra 1964 og dens senere endringer. 12 uker gamle kvinnelige C57BL/6 mus ble brukt til denne prosedyren. Alle kirurgiske verktøy ble autoklavert for sterilitet før eksperimentering.

1. TA og EDL injeksjon / elektroporasjon forberedelse

MERK: Disse trinnene er identiske for TA- og EDL-injeksjon/elektroporasjonspreparat.

  1. Rens uttrykksplasmidkonstruksjoner til en konsentrasjon på 1 μg/μL fortynnet i steril PBS før forsøket. For denne prosedyren ble et kommersielt tilgjengelig endotoksinfritt rensesett brukt til å rense pcDNA3-EGFP (GFP) eller pcDNA3 tom vektor (kontroll).
  2. Beregn plasmidkonsentrasjonen for å sikre tilstrekkelig injeksjonsvolum (TA 50 μg DNA i 50 μL steril PBS; EDL 10 μg DNA i 10 μL sterile PBS) og aliquotprøver.
  3. Programmer elektroporatorinnstillingene ved hjelp av det valgte hjulet og trykk på hjulet for å velge parametrene som følger: Modus - LV, Spenning - 12,5 V/mm (justeres på injeksjonstidspunktet), pulslengde - 20 ms, antall pulser - 5, intervall - 200 ms, polaritet - unipolar.
  4. Bedøv musene ved hjelp av isoflurangass. Plasser musene i en induksjonsboks med 5% isofluran. Bekreft det kirurgiske planet av anestesi ved fravær av tåklemmerefleksen ved hjelp av tang og reduser isofluran til 2% vedlikeholdsdose. Overfør mus til en passende nesekjegle som hviler på en sirkulerende vannplate ved 37 °C for resten av prosedyren.
  5. Fjern hår fra begge bakbenene ved hjelp av små hårklippere. Skrubb underekstremitetene med vekslende 70% etanol/betadin for å desinfisere injeksjonsområdet.

2. TA-injeksjon/elektroporasjon

  1. Med musen i en liggende stilling, finn TA-senen synlig gjennom huden på siden av underbenet. Bruk en 50 μL mikrosprøyte med en avtakbar 30 G nål, sett nålen 1-2 mm overlegen det myotendinøse krysset i en grunne 5° vinkel til nålen når den overlegne enden av muskelen.
    MERK: Injeksjon i midten av muskelen er målet.
  2. Trykk stempelet langsomt ned mens du sakte trekker kanylen tilbake langs injeksjonsbanen for å levere 50 μL plasmidoppløsning. Muskelen skal svulme.
  3. Still inn timeren i 1 min og mål tykkelsen på benet ved TA. Avhengig av størrelsen på musen, kan dette være fra 5-10 mm. Sett kaliperelektrodene til den målte tykkelsen og sett elektroporatorspenningen til 12,5 V/mm.
  4. Etter 1 min plasserer du kaliperelektrodene rundt underekstremiteten. Elektrodene skal være tettsittende, men ikke altfor stramme. Lever 5 kvadratbølgepulser, med 20 ms varighet og 200 ms intervaller (muskelen skal rykke med hver puls).
  5. Gjenta med den alternative lemmen ved hjelp av kontrollvektoren.
  6. Fjern musen fra anestesi og la den gjenopprette på en varmepute satt til 37 °C. Når den er gjenopprettet, returner musen til buret.

3. EDL injeksjon / elektroporasjon

  1. Med musen i en liggende stilling, finn tibiabenet fremre kam visuelt og gjennom mild palpasjon.
    1. Bruk en skalpell, gjør et grunt snitt gjennom huden på sidesiden av tibia fremre kam 5 mm dårligere enn kneet til 2 mm overlegen TA myotendinøst kryss.
    2. Ved hjelp av liten saks, stump disseker fascia, utsette TA muskelen.
    3. Igjen, ved hjelp av stump disseksjon med saks, skille TA muskelen fra tibia forsiktig ved å trekke muskelen lateralt, utsette EDL. Små, buede tang kan brukes til å holde TA klar fra EDL under prosedyren.
  2. Bruk en 50 μL mikrosprøyte med en avtakbar 30 G nål, sett nålen inn i EDL-langsgående til nålen når den overlegne enden av muskelen.
  3. Trykk stempelet langsomt mens du sakte trekker tilbake nålen langs injeksjonsbanen for å injisere 10 μL av plasmidoppløsningen (muskelen skal svulme).
  4. Still inn en timer i 1 min og mål tykkelsen på benet ved EDL. Avhengig av størrelsen på musen, kan dette være fra 5-10 mm. Sett kaliperelektrodene til den målte tykkelsen og sett elektroporatorspenningen til 12,5 V/mm.
  5. Etter 1 min plasserer du kaliperelektrodene rundt underekstremiteten. Elektrodene skal være tettsittende, men ikke altfor stramme. Lever 5 kvadratbølgepulser, med 20 ms varighet og 200 ms intervaller (muskelen skal rykke med hver puls).
  6. Lukk snittet ved hjelp av engangs 4/0 ikke-absorberbare nylon suturer.
  7. Gjenta med den alternative lemmen eller la lemmen være uberørt som absolutt kontroll.
  8. Fjern musen fra anestesi og la den gjenopprette på en varmepute satt til 37 °C. Administrer et passende subkutant smertestillende umiddelbart etter operasjonen og 12-24 timer etter operasjonen. Når den er gjenopprettet, returner musen til buret.
    MERK: Tidligere studier har vist en muskel kontraktilitet underskudd i TA umiddelbart etter elektroporasjon og at kontraktil utvinning skjer i løpet av 3 dager13,15. Av denne grunn utføres analysen av både TA- og EDL-musklene for histologi, proteinuttrykk eller muskelkontraktilitet 3-10 dager etter elektroporasjon. Langvarig uttrykk for EGFP har blitt observert opptil 3 uker etter prosedyren13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Elektroporasjon for å lette genoverføring i skjelettmuskulatur er en nyttig teknikk som brukes til å evaluere endringer i muskelfysiologi. Vi har demonstrert en detaljert, trinnvis prosedyre for å oppnå effektiv genoverføring i både TA- og EDL-musklene. Forskjeller i transfeksjonseffektivitet oppstår på grunn av en rekke variabler. Blant disse variablene er elektroporasjonsparametere (pulser, spenning, pulsvarighet, etc.), genkonstruksjonsstørrelse og konsentrasjon / volum av DNA injisert. Vi har tidligere vist at elektroporasjonsparametere på 5 pulser ved 125 V/cm, med 20 ms varighet atskilt med 200 ms intervaller, er tilstrekkelig til å oppnå effektiv genoverføring i TA14. Vi demonstrerer også i den nåværende studien at injeksjon / elektroporasjon av DNA ikke forårsaker tap av muskelkontraktilitet i EDL 3-dagers etter eksperimentering.

For å visualisere genoverføring ble en pcDNA3-EGFP eller pcDNA3 (kontroll) konstruksjon elektroporert i mus TA eller EDL muskel. 3 dager etter inngrepet ble TA eller EDL forsiktig dissekert, plassert i optimale skjæringstemperaturmedier (OTC) og snapfryst i flytende nitrogenkjølt isopentan (2-metylbutan), som tidligere beskrevet 14,17,18,19. 10 μm muskelseksjoner ble oppnådd ved hjelp av en kryostat tatt fra midten av magen av hver muskel. Seksjoner ble deretter inkubert i 1% paraformaldehyd i 5 min, etterfulgt av 3-5 min vasker i PBS. Seksjoner ble deretter inkubert i hvete-bakterie agglutinin konjugert til Texas Red fortynnet 1:100 i PBS i 90 min i mørket. Seksjoner ble igjen vasket i PBS 3 ganger i 5 min hver. Muskelseksjoner ble deretter dekket i vandige monteringsmedier og avbildet i bølgelengden på 594 nm (rød) for å visualisere de enkelte muskelfibrene og i 480 nm bølgelengde for å oppdage GFP (figur 1A). Kontrollmusklene injisert med pcDNA3 ble avbildet i begge kanaler med samme eksponeringsinnstillinger for å kontrollere for potensiell autofluorescence. Muskler injisert/elektroporert med EGFP viste positive grønne fibre, som viste opptak av pcDNA3-EGFP-konstruksjonen, mens muskler injisert / elektroporert med pcDNA3 (kontroll) viste ingen grønne positive fibre. Vi og andre har tidligere vist at myofiber tverrsnittsområdet ikke er kompromittert av GFP-uttrykk ved å sammenligne GFP positive fibre (grønn) med ikke-GFP som uttrykker fibre (svart) innenfor de samme muskeldelene 4,6,19. Når bildet ved en lavere forstørrelse, EDL muskel transfection effektivitet visualiseres gjennom utseendet av grønne fibre (positive) versus svarte fibre (negativ) (Figur 1B). Transfeksjonseffektivitet ved hjelp av denne prosedyren var 56,6% ± 4,7%, målt i 3 EDL muskler. Disse dataene viser at injeksjon og elektroporasjon av TA muskelen er tilstrekkelig for effektiv genoverføring. I tillegg fremkaller injeksjon og elektroporasjon av EDL effektiv opptak av genkonstruksjoner.

Et viktig verktøy for evaluering av skjelettmuskulaturfysiologi er måling av muskelkontraktilitet. Tidligere etterforskere har vist at kontraktiliteten til TA målt in situ kan bli kompromittert tidlig etter injeksjon og elektroporasjon av bakre lem13. For å teste om EDL-kontraktilitet er kompromittert etter injeksjon og elektroporasjon, eksponerte vi kirurgisk EDL, injiserte den med pcDNA3-EGFP eller konstruksjon, og elektroporerte bakbenet. Som en kontroll ble den alternative lemmen stående uberørt for sammenligning. Musene ble euthanized 3 dager senere, og EDL hele muskel kontraktilitet ble målt ved hjelp av feltstimulering i et fysiologisk bad, som tidligere beskrevet 14,19,20,21. Kort sagt ble EDL dissekert, og senene ble bundet via 4/0 silke sutur til rustfrie stålkroker og suspendert mellom en krafttransduser og statisk base. Musklene ble badet i Tyrode buffer, som er en fysiologisk badeløsning (121 mM NaCl, 5,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 24 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA, 5,5 mM glukose) og boblet med 100% oksygen gjennom hele prosedyren. Muskelkontraksjon ble stimulert ved hjelp av platinaelektroder for å levere en supramaximal stimulans. Muskel optimal lengde (Lo) ble justert for å gi maksimal kraft i begynnelsen av prosedyren. Kraftfrekvensforholdet ble bestemt ved hjelp av stimuleringsfrekvenser mellom 1-150 Hz (0,5 ms pulser ved supramaximal spenning). Muskelen fikk lov til å slappe av i 3 minutter mellom hver stimulering. Etter at stimuleringsprosedyren var fullført, ble vekten og lengden på muskelen målt. Den spesifikke kraften ble beregnet ved å normalisere den absolutte kraften til hele muskel-tverrsnittsområdet, som beregnes som vekten delt på lengden og ved hjelp av den tidligere bestemte muskeltetthetskonstanten (1,056 kg / m −3)21. Vi har vist at representative injiserte og elektroporerte EDLer har lignende tetaniske responser ved 100 Hz sammenlignet med å kontrollere ikke-injiserte eller elektroporerte muskler (figur 2A og figur 2B). Vi fant muskel tetanisk kraft, spesifikk tetanisk kraft, tid til toppspenning, og halv avslapningstid ble ikke kompromittert i den injiserte og elektroporerte EDL sammenlignet med den uberørte kontrollen (tabell 1). Våre data viser at proteinuttrykk som påvirker kontraktilitet kan moduleres ved hjelp av elektroporasjon i EDL uten å forårsake bivirkninger.

Figure 1
Figur 1: Elektroporasjon av pcDNA3-EGFP er tilstrekkelig for DNA-opptak i TA- og EDL-muskler. A) Representative tverrsnitt fra TA- og EDL-kontroller (injisert med kontrollvektor og elektroporert 125 V/cm) og GFP (injisert med pcDNA3-EGFP og elektroporert 125 V/cm). Skalastang 50 μm. B) Representativt tverrsnitt fra EDL som demonstrerer transfeksjonseffektivitet. Skalalinje 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Injeksjon og elektroporasjon kompromitterer ikke muskelfunksjonen. Representative tetaniske kraftkurver ved 100 Hz fra A) ikke-injisert/elektroporert EDL (kontroll) og B) injisert/elektroporert EDL (GFP). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Kontroll (n=3) GFP (n=3) p-verdi
FO (g) 34.13 ± 1.15 35.87 ± 1,55 0.1918
sFO (kN/m2) 691,56 ± 45,80 660.00 ± 33.61 0.3917
TTP (sek) 0.249 ± 0.0203 0.247 ± 0.0197 0.9084
RT1/2 (sek) 0,035 ± 0,0035 0,033 ± .0031 0.6458
Kontroll -ikke-injisert/ikke-elektroporert; GFP-injisert med pcDNA3-EGFP og elektroporert. Verdier er gjennomsnittlige ± SD. p =0,05 betraktet som signifikante. F0- Rå tetanisk kraft ved 100 Hz, sF 0-tetanisk spesifikk kraft ved 100 Hz, TTP- tid til topp på 1 Hz, RT1 / 2 - tid til halv avslapning ved 1Hz.

Tabell 1: Hel muskelkontraktilitet fra kontroll versus elektroporerte EDLer. Tabell som viser at ulike muskelkraftparametere ikke er kompromittert i injiserte/elektroporerte EDLer (GFP) sammenlignet med ikke-injiserte/ikke-elektroporerte kontroller. F0 = tetanisk kraft ved 100 Hz, sF0 = spesifikk tetanisk kraft ved 100 Hz, TTP = tid til toppspenning ved 1 Hz, RT1/2 = halv avslapningstid. Studentens t-test; Signifikans ved p = 0,05. n = 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo genoverføring i skjelettmuskulatur forsterket av elektroporasjon er et nyttig og relativt enkelt verktøy for modulering av proteinuttrykk i muskel. Vi har vist trinnene som kreves for å oppnå effektiv genoverføring i EDL- og TA-musklene og vist at kontraktilitetsmåling av EDL er levedyktig etter prosedyren. Denne teknikken krever ikke mer kompliserte virale vektorer og tillater sammenligning av transfekterte og ikke-transfekterte muskelfiber tverrsnittsområde i en enkelt muskel. En begrensning i denne prosedyren er at konstruksjonsopptakseffektiviteten ikke var fullført, og noen myofibers forble ikke-transfektert.

De diskuterte prosedyrene er ikke begrenset til elektroporasjon av uttrykksvektorer. Vi har tidligere vist at protein knockdown kan oppnås ved å følge de samme prosedyrene, men ved hjelp av enten siRNA eller shRNA konstruksjoner in vivo14. I tillegg kan reporterkonstruksjoner brukes til å måle transkripsjonsaktiviteten til målgener 2,4,22. Disse verktøyene tillater manipulering av flere proteiner samtidig i en enkelt skjelettmuskulatur, samtidig som det gir undersøkeren muligheten til enkelt å måle transkripsjonsendringer. Skjelettmuskulaturen kan også kolisekteres sammen med et uttrykk eller sh/siRNA-vektor og fluorescerende reporter. Studier har vist at oppover 95% av muskelfibre som tar opp en vektor vil også ta opp en annen vektor23. Dette er nyttig når kodede konstruksjoner ikke kan brukes. Lignende eksperimenter kan utføres i ulike muskler, inkludert soleus, gastrocnemius, quadriceps og flexor digitorum brevis, blant andre24. Prosedyren er ikke begrenset til mus. Rotter har blitt brukt mye til muskelgenoverføring, men endringer i injeksjonsvolum, DNA-konsentrasjon og elektroporasjonsparametere bør vurderes. Det er viktig at genoverføringseffektiviteten reduseres når elektroporasjon påføres store områder, og større muskler kan kreve flere injeksjoner24.

Postgenoverføringsdyr kan brukes til å studere en rekke fysiologiske og patofysiologiske forhold. De viktigste determinantene for effekten av denne prosedyren for å ta hensyn til er transfeksjonseffektiviteten til ønsket konstruksjon og studiens varighet. Mens økt proteinuttrykk har blitt observert så lenge som 270 dager etter elektroporasjon12, har studier vist at det er en reduksjon i uttrykk over tid13,25. Enkelheten og effekten av denne prosedyren gjør det svært anvendelig for studiet av skjelettmuskulaturfysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

B.A.H. og D.L.W hevder ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

Tags

Biologi utgave 182
Elektroporasjon av plasmid DNA i mus skjelettmuskulatur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hain, B. A., Waning, D. L.… More

Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (182), e63916, doi:10.3791/63916 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter