Summary
Denne protokol beskriver begreberne og den tekniske anvendelse af den tensometriske myografteknik ved hjælp af et multikammermyografsystem i den eksperimentelle ex vivo-vurdering af musens aortaendotelfunktion.
Abstract
Lille volumen kammer tensometrisk myografi er en almindeligt anvendt teknik til at evaluere vaskulær kontraktilitet af små og store blodkar i forsøgsdyr og små arterier isoleret fra humant væv. Teknikken gør det muligt for forskere at opretholde isolerede blodkar i en tæt kontrolleret og standardiseret (næsten fysiologisk) indstilling med mulighed for at tilpasse sig forskellige miljøfaktorer, samtidig med at de isolerede kar udfordres med forskellige farmakologiske midler, der kan inducere vasokonstriktion eller vasodilatation. Myografkammeret giver også en platform til måling af vaskulær reaktivitet som reaktion på forskellige hormoner, hæmmere og agonister, der kan påvirke funktionen af glatte muskel- og endotellag separat eller samtidigt. Blodkarvæggen er en kompleks struktur bestående af tre forskellige lag: intima (endotellag), medier (glatte muskel- og elastinfibre) og adventitia (kollagen og andet bindevæv). For at få en klar forståelse af de funktionelle egenskaber ved hvert lag er det afgørende at have adgang til en eksperimentel platform og et system, der giver mulighed for en kombinationstilgang til at studere alle tre lag samtidigt. En sådan fremgangsmåde kræver adgang til en semifysiologisk tilstand, der efterligner in vivo-miljøet i en ex vivo-indstilling. Lille volumen kammer tensometrisk myografi har givet et ideelt miljø til at evaluere virkningen af miljømæssige signaler, eksperimentelle variabler eller farmakologiske agonister og antagonister på vaskulære egenskaber. I mange år har forskere brugt den tensometriske myografteknik til at måle endotelfunktion og glat muskelkontraktilitet som reaktion på forskellige midler. I denne rapport anvendes et lille volumen kammer tensometrisk myografsystem til at måle endotelfunktionen i den isolerede mus aorta. Denne rapport fokuserer på, hvordan lille volumen kammer tensometrisk myografi kan bruges til at evaluere endotelets funktionelle integritet i små segmenter af en stor arterie såsom thorax aorta.
Introduction
I de sidste par årtier er det lille kammermyografisystem blevet brugt til at måle reaktiviteten af forskellige lag af blodkarvægge som reaktion på forskellige farmakologiske midler og neurotransmittere i en ex vivo realtidsindstilling. Vaskulær reaktivitet er en vigtig komponent i et sundt funktionelt blodkar og er kritisk for reguleringen af blodgennemstrømning og perfusion i perifer og cerebral vaskulatur1. Inden for blodkarvæggen er interaktionen mellem endotel og glatte muskellag en vigtig determinant for vaskulær tone, som også konstant påvirkes af strukturelle ændringer i bindevævslaget omkring blodkarvæggen (adventitia).
Endotellaget styrer vasomotion ved at frigive nogle få vasodilatoriske faktorer, herunder nitrogenoxid (NO), prostacyclin (BGB2) og endotelafledt hyperpolariserende faktor (EDHF) eller ved at producere vasokonstriktive midler såsom endothelin-1 (ET-1) og thromboxan (TXA2)2,3,4. Blandt disse faktorer er NO blevet grundigt undersøgt, og dets vigtige regulatoriske roller i andre kritiske cellulære funktioner såsom inflammation, migration, overlevelse og spredning er blevet stærkt citeret i videnskabelig litteratur 2,5.
Inden for vaskulær biologi har kammermyografi givet vaskulære fysiologer og farmakologer et værdifuldt og pålideligt værktøj til at måle endotelfunktion i et tæt kontrolleret semifysiologisk system1. I øjeblikket er der to forskellige myografsystemer til rådighed for forskere: tråd (eller pin) tensometrisk (isometrisk) myografi og trykmyografi. I et trådmyografisystem strækkes blodkarret mellem to ledninger eller stifter, hvilket giver mulighed for isometrisk måling af kraft eller spændingsudvikling i blodkarets væg, mens trykmyografi er en foretrukken platform til målinger af vaskulær reaktivitet i små modstandsarterier, hvor ændringer i blodtrykket betragtes som den vigtigste stimulus for ændringer i vaskulær tone og vasomotion. Der er generel enighed om, at for små modstandsarterier som mesenteriske og cerebrale arterier skaber trykmyografi en tilstand, der er tættere på de fysiologiske forhold i menneskekroppen. Den lille kammermyograf kan bruges til fartøjer med meget små diametre (200-500 μm) til meget større fartøjer som aorta.
Mens trådmyografen er et kraftfuldt system til registrering af blodkarspænding under isometriske forhold, er trykmyografen et mere passende system til måling af ændringer i kardiameter som reaktion på ændringer i isobariske forhold. Diameterændringerne i karret som reaktion på ændringer i tryk eller strømning er meget større i en lille muskelarterie (arteriole) sammenlignet med store elastiske arterier såsom aorta. Af disse grunde betragtes trykmyografen som et bedre værktøj til små blodkar med betydelig vasoreaktivitet1. En af de andre praktiske styrker ved multi-kammer lille volumen kammer tensometrisk myografi er, at man kan skelne bidraget fra forskellige mekanismer til vaskulær reaktivitet ved at studere flere (op til fire) segmenter af samme arterie og fra det samme dyr for at reducere variabilitet og producere robuste og afgørende data. Det er også relativt let at konfigurere og vedligeholde teknisk. Fartøjer af næsten enhver størrelse kan studeres med en trådmyografi. Det er en mere omkostningseffektiv løsning til vurdering af vaskulær funktion og er et godt alternativ til trykmyografi i eksperimenter, hvor længden af det dissekerede kar er for kort til trykmyografiprotokollen.
Denne rapport giver en detaljeret protokol til vurdering af endotelfunktionen i den isolerede thorax-aortaring til mus ved hjælp af monteringsstifter i den lille volumenkammer tensometrisk myografiteknik ved hjælp af DMT-620 multi-kammer myograph system (DMT-USA). Denne protokol bruger en 6 måneder gammel C57BL6-hanmus med en gennemsnitsvægt mellem 25-35 g. Heldigvis kan denne protokol anvendes på forskellige dyretyper og vægte i betragtning af den brede vifte af fartøjstyper og diametre, som denne protokol kan bruges til.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle kirurgiske procedurer og dyrepleje blev godkendt af Institutional Animal Care and Use and Care Committee (IACUC) ved Midwestern University (IACUC # AZ-3006, AZ-2936).
1. Forberedelse af buffer
BEMÆRK: Selvom HEPES fysiologisk saltopløsning (HEPES-PSS) bufferen er stabil ved 4 °C i 7 dage, anbefales det, at alle buffere er frisklavede på dagen for hvert forsøg. Alle andre reagenser og agonister skal tilberedes frisk til hvert forsøg. HEPES-PSS-bufferen, der anvendes i denne protokol, er en veletableret buffer til ex vivo vaskulære undersøgelser, der har vist sig at være cytobeskyttende i mere end 12 timer, samtidig med at fartøjets vasodilatoriske responser bevares - hovedfokus for denne eksperimentelle protokol 6,7.
- HEPES-PSS-opløsning (pH 7,4) fremstilles som følger: Bland 10 mmol/L HEPES, 6 mmol/l glucose, 1,5 mmol/L CaCl 2, 130 mmol/L NaCl, 4 mmol/L KCl, 4 mmol/L NaHCO3, 1,2 mmol/L MgSO 4, 1,2 mmol/L KH2 PO4 og 0,03 mmol/L EDTA.
- Forbered HEPES-PSS høj K + buffer. Dette er identisk med HEPES-PSS-opløsningen, bortset fra at den indeholder 5 mmol/l HEPES, 65 mmol/L NaCl, 10 mmol/l glucose, 1 mmol/L MgCl2, 80 mmol/L KCl og ikke indeholder MgSO4 og EDTA.
2. Forberedelse af myografenhed
- Tænd og indstil vandbadet til 37 °C. Sørg for en passende vandstand.
- Der anbringes to bægerglas mærket korrekt i vandbadet, et med 600 ml HEPES-PSS-opløsning og et med 150 ml høj K+ opløsning.
- Lufte et bægerglas på 300 ml HEPES-PSS-opløsning med karbogsgas (5 % CO 2 og 95 % O2) i mindst 10 min.
- Der tilsættes 30 ml luftet HEPES-PSS-opløsning til et 50 ml centrifugerør, etiketten er passende (thoraxbur, museidentifikationsnummer), og læg den på is. Den resterende luftede HEPES-PSS-opløsning opbevares på is til brug under aortadissektionsprocessen.
- Tænd for myografenheden med fire kamre; Der tilsættes 6 ml HEPES-PSS-opløsning til hvert myografkammer, og varmen indstilles til 37 °C. Lad opløsningen i hvert kammer luftes (med karbogblanding) i 30 minutter, og kontroller, at kamrene har nået de ønskede 37 °C (brug denne ventetid til at dissekere musens aorta).
- Tænd for myograph dataindsamlingshardware og computer.
3. Mus aorta isolering
- Anæstetiser den eksperimentelle mus med 5% isofluranindånding og aflivning ved cervikal dislokation (en 6 måneder gammel mandlig C57BL / 6J mus bruges til denne demonstration).
- Læg musen på et kirurgisk bord i liggende stilling og fastgør vedhængene til brættet ved hjælp af kirurgisk tape.
- Spray maveregionen med 70% alkohol, så pelsen er helt våd, og eventuelle løse/tørre hår ikke kommer ind i snittet. Tør forsigtigt overskydende opløsning væk.
- Brug tang til at lokalisere og isolere maveskindet lige ringere end brystbenets xiphoidproces.
- Skab spændinger ved at løfte huden lige op. Lav et stumpt snit ved hjælp af en saks, og fjern den overfladiske hud og udsæt brysthulen.
- Løft xiphoidprocessen og gør laterale snit bare ringere end processen langs de subkostale margener.
- Forlæng de laterale snit kranielt for at fjerne den forreste del af brystkassen.
- Fjern brystkassen ved at lave et stumpt snit gennem rygsøjlen, under membranen og i nakken.
BEMÆRK: Forskere kan også fjerne aorta direkte fra dyret, men man skal sørge for at beskytte karret og skylle det størknede blod fra aorta. Denne protokol bruger eksemplet med at fjerne thoraxburet og omhyggeligt rengøre og dissekere aorta. Med praksis kan denne metode udføres hurtigt og effektivt og er gavnlig for at bevare det ekstra væv til andre undersøgelser såsom immunohistokemi, histologi og western blotting. - Overfør brystkassen til en klar silikoneelastomerbelagt petriskål fyldt med iskold luftet HEPES-PSS-buffer, og fastgør den på begge sider.
BEMÆRK: Brug et silikoneelastomersæt (materialetabel). Bland base og hærdningsmiddel (10:1 efter vægt), hæld derefter i en glas petriskål, og lad det hærde i 24 timer ved 25 ° C. - Placer petriskålen under et stereozoommikroskop, skær forsigtigt og fjern hjertet og fastgjort aorta fra brystkassen, og overfør til en ren, klar silikoneelastomerbelagt skål (figur 1).
- Fjern derefter forsigtigt fedt og bindevæv og eventuelt størknet blod fra aorta. Brug skarp, lille saks til at dissekere og isolere hele aorta startende fra bueområdet til den nederste del af den faldende aorta. Husk, at aortabuen ikke er egnet til myografieksperimenter, men kan bruges til histologiske undersøgelser.
- Brug koldluftet HEPES-PSS-opløsning under hele dissektionen. Skift løsning hvert 10. minut, eller når synligheden kompromitteres, uanset hvad der kommer først. Det anbefales, at hver aortaring monteres på myografkammeret inden for 20 minutters postdissektion (maks. 60 min).
4. Montering af aortasegmenterne på myografkamrene
- Skær den dissekerede aorta i fire segmenter på 2 mm hver ved hjælp af en skarp lille kirurgisk saks. Brug mini-linealen i skålen som reference.
- Placer myografkammeret under stereozoommikroskopet for let at visualisere stifterne og indstille mikrometerne, så stifterne næsten rører (figur 2).
- Sørg for, at begge vævsholderstifter er korrekt justeret.
- Vær opmærksom og undgå at klemme aorta, mens du monterer segmenterne for at forhindre beskadigelse af endotelet.
- I kamre, der allerede indeholder 5 ml opvarmet og luftet HEPES-PSS-buffer, skal du forsigtigt skubbe hvert af 2 mm aortasegmenterne på de to monteringsstifter ved hjælp af tang. Vær meget blid, mens du glider aortasegmenterne over stifterne. Endotellaget er meget skrøbeligt og kommer meget let ud fra luminalsiden.
- Flyt langsomt stifterne fra hinanden ved at dreje mikrometeret mod uret, så aortasegmentet ikke glider af stifterne, når kammeret placeres tilbage i myografenheden (figur 3).
- Brug det tidligere kalibrerede okulargitter i dissekeringsmikroskopet til at måle den sande og nøjagtige længde af den monterede aortaring ved at placere linealens begyndelse i den ene ende af segmentet (markeret som vævsende α1) og notere målingen i den anden ende af aortasegmentet i okulære divisioner (markeret som vævsende α2)8. Disse værdier bruges under normaliseringstrinnene i afsnit 5.
- Hvert myografkammer returneres til enheden, og begynd at lufte kamrene ved 37 °C i 30 minutter.
BEMÆRK: De fire segmenter af aorta kan bruges som replikater til samme behandling, eller hvert segment af aorta kan bruges samtidigt til forskellige eksperimenter.
5. Normalisering
BEMÆRK: En normaliseringsprocedure er nødvendig for at sikre, at de eksperimentelle betingelser er korrekt standardiserede, og de indsamlede data er pålidelige og reproducerbare. "IC1/IC100" eller "Normaliseringsfaktor" defineres som forholdet mellem arteriens indre omkreds, hvor det er muligt at registrere den maksimale respons på en vasokonstriktor (f.eks. 60 mM KCl) divideret med den indre omkreds, ved hvilken et transmural vægtryk på 100 mm Hg (dvs. IC100) registreres. Derfor kan vi ved at multiplicere IC100 med dette forhold bestemme den indre omkreds af arterien, hvor et optimalt respons (dvs. IC1) kan etableres.
- Indstil mikrometeret således, at stifterne næsten rører ved hinanden.
- Indstil kræfter til nul for alle myografkamre, og lad det balancere i yderligere 1-2 minutter.
- Noter den første diameteraflæsning fra mikrometeret. Dette er den position, hvor afstanden mellem to ben betragtes som nul (nødvendig for trin 5.7.).
- Åbn dataindsamlingssoftwaren Normaliseringsindstillinger under DMT-rullemenuen; En ny skærm åbnes med følgende indstillinger og standardværdier:
Kalibrering af okular (mm/div): 0,36
Måltryk (kPa): 13,3
IC1/IC100: 0,9
Online gennemsnitstid (er): 2
Forsinkelsestid(er): 60
Afspil lyd ved forsinket afslutning (afkrydsningsfelt)
Lyde (med rullemenuen eller funktionen Gennemse) - Afhængigt af antallet af segmenter skal du vælge det korrekte antal kanaler, der er tilgængelige på skærmen, og starte diagramoptagelsen.
- Brug rullemenuen til at vælge kanal af interesse; normaliseringsskærmen vises.
- Indtast de konstante værdier i vinduerne som følger: Vævsendepunkter α1; Vævets endepunkter α2; Pin diameter: 40 μm; Mikrometeraflæsningsværdi fra den analoge mikrometerskala.
- For at registrere det første punkt (den oprindelige værdi af X eller X0) skal du klikke på knappen Tilføj punkt . Efter en forsinkelse på 60 s vises værdierne for kraften og det effektive tryk (ERTP) svarende til dette mikrometer, og boksen til mikrometeraflæsningen bliver aktiv og tilgængelig.
- Begynd at strække fartøjet ved at dreje mikrometeret mod uret. Brug mikrometeraflæsningsboksen til at indtaste værdien, og klik på knappen Tilføj punkt (der vil være en forsinkelsestid på 60 s igen).
- Bliv ved med at strække fartøjet, og fortsæt med at tilføje mikrometerværdier, indtil værdien af Micrometer X1 ses, hvilket er den beregnede mikrometerindstilling, der bruges til at strække fartøjet til dets IC1.
- Indstil mikrometeret til X1-værdien.
BEMÆRK: Den normaliserede (optimale) spænding for en 6 måneder gammel C57BL6-mus er 6 mN. - Efter normalisering skal du lade vævet hvile og balancere i 30 minutter. Der er ingen grund til at ændre HEPES-PSS-løsningen i kamrene på nuværende tidspunkt.
BEMÆRK: Hvert kammer er i stand til at rumme 8 ml opløsning. Denne protokol er skrevet ved brug af 5 ml, hvilket giver mulighed for fuld nedsænkning af fartøjet og monteringsstifterne. - Brug hvile- og ækvilibreringstiden til at forberede følgende.
- Arbejd arbejdsbestanden af acetylcholin serielle fortyndinger i destilleret vand (RO-vand) fra laveste til højeste koncentrationer som følger: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM og 1 mM. Hold alle rørene på is i løbet af eksperimentet.
- Der fremstilles en 100 mM arbejdsopløsning af N-nitro-L-argininmethylester (L-NAME) i dobbeltdestilleret vand, og opløsningen holdes på is under hele forsøget.
- Den submaksimale dosis phenylephrin (10 μM) bestemmes i et separat sæt forsøg.
BEMÆRK: Ækvilibreringsperioden er nødvendig for, at blodkarsegmentet kan tilpasse sig det nye miljø i myografkammeret, nulstille iongradienter og opnå et stabilt niveau af passiv spænding, inden det udsættes for forskellige farmakologiske og mekaniske udfordringer.
6. Måling af endotelafhængig vasorelaxation i aortaringe
- Ved afslutningen af 30-minutters ligevægtsperioden drænes kamrene og tilsættes 5 ml frisk, varm, luftet HEPES-PSS-opløsning til hvert kammer. Tøm et kammer ad gangen for at minimere vævseksponering for luft. Dræning af kamrene udføres ved hjælp af en vakuumpumpe, der er indstillet til 60 cmHg, og myografventilerne indstilles til en forsinkelse på 6 s for at sikre fjernelse af 5 ml opløsning.
- Hvis det er nødvendigt, skal du justere kraftmålingerne for at læse den optimale spænding på 6 mN. Det er meget vigtigt at justere kraften til optimal spænding under hver inkubationsperiode såvel som forud for hvert nyt sæt eksperimenter. Hvil vævet i yderligere 15-20 min.
- Åbn dataindsamlingssoftwaren, skift sporingsnumrene fra 50: 1 til 500: 1, og tryk på Start. På dette stadium kan den registrerede kraft for hvert kammer ses i software.
- Umiddelbart før starten af et nyt eksperiment skal du sørge for at tilføje den relevante etiket på dataindsamlingssoftwaren.
- Tøm kamrene endnu en gang, før du tilsætter 5 ml høj K+ opløsning til hvert kammer. Dette er egnet til at teste levedygtigheden af aortavæv og integriteten af det glatte muskelkontraktile respons på membrandepolarisering, inden vævet anvendes til enhver anden eksperimentel protokol. Dette hjælper med at afgøre, om blodkarsegmentet kan bruges til yderligere eksperimenter.
- Kamrene tømmes igen, så snart det kontraktile respons på den høje K+ opløsning når et plateau for kraftgenerering (figur 4).
BEMÆRK: Efterlad ikke den høje K + -opløsning i kamrene i mere end 3 minutter, da det ville beskadige vævet. - Vævet vaskes med HEPES-PSS opløsning 3x. Der tilsættes 5 ml høj K+ opløsning til hvert kammer. Tøm kamrene, så snart det kontraktile respons på høj K+ opløsning når et plateau til kraftgenerering, og vask vævet 3x med HEPES-PSS, før vævet får lov til at hvile i yderligere 15 minutter.
BEMÆRK: I nogle laboratorier udsættes blodsegmenterne for en høj K + -opløsning tre på hinanden følgende gange for at sikre variationen i blodkarret, inden myografforsøgene påbegyndes. I denne protokol udsættes de nyligt isolerede aortasegmenter for en høj K + -opløsning to gange, før vævet anvendes til yderligere eksperimenter. Det er vigtigt at holde dette konsekvent på tværs af alle eksperimenter. - Brug gennemsnittet af de to registrerede toppe af kraftudvikling (sammentrækningskraft) som reaktion på en høj K + -opløsning til at normalisere de registrerede værdier som reaktion på andre vasokonstriktor- og vasodilatormidler, der anvendes i eksperimentet.
- Hvil vævet i 15-20 min.
- Forkontrakt med aortasegmenterne med vasokonstriktormidlet phenylephrin (PE) ved en allerede fastlagt submaksimal dosis (10 μM slutkoncentration i kammeret).
BEMÆRK: Den submaksimale dosis phenylephrin (10 μM) blev bestemt i et separat sæt forsøg, hvor aortasegmenter blev udsat for stigende koncentrationer af phenylephrinopløsning ved slutkoncentrationer på 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM og 50 μM. Som et resultat blev det fastslået, at en endelig koncentration på 10 μM phenylephrin kunne generere den submaksimale sammentrækningskraft (90% af den maksimale kraft) i 2 mm aortasegmenter, hvilket er lige før sammentrækningskraften når et plateau. Årsagen til at anvende den sub-maksimale koncentration af phenylephrin er at undgå problemer relateret til aortavævsmætning eller desensibilisering til den vasokonstrikerende agonist. - Tillad den PE-inducerede sammentrækningskurve at nå et plateau for spændingsudvikling (kraft) (figur 5).
- På et plateau af spændingsudvikling til phenylephrin, udføre acetylcholin dosis-respons kurven ved at tilføje 5 μL stigende doser acetylcholin arbejdsstamopløsninger i 3 minutters intervaller for at etablere endelige koncentrationer af acetylcholin i myografkammeret som følger: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM og 1 μM (figur 6).
BEMÆRK: Efter tilsætning af hver dosis acetylcholin, vent i mindst 3 min (for spændingen at nå et plateau), før du tilføjer den næste dosis. - Ved hvert trin pipetteres acetylcholinstamopløsningen ind i kammeret meget langsomt og langt fra aortastene for at undgå vævsforstyrrelser.
- Efter afslutning af dosis-respons-eksperimentet drænes kamrene og vaskes aortasegmenterne med varm og luftet HEPES-PSS-opløsning 3x for at fjerne eventuelle resterende rester af lægemidlet.
- Hvil vævet i 30 minutter, før du starter de næste eksperimenttrin. Aortas levedygtighed kontrolleres før hvert forsøgstrin ved hjælp af HEPES-PSS høj K + opløsning. Hvis alle forberedelses- og eksperimentelle trin følges korrekt, forbliver aortavævets levedygtighed den samme i hele eksperimentets varighed (4-6 timer).
7. Virkninger af generelle hæmmere af NO-produktion på endotelmedieret vasorelaxation
- Brug det samme aortavæv til denne del af eksperimentet efter omhyggeligt vask og hvile segmenterne i mindst 30 minutter.
BEMÆRK: Brug hviletiden på 30 minutter til at forberede en 100 mM arbejdsløsning af N-nitro-L-argininmethylester (L-NAME) i dobbeltdestilleret vand og hold opløsningen på is i forsøgets varighed. - Efter hvile af aortasegmenterne i 30 min. drænes kamrene og tilsættes frisk, varm høj K + (60 mM KCl) opløsning til hvert kammer.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at aortavævet for hver del af eksperimentet udfordres med en høj K+ opløsning mindst én gang. Den registrerede sammentrækningstop vil blive brugt til at normalisere de data, der er indsamlet under den del af eksperimentet. - Tøm kamrene igen, så snart sammentrækningsresponsen på høj K+ opløsning når et plateau, og vask vævet med HEPES-PSS-opløsning 3x.
- For at vurdere NO-produktionens bidrag til den observerede acetylcholin-inducerede vasorelaxation (se punkt 6.) præinkuberes aortasegmenterne på dette stadium med en generel hæmmer af NO-produktion (L-NAME) ved at tilsætte 10 μL af den fremstillede 100 mM arbejdslageropløsning af L-NAME til hvert myografkammer (indeholdende 5 ml bufferopløsning) for at opnå en endelig koncentration på 200 μM i hvert myografkammer.
BEMÆRK: L-NAME er en ikke-selektiv og potent hæmmer af alle isoformer af NOS (et enzym, der er ansvarlig for INGEN produktion), og det betragtes derfor som et effektivt værktøj til at blokere produktionen af NO i blodkarvæggen9. - Lad aortasegmenterne hvile i præinkubationstiden med L-NAME (30 min).
- Vask ikke på dette tidspunkt.
- Uden at fjerne L-NAME tilsættes den submaksimale dosis phenylephrin (10 μM endelig koncentration) til kammeret for at inducere aortakontraktion.
BEMÆRK: På grund af den hæmmende virkning af L-NAME på endogen NO-produktion vil den nyregistrerede top for phenylephrin-induceret aortakontraktion være meget højere end den oprindelige top, der blev registreret før inkubation af vævet med L-NAME. Dette forventes på grund af L-NAME's effekt på basal NO-produktion i aortavæggen, hvilket fører til højere kraftgenerering (på grund af højere kontraktil kraftgenerering af den glatte muskel). - Vent, indtil den phenylephrin-inducerede sammentrækningskurve når et plateau for spænding (kontraktil kraft) udvikling.
- På dette tidspunkt tilsættes acetylcholin til myografkammeret for at opnå en endelig koncentration på 500 nM (dette er den sub-maksimale koncentration af acetylcholin, der blev etableret under forsøgene beskrevet i afsnit 5. i protokollen).
- Vent et par minutter med at registrere eventuelle ændringer i kraftudviklingen, indtil det dannede plateau er stabilt (figur 7).
BEMÆRK: På grund af den hæmmende virkning af L-NAME på endotellagets evne til at producere NO som reaktion på acetylcholin, Det forventes ikke at se nogen ændringer i registreret kraft generation som reaktion på phenylephrin, da aorta endotel NOS (eNOS) ikke er i stand til at generere NO som reaktion på acetylcholin ansøgning. - Tøm kamrene og vask vævet med varm, luftet HEPES-PSS-opløsning 3x.
8. Endotellagets bidrag til aorta vasorelaxation
- For at understrege endotellagets rolle i aorta vasorelaxation, test acetylcholin-induceret vasorelaxation i endotel-denuderede aorta segmenter, hvor endotellagene fjernes.
- Placer myografkammeret under mikroskopet og før forsigtigt en lille ledning (den samme ledning, der bruges til trådmyografi, kan bruges her) gennem aortaens lumen. Flyt forsigtigt ledningen gennem lumen (blid cirkulær bevægelse) i en kort periode. Dette er nok til at fjerne endotelet eller intima.
- Skær aorta i 2 mm aortaringe, og monter disse ringe på myografkammeret som beskrevet før.
- Indstil den optimale spænding ved 6 mN, og lad vævet hvile i 30 minutter i luftet, varm HEPES-PSS-buffer
- Ved afslutningen af 30 minutters ligevægtsperioden drænes kamrene, og der tilsættes 5 ml frisk, varm, luftet HEPES-PSS-opløsning til hvert kammer.
- Nul kraften for alle myografkamre ved at dreje mikrometeret mod uret.
- Drej langsomt mikrometeret mod uret for at øge afstanden mellem stifterne, indtil den registrerede kraft når den ønskede optimale spænding for musens aorta (6 mN for C57BL/6J mus aorta). Hvil vævet i yderligere 15-20 minutter ved den optimale spænding (6 mN).
- Tøm kamrene 1x mere, før du tilsætter 5 ml høj K+ opløsning til hvert kammer.
- Tøm kamrene igen, så snart sammentrækningsresponsen på høj K+ opløsning når et plateau, og vask vævet med HEPES-PSS-opløsning 3x. Hvil vævet i 15-20 min
- Forkontrakt aortasegmenterne med vasokonstriktormidlet phenylephrin (10 μM endelig koncentration i kammeret).
BEMÆRK: På grund af fjernelsen af endotelet er den basale NO-produktion i aortavæggen signifikant formindsket; Derfor forventes toppen for phenylephrin-induceret sammentrækning (toppen af kraftgenerering) at være højere i aortavæv, der mangler endotellaget. - Når den phenylephrin-inducerede kraft når et plateau, tilsættes sub-maksimal koncentration af acetylcholin til myografkammeret for at opnå en endelig koncentration på 500 nM.
BEMÆRK: Hvis fjernelsen af endotellaget udføres korrekt, vil der ikke være nogen ændringer i den registrerede phenylephrin-inducerede kraft, da den acetylcholin-inducerede NO-produktion af endotelet vil være blevet formindsket på grund af fjernelsen af endotellaget. Det registrerede spor vil være meget lig det, der observeres i nærværelse af L-NAME (afsnit 7.). - Vent i 3 minutter for at sikre, at det registrerede plateau for phenylephrin-induceret kraftudvikling ikke ændrer sig, før forsøget afsluttes (figur 8).
BEMÆRK: Hvis anvendelsen af acetylcholin forårsager et fald i phenylephrin-induceret sammentrækning, mens i plateauet, dette er en indikation af, at endotellaget ikke er blevet fjernet fuldstændigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tensometriske lille kammermyografiprotokol, der er forklaret her, er standardmetoden til måling af vaskulær reaktivitet i små og store arterier og giver mulighed for samtidige målinger af vaskulær reaktivitet i op til fire blodkarsegmenter fra det samme eksperimentelle lille forsøgsdyr. I denne rapport bruger vi specifikt systemet til at måle endotelfunktionen i den isolerede mus aorta (figur 1). I denne protokol er isolerede aortasegmenter monteret på et lille organkammer (figur 2) mellem to små stifter i rustfrit stål (figur 3). Myografkammeret kan rumme op til 8 ml bufferopløsning og give et semifysiologisk miljø for de isolerede kar i løbet af forsøgene. Det er meget vigtigt, at levedygtigheden af hvert isoleret segment testes og verificeres forud for hvert eksperiment. Standardprotokollen til at fastslå integriteten og levedygtigheden af hvert isoleret karsegment er at udfordre vævet med en høj koncentration af kaliumchlorid for at inducere glat muskelmembrandepolarisering. I scenariet om, at det isolerede fartøj er sundt og responsivt, ville vi være i stand til at registrere den kontraktile kraftgenerering på displayet (figur 4). Toppen af den registrerede kraft bruges senere til at normalisere kraftgenereringen for det samme segment som reaktion på de agonister, der blev brugt under protokollen (f.eks. Phenylephrin). For at måle endotelmedieret vasorelaxation er det nødvendigt at præ-kontrahere aortavævet med den sub-maksimale koncentration (10 μM) af phenylephrin, hvilket forårsager glat muskelmedieret sammentrækning og kraftgenerering (figur 5). Når phenylephrin-induceret sammentrækning når et plateau (figur 6), øges doser af acetylcholin anvendes i flere trin for at opnå den maksimale vasorelaxation i det isolerede segment (figur 6). Niveauet af fartøjsafslapning er en indirekte måling af endotelmedieret nitrogenoxidproduktion. For yderligere at bekræfte, at acetylcholin-induceret vasorelaxation i aortaringe skyldes produktionen af nitrogenoxid, forbehandles aortasegmenter med en generel hæmmer af nitrogenoxidproduktion (200 μM L-NAME) i 30 minutter før phenylephrin ansøgning. Som vist i figur 7, L-NAME er i stand til fuldstændigt at blokere acetylcholin-induceret vasorelaxation i pre-kontraheret aorta, fremhæve det faktum, at acetylcholin inducerer aorta vasorelaxation gennem stigende nitrogenoxid produktion. På den anden side blokerer fjernelsen af endotellaget fra aortasegmenterne også acetylcholinduceret vasorelaxation, hvilket understreger den rolle, som endotelet spiller i blodkarafslapning (figur 8).
Figur 1: Groft anatomisk syn på hjertet, aortaroden og faldende aorta isoleret fra en 6 måneder gammel kontrolmus. Efter fjernelse af ribbenburet fra musen isoleres hjertet og aorta fra ribbenburet og overføres til en ren silikoneelastomerbelagt petriskål. Før isolering af aorta er det vigtigt at fjerne alt fedt og bindevæv og eventuel blodprop fra aortaens lumen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Et repræsentativt billede af et kammer i myografenheden, der viser monteringsstifterne på 200 μm. Som vist rører de to stifter inde i myografkammeret næsten ikke. Før du bruger kammeret, er det vigtigt at sikre, at stifterne er korrekt justeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Forankring af aortasegmenterne på myografkammeret. Et 2 mm mus aorta segment isoleret fra en 6 måneder gammel C57BL/6 mus holdes af to stifter inde i et myografkammer. Dette opnås ved forsigtigt at skubbe aorta på de to monteringsstifter ved hjælp af tang. Den røde stiplede boks viser det zoomede billede af 2 mm aortasegmentet, der er monteret mellem to ben inde i myografkammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Aortakontraktion på grund af glat muskelmembrandepolarisering. Repræsentativt billede, der viser sporet for musens aortakontraktion (kraftgenerering) som reaktion på en høj koncentration af K + (60 mM KCl), der ville fremkalde glat muskelmembrandepolarisering og sammentrækning inden for det mediale lag af aorta. Påføring af høj K+ opløsning efterfølges straks af tre på hinanden følgende vaske med varm, luftet HEPES-PSS-opløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Aortakontraktion som reaktion på det vasokonstriktionsmiddel phenylephrin. Repræsentativt myografspor, der viser kraftgenerering (sammentrækning) af aortaringen som reaktion på den submaksimale koncentration af phenylephrin (10 μM). Som vist når toppen af phenylephrin-induceret sammentrækning til sidst et plateau. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Dosis-respons virkninger af acetylcholin på den præ-kontraherede aorta ring. Repræsentativt myografspor, der viser dosis-respons (50 pM-1 μM) vasodilatorisk virkning af vasodilator neurotransmitter acetylcholin på en 2 mm præ-kontraheret aortaring. Aortrien er forudkontraheret med 10 μM phenylephrin før påføring af acetylcholin. Den første dosis acetylcholin tilsættes, når phenylephrin-induceret spænding når et plateau. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Virkninger af en generel hæmmer af NO-produktion (L-NAME) på endotelmedieret vasorelaxation i mus aorta. Repræsentativt myografspor, der viser, at præinkubation af aortasegmenter med en generel hæmmer af NO-produktion (L-NAME, 200 μM endelig koncentration) blokerer acetylcholinduceret vasodilatation i en prækontraheret aortaring. Dette skyldes endotelets hæmning af NO-produktion på grund af den hæmmende virkning af L-NAME på eNOS. Acetylcholin blev tilsat til det prækontraherede aortasegment ved sub-maksimal koncentration på 500 nM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Virkninger af mekanisk endotelfjernelse på endotelmedieret vasorelaxation i mus aorta. Repræsentativ myografsporing, der viser, at fjernelse af endotelet fra aortasegmenter ved hjælp af tråddenudation blokerer acetylcholin-induceret vasodilatation i en prækontraheret aortaring. Dette skyldes inhiberingen af endotelmedieret vasorelaxation. Acetylcholin blev tilsat til det prækontraherede aortasegment ved sub-maksimal koncentration på 500 nM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Området for vaskulær biologi er stærkt afhængig af værktøjer, der hjælper forskere med at vurdere blodkarvæggens funktionelle og strukturelle integritet. Det kræver også særlig opmærksomhed på de direkte og indirekte interaktioner mellem de tre lag af blodkar: intima, medier og adventitia. Blandt disse tre lag er intima dannet af et monolag af endotelceller og har en meget vigtig funktion til regulering af vaskulær sundhed og hæmostase.
Det er veletableret, at enhver skade på endotellaget kan påvirke dets evne til at frigive NO og andre vasodilatoriske faktorer negativt, hvilket fører til dysregulering af vaskulær funktion, som observeres i forskellige vaskulære lidelser såsom aterosklerose, aneurisme og vaskulitis10,11,12. For at forstå de underliggende mekanismer, der styrer normal endotelfunktion og vurderer endotelets vasodilatoriske funktion og integritet i vaskulærvæggen, er det bydende nødvendigt at anvende et standard eksperimentelt system, der efterligner in vivo fysiologiske tilstande.
For store arterier, såsom aorta, er den lille kammer tensometrisk (isometriske) myografi meget anerkendt som et pålideligt værktøj, der skaber de bedste tilgængelige, næsten fysiologiske betingelser for blodkarret i en ex vivo-indstilling . Systemet giver også mulighed for at opretholde vævets levedygtighed i en betydelig lang periode (op til 6-8 timer) i laboratorieindstillingen, hvilket gør teknikken til et værdifuldt og alsidigt værktøj. En anden fordel er, at myografkammeret gør det muligt at opbevare blodkarringene og genbruges til back-to-back forskellige eksperimenter, hvilket gør det til en omkostningseffektiv tilgang, samtidig med at behovet for et stort antal eksperimentelle mus reduceres. Op til fire blodkarsegmenter kan testes samtidigt ved hjælp af et firekammermyografsystem, hvilket øger konsistensen og reducerer variationer på tværs af eksperimenter.
Forskellige farmakologiske og mekaniske værktøjer kan bruges til at studere funktionen af endotellaget i blodkar. Den vigtigste markør for et funktionelt endotel er den normale produktion af NO, som er kendt som det vigtigste vasodilatoriske middel, der produceres og frigives af endotellaget. Endotel dysfunktion er hovedsageligt forbundet med et signifikant fald i NO-produktion og har vist sig at være involveret i progressionen af forskellige vaskulære lidelser såsom hypertension, trombose og aterosklerose.
Inden for vaskulærsengen styres NO-produktionen hovedsageligt af ændringer i blodgennemstrømning og tryk eller af andre intracellulære hændelser, der kan føre til ændringer i cytoplasmatisk calciumkoncentration eller aktivering af signalveje som reaktion på hormoner og vækstfaktorer13,14. Ændringer i NO-produktion betragtes som en af de tidlige og pålidelige markører for endotel dysfunktion, og de kan normalt påvises tidligt under udviklingen af hjerte-kar-sygdomme. Uanset sygdomsmodellen er vaskulære biologer meget interesserede i værktøjer og assays, der gør det muligt at måle endotelfunktionen. Det er især vigtigt, at man kan skelne mellem bidraget fra forskellige lag af blodkarret ved hjælp af en platform, der efterligner de fysiologiske forhold.
I en lille kammermyograf kan forskere bruge farmakologiske og mekaniske værktøjer til at måle endotelfunktion i et tæt kontrolleret miljø. Inde i myografkammeret skabes et kunstigt miljø, der kan understøtte blodkarets normale funktion. I et sådant kunstigt miljø, da de isolerede blodkarsegmenter ikke understøttes af det omgivende bindevæv og andre organer, er det vigtigt at bestemme den optimale passive spænding, hvor de isolerede segmenter kan generere den maksimale mulige sammentrækning som reaktion på vasopressorer. Ved den optimale spænding kan man måle det normale maksimale kontraktile respons på vasokonstriktionsmidler såsom phenylephrin eller noradrenalin for at teste den strukturelle og funktionelle integritet af det glatte muskellag i blodkarvæggen. I laboratoriet blev det fastslået, at den passive spænding på 6 mN er en korrekt spænding for 2 mm mus aortasegmenter15. Den optimale passive spænding skal dog bestemmes for forskellige typer arterier i forskellige arter16.
Derudover er det bydende nødvendigt at teste levedygtigheden af isolerede ringe, før der udføres forsøg med isolerede blodkar, for at sikre, at de opfylder inklusions- og udelukkelseskriterierne for levedygtigt og brugbart væv. Dette opnås normalt ved at udsætte de isolerede ringe for K + -opløsning med høj koncentration (60 mM KCl). Dette resulterer i depolarisering af den glatte muskelmembran på grund af åbningen af spændingsstyrede calciumkanaler (VGCC), hvilket fører til glat muskelkontraktion og aorta vasokonstriktion. Denne metode bruges til at validere levedygtigheden af aortasegmenterne, før disse segmenter bruges til yderligere eksperimenter.
På den anden side kan vasodilerende midler såsom acetylcholin anvendes til at teste endotellagets funktionelle egenskaber. Hvis endotellaget er intakt og funktionelt, kan en sub-maksimal koncentration af acetylcholin fremkalde afslapning i et præ-kontraheret blodkarsegment17. Størrelsen af acetylcholin-induceret afslapning er en indikation af niveauet af NO-frigivelse fra endotellaget. Enhver skade på endotellaget (mekanisk eller funktionelt) vil have indflydelse på NO-produktionen og fartøjets vasodilaterende respons. I denne protokol viser de leverede data, at acetylcholin kan fremkalde afslapning i den forudkontraherede museaorta på en dosisafhængig måde, med sub-maksimal afslapning opnået ved den endelige koncentration på 500 nM (figur 6).
I nogle eksperimenter er forskere interesserede i at måle den glatte muskels direkte respons på vasodilator NO. Da fokus for sådanne eksperimenter kun er på glat muskelfunktion, er der en protokol på plads, der gør det muligt for forskere at omgå endotelbidraget ved at fjerne (denuding) endotellaget fra blodkarsegmentet. Endotelet kan fjernes ved hjælp af forskellige metoder, herunder luft, rulning mellem fingrene eller fjernelse med ledning. I sådanne eksperimentelle indstillinger udsættes det denuderede blodkar (uden endotellag) for NO-donorer såsom nitroglycerin og natriumnitroprussid. Dette gør det muligt at bestemme, om den glatte muskelcykliske GMP-proteinkinase G-signalvej, der reagerer på NO, er intakt og funktionel 7,18. Dette manuskript forklarede, hvordan fjernelsen af endotellaget i det isolerede aortasegment fuldstændigt blokerer acetylcholin vasodilatatoriske virkninger, hvilket fremhæver vigtigheden af INGEN frigivelse i blodkarafslapning og vasodilatation (figur 8).
Mens tråd- og tensometriske myografteknikker har bred anvendelighed i vaskulære biologiske eksperimenter, er det værd at bemærke de potentielle begrænsninger. Specifikt har det tensometriske system vævsstørrelsesbegrænsninger (dvs. mindre vaskulatur). Desuden tillader denne tekniks ex vivo-karakter ikke manipulation af intraluminaltrykket og strømmen for mere præcis efterligning af in vivo-vaskulær funktion og hæmodynamiske parametre. Tryk myograph opsætninger ville faktisk redegøre for disse variabler og simulere real-time vaskulær dynamik, samtidig med at det giver mulighed for brug af mindre modstandsarterier. Derudover kan trådmyografeksperimenter ikke fuldt ud replikere fysiologiske tilstande eller nøjagtigt modellere interaktionerne mellem cirkulerende blod, karvægge og omgivende væv, som også spiller vigtige roller i reguleringen af vaskulær funktion i kroppen.
Uanset den eksperimentelle protokol, der anvendes i myografiforsøgene eller den valgte vasokonstriktor / vasodilator i eksperimentet, giver det lille kammermyografisystem en pålidelig, reproducerbar og stabil semifysiologisk platform til måling af blodkarreaktivitet og funktionel integritet. Selvom fokus i denne rapport kun var på den grundlæggende måling af endotelfunktionen, kan myografisystemet bruges til at vurdere mange andre funktionelle egenskaber ved blodkarret, såsom stress / belastningsforholdet, vaskulær vægstyrke, brudpunkt og passiv og aktiv sammentrækning for at nævne nogle få. Dette fremhæver værdien af myografsystemet som et pålideligt værktøj inden for vaskulær biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af finansiering fra National Institutes of Health (R15HL145646) og Midwestern University College of Graduate Studies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
References
- Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Lerman, A., Zeiher, A. M.
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Galley, H. F., Webster, N. R.
- Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
- Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
- Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
- Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
- Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
- Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958 (2021).
- Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157 (2021).
- Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
- Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
- Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
- Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
- Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
- Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412 (2021).
