Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Elektroporering av plasmid-DNA i musskelettmuskel

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63916
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Summary

Elektroporering av plasmid-DNA i skelettmuskulaturen är en livskraftig metod för att modulera genuttryck utan att kompromissa med muskelkontraktiliteten hos möss.

Abstract

Övergående genuttrycksmodulering i murin skelettmuskel genom plasmidelektroporering är ett användbart verktyg för att bedöma normal och patologisk fysiologi. Överuttryck eller knockdown av målgener gör det möjligt för utredare att manipulera enskilda molekylära händelser och därmed bättre förstå de mekanismer som påverkar muskelmassa, muskelmetabolism och kontraktilitet. Dessutom tillåter elektroporering av DNA-plasmider som kodar fluorescerande taggar utredare att mäta förändringar i subcellulär lokalisering av proteiner i skelettmuskulaturen in vivo. En viktig funktionell bedömning av skelettmuskulaturen inkluderar mätning av muskelkontraktilitet. I detta protokoll visar vi att hela muskelkontraktilitetsstudier fortfarande är möjliga efter plasmid-DNA-injektion, elektroporering och genuttrycksmodulering. Målet med denna instruktionsprocedur är att demonstrera steg-för-steg-metoden för DNA-plasmidelektroporering i musskelettmuskulatur för att underlätta upptag och uttryck i myofibrerna i tibialis främre och extensor digitorum longus muskler, samt att visa att skelettmuskelkontraktilitet inte äventyras genom injektion och elektroporation.

Introduction

Plasmid-DNA-elektroporering i skelettmuskulaturen in vivo är ett viktigt verktyg för att bedöma förändringar i skelettmuskelfysiologi och molekylär signalering genom att modulera genuttryck i en mängd olika fysiologiska och patofysiologiska tillstånd 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Experimentell genöverföring till skelettmuskulatur demonstrerades redan 1990 av Wolff et al., där både RNA och DNA framgångsrikt överfördes utan elektroporering, och luciferasuttryck bibehölls i minst 2 månader10. Den relativt låga transfektionseffektiviteten med endast injektion är problematisk, och Aihara och Miyazaki visade ökad genöverföring med elektroporering 1998 genom att elektroporera en pCAGGS-IL-5-konstruktion i tibialis främre (TA) muskel och mäta serum IL-5-uttryck11. Sedan dess har många studier undersökt effekten av olika DNA-koncentrationer, volymer och elektroporeringsparametrar för att säkerställa maximal genöverföringseffektivitet. testade olika elektroporeringsparametrar, inklusive spänning, pulsnummer, pulsvaraktighet och frekvens, samt DNA-koncentration, och bestämde att större spänning, pulsnummer och DNA-koncentration alla bidrog till ökad elektroporeringseffektivitet12. En viktig varning för hög elektroporeringsspänning är att även om det underlättar ökat DNA-upptag i myofibrer, orsakar det också muskelskador, vilket kan förvirra resultaten. visade att elektroporering vid 200 V orsakade skador i cirka 50% av myofibrerna 3 dagar efter elektroporering, medan endast 10% av myofibrerna skadades vid 50 V13. Vi har tagit hänsyn till de variabler som påverkar effektiv DNA-överföring kontra muskelskada och funnit att en spänning på 125 V per centimeter bromsokbredd är tillräcklig för att uppnå effektiv genöverföring.

Analys av muskelfibertvärsnittsarea och helmuskelkontraktilitet efter elektroporering är viktiga aspekter av metoden för att mäta förändringar i muskelstorlek och funktion på grund av genmodulering. Vi och andra har tidigare visat att elektroporering av enbart kontrollvektorer inte orsakar en minskning av myofiberområdet. Konstruktionen av grönt fluorescerande protein (EGFP) var en användbar fluorescerande indikator för DNA-transfektion i dessa studier13,14. Ett antal studier har undersökt in situ kontraktilitet av TA efter elektroporering och funnit varierande resultat. En studie visade att 75 V / cm elektroporering orsakade cirka 30% minskning av tetanisk kraft 3 dagar efter elektroporering, och med 7 dagar efter elektroporering var tetanisk kraft tillbaka till kontrollnivån, medan 50 V / cm elektroporering inte äventyrade kraften13,15. En annan studie visade att det fanns en 30% förlust av tetanisk kraft 3 h efter 180 V / cm elektroporering, som återhämtade sig till skenkraftnivåerna efter 7 dagar16.

I följande detaljerade procedur demonstrerar vi injektion och elektroporering av en pcDNA3-EGFP-plasmid i TA- och extensor digitorum longus (EDL) -musklerna hos möss. Vi visar också att denna metod inte påverkar EDL-helmuskelkontraktiliteten. Syftet är att påvisa effektivt plasmidupptag i myofibrer utan att orsaka funktionsförlust.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök utfördes vid Penn State College of Medicine, godkända av Penn State Universitys institutionella djurvårds- och användningskommitté, och utfördes i enlighet med de etiska normer som fastställdes i Helsingforsdeklarationen från 1964 och dess senare ändringar. 12 veckor gamla kvinnliga C57BL/6 möss användes för denna procedur. Alla kirurgiska verktyg autoklaverades för sterilitet före experiment.

1. Beredning av TA- och EDL-injektion/elektroporering

OBS: Dessa steg är identiska för TA- och EDL-injektions- / elektroporeringspreparat.

  1. Purify expression plasmid konstruerar till en koncentration av 1 μg / μL utspädd i steril PBS före experimentet. För denna procedur användes en kommersiellt tillgänglig endotoxinfri reningssats för att rena pcDNA3-EGFP (GFP) eller pcDNA3 tom vektor (kontroll).
  2. Beräkna plasmidkoncentrationen för att säkerställa tillräcklig injektionsvolym (TA50 μg DNA i 50 μl steril PBS; EDL 10 μg DNA i 10 μL steril PBS) och alikvotprover.
  3. Programmera elektroindunatorinställningarna genom att använda det valda hjulet och trycka ner hjulet för att välja parametrar enligt följande: Läge - LV, Spänning - 12,5 V / mm (ska justeras vid injektionstillfället), pulslängd - 20 ms, antal pulser - 5, intervall - 200 ms, polaritet - unipolär.
  4. Bedöva mössen med isoflurangas. Placera mössen i en induktionslåda med 5% isofluran. Bekräfta det kirurgiska anestesiplanet genom frånvaro av tånypreflexen med pincett och minska isofluran till 2% underhållsdos. Överför mössen till en lämplig noskon som vilar på en cirkulerande vattenplatta vid 37 °C under resten av proceduren.
  5. Ta bort hår från båda bakbenen med små hårklippare. Skrubba underbenen med alternerande 70% etanol/betadin för att sanera injektionsområdet.

2. TA-injektion/elektroporering

  1. Med musen i ryggläge, lokalisera TA-senan synlig genom huden på sidosidan av underbenet. Använd en 50 μL mikrospruta med en avtagbar 30 G-nål och sätt in nålen 1-2 mm överlägsen den myotendinösa korsningen i en grund 5 ° vinkel tills nålen når den överlägsna änden av muskeln.
    OBS: Injektion i mitten av muskeln är målet.
  2. Tryck långsamt ner kolven medan du långsamt drar tillbaka nålen längs injektionsvägen för att leverera 50 μL plasmidlösning. Muskeln ska svälla.
  3. Ställ in timern på 1 min och mät benets tjocklek vid TA. Beroende på musens storlek kan detta vara från 5-10 mm. Ställ in bromsokets elektroder på den uppmätta tjockleken och ställ in elektroindunatorspänningen på 12,5 V/mm.
  4. Efter 1 min placerar du bromsokselektroderna runt underbenet. Elektroderna ska vara tätt men inte alltför täta. Leverera 5 fyrkantsvågspulser, med 20 ms varaktighet och 200 ms intervaller (muskeln ska rycka med varje puls).
  5. Upprepa med den alternativa lemmen med hjälp av kontrollvektorn.
  6. Ta bort musen från anestesi och låt den återhämta sig på en värmedyna inställd på 37 °C. När du har återhämtat dig, sätt tillbaka musen i buret.

3. EDL-injektion/elektroporering

  1. Med musen i ryggläge, lokalisera tibiabenets främre vapen visuellt och genom mild palpation.
    1. Använd en skalpell, gör ett grunt snitt genom huden på sidosidan av tibia främre vapen 5 mm sämre än knäet till 2 mm överlägsen TA-myotendinös korsning.
    2. Med hjälp av en liten sax dissekerar trubbig fascia och exponerar TA-muskeln.
    3. Återigen, med hjälp av trubbig dissektion med sax, separera TA-muskeln från skenbenet försiktigt genom att dra muskeln i sidled och exponera EDL. Små, böjda pincett kan användas för att hålla TA fri från EDL under proceduren.
  2. Använd en 50 μL mikrospruta med en avtagbar 30 G-nål och sätt in nålen i EDL i längdriktningen tills nålen når den överlägsna änden av muskeln.
  3. Tryck långsamt ner kolven medan du långsamt drar tillbaka nålen längs injektionsvägen för att injicera 10 μL av plasmidlösningen (muskeln ska svälla).
  4. Ställ in en timer på 1 min och mät benets tjocklek vid EDL. Beroende på musens storlek kan detta vara från 5-10 mm. Ställ in bromsokets elektroder på den uppmätta tjockleken och ställ in elektroindunatorspänningen på 12,5 V/mm.
  5. Efter 1 min placerar du bromsokselektroderna runt underbenet. Elektroderna ska vara tätt men inte alltför täta. Leverera 5 fyrkantsvågspulser, med 20 ms varaktighet och 200 ms intervaller (muskeln ska rycka med varje puls).
  6. Stäng snittet med engångs 4/0 icke absorberbara nylonsuturer.
  7. Upprepa med den alternativa lemmen eller lämna lemmen orörd som absolut kontroll.
  8. Ta bort musen från anestesi och låt den återhämta sig på en värmedyna inställd på 37 °C. Administrera ett lämpligt subkutant smärtstillande medel omedelbart efter operationen och 12-24 timmar efter operationen. När du har återhämtat dig, sätt tillbaka musen i buret.
    OBS: Tidigare studier har visat ett muskelkontraktilitetsunderskott i TA omedelbart efter elektroporation och att kontraktil återhämtning sker under 3 dagar13,15. Av denna anledning utförs analysen av både TA- och EDL-musklerna för histologi, proteinuttryck eller muskelkontraktilitet 3-10 dagar efter elektroporering. Långvarigt uttryck av EGFP har observerats upp till 3 veckor efter proceduren13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Elektroporering för att underlätta genöverföring i skelettmuskulaturen är en användbar teknik som används för att utvärdera förändringar i muskelfysiologi. Vi har demonstrerat en detaljerad, steg-för-steg-procedur för att åstadkomma effektiv genöverföring i både TA- och EDL-musklerna. Skillnader i transfektionseffektivitet uppstår på grund av ett antal variabler. Bland dessa variabler finns elektroporeringsparametrar (pulser, spänning, pulsvaraktighet etc.), genkonstruktionsstorlek och koncentration / volym av DNA som injiceras. Vi har tidigare visat att elektroporeringsparametrar på 5 pulser vid 125 V/cm, med 20 ms varaktighet åtskilda av 200 ms intervall, är tillräckliga för att åstadkomma effektiv genöverföring i TA14. Vi visar också i den aktuella studien att injektion/elektroporering av DNA inte orsakar förlust av muskelkontraktilitet i EDL 3-dagars efter experiment.

För att visualisera genöverföring elektroporerades en pcDNA3-EGFP- eller pcDNA3 -konstruktion (kontroll) i mus TA- eller EDL-muskel. 3 dagar efter proceduren dissekerades TA eller EDL noggrant, placerades i optimal skärtemperatur (OTC) och snäppfrystes i flytande kvävekyld isopentan (2-metylbutan), som tidigare beskrivits 14,17,18,19. 10 μm muskelsektioner erhölls med användning av en kryostat som togs från mitten av magen i varje muskel. Sektioner inkuberades sedan i 1% paraformaldehyd i 5 min, följt av 3-5 min tvättar i PBS. Sektioner inkuberades sedan i vete-grodd agglutinin konjugerat till Texas Red utspätt 1:100 i PBS i 90 minuter i mörkret. Sektioner tvättades igen i PBS 3 gånger i 5 min vardera. Muskelsektioner täcktes sedan i vattenhaltiga monteringsmedier och avbildades i våglängden 594 nm (röd) för att visualisera de enskilda muskelfibrerna och i 480 nm våglängd för att detektera GFP (figur 1A). Kontrollmusklerna injicerade med pcDNA3 avbildades i båda kanalerna med samma exponeringsinställningar för att kontrollera för potentiell autofluorescens. Muskler injicerade /elektroporerade med EGFP visade positiva gröna fibrer, vilket visade upptag av pcDNA3-EGFP-konstruktionen, medan muskler injicerade / elektroporerade med pcDNA3 (kontroll) visade inga gröna positiva fibrer. Vi och andra har tidigare visat att myofibertvärsnittsarean inte äventyras av GFP-uttryck genom att jämföra GFP-positiva fibrer (gröna) med icke-GFP-uttryckande fibrer (svarta) inom sammamuskelsektioner 4,6,19. När den avbildas med en lägre förstoring visualiseras EDL-muskeltransfektionseffektivitet genom utseendet på gröna fibrer (positiva) kontra svarta fibrer (negativa) (figur 1B). Transfektionseffektiviteten med denna procedur var 56,6% ± 4,7%, mätt i 3 EDL-muskler. Dessa data visar att injektionen och elektroporeringen av TA-muskeln är tillräcklig för effektiv genöverföring. Dessutom framkallar injektion och elektroporering av EDL effektivt upptag av genkonstruktioner.

Ett viktigt verktyg för utvärdering av skelettmuskelfysiologi är mätning av muskelkontraktilitet. Tidigare utredare har visat att kontraktiliteten hos ta mätt in situ kan äventyras tidigt efter injektion och elektroporering av bakbenet13. För att testa om EDL-kontraktiliteten äventyras efter injektion och elektroporering exponerade vi kirurgiskt EDL, injicerade den med pcDNA3-EGFP eller konstruktion och elektroporerade bakbenet. Som en kontroll lämnades den alternativa lemmen orörd för jämförelse. Mössen avlivades 3 dagar senare, och EDL-hela muskelkontraktiliteten mättes med fältstimulering i ett fysiologiskt bad, som tidigare beskrivits 14,19,20,21. Kortfattat dissekerades EDL och senorna knöts via 4/0 sidens sutur till rostfria krokar och hängdes upp mellan en kraftgivare och statisk bas. Musklerna badades i Tyrodebuffert, som är en fysiologisk badlösning (121 mM NaCl, 5,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 24 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA, 5,5 mM glukos) och bubblade med 100% syre under hela proceduren. Muskelkontraktion stimulerades med hjälp av platinaelektroder för att leverera en supramaximal stimulans. Muskeloptimal längd (Lo) justerades för att ge maximal kraft i början av proceduren. Kraftfrekvensförhållandet bestämdes med hjälp av stimuleringsfrekvenser mellan 1-150 Hz (0,5 ms pulser vid supramaximal spänning). Muskeln fick slappna av i 3 min mellan varje stimulering. Efter att stimuleringsproceduren var klar mättes muskelns vikt och längd. Den specifika kraften beräknades genom att normalisera den absoluta kraften till hela muskeltvärsnittsarean, som beräknas som vikten dividerad med längden och med hjälp av den tidigare bestämda muskeltäthetskonstanten (1,056 kg/m−3)21. Vi har visat att representativa injicerade och elektroporerade EDL har liknande tetaniska svar vid 100 Hz jämfört med kontroll av icke-injicerade eller elektroporerade muskler (figur 2A och figur 2B). Vi fann att muskeltetanisk kraft, specifik tetanisk kraft, tid till toppspänning och halv avslappningstid inte äventyrades i den injicerade och elektroporerade EDL jämfört med den orörda kontrollen (tabell 1). Våra data visar att proteinuttryck som påverkar kontraktiliteten kan moduleras med hjälp av elektroporering i EDL utan att orsaka negativa effekter.

Figure 1
Figur 1: Elektroporering av pcDNA3-EGFP är tillräcklig för DNA-upptag i TA- och EDL-muskler. A) Representativa tvärsnitt från TA- och EDL-kontroller (injicerade med kontrollvektor och elektroporerade 125 V/cm) och GFP (injicerade med pcDNA3-EGFP och elektroporerade 125 V/cm). Skalstreck 50 μm. B) Representativt tvärsnitt från EDL som visar transfektionseffektivitet. Skala bar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Injektion och elektroporering äventyrar inte muskelfunktionen. Representativa tetaniska kraftkurvor vid 100 Hz från A) icke-injicerad/elektroporerad EDL (kontroll) och B) injicerad/elektroporerad EDL (GFP). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kontroll (n=3) GFP (n=3) p-värde
FO (g) 34.13 ± 1.15 35,87 ± 1,55 0.1918
sFO (kN/m2) 691,56 ± 45,80 660,00 ± 33,61 0.3917
TTP (sek) 0,249 ± 0,0203 0,247 ± 0,0197 0.9084
RT1/2 (sek) 0,035 ± 0,0035 0,033 ± .0031 0.6458
Kontroll -icke-injicerad/icke-elektroporerad; GFP-injicerad med pcDNA3-EGFP och elektroporerad. Värdena är medelvärden ± SD. p=0,05 anses signifikant. F0- Rå tetanisk kraft vid 100Hz, sF 0-Tetanic Specific Force vid 100Hz, TTP- Tid att peaka vid 1Hz, RT1/2- Tid till halv avslappning vid 1Hz.

Tabell 1: Hel muskelkontraktilitet från kontroll kontra elektroporerade EDL. Tabell som visar att olika muskelkraftparametrar inte äventyras i injicerade/elektroporerade EDL (GFP) jämfört med icke-injicerade/icke-elektroporerade kontroller. F0 = tetanisk kraft vid 100 Hz, sF0 = specifik tetankraft vid 100 Hz, TTP = tid till toppspänning vid 1 Hz, RT1/2 = halv avslappningstid. Elevens t-test; Betydelse vid p = 0, 05. n = 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo genöverföring i skelettmuskulatur förstärkt genom elektroporering är ett användbart och relativt enkelt verktyg för att modulera proteinuttryck i muskler. Vi har visat de steg som krävs för att uppnå effektiv genöverföring i EDL- och TA-musklerna och visat att kontraktilitetsmätning av EDL är livskraftig efter proceduren. Denna teknik kräver inte mer komplicerade virala vektorer och möjliggör jämförelse av transfekterad och icke-transfekt muskelfibertvärsnittsarea i en enda muskel. En begränsning för denna procedur är att konstruktionsupptagningseffektiviteten inte var fullständig och vissa myofibrer förblev icke-transfekterade.

De diskuterade procedurerna är inte begränsade till elektroporering av uttrycksvektorer. Vi har tidigare visat att protein knockdown kan uppnås genom att följa samma procedurer, men med hjälp av antingen siRNA eller shRNA-konstruktioner in vivo14. Dessutom kan reporterkonstruktioner användas för att mäta transkriptionsaktiviteten hosmålgenerna 2,4,22. Dessa verktyg möjliggör manipulation av flera proteiner samtidigt i en enda skelettmuskel, samtidigt som utredaren får möjlighet att enkelt mäta transkriptionella förändringar. Skelettmuskulaturen kan också samtransfekteras med ett uttryck eller sh / siRNA-vektor och fluorescerande reporter. Studier har visat att uppemot 95% av muskelfibrerna som tar upp en vektor också kommer att ta upp en annan vektor23. Detta är användbart när taggade konstruktioner inte är genomförbara. Liknande experiment kan utföras i olika muskler, inklusive soleus, gastrocnemius, quadriceps och flexor digitorum brevis, bland andra24. Förfarandet är inte begränsat till möss. Råttor har använts i stor utsträckning för muskelgenöverföring, men förändringar i injektionsvolym, DNA-koncentration och elektroporeringsparametrar bör övervägas. Viktigt är att genöverföringseffektiviteten minskar när elektroporering appliceras på stora områden, och större muskler kan kräva flera injektioner24.

Djur efter genöverföring kan användas för att studera en mängd olika fysiologiska och patofysiologiska tillstånd. De viktigaste determinanterna för effekten av denna procedur att ta hänsyn till är transfektionseffektiviteten hos den önskade konstruktionen och studiens varaktighet. Medan ökat proteinuttryck har observerats så länge som 270 dagar efter elektroporering12, har studier visat att det finns en minskning av uttrycket över tiden13,25. Enkelheten och effekten av denna procedur gör den mycket tillämplig på studier av skelettmuskelfysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

B.A.H. och D.L.W hävdar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

Tags

Biologi utgåva 182
Elektroporering av plasmid-DNA i musskelettmuskel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hain, B. A., Waning, D. L.… More

Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (182), e63916, doi:10.3791/63916 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter