Summary
Il presente protocollo descrive i concetti e l'applicazione tecnica della tecnica del miografo tensometrico utilizzando un sistema miografo multicamera nella valutazione sperimentale ex vivo della funzione endoteliale aortica del topo.
Abstract
La miografia tensometrica a camera di piccolo volume è una tecnica comunemente usata per valutare la contrattilità vascolare dei vasi sanguigni piccoli e grandi negli animali da laboratorio e nelle piccole arterie isolate dal tessuto umano. La tecnica consente ai ricercatori di mantenere i vasi sanguigni isolati in un ambiente strettamente controllato e standardizzato (quasi fisiologico), con la possibilità di adattarsi a vari fattori ambientali, sfidando i vasi isolati con diversi agenti farmacologici che possono indurre vasocostrizione o vasodilatazione. La camera miografica fornisce anche una piattaforma per misurare la reattività vascolare in risposta a vari ormoni, inibitori e agonisti che possono influire sulla funzione della muscolatura liscia e degli strati endoteliali separatamente o contemporaneamente. La parete dei vasi sanguigni è una struttura complessa costituita da tre diversi strati: l'intima (strato endoteliale), i media (muscoli lisci e fibre di elastina) e l'avventizia (collagene e altro tessuto connettivo). Per ottenere una chiara comprensione delle proprietà funzionali di ogni strato, è fondamentale avere accesso a una piattaforma sperimentale e a un sistema che consenta un approccio combinato per studiare tutti e tre gli strati contemporaneamente. Tale approccio richiede l'accesso a una condizione semi-fisiologica che imiterebbe l'ambiente in vivo in un ambiente ex vivo . La miografia tensometrica a camera di piccolo volume ha fornito un ambiente ideale per valutare l'impatto di segnali ambientali, variabili sperimentali o agonisti e antagonisti farmacologici sulle proprietà vascolari. Per molti anni, gli scienziati hanno utilizzato la tecnica del miografo tensometrico per misurare la funzione endoteliale e la contrattilità della muscolatura liscia in risposta a diversi agenti. In questo rapporto, un sistema miografico tensometrico a camera di piccolo volume viene utilizzato per misurare la funzione endoteliale nell'aorta isolata del topo. Questo rapporto si concentra su come la miografia tensometrica a camera di piccolo volume può essere utilizzata per valutare l'integrità funzionale dell'endotelio in piccoli segmenti di una grande arteria come l'aorta toracica.
Introduction
Negli ultimi decenni, il sistema di miografia a camera piccola è stato utilizzato per misurare la reattività di diversi strati di pareti dei vasi sanguigni in risposta a vari agenti farmacologici e neurotrasmettitori in un ambiente ex vivo, in tempo reale. La reattività vascolare è una componente importante di un vaso sanguigno funzionale sano ed è fondamentale per la regolazione del flusso sanguigno e della perfusione nel sistema vascolare periferico e cerebrale1. All'interno della parete dei vasi sanguigni, l'interazione tra strati endoteliali e muscolari lisci è un importante determinante del tono vascolare, che è anche costantemente influenzato da cambiamenti strutturali nello strato di tessuto connettivo che circonda la parete dei vasi sanguigni (avventizia).
Lo strato endoteliale controlla la vasomozione rilasciando alcuni fattori vasodilatatori, tra cui ossido nitrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fattore iperpolarizzante derivato dall'endotelio (EDHF), o producendo agenti vasocostrittori come endotelina-1 (ET-1) e trombossano (TXA2)2,3,4. Tra questi fattori, l'NO è stato ampiamente studiato e i suoi importanti ruoli regolatori in altre funzioni cellulari critiche come l'infiammazione, la migrazione, la sopravvivenza e la proliferazione sono stati altamente citati nella letteratura scientifica 2,5.
Nel campo della biologia vascolare, la miografia camerale ha fornito ai fisiologi vascolari e ai farmacologi uno strumento prezioso e affidabile per misurare la funzione endoteliale in un sistema semi-fisiologico strettamente controllato1. Attualmente, ci sono due diversi sistemi miografici disponibili per gli scienziati: miografia tensometrica (isometrica) a filo (o pin) e miografia a pressione. In un sistema di miografia a filo, il vaso sanguigno è teso tra due fili o perni, consentendo la misurazione isometrica dello sviluppo di forza o tensione nella parete del vaso sanguigno, mentre la miografia a pressione è una piattaforma preferibile per le misurazioni della reattività vascolare nelle piccole arterie di resistenza, dove i cambiamenti nella pressione sanguigna sono considerati lo stimolo principale per i cambiamenti nel tono vascolare e nella vasomozione. C'è un accordo generale sul fatto che, per le piccole arterie di resistenza come le arterie mesenteriche e cerebrali, la miografia pressoria crea una condizione più vicina alle condizioni fisiologiche nel corpo umano. Il miografo a camera piccola può essere utilizzato per vasi con diametri molto piccoli (200-500 μm) a vasi molto più grandi come l'aorta.
Mentre il miografo a filo è un potente sistema per registrare la tensione dei vasi sanguigni in condizioni isometriche, il miografo a pressione è un sistema più appropriato per misurare i cambiamenti nel diametro del vaso in risposta ai cambiamenti nelle condizioni isobariche. I cambiamenti di diametro nel vaso in risposta a cambiamenti di pressione o flusso sono molto più grandi in una piccola arteria muscolare (arteriola) rispetto alle grandi arterie elastiche come l'aorta. Per questi motivi, il miografo a pressione è considerato uno strumento migliore per i piccoli vasi sanguigni con vasoreattività sostanziale1. Uno degli altri punti di forza pratici della miografia tensometrica a camera multicamera a piccolo volume è che si può discernere il contributo di diversi meccanismi alla reattività vascolare studiando più (fino a quattro) segmenti della stessa arteria e dallo stesso animale per ridurre la variabilità e produrre dati robusti e conclusivi. È anche relativamente facile da configurare e mantenere tecnicamente. Vasi di quasi tutte le dimensioni possono essere studiati con un miografo a filo. È una soluzione più economica per valutare la funzione vascolare ed è una buona alternativa alla miografia a pressione negli esperimenti in cui la lunghezza del vaso sezionato è troppo breve per il protocollo del miografo a pressione.
Questo rapporto fornisce un protocollo dettagliato per la valutazione della funzione endoteliale nell'anello aortico toracico isolato del topo utilizzando perni di montaggio nella tecnica di miografia tensometrica a camera a piccolo volume utilizzando il sistema miografico multicamera DMT-620 (DMT-USA). Questo protocollo utilizza un topo maschio C57BL6 di 6 mesi con un peso medio compreso tra 25-35 g. Fortunatamente, questo protocollo può essere applicato a vari tipi e pesi di animali, considerando l'ampia gamma di tipi di vasi e diametri per cui questo protocollo può essere utilizzato.
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Protocol
Tutte le procedure chirurgiche e la cura degli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use and Care Committee (IACUC) della Midwestern University (IACUC # AZ-3006, AZ-2936).
1. Preparazione del buffer
NOTA: Sebbene il tampone della soluzione fisiologica di sale HEPES (HEPES-PSS) sia stabile a 4 °C per 7 giorni, si raccomanda che tutti i tamponi siano preparati il giorno di ogni esperimento. Tutti gli altri reagenti e agonisti devono essere preparati freschi per ogni esperimento. Il tampone HEPES-PSS utilizzato in questo protocollo è un tampone ben consolidato per studi vascolari ex vivo che ha dimostrato di essere citoprotettivo per più di 12 ore preservando le risposte vasodilatatorie del vaso - l'obiettivo principale di questo protocollo sperimentale 6,7.
- Preparare la soluzione HEPES-PSS (pH 7,4) come segue: Mescolare 10 mmol/L HEPES, 6 mmol/L glucosio, 1,5 mmol/L CaCl 2, 130 mmol/L NaCl, 4 mmol/L KCl, 4 mmol/L NaHCO3, 1,2 mmol/L MgSO 4, 1,2 mmol/L KH2 PO4 e 0,03 mmol/L EDTA.
- Preparare il buffer HEPES-PSS ad alto K+ . Questo è identico alla soluzione HEPES-PSS, tranne che contiene 5 mmol / L HEPES, 65 mmol / L NaCl, 10 mmol / L glucosio, 1 mmol / L MgCl2, 80 mmol / L KCl e non contiene MgSO4 e EDTA.
2. Preparazione dell'unità miografica
- Accendere e impostare il bagnomaria a 37 °C. Garantire un livello d'acqua adeguato.
- Posizionare due becher opportunamente etichettati nel bagnomaria, uno con 600 mL di soluzione HEPES-PSS e uno con 150 mL di soluzione ad alto K+ .
- Aerare un becher di 300 mL di soluzione HEPES-PSS con gas carbogeno (5% CO 2 e 95% O2) per almeno 10 minuti.
- Aggiungere 30 mL della soluzione HEPES-PSS aerata in una provetta da centrifuga da 50 ml, etichettare in modo appropriato (gabbia toracica, numero di identificazione del topo) e metterlo su ghiaccio. Conservare la soluzione HEPES-PSS aerata rimanente su ghiaccio da utilizzare durante il processo di dissezione aortica.
- Accendere l'unità miografica a quattro camere; aggiungere 6 mL di soluzione HEPES-PSS a ciascuna camera del miografo e impostare il calore a 37 °C. Lasciare che la soluzione in ciascuna camera venga aerata (con miscela di carbogeno) per 30 minuti e controllare che le camere abbiano raggiunto i 37 °C desiderati (utilizzare questo periodo di attesa per sezionare l'aorta del topo).
- Accendere l'hardware e il computer di acquisizione dati del miografo.
3. Isolamento dell'aorta del topo
- Anestetizzare il topo sperimentale con inalazione di isoflurano al 5% ed eutanasia per lussazione cervicale (per questa dimostrazione viene utilizzato un topo maschio C57BL/6J di 6 mesi).
- Appoggiare il mouse su una tavola chirurgica in posizione supina e fissare le appendici alla scheda usando del nastro chirurgico.
- Spruzzare la regione addominale con alcool al 70% in modo che la pelliccia sia completamente bagnata e che eventuali peli sciolti / secchi non entrino nell'incisione. Rimuovere delicatamente la soluzione in eccesso.
- Utilizzare una pinza per individuare e isolare la pelle addominale appena inferiore al processo xifoideo dello sterno.
- Crea tensione sollevando la pelle verso l'alto. Fai un taglio smussato usando le forbici e rimuovi la pelle superficiale, esponendo la cavità toracica.
- Sollevare il processo xifoideo e fare incisioni laterali appena inferiori al processo lungo i margini subcostali.
- Estendere le incisioni laterali cranialmente per rimuovere la porzione anteriore della gabbia toracica.
- Rimuovere la gabbia toracica facendo un taglio smussato attraverso la colonna vertebrale, sotto il diaframma e nel collo.
NOTA: I ricercatori possono anche rimuovere l'aorta direttamente dall'animale, ma bisogna fare attenzione a proteggere la nave e lavare il sangue coagulato dall'aorta. Questo protocollo utilizza l'esempio della rimozione della gabbia toracica e della pulizia e dissezione accurata dell'aorta. Con la pratica, questo metodo può essere eseguito in modo rapido ed efficiente ed è utile per preservare il tessuto extra per altri studi come l'immunoistochimica, l'istologia e il western blotting. - Trasferire la gabbia toracica in una capsula di Petri rivestita di elastomero di silicone trasparente riempita con tampone HEPES-PSS aerato ghiacciato e fissarla su entrambi i lati.
NOTA: Utilizzare un kit di elastomero siliconico (Tabella dei materiali). Mescolare base e agente polimerizzante (10:1 in peso), quindi versare in una capsula di Petri di vetro e lasciare polimerizzare per 24 ore a 25 °C. - Posizionare la capsula di Petri sotto un microscopio zoom stereo, tagliare delicatamente e rimuovere il cuore e l'aorta attaccata dalla gabbia toracica e trasferirla in un piatto rivestito di elastomero siliconico pulito e trasparente (Figura 1).
- Quindi, rimuovere delicatamente il grasso e il tessuto connettivo e qualsiasi sangue coagulato dall'aorta. Usando piccole forbici affilate, sezionare e isolare l'intera aorta a partire dall'area dell'arco fino alla parte inferiore dell'aorta discendente. Ricorda che l'arco aortico non è adatto per esperimenti miografici ma può essere utilizzato per studi istologici.
- Utilizzare la soluzione HEPES-PSS aerata a freddo durante tutta la dissezione. Cambia la soluzione ogni 10 minuti o quando la visibilità è compromessa, qualunque cosa accada prima. Si raccomanda che ogni anello aortico sia montato sulla camera del miografo entro 20 minuti dopo la dissezione (max 60 min).
4. Montaggio dei segmenti aortici sulle camere del miografo
- Tagliare l'aorta sezionata in quattro segmenti di 2 mm ciascuno usando piccole forbici chirurgiche affilate. Usa il mini-righello all'interno del piatto come riferimento.
- Posizionare la camera del miografo sotto il microscopio zoom stereo per visualizzare facilmente i pin e impostare i micrometri in modo tale che i pin si tocchino quasi (Figura 2).
- Assicurarsi che entrambi i perni di supporto del tessuto siano correttamente allineati.
- Prestare attenzione ed evitare di pizzicare l'aorta durante il montaggio dei segmenti per evitare danni all'endotelio.
- Nelle camere contenenti già 5 ml di tampone HEPES-PSS riscaldato e aerato, far scorrere con attenzione ciascuno dei segmenti aortici di 2 mm sui due perni di montaggio usando una pinza. Sii molto delicato mentre fai scorrere i segmenti aortici sui perni. Lo strato endoteliale è molto fragile e si stacca molto facilmente dal lato luminale.
- Allontanare lentamente i perni ruotando il micrometro in senso antiorario in modo che il segmento aortico non scivoli via dai perni quando si riposiziona la camera nell'unità miografica (Figura 3).
- Utilizzare il reticolo oculare precedentemente calibrato del microscopio da dissezione per misurare la lunghezza reale e accurata dell'anello aortico montato posizionando l'inizio del righello a un'estremità del segmento (contrassegnato come estremità tissutale α1) e prendendo nota della misurazione all'altra estremità del segmento aortico nelle divisioni oculari (contrassegnate come estremità tissutale α2)8. Questi valori verranno utilizzati durante i passaggi di normalizzazione nella sezione 5.
- Riportare ciascuna camera miografica all'unità e iniziare ad aerare le camere a 37 °C per 30 minuti.
NOTA: I quattro segmenti dell'aorta possono essere utilizzati come repliche per lo stesso trattamento, oppure ogni segmento dell'aorta può essere utilizzato contemporaneamente per esperimenti diversi.
5. Normalizzazione
NOTA: È necessaria una procedura di normalizzazione per garantire che le condizioni sperimentali siano adeguatamente standardizzate e che i dati raccolti siano affidabili e riproducibili. Il "IC1/IC100", o "Fattore di normalizzazione", è definito come il rapporto tra la circonferenza interna dell'arteria al quale è possibile registrare la massima risposta a un vasocostrittore (ad esempio, 60 mM KCl) diviso per la circonferenza interna alla quale viene registrata una pressione della parete transmurale di 100 mm Hg (cioè IC100). Pertanto, moltiplicando l'IC100 per questo rapporto, possiamo determinare la circonferenza interna dell'arteria alla quale è possibile stabilire una risposta ottimale (cioè IC1).
- Impostare il micrometro in modo tale che i pin si tocchino quasi.
- Impostare le forze a zero per tutte le camere del miografo e lasciare che si equilibri per altri 1-2 minuti.
- Prendi nota della prima lettura del diametro dal micrometro. Questa è la posizione in cui lo spazio tra due pin è considerato zero (necessario per il passaggio 5.7.).
- Aprire le impostazioni di normalizzazione del software di acquisizione dati nel menu a discesa DMT ; Si aprirà una nuova schermata con le seguenti impostazioni e valori predefiniti:
Calibrazione oculare (mm/div): 0.36
Pressione target (kPa): 13.3
IC1/IC100: 0,9
Tempo medio online (s): 2
Tempo di ritardo (s): 60
Riproduci audio al completamento del ritardo (casella di controllo)
Suoni (con menu di selezione a discesa o funzione Sfoglia) - A seconda del numero di segmenti, scegli il numero corretto di canali disponibili sullo schermo e avvia la registrazione del grafico.
- Utilizza il menu a tendina per selezionare il canale di interesse; Verrà visualizzata la schermata di normalizzazione.
- Immettere i valori costanti nelle finestre come segue: endpoint del tessuto α1; Punti finali del tessuto α2; Diametro perno: 40 μm; Valore di lettura micrometrica dalla scala micrometrica analogica.
- Per registrare il primo punto (il valore iniziale di X o X0), fare clic sul pulsante Aggiungi punto . Dopo un ritardo di 60 s, verranno visualizzati i valori per la forza e la pressione effettiva (ERTP) corrispondenti a questo micrometro e la casella per la lettura del micrometro diventerà attiva e disponibile.
- Inizia ad allungare la nave ruotando il micrometro in senso antiorario. Utilizzare la casella di lettura del micrometro per inserire il valore e fare clic sul pulsante Aggiungi punto (ci sarà di nuovo un tempo di ritardo di 60 s).
- Continuare ad allungare il recipiente e continuare ad aggiungere valori micrometrici fino a quando non viene visualizzato il valore di Micrometro X1, che è l'impostazione micrometrica calcolata utilizzata per allungare il recipiente fino al suo IC1.
- Impostare il micrometro sul valore X1.
NOTA: la tensione normalizzata (ottimale) per un topo C57BL6 di 6 mesi è di 6 mN. - Dopo la normalizzazione, lasciare riposare il tessuto ed equilibrare per 30 minuti. A questo punto non è necessario cambiare la soluzione HEPES-PSS nelle camere.
NOTA: Ogni camera è in grado di contenere 8 ml di soluzione. Questo protocollo è scritto con l'uso di 5 ml, che consente la completa immersione della nave e dei perni di montaggio. - Usa il tempo di riposo e di equilibrio per preparare quanto segue.
- Preparare lo stock di lavoro delle diluizioni seriali di acetilcolina in acqua distillata (acqua RO) dalle concentrazioni più basse a quelle più alte come segue: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM e 1 mM. Tenere tutti i tubi sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento.
- Preparare una soluzione di lavoro 100 mM di estere metilico N-nitro-L-arginina (L-NAME) in acqua bidistillata e mantenere la soluzione su ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento.
- Preparare la dose sub-massima di fenilefrina (10 μM) determinata in una serie separata di esperimenti.
NOTA: Il periodo di equilibrio è necessario affinché il segmento dei vasi sanguigni si adatti al nuovo ambiente nella camera del miografo, reimposti i gradienti ionici e raggiunga un livello stabile di tensione passiva prima di essere sottoposto a diverse sfide farmacologiche e meccaniche.
6. Misurazione della vasorilassazione endotelio-dipendente negli anelli aortici
- Al termine del periodo di equilibrio di 30 minuti, drenare le camere e aggiungere 5 ml di soluzione HEPES-PSS fresca, calda e aerata a ciascuna camera. Drenare una camera alla volta per ridurre al minimo l'esposizione dei tessuti all'aria. Il drenaggio delle camere viene eseguito utilizzando una pompa per vuoto impostata a 60 cmHg e le valvole del miografo impostate su un ritardo di 6 s per garantire la rimozione dei 5 ml di soluzione.
- Se necessario, regolare nuovamente le misurazioni della forza per leggere la tensione ottimale di 6 mN. È molto importante riadattare la forza alla tensione ottimale durante ogni periodo di incubazione, così come prima di ogni nuova serie di esperimenti. Riposare il tessuto per altri 15-20 minuti.
- Aprire il software di acquisizione dati, modificare i numeri di tracciamento da 50:1 a 500:1 e premere Start. In questa fase, la forza registrata per ogni camera può essere vista nel software.
- Immediatamente prima dell'inizio di un nuovo esperimento, assicurarsi di aggiungere l'etichetta appropriata sul software di acquisizione dati.
- Drenare le camere ancora una volta prima di aggiungere 5 ml di soluzione ad alto K+ a ciascuna camera. Questo è adatto per testare la vitalità del tessuto aortico e l'integrità della risposta contrattile della muscolatura liscia alla depolarizzazione della membrana prima di utilizzare il tessuto per qualsiasi altro protocollo sperimentale. Questo aiuta a determinare se il segmento dei vasi sanguigni è utilizzabile per ulteriori sperimentazioni.
- Drenare nuovamente le camere non appena la risposta contrattile alla soluzione ad alto K+ raggiunge un plateau per la generazione di forza (Figura 4).
NOTA: Non lasciare la soluzione ad alto K+ nelle camere per più di 3 minuti, poiché danneggerebbe il tessuto. - Lavare il tessuto con la soluzione HEPES-PSS 3x. Aggiungere 5 ml di soluzione ad alto K+ in ciascuna camera. Drenare le camere non appena la risposta contrattile alla soluzione ad alto K+ raggiunge un plateau per la generazione di forza e lavare il tessuto 3 volte con HEPES-PSS prima di lasciare riposare il tessuto per altri 15 minuti.
NOTA: In alcuni laboratori, i segmenti sanguigni sono sottoposti a una soluzione ad alto K+ tre volte consecutive per garantire la variabilità del vaso sanguigno prima di iniziare gli esperimenti miografici. In questo protocollo, i segmenti aortici appena isolati vengono sottoposti a una soluzione ad alto K+ due volte prima di utilizzare il tessuto per ulteriori esperimenti. È importante mantenere questo coerente in tutti gli esperimenti. - Utilizzare la media dei due picchi registrati di sviluppo della forza (forza di contrazione) in risposta a una soluzione ad alto K+ per normalizzare i valori registrati in risposta ad altri agenti vasocostrittori e vasodilatatori utilizzati nell'esperimento.
- Riposare il tessuto per 15-20 min.
- Pre-contrarre i segmenti aortici con l'agente vasocostrittore fenilefrina (PE) ad una dose sub-massima già stabilita (concentrazione finale di 10 μM nella camera).
NOTA: La dose sub-massima di fenilefrina (10 μM) è stata determinata in una serie separata di esperimenti, in cui i segmenti aortici sono stati sottoposti a concentrazioni crescenti di soluzione di fenilefrina a concentrazioni finali di 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM e 50 μM. Di conseguenza, è stato determinato che una concentrazione finale di 10 μM di fenilefrina potrebbe generare la forza di contrazione sub-massima (90% della forza massima) in segmenti aortici di 2 mm, che è giusto prima che la forza di contrazione raggiunga un plateau. La ragione per utilizzare la concentrazione sub-massima di fenilefrina è quella di evitare problemi legati alla saturazione del tessuto aortico o alla desensibilizzazione all'agonista vasocostrittore. - Lasciare che la curva di contrazione indotta da PE raggiunga un plateau per lo sviluppo della tensione (forza) (Figura 5).
- Ad un plateau di sviluppo della tensione alla fenilefrina, eseguire la curva dose-risposta dell'acetilcolina aggiungendo 5 μL di dosi crescenti di soluzioni di acetilcolina working stock in intervalli di 3 minuti al fine di stabilire le concentrazioni finali di acetilcolina nella camera del miografo come segue: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM e 1 μM (Figura 6).
NOTA: Dopo aver aggiunto ogni dose di acetilcolina, attendere almeno 3 minuti (affinché la tensione raggiunga un plateau) prima di aggiungere la dose successiva. - Ad ogni passo, pipettare la soluzione madre di acetilcolina nella camera molto lentamente e lontano dagli anelli aortici per evitare qualsiasi disturbo tissutale.
- Dopo aver completato l'esperimento dose-risposta, drenare le camere e lavare i segmenti aortici con una soluzione HEPES-PSS calda e aerata 3x per rimuovere eventuali residui residui del farmaco.
- Riposare il tessuto per 30 minuti prima di iniziare i prossimi passaggi dell'esperimento. La vitalità dell'aorta viene controllata prima di ogni fase sperimentale utilizzando la soluzione HEPES-PSS ad alto K+ . Se tutte le fasi di preparazione e sperimentazione vengono seguite correttamente, la vitalità del tessuto aortico rimarrà la stessa per tutta la durata dell'intero esperimento (4-6 ore).
7. Effetti degli inibitori generali della produzione di NO sulla vasorilassazione endotelio-mediata
- Utilizzare lo stesso tessuto aortico per questa parte dell'esperimento dopo aver accuratamente lavato e fatto riposare i segmenti per almeno 30 minuti.
NOTA: Utilizzare il tempo di riposo di 30 minuti per preparare una soluzione di lavoro di 100 mM di estere metilico di N-nitro-L-arginina (L-NAME) in acqua bidistillata e mantenere la soluzione su ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento. - Dopo aver fatto riposare i segmenti aortici per 30 minuti, drenare le camere e aggiungere una soluzione fresca e calda ad alto K+ (60 mM KCl) a ciascuna camera.
NOTA: È importante che, per ogni parte dell'esperimento, il tessuto aortico venga sfidato con una soluzione ad alto K+ almeno una volta. Il picco di contrazione registrato verrà utilizzato per normalizzare i dati raccolti durante quella parte dell'esperimento. - Drenare nuovamente le camere non appena la risposta di contrazione alla soluzione ad alto K+ raggiunge un plateau e lavare il tessuto con la soluzione HEPES-PSS 3x.
- Al fine di valutare il contributo della produzione di NO alla vasorilassazione indotta da acetilcolina osservata (vedere paragrafo 6.), in questa fase, preincubare i segmenti aortici con un inibitore generale della produzione di NO (L-NAME) aggiungendo 10 μL della soluzione madre di lavoro 100 mM preparata di L-NAME a ciascuna camera miografica (contenente 5 ml di soluzione tampone) al fine di ottenere una concentrazione finale di 200 μM in ciascuna camera miografica.
NOTA: L-NAME è un inibitore non selettivo e potente di tutte le isoforme di NOS (un enzima responsabile della produzione di NO) e, pertanto, è considerato uno strumento efficace per bloccare la produzione di NO nella parete dei vasi sanguigni9. - Lasciare riposare i segmenti aortici durante il tempo di pre-incubazione con L-NAME (30 min).
- Non lavare a questo punto.
- Senza rimuovere il L-NAME, aggiungere la dose sub-massima di fenilefrina (concentrazione finale di 10 μM) alla camera per indurre la contrazione aortica.
NOTA: A causa dell'azione inibitoria di L-NAME sulla produzione endogena di NO, il picco recentemente registrato per la contrazione aortica indotta da fenilefrina sarà molto più alto del picco iniziale registrato prima dell'incubazione del tessuto con L-NAME. Ciò è previsto a causa dell'effetto di L-NAME sulla produzione di NO basale nella parete aortica, che porta a una maggiore generazione di forza (a causa della maggiore generazione di forza contrattile da parte della muscolatura liscia). - Attendere che la curva di contrazione indotta dalla fenilefrina raggiunga un plateau per lo sviluppo della tensione (forza contrattile).
- A questo punto, aggiungere acetilcolina alla camera del miografo per ottenere una concentrazione finale di 500 nM (questa è la concentrazione sub-massima di acetilcolina che è stata stabilita durante gli esperimenti descritti nella sezione 5. del protocollo).
- Attendere alcuni minuti per registrare eventuali cambiamenti nello sviluppo della forza fino a quando il plateau formato è stabile (Figura 7).
NOTA: A causa dell'azione inibitoria di L-NAME sulla capacità dello strato endoteliale di produrre NO in risposta all'acetilcolina, non si prevede di vedere alcun cambiamento nella generazione di forza registrata in risposta alla fenilefrina, poiché il NOS endoteliale aortico (eNOS) non è in grado di generare NO in risposta all'applicazione di acetilcolina. - Scolare le camere e lavare il tessuto con una soluzione HEPES-PSS calda e aerata 3x.
8. Contributo dello strato endoteliale al vasorilassamento aortico
- Al fine di sottolineare il ruolo dello strato endoteliale nella vasorilassamento aortica, testare la vasorilassamento indotto da acetilcolina nei segmenti aortici denudati dall'endotelio, in cui vengono rimossi gli strati endoteliali.
- Posizionare la camera del miografo sotto il microscopio e passare delicatamente un piccolo filo (lo stesso filo che viene utilizzato per la miografia del filo può essere usato qui) attraverso il lume dell'aorta. Spostare delicatamente il filo attraverso il lume (delicato movimento circolare) per un breve periodo di tempo. Questo è sufficiente per rimuovere l'endotelio o l'intima.
- Tagliare l'aorta in anelli aortici di 2 mm e montare tali anelli sulla camera del miografo come descritto in precedenza.
- Impostare la tensione ottimale a 6 mN e lasciare riposare il tessuto per 30 minuti in tampone HEPES-PSS caldo e aerato
- Al termine del periodo di equilibrio di 30 minuti, drenare le camere e aggiungere 5 ml di soluzione HEPES-PSS fresca, calda e aerata a ciascuna camera.
- Azzerare la forza per tutte le camere miografiche ruotando il micrometro in senso antiorario.
- Ruotare lentamente il micrometro in senso antiorario per aumentare la distanza tra i pin fino a quando la forza registrata raggiunge la tensione ottimale desiderata per l'aorta del topo (6 mN per l'aorta del topo C57BL/6J). Riposare il tessuto per altri 15-20 minuti alla tensione ottimale (6 mN).
- Scolare le camere altre 1 volte prima di aggiungere 5 ml di soluzione ad alto K+ a ciascuna camera.
- Drenare nuovamente le camere non appena la risposta di contrazione alla soluzione ad alto K+ raggiunge un plateau e lavare il tessuto con la soluzione HEPES-PSS 3x. Riposare il fazzoletto per 15-20 minuti
- Pre-contrarre i segmenti aortici con l'agente vasocostrittore fenilefrina (concentrazione finale di 10 μM nella camera).
NOTA: A causa della rimozione dell'endotelio, la produzione di NO basale nella parete aortica è significativamente diminuita; Pertanto, il picco per la contrazione indotta da fenilefrina (il picco di generazione della forza) dovrebbe essere più alto nel tessuto aortico privo dello strato endoteliale. - Quando la forza indotta dalla fenilefrina raggiunge un plateau, aggiungere la concentrazione sub-massima di acetilcolina alla camera del miografo per ottenere una concentrazione finale di 500 nM.
NOTA: Se la rimozione dello strato endoteliale viene eseguita correttamente, non ci saranno cambiamenti nella forza indotta dalla fenilefrina registrata, poiché la produzione di NO indotta da acetilcolina dall'endotelio sarà diminuita a causa della rimozione dello strato endoteliale. La traccia registrata sarà molto simile a quella osservata in presenza di L-NAME (sezione 7.). - Attendere 3 minuti per assicurarsi che il plateau registrato per lo sviluppo della forza indotta dalla fenilefrina non cambi prima di terminare l'esperimento (Figura 8).
NOTA: Se l'applicazione di acetilcolina provoca qualsiasi calo della contrazione indotta da fenilefrina mentre si trova nel plateau, questa è un'indicazione che lo strato endoteliale non è stato completamente rimosso.
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Representative Results
Il protocollo di miografia tensometrica a piccola camera spiegato qui è il metodo standard per misurare la reattività vascolare nelle arterie piccole e grandi e consente misurazioni simultanee della reattività vascolare in un massimo di quattro segmenti di vasi sanguigni dallo stesso piccolo animale da laboratorio sperimentale. In questo rapporto, utilizziamo specificamente il sistema per misurare la funzione endoteliale nell'aorta di topo isolata (Figura 1). In questo protocollo, segmenti aortici isolati sono montati su una piccola camera d'organo (Figura 2) tra due piccoli perni di acciaio inossidabile (Figura 3). La camera miografica può contenere fino a 8 ml di soluzione tampone e fornire un ambiente semi-fisiologico per i vasi isolati per la durata degli esperimenti. È molto importante che, prima di ogni esperimento, la fattibilità di ciascun segmento isolato sia testata e verificata. Il protocollo standard per stabilire l'integrità e la vitalità di ciascun segmento di vaso isolato è quello di sfidare il tessuto con un'alta concentrazione di cloruro di potassio per indurre la depolarizzazione della membrana muscolare liscia. Nello scenario in cui il vaso isolato è sano e reattivo, saremmo in grado di registrare la generazione di forza contrattile sul display (Figura 4). Il picco della forza registrata viene successivamente utilizzato per normalizzare la generazione di forza per lo stesso segmento in risposta agli agonisti utilizzati durante il protocollo (ad esempio, fenilefrina). Per misurare la vasorilassamento endotelio-mediata, è necessario pre-contrarre il tessuto aortico con la concentrazione sub-massima (10 μM) di fenilefrina, che causa la contrazione mediata dalla muscolatura liscia e la generazione di forza (Figura 5). Quando la contrazione indotta dalla fenilefrina raggiunge un plateau (Figura 6), dosi crescenti di acetilcolina vengono applicate in più fasi per ottenere il massimo vasorilassamento nel segmento isolato (Figura 6). Il livello di rilassamento dei vasi è una misura indiretta della produzione di ossido nitrico mediata dall'endotelio. Per confermare ulteriormente che la vasorilassazione indotta da acetilcolina negli anelli aortici è dovuta alla produzione di ossido nitrico, i segmenti aortici vengono pretrattati con un inibitore generale della produzione di ossido nitrico (200 μM di L-NAME) per 30 minuti prima dell'applicazione della fenilefrina. Come mostrato in Figura 7, L-NAME è in grado di bloccare completamente la vasorilassazione indotta da acetilcolina nell'aorta pre-contratta, evidenziando il fatto che l'acetilcolina induce vasorilassamento aortico attraverso l'aumento della produzione di ossido nitrico. D'altra parte, la rimozione dello strato endoteliale dai segmenti aortici blocca anche il vasorilassamento indotto da acetilcolina, sottolineando il ruolo che l'endotelio svolge nel rilassamento dei vasi sanguigni (Figura 8).
Figura 1: Vista anatomica grossolana del cuore, della radice aortica e dell'aorta discendente isolata da un topo di controllo di 6 mesi. Dopo aver rimosso la gabbia toracica dal topo, il cuore e l'aorta vengono isolati dalla gabbia toracica e trasferiti in una capsula di Petri rivestita di elastomero siliconico pulita. Prima di isolare l'aorta, è importante rimuovere tutto il grasso e il tessuto connettivo e qualsiasi coagulo di sangue dal lume dell'aorta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Un'immagine rappresentativa di una camera dell'unità miografica che mostra i perni di montaggio da 200 μm. Come mostrato, i due perni all'interno della camera del miografo si toccano appena. Prima di utilizzare la camera, è fondamentale assicurarsi che i perni siano correttamente allineati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Ancoraggio dei segmenti aortici sulla camera miografica. Un segmento aortico di topo di 2 mm isolato da un topo C57BL/6 di 6 mesi è tenuto da due pin all'interno di una camera miografica. Ciò si ottiene facendo scorrere delicatamente l'aorta sui due perni di montaggio usando una pinza. La casella tratteggiata rossa mostra l'immagine ingrandita del segmento aortico di 2 mm montato tra due pin all'interno della camera del miografo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Contrazione aortica dovuta alla depolarizzazione della membrana della muscolatura liscia. Immagine rappresentativa che mostra la traccia per la contrazione aortica del topo (generazione di forza) in risposta ad un'alta concentrazione di K+ (60 mM KCl) che indurrebbe la depolarizzazione e la contrazione della membrana muscolare liscia all'interno dello strato mediale dell'aorta. L'applicazione della soluzione ad alto K+ è seguita immediatamente da tre lavaggi consecutivi utilizzando una soluzione HEPES-PSS calda e aerata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Contrazione aortica in risposta all'agente vasocostrittore fenilefrina. Traccia miografica rappresentativa che mostra la generazione di forza (contrazione) da parte dell'anello aortico in risposta alla concentrazione sub-massima di fenilefrina (10 μM). Come mostrato, il picco della contrazione indotta dalla fenilefrina alla fine raggiunge un plateau. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Effetti dose-risposta dell'acetilcolina sull'anello aortico precontratto. Traccia miografica rappresentativa che mostra l'effetto vasodilatatore dose-risposta (50 pM-1 μM) del neurotrasmettitore vasodilatatore acetilcolina su un anello aortico precontratto di 2 mm. L'anello aortico è pre-contratto con 10 μM di fenilefrina prima dell'applicazione di acetilcolina. La prima dose di acetilcolina viene aggiunta quando la tensione indotta dalla fenilefrina raggiunge un plateau. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Effetti di un inibitore generale della produzione di NO (L-NAME) sulla vasorilassazione endotelio-mediata nell'aorta di topo. Traccia miografica rappresentativa che mostra che la preincubazione dei segmenti aortici con un inibitore generale della produzione di NO (L-NAME, concentrazione finale di 200 μM) blocca la vasodilatazione indotta da acetilcolina in un anello aortico precontratto. Ciò è dovuto all'inibizione della produzione di NO da parte dell'endotelio dovuta all'azione inibitoria di L-NAME su eNOS. L'acetilcolina è stata aggiunta al segmento aortico pre-contratto alla concentrazione sub-massima di 500 nM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Effetti della rimozione meccanica dell'endotelio sulla vasorilassazione endotelio-mediata nell'aorta di topo. Traccia miografica rappresentativa che mostra che la rimozione dell'endotelio dai segmenti aortici mediante denudazione del filo blocca la vasodilatazione indotta da acetilcolina in un anello aortico precontratto. Ciò è dovuto all'inibizione del vasorilassamento mediato dall'endotelio. L'acetilcolina è stata aggiunta al segmento aortico pre-contratto alla concentrazione sub-massima di 500 nM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il campo della biologia vascolare si basa fortemente su strumenti che aiutano i ricercatori a valutare l'integrità funzionale e strutturale della parete dei vasi sanguigni. Richiede anche un'attenzione particolare sulle interazioni dirette e indirette tra i tre strati di vasi sanguigni: l'intima, i media e l'avventizia. Tra questi tre strati, l'intima è formata da un monostrato di cellule endoteliali e ha una funzione molto importante nella regolazione della salute vascolare e dell'emostasi.
È ben noto che qualsiasi danno allo strato endoteliale può influire negativamente sulla sua capacità di rilasciare NO e altri fattori vasodilatatori, portando alla disregolazione della funzione vascolare, che si osserva in vari disturbi vascolari come aterosclerosi, aneurisma e vasculite10,11,12. Al fine di comprendere i meccanismi sottostanti che controllano la normale funzione endoteliale e valutare la funzione vasodilatatrice e l'integrità dell'endotelio all'interno della parete vascolare, è imperativo utilizzare un sistema sperimentale standard che imiti le condizioni fisiologiche in vivo.
Per le grandi arterie, come l'aorta, la miografia tensometrica (isometrica) a piccola camera è ampiamente riconosciuta come uno strumento affidabile che crea le migliori condizioni disponibili e quasi fisiologiche per il vaso sanguigno in un ambiente ex vivo . Il sistema consente inoltre di mantenere la vitalità del tessuto per un periodo di tempo considerevolmente lungo (fino a 6-8 ore) in laboratorio, rendendo la tecnica uno strumento prezioso e versatile. Un altro vantaggio è che la camera miografica consente di conservare e riutilizzare gli anelli dei vasi sanguigni per diversi esperimenti consecutivi, rendendolo così un approccio economico riducendo al contempo la necessità di un numero elevato di topi sperimentali. Fino a quattro segmenti di vasi sanguigni possono essere testati contemporaneamente utilizzando un sistema di miografo a quattro camere, aumentando la coerenza e riducendo le variazioni tra gli esperimenti.
Vari strumenti farmacologici e meccanici possono essere utilizzati per studiare la funzione dello strato endoteliale nei vasi sanguigni. Il principale marker di un endotelio funzionale è la normale produzione di NO, che è noto come il più importante agente vasodilatatore prodotto e rilasciato dallo strato endoteliale. La disfunzione endoteliale è principalmente associata a un calo significativo della produzione di NO e ha dimostrato di essere coinvolta nella progressione di diversi disturbi vascolari come ipertensione, trombosi e aterosclerosi.
All'interno del letto vascolare, la produzione di NO è controllata principalmente da cambiamenti nel flusso sanguigno e nella pressione, o da altri eventi intracellulari che possono portare a cambiamenti nella concentrazione citoplasmatica di calcio o all'attivazione di vie di segnalazione in risposta agli ormoni e ai fattori di crescita13,14. I cambiamenti nella produzione di NO sono considerati uno dei marcatori precoci e affidabili della disfunzione endoteliale e di solito sono rilevabili precocemente durante la progressione dei disturbi cardiovascolari. Indipendentemente dal modello di malattia, i biologi vascolari sono molto interessati a strumenti e saggi che consentono di misurare la funzione endoteliale. È particolarmente importante poter distinguere tra il contributo di vari strati del vaso sanguigno utilizzando una piattaforma che imita le condizioni fisiologiche.
In un miografo a piccola camera, i ricercatori possono utilizzare strumenti farmacologici e meccanici per misurare la funzione endoteliale in un ambiente strettamente controllato. All'interno della camera del miografo, viene creato un ambiente artificiale in grado di supportare la normale funzione del vaso sanguigno. In un tale ambiente artificiale, poiché i segmenti dei vasi sanguigni isolati non sono supportati dal tessuto connettivo circostante e da altri organi, è importante determinare la tensione passiva ottimale alla quale i segmenti isolati possono generare la massima contrazione possibile in risposta ai vasopressori. Alla tensione ottimale, si può misurare la normale risposta contrattile massima agli agenti vasocostrittori come la fenilefrina o la noradrenalina per testare l'integrità strutturale e funzionale dello strato muscolare liscio della parete dei vasi sanguigni. In laboratorio, è stato determinato che la tensione passiva di 6 mN è una tensione propria per segmenti aortici di topo di 2 mm15. Tuttavia, la tensione passiva ottimale deve essere determinata per diversi tipi di arterie in diverse specie16.
Inoltre, prima di eseguire qualsiasi esperimento con vasi sanguigni isolati, è imperativo testare la vitalità degli anelli isolati per assicurarsi che soddisfino i criteri di inclusione ed esclusione per il tessuto vitale e utilizzabile. Questo di solito si ottiene sottoponendo gli anelli isolati a soluzione K+ ad alta concentrazione (60 mM KCl). Ciò si traduce nella depolarizzazione della membrana muscolare liscia a causa dell'apertura dei canali del calcio voltaggio-dipendenti (VGCC), che porta alla contrazione della muscolatura liscia e alla vasocostrizione aortica. Questo metodo viene utilizzato per convalidare la vitalità dei segmenti aortici prima di utilizzare tali segmenti per ulteriori esperimenti.
D'altra parte, agenti vasodilatatori come l'acetilcolina possono essere utilizzati per testare le proprietà funzionali dello strato endoteliale. Se lo strato di endotelio è intatto e funzionale, una concentrazione sub-massima di acetilcolina può indurre il rilassamento in un segmento di vasi sanguigni pre-contratto17. L'entità del rilassamento indotto da acetilcolina è un'indicazione del livello di rilascio di NO dallo strato endoteliale. Qualsiasi danno allo strato endoteliale (meccanico o funzionale) avrà un impatto sulla produzione di NO e sulla risposta vasodilatatrice del vaso. In questo protocollo, i dati forniti mostrano che l'acetilcolina può indurre rilassamento nell'aorta del topo pre-contratta in modo dose-dipendente, con rilassamento sub-massimo raggiunto alla concentrazione finale di 500 nM (Figura 6).
In alcuni esperimenti, i ricercatori sono interessati a misurare la risposta diretta della muscolatura liscia al vasodilatatore NO. Poiché il focus di tali esperimenti è solo sulla funzione della muscolatura liscia, esiste un protocollo in atto che consentirebbe ai ricercatori di bypassare il contributo dell'endotelio rimuovendo (denudando) lo strato di endotelio dal segmento dei vasi sanguigni. L'endotelio può essere rimosso attraverso vari metodi, tra cui aria, rotolamento tra le dita o rimozione tramite filo. In tali contesti sperimentali, il vaso sanguigno denudato (senza strato endoteliale) è sottoposto a donatori di NO come nitroglicerina e nitroprussiato di sodio. Ciò consente di determinare se la via di segnalazione della proteina G ciclica GMP-chinasi della muscolatura liscia che risponde all'NO è intatta e funzionale 7,18. Questo manoscritto spiegava come la rimozione dello strato endoteliale nel segmento aortico isolato blocca completamente gli effetti vasodilatatori dell'acetilcolina, evidenziando l'importanza del rilascio di NO nel rilassamento e nella vasodilatazione dei vasi sanguigni (Figura 8).
Mentre le tecniche del filo e del miografo tensometrico hanno ampia utilità negli esperimenti di biologia vascolare, vale la pena notare i potenziali limiti. In particolare, il sistema tensometrico ha limitazioni delle dimensioni del tessuto (cioè vascolarizzazione più piccola). Inoltre, la natura ex vivo di questa tecnica non consente la manipolazione della pressione e del flusso intraluminale per un mimetismo più preciso della funzione vascolare in vivo e dei parametri emodinamici. Le configurazioni del miografo a pressione tengono, infatti, conto di queste variabili e simulano la dinamica vascolare in tempo reale, consentendo anche l'uso di arterie di resistenza più piccole. Inoltre, gli esperimenti di miografo a filo non possono replicare completamente le condizioni fisiologiche o modellare accuratamente le interazioni tra sangue circolante, pareti dei vasi e tessuto circostante, che svolgono anche ruoli importanti nella regolazione della funzione vascolare nel corpo.
Indipendentemente dal protocollo sperimentale utilizzato negli esperimenti di miografia o dal vasocostrittore/vasodilatatore selezionato nell'esperimento, il sistema di miografia a camera piccola fornisce una piattaforma semifisiologica affidabile, riproducibile e stabile per misurare la reattività dei vasi sanguigni e l'integrità funzionale. Sebbene il focus di questo rapporto fosse solo sulla misurazione di base della funzione endoteliale, il sistema miografico può essere utilizzato per valutare molte altre proprietà funzionali del vaso sanguigno, come la relazione stress / sforzo, la forza della parete vascolare, il punto di rottura e la contrazione passiva e attiva per citarne alcuni. Ciò evidenzia il valore del sistema miografico come strumento affidabile nel campo della biologia vascolare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del National Institutes of Health (R15HL145646) e del Midwestern University College of Graduate Studies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
References
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