Summary
O presente protocolo descreve os conceitos e a aplicação técnica da técnica do miógrafo tensométrico utilizando um sistema de miógrafo multicâmara na avaliação experimental ex vivo da função endotelial da aorta em camundongos.
Abstract
A miografia tensométrica de câmara de pequeno volume é uma técnica comumente utilizada para avaliar a contratilidade vascular de vasos sanguíneos pequenos e grandes em animais de laboratório e pequenas artérias isoladas do tecido humano. A técnica permite que os pesquisadores mantenham vasos sanguíneos isolados em um ambiente rigidamente controlado e padronizado (quase fisiológico), com a opção de se ajustar a vários fatores ambientais, enquanto desafiam os vasos isolados com diferentes agentes farmacológicos que podem induzir vasoconstrição ou vasodilatação. A câmara miográfica também fornece uma plataforma para medir a reatividade vascular em resposta a vários hormônios, inibidores e agonistas que podem afetar a função do músculo liso e das camadas endoteliais separadamente ou simultaneamente. A parede dos vasos sanguíneos é uma estrutura complexa que consiste em três camadas diferentes: a íntima (camada endotelial), a média (músculo liso e fibras de elastina) e a adventícia (colágeno e outros tecidos conjuntivos). Para obter uma compreensão clara das propriedades funcionais de cada camada, é fundamental ter acesso a uma plataforma e sistema experimental que permita uma abordagem combinatória para estudar todas as três camadas simultaneamente. Tal abordagem exige acesso a uma condição semifisiológica que imitaria o ambiente in vivo em um ambiente ex vivo. A miografia tensométrica de câmara de pequeno volume forneceu um ambiente ideal para avaliar o impacto de pistas ambientais, variáveis experimentais ou agonistas farmacológicos e antagonistas nas propriedades vasculares. Por muitos anos, os cientistas usaram a técnica do miógrafo tensométrico para medir a função endotelial e a contratilidade do músculo liso em resposta a diferentes agentes. Neste relato, um sistema de miógrafo tensométrico de câmara de pequeno volume é usado para medir a função endotelial na aorta isolada de camundongos. Este relatório se concentra em como a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume pode ser usada para avaliar a integridade funcional do endotélio em pequenos segmentos de uma grande artéria, como a aorta torácica.
Introduction
Nas últimas décadas, o sistema de miografia de câmara pequena tem sido usado para medir a reatividade de diferentes camadas de paredes dos vasos sanguíneos em resposta a vários agentes farmacológicos e neurotransmissores em um ambiente ex vivo e em tempo real. A reatividade vascular é um componente importante de um vaso sanguíneo funcional saudável e é fundamental para a regulação do fluxo sanguíneo e da perfusão na vasculatura periférica e cerebral1. Dentro da parede dos vasos sanguíneos, a interação entre as camadas endotelial e muscular lisa é um dos principais determinantes do tônus vascular, que também é constantemente impactado por mudanças estruturais na camada de tecido conjuntivo ao redor da parede dos vasos sanguíneos (adventícia).
A camada endotelial controla o vasomovimento liberando alguns fatores vasodilatadores, incluindo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizador derivado do endotélio (EDHF), ou produzindo agentes vasoconstritores como endotelina-1 (ET-1) e tromboxano (TXA2)2,3,4. Dentre esses fatores, o NO tem sido extensivamente estudado, e seus importantes papéis regulatórios em outras funções celulares críticas, como inflamação, migração, sobrevivência e proliferação, têm sido altamente citados na literatura científica 2,5.
No campo da biologia vascular, a miografia de câmara forneceu aos fisiologistas vasculares e farmacologistas uma ferramenta valiosa e confiável para medir a função endotelial em um sistema semifisiológico rigidamente controlado1. Atualmente, existem dois sistemas de miógrafos diferentes disponíveis para os cientistas: miografia tensométrica (isométrica) de fio (ou pino) e miografia de pressão. Em um sistema de miografia de fio, o vaso sanguíneo é esticado entre dois fios ou pinos, permitindo a medição isométrica do desenvolvimento de força ou tensão na parede do vaso sanguíneo, enquanto a miografia por pressão é uma plataforma preferível para medições de reatividade vascular em artérias de pequena resistência, onde as alterações na pressão arterial são consideradas o principal estímulo para mudanças no tônus vascular e vasomoção. Há um consenso geral de que, para pequenas artérias de resistência, como artérias mesentéricas e cerebrais, a miografia por pressão cria uma condição mais próxima das condições fisiológicas do corpo humano. O miógrafo de câmara pequena pode ser utilizado para vasos com diâmetros muito pequenos (200-500 μm) a vasos muito maiores, como a aorta.
Enquanto o miógrafo de fio é um poderoso sistema para registrar a tensão dos vasos sanguíneos sob condições isométricas, o miógrafo de pressão é um sistema mais apropriado para medir mudanças no diâmetro do vaso em resposta a mudanças nas condições isobáricas. As mudanças de diâmetro no vaso em resposta a mudanças na pressão ou fluxo são muito maiores em uma pequena artéria muscular (arteríola) em comparação com grandes artérias elásticas, como a aorta. Por esses motivos, o miógrafo de pressão é considerado uma ferramenta melhor para pequenos vasos sanguíneos com vasorreatividade substancial1. Um dos outros pontos fortes práticos da miografia tensométrica de câmara de pequeno volume multicâmara é que se pode discernir a contribuição de diferentes mecanismos para a reatividade vascular estudando múltiplos (até quatro) segmentos da mesma artéria e do mesmo animal para reduzir a variabilidade e produzir dados robustos e conclusivos. Também é relativamente fácil de configurar e manter tecnicamente. Vasos de quase qualquer tamanho podem ser estudados com um miógrafo de fio. É uma solução mais econômica para avaliar a função vascular e é uma boa alternativa à miografia por pressão em experimentos em que o comprimento do vaso dissecado é muito curto para o protocolo de miógrafo de pressão.
Este relato fornece um protocolo detalhado para a avaliação da função endotelial no anel aórtico torácico isolado de camundongos utilizando pinos de montagem na técnica de miografia tensométrica de câmara de pequeno volume utilizando o sistema de miógrafo multicâmara DMT-620 (DMT-USA). Este protocolo utiliza um rato C57BL6 macho de 6 meses de idade com um peso médio entre 25-35 g. Felizmente, este protocolo pode ser aplicado a vários tipos e pesos de animais, considerando a ampla gama de tipos de vasos e diâmetros para os quais este protocolo pode ser usado.
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Protocol
Todos os procedimentos cirúrgicos e cuidados com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use and Care Committee (IACUC) da Midwestern University (IACUC# AZ-3006, AZ-2936).
1. Preparação do tampão
NOTA: Embora o tampão de solução salina fisiológica HEPES (HEPES-PSS) seja estável a 4 °C por 7 dias, recomenda-se que todos os tampões sejam feitos na hora no dia de cada experimento. Todos os outros reagentes e agonistas devem ser preparados na hora para cada experiência. O tampão HEPES-PSS utilizado neste protocolo é um tampão bem estabelecido para estudos vasculares ex vivo que tem se mostrado citoprotetor por mais de 12 h, preservando as respostas vasodilatadoras do vaso - o foco principal deste protocolo experimental 6,7.
- Preparar a solução de HEPES-PSS (pH 7,4) da seguinte forma: Misture 10 mmol/L de HEPES, 6 mmol/L de glicose, 1,5 mmol/L de CaCl 2, 130 mmol/L de NaCl, 4 mmol/L de KCl, 4 mmol/L de NaHCO3, 1,2 mmol/L de MgSO 4, 1,2 mmol/L KH2 PO4 e 0,03 mmol/L EDTA.
- Prepare o buffer HEPES-PSS high K+. Isto é idêntico à solução HEPES-PSS, exceto que contém 5 mmol / L HEPES, 65 mmol / L NaCl, 10 mmol / L de glicose, 1 mmol / L MgCl2, 80 mmol / L KCl e não contém MgSO4 e EDTA.
2. Preparação da unidade miográfica
- Ligue e ajuste o banho-maria para 37 °C. Garantir um nível de água adequado.
- Coloque dois copos rotulados adequadamente no banho-maria, um com 600 mL de solução de HEPES-PSS e outro com 150 mL de solução de K+ alto.
- Arejar um copo de 300 ml de solução de HEPES-PSS com gás carbógeno (5% de CO 2 e 95% de O2) por pelo menos 10 min.
- Adicione 30 mL da solução de HEPES-PSS aerada a um tubo de centrífuga de 50 mL, rotule adequadamente (gaiola torácica, número de identificação do rato) e coloque-a no gelo. Manter a solução de HEPES-PSS aerada restante no gelo para ser utilizada durante o processo de dissecção da aorta.
- Ligue a unidade miográfica de quatro câmaras; adicionar 6 ml de solução de HEPES-PSS a cada câmara miográfica e ajustar o calor para 37 °C. Deixar que a solução em cada câmara seja aerada (com mistura de carbogénio) durante 30 minutos e verificar se as câmaras atingiram os 37 °C desejados (utilize este período de espera para dissecar a aorta do rato).
- Ligue o hardware e o computador de aquisição de dados do miógrafo.
3. Isolamento da aorta do rato
- Anestesiar o rato experimental com inalação de isoflurano a 5% e eutanasiar por luxação cervical (um rato C57BL/6J macho de 6 meses de idade é utilizado para esta demonstração).
- Coloque o rato numa tábua cirúrgica na posição supina e prenda os apêndices à placa utilizando fita cirúrgica.
- Pulverize a região abdominal com álcool a 70% para que o pelo fique completamente molhado e os pelos soltos/secos não entrem na incisão. Limpe suavemente o excesso de solução.
- Use fórceps para localizar e isolar a pele abdominal logo inferior ao processo xifoide do esterno.
- Crie tensão levantando a pele para cima. Faça um corte contundente usando uma tesoura e remova a pele superficial, expondo a cavidade torácica.
- Levante o processo xifoide e faça incisões laterais ligeiramente inferiores ao processo ao longo das margens subcostais.
- Estenda as incisões laterais cranialmente para remover a porção anterior da caixa torácica.
- Remova a gaiola torácica fazendo um corte contundente através da coluna vertebral, abaixo do diafragma e no pescoço.
NOTA: Os pesquisadores também podem remover a aorta diretamente do animal, mas deve-se tomar cuidado para proteger o vaso e liberar o sangue coagulado da aorta. Este protocolo usa o exemplo da remoção da gaiola torácica e limpeza e dissecação cuidadosa da aorta. Com a prática, esse método pode ser realizado de forma rápida e eficiente e é benéfico para a preservação do tecido extra para outros estudos, como imuno-histoquímica, histologia e western blotting. - Transfira a gaiola torácica para uma placa de Petri revestida de elastômero de silicone transparente cheia de tampão HEPES-PSS aerado gelado e fixe-a em ambos os lados.
NOTA: Use um kit de elastômero de silicone (Tabela de Materiais). Misture a base e o agente de cura (10:1 em peso), em seguida, despeje em uma placa de Petri de vidro e deixe curar por 24 h a 25 °C. - Coloque a placa de Petri sob um microscópio de zoom estéreo, corte e remova suavemente o coração e a aorta anexada da caixa torácica e transfira para um prato limpo e transparente revestido de elastômero de silicone (Figura 1).
- Em seguida, remova suavemente a gordura e o tecido conjuntivo e qualquer sangue coagulado da aorta. Usando uma tesoura pequena e afiada, disseque e isole toda a aorta a partir da área do arco até a parte inferior da aorta descendente. Lembre-se de que o arco aórtico não é adequado para experimentos de miografia, mas pode ser usado para estudos histológicos.
- Use a solução de HEPES-PSS aerada a frio durante toda a dissecção. Mude a solução a cada 10 minutos ou quando a visibilidade for comprometida, o que vier primeiro. Recomenda-se que cada anel aórtico seja montado na câmara do miógrafo dentro de 20 min após a dissecção (max 60 min).
4. Montagem dos segmentos aórticos nas câmaras do miógrafo
- Corte a aorta dissecada em quatro segmentos de 2 mm cada usando uma pequena tesoura cirúrgica afiada. Use a mini-régua dentro do prato como referência.
- Coloque a câmara do miógrafo sob o microscópio de zoom estéreo para visualizar facilmente os pinos e ajuste os micrômetros de modo que os pinos estejam quase se tocando (Figura 2).
- Certifique-se de que ambos os pinos de retenção de tecido estejam devidamente alinhados.
- Preste atenção e evite beliscar a aorta enquanto monta os segmentos para evitar danos ao endotélio.
- Em câmaras que já contenham 5 mL de tampão HEPES-PSS aquecido e aerado, deslize cuidadosamente cada um dos segmentos aórticos de 2 mm sobre os dois pinos de montagem usando pinça. Seja muito gentil ao deslizar os segmentos da aorta sobre os pinos. A camada endotelial é muito frágil e sai muito facilmente do lado luminal.
- Afaste lentamente os pinos girando o micrômetro no sentido anti-horário para que o segmento aórtico não deslize para fora dos pinos ao colocar a câmara de volta na unidade do miógrafo (Figura 3).
- Use a gratícula ocular previamente calibrada do microscópio de dissecação para medir o comprimento verdadeiro e preciso do anel aórtico montado, posicionando o início da régua em uma extremidade do segmento (marcada como extremidade do tecido α1) e anotando a medida na outra extremidade do segmento aórtico em divisões oculares (marcadas como extremidade do tecido α2)8. Esses valores serão usados durante as etapas de normalização na seção 5.
- Devolver cada câmara miográfica à unidade e começar a arejar as câmaras a 37 °C durante 30 minutos.
NOTA: Os quatro segmentos da aorta podem ser usados como replicantes para o mesmo tratamento, ou cada segmento da aorta pode ser usado simultaneamente para diferentes experimentos.
5. Normalização
NOTA: Um procedimento de normalização é necessário para garantir que as condições experimentais sejam adequadamente padronizadas e que os dados coletados sejam confiáveis e reprodutíveis. O "IC1/IC100", ou "Fator de Normalização", é definido como a razão da circunferência interna da artéria na qual é possível registrar a resposta máxima a um vasoconstritor (por exemplo, 60 mM KCl) dividida pela circunferência interna na qual uma pressão de parede transmural de 100 mm Hg (ou seja, IC100) é registrada. Portanto, multiplicando a CI100 por essa razão, podemos determinar a circunferência interna da artéria na qual uma resposta ótima (ou seja, CI1) pode ser estabelecida.
- Ajuste o micrômetro de tal forma que os pinos estejam quase se tocando.
- Defina as forças como zero para todas as câmaras do miógrafo e deixe-o se equilibrar por mais 1-2 min.
- Anote a primeira leitura do diâmetro do micrômetro. Esta é a posição em que o intervalo entre dois pinos é considerado zero (necessário para a etapa 5.7.).
- Abra as Configurações de normalização do software de aquisição de dados no menu suspenso DMT ; uma nova tela será aberta com as seguintes configurações e valores padrão:
Calibração da ocular (mm/div): 0.36
Pressão alvo (kPa): 13,3
IC1/IC100: 0,9
Tempo médio (s) on-line: 2
Tempo(s) de atraso(s): 60
Reproduzir som ao atrasar a conclusão (caixa de seleção)
Sons (com menu de seleção suspenso ou função Procurar) - Dependendo do número de segmentos, escolha o número correto de canais disponíveis na tela e inicie a gravação do gráfico.
- Use o menu suspenso para selecionar o canal de interesse; a tela de normalização será exibida.
- Introduza os valores constantes nas janelas da seguinte forma: Pontos finais do tecido α1; Pontos finais do tecido α2; Diâmetro do pino: 40 μm; Valor de leitura do micrômetro da escala micrômetro analógica.
- Para registrar o primeiro ponto (o valor inicial de X ou X0), clique no botão Adicionar Ponto . Após um atraso de 60 s, os valores para a força e a pressão efetiva (ERTP) correspondentes a este micrômetro serão exibidos, e a caixa para a leitura do micrômetro se tornará ativa e disponível.
- Comece a esticar o vaso girando o micrômetro no sentido anti-horário. Use a caixa de leitura do micrômetro para inserir o valor e clique no botão Adicionar ponto (haverá um tempo de atraso de 60 s novamente).
- Continue esticando o vaso e continue a adicionar valores de micrômetro até que o valor do micrômetro X1 seja visto, que é a configuração de micrômetro calculada usada para esticar o vaso até seu IC1.
- Defina o micrômetro para o valor X1.
NOTA: A tensão normalizada (ótima) para um rato C57BL6 de 6 meses de idade é de 6 mN. - Após a normalização, deixe o tecido descansar e equilibrar por 30 min. Não há necessidade de alterar a solução HEPES-PSS nas câmaras neste momento.
NOTA: Cada câmara é capaz de armazenar 8 mL de solução. Este protocolo é escrito com o uso de 5 mL, o que permite a submersão total do vaso e pinos de montagem. - Use o tempo de descanso e equilíbrio para preparar o seguinte.
- Preparar o estoque de trabalho de diluições seriadas de acetilcolina em água destilada (água RO) das concentrações mais baixas às mais altas da seguinte forma: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM e 1 mM. Mantenha todos os tubos no gelo durante a duração do experimento.
- Preparar uma solução de trabalho de 100 mM de éster metílico N-nitro-L-arginina (L-NAME) em água duplamente destilada e manter a solução sobre gelo durante a duração da experiência.
- Preparar a dose submáxima de fenilefrina (10 μM) determinada num conjunto separado de experiências.
NOTA: O período de equilíbrio é necessário para que o segmento dos vasos sanguíneos se ajuste ao novo ambiente na câmara do miógrafo, redefina os gradientes iônicos e atinja um nível estável de tensão passiva antes de ser submetido a diferentes desafios farmacológicos e mecânicos.
6. Medida do vasorelaxamento endotélio-dependente em anéis aórticos
- No final do período de equilíbrio de 30 minutos, drene as câmaras e adicione 5 mL de solução HEPES-PSS fresca, quente e aerada a cada câmara. Escorra uma câmara de cada vez para minimizar a exposição do tecido ao ar. A drenagem das câmaras é realizada usando uma bomba de vácuo ajustada para 60 cmHg e as válvulas do miógrafo ajustadas para um atraso de 6 s para garantir a remoção dos 5 mL de solução.
- Se necessário, reajuste as medições de força para ler a tensão ideal de 6 mN. É muito crítico reajustar a força à tensão ideal durante cada período de incubação, bem como antes de cada novo conjunto de experimentos. Descanse o tecido por mais 15-20 min.
- Abra o software de aquisição de dados, altere os números de rastreamento de 50:1 para 500:1 e pressione Iniciar. Nesta fase, a força registrada para cada câmara pode ser vista no software.
- Imediatamente antes do início de um novo experimento, certifique-se de adicionar o rótulo apropriado no software de aquisição de dados.
- Escorra as câmaras mais uma vez antes de adicionar 5 mL de solução de K+ alta a cada câmara. Isso é adequado para testar a viabilidade do tecido aórtico e a integridade da resposta contrátil do músculo liso à despolarização da membrana antes de usar o tecido para qualquer outro protocolo experimental. Isso ajuda a determinar se o segmento dos vasos sanguíneos é utilizável para experimentação adicional.
- Drene as câmaras novamente assim que a resposta contrátil à solução de K+ alta atingir um platô para geração de força (Figura 4).
NOTA: Não deixe a solução de K+ alta nas câmaras por mais de 3 minutos, pois danificaria o tecido. - Lave o tecido com a solução HEPES-PSS 3x. Adicionar 5 ml de solução de K+ elevada a cada câmara. Drene as câmaras assim que a resposta contrátil à solução de K+ alta atingir um platô para geração de força e lave o tecido 3x com HEPES-PSS antes de permitir que o tecido descanse por mais 15 minutos.
NOTA: Em alguns laboratórios, os segmentos sanguíneos são submetidos a uma solução alta de K+ três vezes consecutivas para garantir a variabilidade do vaso sanguíneo antes de iniciar os experimentos do miógrafo. Neste protocolo, os segmentos aórticos recém-isolados são submetidos a uma solução alta de K+ duas vezes antes de usar o tecido para experimentos adicionais. É importante manter isso consistente em todos os experimentos. - Utilizar a média dos dois picos registrados de desenvolvimento de força (força de contração) em resposta a uma solução de K+ alta para normalizar os valores registrados em resposta a outros agentes vasoconstritores e vasodilatadores utilizados no experimento.
- Descanse o tecido por 15-20 min.
- Pré-contraia os segmentos aórticos com o agente vasoconstritor fenilefrina (EP) em uma dose submáxima já estabelecida (concentração final de 10 μM na câmara).
NOTA: A dose submáxima de fenilefrina (10 μM) foi determinada em um conjunto separado de experimentos, onde os segmentos aórticos foram submetidos a concentrações crescentes de solução de fenilefrina nas concentrações finais de 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM e 50 μM. Como resultado, determinou-se que uma concentração final de 10 μM de fenilefrina poderia gerar a força de contração submáxima (90% da força máxima) em segmentos aórticos de 2 mm, que é logo antes da força de contração atingir um platô. A razão para o uso da concentração sub-máxima de fenilefrina é evitar problemas relacionados à saturação do tecido aórtico ou dessensibilização ao agonista vasoconstritor. - Permitir que a curva de contração induzida por PE atinja um platô para o desenvolvimento de tensão (força) (Figura 5).
- Em um platô de desenvolvimento de tensão para fenilefrina, execute a curva dose-resposta de acetilcolina adicionando 5 μL de doses crescentes de soluções de estoque de trabalho de acetilcolina em intervalos de 3 minutos, a fim de estabelecer as concentrações finais de acetilcolina na câmara do miógrafo da seguinte forma: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM e 1 μM (Figura 6).
NOTA: Depois de adicionar cada dose de acetilcolina, aguarde pelo menos 3 minutos (para que a tensão atinja um platô) antes de adicionar a próxima dose. - Em cada passo, pipetar a solução de reserva de acetilcolina para a câmara muito lentamente e longe dos anéis aórticos para evitar qualquer perturbação tecidual.
- Após a conclusão do experimento dose-resposta, drene as câmaras e lave os segmentos aórticos com solução HEPES-PSS 3x quente e aerada para remover qualquer resíduo remanescente da droga.
- Descanse o tecido por 30 minutos antes de iniciar as próximas etapas do experimento. A viabilidade da aorta é verificada antes de cada etapa experimental utilizando a solução HEPES-PSS high K+. Se todas as etapas de preparação e experimentais forem seguidas corretamente, a viabilidade do tecido aórtico permanecerá a mesma durante todo o experimento (4-6 h).
7. Efeitos dos inibidores gerais da produção de NO no vasorelaxamento mediado pelo endotélio
- Use o mesmo tecido aórtico para esta parte do experimento depois de lavar cuidadosamente e descansar os segmentos por pelo menos 30 min.
NOTA: Use o tempo de repouso de 30 minutos para preparar uma solução de trabalho de 100 mM de éster metílico N-nitro-L-arginina (L-NAME) em água destilada dupla e mantenha a solução no gelo durante a duração do experimento. - Depois de descansar os segmentos aórticos por 30 min, escorra as câmaras e adicione a cada câmara uma solução fresca e quente de K+ (60 mM KCl).
NOTA: É importante que, para cada parte do experimento, o tecido aórtico seja desafiado com uma solução alta de K+ pelo menos uma vez. O pico de contração registrado será utilizado para normalizar os dados coletados durante essa parte do experimento. - Escorra as câmaras novamente assim que a resposta de contração à solução de K+ elevada atingir um platô e lave o tecido com a solução HEPES-PSS 3x.
- A fim de avaliar a contribuição da produção de NO para o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina observado (ver secção 6.), nesta fase, pré-incubar os segmentos aórticos com um inibidor geral da produção de NO (L-NAME) adicionando 10 μL da solução-mãe de trabalho preparada de 100 mM de L-NAME a cada câmara miográfica (contendo 5ml de solução tampão) para atingir uma concentração final de 200 μM em cada câmara miográfica.
NOTA: L-NAME é um inibidor não seletivo e potente de todas as isoformas de NOS (enzima responsável pela produção de NO) e, portanto, é considerado uma ferramenta eficaz para bloquear a produção de NO na parede dos vasos sanguíneos9. - Deixe os segmentos aórticos descansarem durante o tempo de pré-incubação com L-NAME (30 min).
- Não lave neste momento.
- Sem remover o L-NAME, adicione a dose submáxima de fenilefrina (concentração final de 10 μM) à câmara para induzir a contração aórtica.
NOTA: Devido à ação inibitória do L-NAME na produção endógena de NO, o pico recém-registrado para a contração aórtica induzida pela fenilefrina será muito maior do que o pico inicial que foi registrado antes da incubação do tecido com L-NAME. Isso é esperado devido ao efeito do L-NAME na produção basal de NO na parede aórtica, o que leva a uma maior geração de força (devido à maior geração de força contrátil pelo músculo liso). - Espere até que a curva de contração induzida pela fenilefrina atinja um platô para o desenvolvimento de tensão (força contrátil).
- Neste ponto, adicione acetilcolina à câmara do miógrafo para atingir uma concentração final de 500 nM (esta é a concentração sub-máxima de acetilcolina que foi estabelecida durante os experimentos descritos na seção 5. do protocolo).
- Aguarde alguns minutos para registrar possíveis alterações no desenvolvimento da força até que o platô formado esteja estável (Figura 7).
NOTA: Devido à ação inibitória do L-NAME na capacidade da camada endotelial de produzir NO em resposta à acetilcolina, não se espera que haja alterações na geração de força registrada em resposta à fenilefrina, pois o NOS endotelial aórtico (eNOS) não é capaz de gerar NO em resposta à aplicação de acetilcolina. - Escorra as câmaras e lave o tecido com uma solução HEPES-PSS quente e aerada 3x.
8. Contribuição da camada endotelial para o vasorelaxamento da aorta
- A fim de ressaltar o papel da camada endotelial no vasorelaxamento aórtico, teste o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina em segmentos aórticos desnudados do endotélio, nos quais as camadas endoteliais são removidas.
- Posicione a câmara do miógrafo sob o microscópio e passe suavemente um pequeno fio (o mesmo fio que é usado para a miografia do fio pode ser usado aqui) através do lúmen da aorta. Mova suavemente o fio através do lúmen (movimento circular suave) por um curto período de tempo. Isso é suficiente para remover o endotélio ou a íntima.
- Corte a aorta em anéis aórticos de 2 mm e monte esses anéis na câmara do miógrafo, conforme descrito anteriormente.
- Ajuste a tensão ideal em 6 mN e deixe o tecido descansar por 30 minutos em tampão HEPES-PSS quente e arejado.
- No final do período de equilíbrio de 30 minutos, drene as câmaras e adicione 5 mL de solução HEPES-PSS fresca, quente e aerada a cada câmara.
- Zerar a força para todas as câmaras do miógrafo girando o micrômetro no sentido anti-horário.
- Gire lentamente o micrômetro no sentido anti-horário para aumentar a distância entre os pinos até que a força registrada atinja a tensão ideal desejada para a aorta do camundongo (6 mN para a aorta do camundongo C57BL/6J). Descanse o tecido por mais 15-20 minutos na tensão ideal (6 mN).
- Escorra as câmaras 1x mais antes de adicionar 5 mL de solução de K+ alta a cada câmara.
- Escorra as câmaras novamente assim que a resposta de contração à solução de K+ elevada atingir um platô e lave o tecido com a solução HEPES-PSS 3x. Descanse o tecido por 15-20 min
- Pré-contrair os segmentos aórticos com o agente vasoconstritor fenilefrina (concentração final de 10 μM na câmara).
NOTA: Devido à remoção do endotélio, a produção basal de NO na parede aórtica é significativamente diminuída; portanto, espera-se que o pico de contração induzida pela fenilefrina (o pico de geração de força) seja maior no tecido aórtico sem a camada endotelial. - Quando a força induzida pela fenilefrina atingir um platô, adicione a concentração submáxima de acetilcolina à câmara do miógrafo para atingir uma concentração final de 500 nM.
NOTA: Se a remoção da camada endotelial for feita corretamente, não haverá alterações na força induzida pela fenilefrina registrada, pois a produção de NO induzida pela acetilcolina pelo endotélio terá sido diminuída devido à remoção da camada endotelial. O traço registrado será muito semelhante ao observado na presença de L-NAME (seção 7.). - Aguarde 3 min para garantir que o platô registrado para o desenvolvimento da força induzida pela fenilefrina não esteja mudando antes de encerrar o experimento (Figura 8).
NOTA: Se a aplicação de acetilcolina causar qualquer queda na contração induzida pela fenilefrina enquanto estiver no platô, isso é uma indicação de que a camada endotelial não foi completamente removida.
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Representative Results
O protocolo tensométrico de miografia de câmara pequena explicado aqui é o método padrão para medir a reatividade vascular em artérias pequenas e grandes e permite medições simultâneas da reatividade vascular em até quatro segmentos de vasos sanguíneos do mesmo pequeno animal de laboratório experimental. Neste relato, utilizamos especificamente o sistema para medir a função endotelial na aorta isolada de camundongos (Figura 1). Neste protocolo, segmentos aórticos isolados são montados em uma pequena câmara de órgão (Figura 2) entre dois pequenos pinos de aço inoxidável (Figura 3). A câmara do miógrafo pode conter até 8 mL de solução tampão e fornecer um ambiente semifisiológico para os vasos isolados durante a duração dos experimentos. É muito importante que, antes de cada experimento, a viabilidade de cada segmento isolado seja testada e verificada. O protocolo padrão para estabelecer a integridade e a viabilidade de cada segmento de vaso isolado é desafiar o tecido com alta concentração de cloreto de potássio para induzir a despolarização da membrana muscular lisa. No cenário em que o vaso isolado está saudável e responsivo, seria possível registrar a geração de força contrátil no visor (Figura 4). O pico da força registrada é usado posteriormente para normalizar a geração de força para o mesmo segmento em resposta aos agonistas usados durante o protocolo (por exemplo, fenilefrina). Para medir o vasorelaxamento mediado pelo endotélio, é necessário pré-contrair o tecido aórtico com a concentração submáxima (10 μM) de fenilefrina, o que causa contração mediada pelo músculo liso e geração de força (Figura 5). Quando a contração induzida pela fenilefrina atinge um platô (Figura 6), doses crescentes de acetilcolina são aplicadas em múltiplas etapas para alcançar o vasorelaxamento máximo no segmento isolado (Figura 6). O nível de relaxamento do vaso é uma medida indireta da produção de óxido nítrico mediado pelo endotélio. Para confirmar ainda mais que o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina em anéis aórticos é devido à produção de óxido nítrico, os segmentos aórticos são pré-tratados com um inibidor geral da produção de óxido nítrico (200 μM de L-NAME) por 30 minutos antes da aplicação de fenilefrina. Como mostrado na Figura 7, o L-NAME é capaz de bloquear completamente o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina na aorta pré-contraída, destacando o fato de que a acetilcolina induz vasorelaxamento aórtico através do aumento da produção de óxido nítrico. Por outro lado, a remoção da camada endotelial dos segmentos aórticos também bloqueia o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina, ressaltando o papel que o endotélio desempenha no relaxamento dos vasos sanguíneos (Figura 8).
Figura 1: Visão anatômica grosseira do coração, raiz aórtica e aorta descendente isolada de um camundongo controle de 6 meses de idade. Depois de remover a caixa torácica do rato, o coração e a aorta são isolados da caixa torácica e transferidos para uma placa de Petri limpa revestida de elastômero de silicone. Antes de isolar a aorta, é importante remover toda a gordura e tecido conjuntivo e qualquer coágulo sanguíneo do lúmen da aorta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem representativa de uma câmara da unidade miográfica mostrando os pinos de montagem de 200 μm. Como mostrado, os dois pinos dentro da câmara do miógrafo mal estão se tocando. Antes de usar a câmara, é fundamental certificar-se de que os pinos estão devidamente alinhados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ancorando os segmentos aórticos na câmara do miógrafo. Um segmento aórtico de camundongo de 2 mm isolado de um camundongo C57BL/6 de 6 meses de idade é mantido por dois pinos dentro de uma câmara de miógrafo. Isto é conseguido deslizando suavemente a aorta sobre os dois pinos de montagem usando pinças. A caixa pontilhada vermelha mostra a imagem ampliada do segmento aórtico de 2 mm que é montado entre dois pinos dentro da câmara do miógrafo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Contração da aorta devido à despolarização da membrana muscular lisa. Imagem representativa mostrando o traço de contração da aorta de camundongo (geração de força) em resposta a uma alta concentração de K+ (60 mM KCl) que induziria a despolarização e contração da membrana muscular lisa dentro da camada medial da aorta. A aplicação de solução de alto K+ é seguida imediatamente por três lavagens consecutivas usando solução HEPES-PSS quente e aerada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Contração da aorta em resposta ao agente vasoconstritor fenilefrina. Traço representativo do miógrafo mostrando a geração de força (contração) pelo anel aórtico em resposta à concentração submáxima de fenilefrina (10 μM). Como mostrado, o pico de contração induzida pela fenilefrina eventualmente atinge um platô. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Efeitos dose-resposta da acetilcolina no anel aórtico pré-contraído. Traço representativo do miógrafo mostrando o efeito vasodilatador dose-resposta (50 pM-1 μM) do neurotransmissor vasodilatador acetilcolina em um anel aórtico pré-contraído de 2 mm. O anel aórtico é pré-contraído com 10 μM de fenilefrina antes da aplicação de acetilcolina. A primeira dose de acetilcolina é adicionada quando a tensão induzida pela fenilefrina atinge um platô. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Efeitos de um inibidor geral da produção de NO (L-NAME) no vasorelaxamento mediado pelo endotélio na aorta de camundongos. Traço representativo do miógrafo mostrando que a pré-incubação de segmentos aórticos com um inibidor geral da produção de NO (L-NAME, concentração final de 200 μM) bloqueia a vasodilatação induzida pela acetilcolina em um anel aórtico pré-contraído. Isto é devido à inibição da produção de NO pelo endotélio devido à ação inibitória do L-NAME sobre a eNOS. A acetilcolina foi adicionada ao segmento aórtico pré-contraído na concentração submáxima de 500 nM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Efeitos da remoção mecânica do endotélio no vasorelaxamento mediado pelo endotélio na aorta de camundongos. Traço representativo do miógrafo mostrando que a remoção do endotélio dos segmentos aórticos usando o desnudamento de fio bloqueia a vasodilatação induzida pela acetilcolina em um anel aórtico pré-contraído. Isto é devido à inibição do vasorelaxamento mediado pelo endotélio. A acetilcolina foi adicionada ao segmento aórtico pré-contraído na concentração submáxima de 500 nM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O campo da biologia vascular depende fortemente de ferramentas que ajudam os pesquisadores a avaliar a integridade funcional e estrutural da parede dos vasos sanguíneos. Também requer atenção especial sobre as interações diretas e indiretas entre as três camadas de vasos sanguíneos: a íntima, a mídia e a adventícia. Dentre essas três camadas, a íntima é formada por uma monocamada de células endoteliais e tem uma função muito importante na regulação da saúde vascular e hemostasia.
Está bem estabelecido que qualquer dano à camada endotelial pode afetar negativamente sua capacidade de liberar NO e outros fatores vasodilatadores, levando à desregulação da função vascular, o que é observado em vários distúrbios vasculares, como aterosclerose, aneurisma e vasculite10,11,12. A fim de compreender os mecanismos subjacentes que controlam a função endotelial normal e avaliar a função vasodilatadora e a integridade do endotélio dentro da parede vascular, é imperativo utilizar um sistema experimental padrão que imite as condições fisiológicas in vivo.
Para grandes artérias, como a aorta, a miografia tensométrica (isométrica) de câmara pequena é amplamente reconhecida como uma ferramenta confiável que cria as melhores condições disponíveis, quase fisiológicas, para o vaso sanguíneo em um ambiente ex vivo . O sistema também permite manter a viabilidade do tecido por um período de tempo consideravelmente longo (até 6-8 h) no ambiente de laboratório, tornando a técnica uma ferramenta valiosa e versátil. Uma outra vantagem é que a câmara do miógrafo permite que os anéis dos vasos sanguíneos sejam mantidos e reutilizados para diferentes experimentos consecutivos, tornando-se assim uma abordagem econômica, reduzindo a necessidade de um grande número de camundongos experimentais. Até quatro segmentos de vasos sanguíneos podem ser testados simultaneamente usando um sistema de miógrafo de quatro câmaras, aumentando a consistência e reduzindo as variações entre os experimentos.
Várias ferramentas farmacológicas e mecânicas podem ser usadas para estudar a função da camada endotelial nos vasos sanguíneos. O principal marcador de um endotélio funcional é a produção normal de NO, que é conhecido como o agente vasodilatador mais importante produzido e liberado pela camada endotelial. A disfunção endotelial está associada principalmente a uma queda significativa na produção de NO e tem se mostrado envolvida na progressão de diferentes distúrbios vasculares, como hipertensão, trombose e aterosclerose.
Dentro do leito vascular, a produção de NO é controlada principalmente por alterações no fluxo sanguíneo e na pressão, ou por outros eventos intracelulares que podem levar a alterações na concentração citoplasmática de cálcio ou à ativação de vias de sinalização em resposta a hormônios e fatores de crescimento13,14. Alterações na produção de NO são consideradas um dos marcadores precoces e confiáveis da disfunção endotelial, e geralmente são detectáveis precocemente durante a progressão dos distúrbios cardiovasculares. Independentemente do modelo da doença, os biólogos vasculares estão muito interessados em ferramentas e ensaios que permitam medir a função endotelial. É especialmente importante que se possa diferenciar entre a contribuição de várias camadas do vaso sanguíneo usando uma plataforma que imita as condições fisiológicas.
Em um miógrafo de câmara pequena, os pesquisadores podem utilizar ferramentas farmacológicas e mecânicas para medir a função endotelial em um ambiente rigidamente controlado. Dentro da câmara do miógrafo, um ambiente artificial é criado que pode suportar a função normal do vaso sanguíneo. Em tal ambiente artificial, uma vez que os segmentos isolados dos vasos sanguíneos não são suportados pelo tecido conjuntivo circundante e outros órgãos, é importante determinar a tensão passiva ideal na qual os segmentos isolados podem gerar a contração máxima possível em resposta aos vasopressores. Na tensão ideal, pode-se medir a resposta contrátil máxima normal a agentes vasoconstritores, como fenilefrina ou norepinefrina, para testar a integridade estrutural e funcional da camada muscular lisa da parede dos vasos sanguíneos. Em laboratório, determinou-se que a tensão passiva de 6 mN é uma tensão adequada para segmentos aórticos de camundongos de 2 mm15. No entanto, a tensão passiva ótima deve ser determinada para diferentes tipos de artérias em diferentes espécies16.
Além disso, antes de realizar qualquer experimento com vasos sanguíneos isolados, é imperativo testar a viabilidade de anéis isolados para garantir que eles atendam aos critérios de inclusão e exclusão de tecido viável e utilizável. Isto é geralmente conseguido submetendo os anéis isolados a uma solução de K+ de alta concentração (60 mM KCl). Isso resulta em despolarização da membrana muscular lisa devido à abertura de canais de cálcio dependentes de voltagem (VGCC), levando à contração do músculo liso e vasoconstrição aórtica. Este método é usado para validar a viabilidade dos segmentos aórticos antes de usar esses segmentos para experimentos futuros.
Por outro lado, agentes vasodilatadores como a acetilcolina podem ser usados para testar as propriedades funcionais da camada endotelial. Se a camada de endotélio estiver intacta e funcional, uma concentração submáxima de acetilcolina pode induzir relaxamento em um segmento de vasos sanguíneos pré-contraído17. A magnitude do relaxamento induzido pela acetilcolina é uma indicação do nível de liberação de NO da camada endotelial. Qualquer dano à camada endotelial (mecânica ou funcional) terá um impacto na produção de NO e na resposta vasodilatadora do vaso. Neste protocolo, os dados fornecidos mostram que a acetilcolina pode induzir relaxamento na aorta pré-contraída de camundongo de forma dose-dependente, com relaxamento submáximo alcançado na concentração final de 500 nM (Figura 6).
Em alguns experimentos, os pesquisadores estão interessados em medir a resposta direta do músculo liso ao vasodilatador NO. Como o foco de tais experimentos é apenas na função do músculo liso, há um protocolo em vigor que permitiria aos pesquisadores contornar a contribuição do endotélio removendo (desnudando) a camada de endotélio do segmento dos vasos sanguíneos. O endotélio pode ser removido através de vários métodos, incluindo ar, rolagem entre os dedos ou remoção por fio. Nesses ambientes experimentais, o vaso sanguíneo desnudo (sem camada endotelial) é submetido a doadores de NO, como nitroglicerina e nitroprussiato de sódio. Isso permite determinar se a via de sinalização da proteína quinase G cíclica do músculo liso que responde ao NO está intacta e funcional 7,18. Este manuscrito explicou como a remoção da camada endotelial no segmento aórtico isolado bloqueia completamente os efeitos vasodilatadores da acetilcolina, destacando a importância da liberação de NO no relaxamento e vasodilatação dos vasos sanguíneos (Figura 8).
Embora as técnicas de fio e miógrafo tensométrico tenham ampla utilidade em experimentos de biologia vascular, vale a pena notar as potenciais limitações. Especificamente, o sistema tensométrico tem limitações de tamanho de tecido (ou seja, vasculatura menor). Além disso, a natureza ex vivo desta técnica não permite a manipulação da pressão e do fluxo intraluminal para um mimetismo mais preciso da função vascular in vivo e dos parâmetros hemodinâmicos. As configurações de miógrafo de pressão, de fato, explicariam essas variáveis e simulariam a dinâmica vascular em tempo real, além de permitir o uso de artérias de menor resistência. Além disso, os experimentos de miógrafo de fio não podem replicar completamente as condições fisiológicas ou modelar com precisão as interações entre o sangue circulante, as paredes dos vasos e o tecido circundante, que também desempenham papéis importantes na regulação da função vascular no corpo.
Independentemente do protocolo experimental utilizado nos experimentos de miografia ou do vasoconstritor/vasodilatador selecionado no experimento, o sistema de miografia de câmara pequena fornece uma plataforma semifisiológica confiável, reprodutível e estável para medir a reatividade dos vasos sanguíneos e a integridade funcional. Embora o foco deste relatório tenha sido apenas na medição básica da função endotelial, o sistema de miografia pode ser usado para avaliar muitas outras propriedades funcionais do vaso sanguíneo, como a relação estresse / tensão, força da parede vascular, ponto de ruptura e contração passiva e ativa, para citar alguns. Isso destaca o valor do sistema de miógrafos como uma ferramenta confiável no campo da biologia vascular.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (R15HL145646) e da Faculdade de Pós-Graduação da Midwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
References
- Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Lerman, A., Zeiher, A. M.
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Galley, H. F., Webster, N. R.
- Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
- Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
- Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
- Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
- Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
- Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958 (2021).
- Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157 (2021).
- Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
- Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
- Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
- Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
- Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
- Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412 (2021).
