Summary
Denne protokollen beskriver konseptene og den tekniske anvendelsen av den tensometriske myografteknikken ved hjelp av et multikammermyografsystem i den eksperimentelle ex vivo-vurderingen av musens aorta-endotelfunksjon.
Abstract
Småvolum kammer tenometrisk myografi er en vanlig teknikk for å evaluere vaskulær kontraktilitet av små og store blodkar i laboratoriedyr og små arterier isolert fra menneskelig vev. Teknikken gjør det mulig for forskere å opprettholde isolerte blodkar i en tett kontrollert og standardisert (nær fysiologisk) innstilling, med mulighet for å tilpasse seg ulike miljøfaktorer, samtidig som de utfordrer de isolerte karene med forskjellige farmakologiske midler som kan indusere vasokonstriksjon eller vasodilatasjon. Myografkammeret gir også en plattform for å måle vaskulær reaktivitet som respons på forskjellige hormoner, hemmere og agonister som kan påvirke funksjonen til glatte muskler og endotellag separat eller samtidig. Blodkarveggen er en kompleks struktur som består av tre forskjellige lag: intima (endotellaget), media (glatt muskulatur og elastinfibre) og adventitia (kollagen og annet bindevev). For å få en klar forståelse av de funksjonelle egenskapene til hvert lag, er det avgjørende å ha tilgang til en eksperimentell plattform og et system som vil tillate en kombinasjonstilnærming for å studere alle tre lagene samtidig. En slik tilnærming krever tilgang til en semi-fysiologisk tilstand som vil etterligne in vivo-miljøet i en ex vivo-setting. Tensometrisk myografi med lite volum har gitt et ideelt miljø for å evaluere virkningen av miljømessige signaler, eksperimentelle variabler eller farmakologiske agonister og antagonister på vaskulære egenskaper. I mange år har forskere brukt den tensometriske myografteknikken for å måle endotelfunksjon og glatt muskelkontraktilitet som svar på forskjellige midler. I denne rapporten brukes et lite volum kammer tensometrisk myografsystem for å måle endotelfunksjonen i den isolerte museaorta. Denne rapporten fokuserer på hvordan små volum kammer tensometral myografi kan brukes til å evaluere endotelets funksjonelle integritet i små segmenter av en stor arterie som thorax aorta.
Introduction
I løpet av de siste tiårene har det lille kammermyografisystemet blitt brukt til å måle reaktiviteten til forskjellige lag av blodkarvegger som svar på forskjellige farmakologiske midler og nevrotransmittere i en ex vivo, sanntidsinnstilling. Vaskulær reaktivitet er en viktig komponent i et sunt funksjonelt blodkar og er kritisk for regulering av blodstrøm og perfusjon i perifer og cerebral vaskulatur1. Innenfor blodkarveggen er samspillet mellom endotel- og glatte muskellag en viktig determinant for vaskulær tone, som også stadig påvirkes av strukturelle endringer i bindevevslaget rundt blodkarveggen (adventitia).
Endotellaget styrer vasomotion ved å frigjøre noen få vasodilatoriske faktorer, inkludert nitrogenoksid (NO), prostacyklin (PGI2) og endotelavledet hyperpolariserende faktor (EDHF), eller ved å produsere vasokonstriktive midler som endotelin-1 (ET-1) og tromboksan (TXA2) 2,3,4. Blant disse faktorene har NO blitt grundig studert, og dens viktige regulatoriske roller i andre kritiske cellulære funksjoner som betennelse, migrasjon, overlevelse og spredning har blitt høyt sitert i vitenskapelig litteratur 2,5.
Innen vaskulær biologi har kammermyografi gitt vaskulære fysiologer og farmakologer et verdifullt og pålitelig verktøy for å måle endotelfunksjon i et tett kontrollert semi-fysiologisk system1. For tiden er det to forskjellige myografsystemer tilgjengelig for forskere: wire (eller pin) tenometrisk (isometrisk) myografi og trykkmyografi. I et ledningsmyografisystem strekkes blodkaret mellom to ledninger eller pinner, noe som muliggjør isometrisk måling av kraft eller spenningsutvikling i blodkarets vegg, mens trykkmyografi er en foretrukket plattform for målinger av vaskulær reaktivitet i små motstandsarterier, hvor endringer i blodtrykk betraktes som den viktigste stimulansen for endringer i vaskulær tone og vasomotion. Det er en generell enighet om at for små motstandsarterier som mesenteriske og cerebrale arterier skaper trykkmyografi en tilstand som er nærmere de fysiologiske forholdene i menneskekroppen. Den lille kammermyografen kan brukes til kar med svært små diametre (200-500 μm) til mye større kar som aorta.
Mens trådmyografen er et kraftig system for registrering av blodkarspenning under isometriske forhold, er trykkmyografen et mer hensiktsmessig system for å måle endringer i kardiameter som svar på endringer i isobariske forhold. Diameterendringene i karet som svar på endringer i trykk eller strømning er mye større i en liten muskelarterie (arteriole) sammenlignet med store elastiske arterier som aorta. Av disse grunner anses trykkmyografien som et bedre verktøy for små blodkar med betydelig vasaraktivitet1. En av de andre praktiske styrkene til multi-kammer lite volum kammer tensometrisk myografi er at man kan skjelne bidraget fra forskjellige mekanismer til vaskulær reaktivitet ved å studere flere (opptil fire) segmenter av samme arterie og fra samme dyr for å redusere variabilitet og produsere robuste og avgjørende data. Det er også relativt enkelt å sette opp og vedlikeholde teknisk. Fartøy av nesten hvilken som helst størrelse kan studeres med en trådmyograf. Det er en mer kostnadseffektiv løsning for vurdering av vaskulær funksjon og er et godt alternativ til trykkmyografi i eksperimenter der lengden på det dissekerte karet er for kort for trykkmyografprotokollen.
Denne rapporten gir en detaljert protokoll for vurdering av endotelfunksjonen i den isolerte thorax-aortaringen med mus ved hjelp av monteringspinner i tensometrisk myografiteknikk med lite volum ved bruk av DMT-620 multikammermyografsystem (DMT-USA). Denne protokollen bruker en 6 måneder gammel mannlig C57BL6-mus med en gjennomsnittlig vekt mellom 25-35 g. Heldigvis kan denne protokollen brukes på forskjellige dyretyper og vekter, med tanke på det brede spekteret av fartøystyper og diametre som denne protokollen kan brukes til.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle kirurgiske prosedyrer og dyrepleie ble godkjent av Institutional Animal Care and Use and Care Committee (IACUC) ved Midwestern University (IACUC # AZ-3006, AZ-2936).
1. Forberedelse av buffer
MERK: Selv om HEPES fysiologisk saltløsning (HEPES-PSS) buffer er stabil ved 4 ° C i 7 dager, anbefales det at alle buffere er nylagde på dagen for hvert eksperiment. Alle andre reagenser og agonister må tilberedes ferskt for hvert eksperiment. HEPES-PSS-bufferen som brukes i denne protokollen er en veletablert buffer for ex vivo vaskulære studier som har vist seg å være cytoprotektive i mer enn 12 timer, samtidig som fartøyets vasodilatoriske responser opprettholdes - hovedfokuset i denne eksperimentelle protokollen 6,7.
- Klargjør HEPES-PSS-løsning (pH 7,4) som følger: Bland 10 mmol / L HEPES, 6 mmol / L glukose, 1,5 mmol / L CaCl 2, 130 mmol / L NaCl, 4 mmol / L KCl, 4 mmol / L NaHCO3, 1,2 mmol / L MgSO 4, 1,2 mmol / L KH2 PO4 og 0,03 mmol / L EDTA.
- Forbered HEPES-PSS høy K + buffer. Dette er identisk med HEPES-PSS-løsningen, bortsett fra at den inneholder 5 mmol / L HEPES, 65 mmol / L NaCl, 10 mmol / L glukose, 1 mmol / L MgCl2, 80 mmol / L KCl og inneholder ikke MgSO4 og EDTA.
2. Forberedelse av myografenhet
- Slå på og sett vannbadet til 37 °C. Sørg for riktig vannstand.
- Plasser to beger merket riktig i vannbadet, en med 600 ml HEPES-PSS-løsning og en med 150 ml høy K + -løsning.
- Luft et beger på 300 ml HEPES-PSS-løsning med karbogengass (5% CO 2 og 95% O2) i minst 10 minutter.
- Tilsett 30 ml av den luftede HEPES-PSS-løsningen til et 50 ml sentrifugerør, merk riktig (thoraxbur, museidentifikasjonsnummer) og legg det på is. Oppbevar den gjenværende luftede HEPES-PSS-løsningen på is som skal brukes under aortadisseksjonsprosessen.
- Slå på firekammermyografenheten; tilsett 6 ml HEPES-PSS-oppløsning i hvert myografkammer, og sett varmen til 37 °C. La oppløsningen i hvert kammer luftes (med karbogenblanding) i 30 minutter og kontroller at kamrene har nådd ønsket 37 °C (bruk denne ventetiden til å dissekere museaorta).
- Slå på maskinvaren og datamaskinen for datainnsamling i myografen.
3. Mus aorta isolasjon
- Bedøv den eksperimentelle musen med 5% isofluraninnånding og avlive ved cervikal dislokasjon (en 6 måneder gammel mannlig C57BL / 6J-mus brukes til denne demonstrasjonen).
- Legg musen på et kirurgisk brett i liggende stilling og fest vedleggene til brettet ved hjelp av kirurgisk tape.
- Spray mageregionen med 70% alkohol slik at pelsen er helt våt og eventuelle løse/tørre hår ikke kommer inn i snittet. Tørk forsiktig bort overflødig løsning.
- Bruk tang for å lokalisere og isolere bukhuden bare dårligere enn brystbenets xiphoidprosess.
- Skap spenning ved å løfte huden rett opp. Lag et sløvt kutt med saks, og fjern den overfladiske huden, og utsett brysthulen.
- Løft xiphoidprosessen og gjør laterale snitt bare dårligere enn prosessen langs subcostalmarginene.
- Forleng sidesnittene kranialt for å fjerne den fremre delen av brystkassen.
- Fjern thoraxburet ved å lage et sløvt kutt gjennom ryggraden, under membranen og i nakken.
Forskere kan også fjerne aorta direkte fra dyret, men det bør utvises forsiktighet for å beskytte karet og skylle det koagulerte blodet fra aorta. Denne protokollen bruker eksemplet på å fjerne thoraxburet og forsiktig rengjøre og dissekere aorta. Med praksis kan denne metoden utføres raskt og effektivt og er gunstig for å bevare det ekstra vevet for andre studier som immunhistokjemi, histologi og vestlig blotting. - Overfør thoraxburet til en klar silikonelastomerbelagt petriskål fylt med iskald luftet HEPES-PSS-buffer og fest den på begge sider.
MERK: Bruk et silikonelastomersett (Materialtabell). Bland base og herdemiddel (10: 1 etter vekt), hell deretter i en petriskål i glass, og la det herde i 24 timer ved 25 ° C. - Plasser petriskålen under et stereozoommikroskop, klipp og fjern forsiktig hjertet og festet aorta fra brystkassen, og overfør til en ren, klar silikonelastomerbelagt tallerken (figur 1).
- Deretter fjerner du forsiktig fett og bindevev og eventuelt koagulert blod fra aorta. Bruk skarp, liten saks, disseker og isoler hele aorta fra bueområdet til den nederste delen av den synkende aorta. Husk at aortabuen ikke er egnet for myografieksperimenter, men kan brukes til histologiske studier.
- Bruk kaldluftet HEPES-PSS-løsning gjennom hele disseksjonen. Endre løsningen hvert 10. minutt eller når sikten er kompromittert, uansett hva som kommer først. Det anbefales at hver aortaring monteres på myografkammeret innen 20 minutter etter disseksjon (maks. 60 min).
4. Montering av aortasegmentene på myografkamrene
- Klipp den dissekerte aorta i fire segmenter på 2 mm hver ved hjelp av skarp liten kirurgisk saks. Bruk minilinjalen i retten som referanse.
- Plasser myografkammeret under stereozoommikroskopet for enkelt å visualisere pinnene og still inn mikrometerne slik at pinnene nesten berører (figur 2).
- Forsikre deg om at begge vevsholdepinnene er riktig justert.
- Vær oppmerksom og unngå å klemme aorta mens du monterer segmentene for å forhindre skade på endotelet.
- I kamre som allerede inneholder 5 ml oppvarmet og luftet HEPES-PSS-buffer, skyv forsiktig hvert av de 2 mm aortasegmentene på de to monteringspinnene ved hjelp av tang. Vær veldig forsiktig mens du skyver aortasegmentene over pinnene. Endotellaget er veldig skjørt og kommer veldig lett ut fra luminalsiden.
- Flytt pinnene sakte fra hverandre ved å rotere mikrometeret mot klokken, slik at aortasegmentet ikke glir av pinnene når du plasserer kammeret tilbake i myografenheten (figur 3).
- Bruk det tidligere kalibrerte okularet graticule av dissekeringsmikroskopet for å måle den sanne og nøyaktige lengden på den monterte aortarringen ved å plassere begynnelsen av linjalen i den ene enden av segmentet (merket som vevsenden α1) og notere målingen i den andre enden av aortasegmentet i okulære divisjoner (merket som vevenden α2)8. Disse verdiene vil bli brukt under normaliseringstrinnene i avsnitt 5.
- Returner hvert myografkammer til enheten, og begynn å lufte kamrene ved 37 °C i 30 minutter.
MERK: De fire segmentene av aorta kan brukes som replikasjoner for samme behandling, eller hvert segment av aorta kan brukes samtidig for forskjellige eksperimenter.
5. Normalisering
MERK: En normaliseringsprosedyre er nødvendig for å sikre at de eksperimentelle forholdene er riktig standardisert og de innsamlede dataene er pålitelige og reproduserbare. "IC1 / IC100", eller "Normaliseringsfaktor", er definert som forholdet mellom den indre omkretsen av arterien der det er mulig å registrere maksimal respons på en vasokonstriktor (f.eks. 60 mM KCl) dividert med den indre omkretsen der et transmuralt veggtrykk på 100 mm Hg (dvs. IC100) registreres. Derfor, ved å multiplisere IC100 med dette forholdet, kan vi bestemme den indre omkretsen av arterien der en optimal respons (dvs. IC1) kan etableres.
- Sett mikrometeret slik at pinnene nesten berører.
- Sett kreftene til null for alle myografkamre og la den balansere i ytterligere 1-2 minutter.
- Noter den første diameteravlesningen fra mikrometeret. Dette er posisjonen der gapet mellom to pinner anses som null (nødvendig for trinn 5.7.).
- Åpne datainnsamlingsprogramvaren Normaliseringsinnstillinger under rullegardinmenyen DMT ; Et nytt skjermbilde åpnes med følgende innstillinger og standardverdier:
Kalibrering av okular (mm/div): 0,36
Måltrykk (kPa): 13,3
IC1/IC100: 0,9
Online gjennomsnittlig tid (er): 2
Forsinkelsestid(er): 60
Spill av lyd ved forsinket fullføring (avmerkingsboks)
Lyder (med rullegardinvalgmeny eller Bla gjennom-funksjon) - Avhengig av antall segmenter, velg riktig antall kanaler som er tilgjengelige på skjermen og start kartopptaket.
- Bruk rullegardinmenyen til å velge kanal av interesse; Normaliseringsskjermen vises.
- Skriv inn de konstante verdiene i vinduene som følger: Vev endepunkter α1; Vev endepunkter α2; Pin diameter: 40 μm; Mikrometeravlesningsverdi fra den analoge mikrometerskalaen.
- For å registrere det første punktet (startverdien til X eller X0), klikk på Legg til punkt-knappen . Etter en forsinkelse på 60 s vises verdiene for kraften og det effektive trykket (ERTP) som tilsvarer dette mikrometeret, og boksen for mikrometeravlesningen blir aktiv og tilgjengelig.
- Begynn å strekke fartøyet ved å vri mikrometeret mot klokken. Bruk mikrometeravlesningsboksen til å skrive inn verdien og klikk på Legg til punkt-knappen (det vil være en forsinkelsestid på 60 s igjen).
- Fortsett å strekke fartøyet og fortsett å legge til mikrometerverdier til verdien av Micrometer X1 er sett, som er den beregnede mikrometerinnstillingen som brukes til å strekke fartøyet til IC1.
- Sett mikrometeret til X1-verdien.
MERK: Den normaliserte (optimale) spenningen for en 6 måneder gammel C57BL6-mus er 6 mN. - Etter normalisering, la vevet hvile og balansere i 30 minutter. Det er ikke nødvendig å endre HEPES-PSS-løsningen i kamrene på dette tidspunktet.
MERK: Hvert kammer er i stand til å holde 8 ml oppløsning. Denne protokollen er skrevet med bruk av 5 ml, noe som muliggjør full nedsenking av fartøyet og monteringspinnene. - Bruk hvile- og likevektstiden til å forberede følgende.
- Forbered arbeidsstokken av acetylkolin serielle fortynninger i destillert vann (RO vann) fra laveste til høyeste konsentrasjoner som følger: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM og 1 mM. Hold alle rørene på is i løpet av forsøket.
- Forbered en 100 mM arbeidsløsning av N-nitro-L-argininmetylester (L-NAME) i dobbeltdestillert vann og hold løsningen på is i løpet av forsøket.
- Forbered submaksimal dose fenylefrin (10 μM) bestemt i et eget sett med eksperimenter.
MERK: Likevektsperioden er nødvendig for at blodkarsegmentet skal tilpasse seg det nye miljøet i myografkammeret, tilbakestille ionegradienter og oppnå et stabilt nivå av passiv spenning før de blir utsatt for forskjellige farmakologiske og mekaniske utfordringer.
6. Måling av endotelavhengig vasolaksasjon i aortasteringer
- På slutten av 30-minutters likevektsperioden, tøm kamrene og tilsett 5 ml frisk, varm, luftet HEPES-PSS-løsning til hvert kammer. Tøm ett kammer om gangen for å minimere vevseksponering for luft. Drenering av kamrene utføres ved hjelp av en vakuumpumpe satt til 60 cmHg og myografventilene satt til en 6 s forsinkelse for å sikre fjerning av 5 ml oppløsning.
- Juster om nødvendig kraftmålingene for å lese den optimale spenningen på 6 mN. Det er svært viktig å justere kraften til optimal spenning i hver inkubasjonsperiode, så vel som før hvert nytt sett med eksperimenter. Hvil vevet i ytterligere 15-20 minutter.
- Åpne datainnsamlingsprogramvaren, endre sporingsnumrene fra 50:1 til 500:1, og trykk på Start. På dette stadiet kan den registrerte kraften for hvert kammer ses i programvare.
- Umiddelbart før starten av et nytt eksperiment, må du legge til riktig etikett på datainnsamlingsprogramvaren.
- Tøm kamrene en gang til før du tilsetter 5 ml høy K + løsning til hvert kammer. Dette er egnet for å teste levedyktigheten til aortavev og integriteten til glatt muskelkontraktil respons på membrandepolarisering før du bruker vevet til noen annen eksperimentell protokoll. Dette bidrar til å avgjøre om blodkarsegmentet er brukbart for videre eksperimentering.
- Tøm kamrene igjen så snart kontraktilresponsen på den høye K+ -løsningen når et platå for kraftgenerering (figur 4).
MERK: Ikke la den høye K + -løsningen ligge i kamrene i mer enn 3 minutter, da det vil skade vevet. - Vask vevet med HEPES-PSS-løsning 3x. Tilsett 5 ml høy K + løsning til hvert kammer. Tøm kamrene så snart kontraktilresponsen på høy K + -løsning når et platå for kraftgenerering og vask vevet 3x med HEPES-PSS før du lar vevet hvile i ytterligere 15 minutter.
MERK: I noen laboratorier blir blodsegmentene utsatt for en høy K + -løsning tre påfølgende ganger for å sikre blodkarets variasjon før myografeksperimentene påbegynnes. I denne protokollen blir de nylig isolerte aortasegmentene utsatt for en høy K + -løsning to ganger før vevet brukes til videre eksperimenter. Det er viktig å holde dette konsistent på tvers av alle eksperimenter. - Bruk gjennomsnittet av de to registrerte toppene av kraftutvikling (sammentrekningskraft) som svar på en høy K + -løsning for å normalisere de registrerte verdiene som svar på andre vasokonstriktor- og vasodilatormidler som ble brukt i forsøket.
- Hvil vevet i 15-20 minutter.
- Forkontrakt aortasegmentene med vasokonstriktormiddelet fenylefrin (PE) ved en allerede etablert submaksimal dose (10 μM endelig konsentrasjon i kammeret).
MERK: Submaksimal dose fenylefrin (10 μM) ble bestemt i et eget sett med eksperimenter, hvor aortasegmenter ble utsatt for økende konsentrasjoner av fenylefrinoppløsning ved endelige konsentrasjoner på 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM og 50 μM. Som et resultat ble det bestemt at en endelig konsentrasjon på 10 μM fenylefrin kunne generere sub-maksimal kontraksjonskraft (90% av maksimal kraft) i 2 mm aortasegmenter, som er rett før sammentrekningskraften når et platå. Årsaken til bruk av submaksimal konsentrasjon av fenylefrin er å unngå problemer knyttet til aortavevsmetning eller desensibilisering til vasokonstriktivagonisten. - La den PE-induserte kontraksjonskurven nå et platå for spenningsutvikling (kraft) (figur 5).
- På et platå av spenningsutvikling til fenylefrin, utfør acetylkolindose-responskurven ved å legge til 5 μL økende doser acetylkolinarbeidsløsninger i 3 minutters intervaller for å etablere endelige konsentrasjoner av acetylkolin i myografkammeret som følger: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM og 1 μM (figur 6).
MERK: Etter å ha tilsatt hver dose acetylkolin, vent i minst 3 minutter (for spenningen å nå et platå) før du legger til neste dose. - Ved hvert trinn, pipetter acetylkolin lager løsning inn i kammeret svært sakte og langt fra aortastene for å unngå vevsforstyrrelser.
- Etter å ha fullført dose-respons-eksperimentet, tøm kamrene og vask aortasegmentene med varm og luftet HEPES-PSS-løsning 3x for å fjerne eventuelle gjenværende rester av legemidlet.
- Hvil vevet i 30 minutter før du starter de neste eksperimenttrinnene. Levedyktigheten til aorta kontrolleres før hvert eksperimentelt trinn ved bruk av HEPES-PSS høy K + -løsning. Hvis alle forberedelses- og eksperimentelle trinn følges riktig, vil aortavevets levedyktighet forbli den samme i løpet av hele eksperimentet (4-6 timer).
7. Effekter av generelle hemmere av NO-produksjon på endotelmediert vasorelaxasjon
- Bruk samme aortavev for denne delen av forsøket etter forsiktig vask og hvile segmentene i minst 30 minutter.
MERK: Bruk hviletiden på 30 minutter til å klargjøre en 100 mM arbeidsløsning av N-nitro-L-argininmetylester (L-NAME) i dobbeltdestillert vann og hold løsningen på is i løpet av forsøket. - Etter å ha hvilt aortasegmentene i 30 minutter, tøm kamrene og tilsett frisk, varm, høy K + (60 mM KCl) løsning til hvert kammer.
MERK: Det er viktig at aortavevet for hver del av forsøket utfordres med en høy K + -løsning minst en gang. Den registrerte sammentrekningstopptoppen vil bli brukt til å normalisere dataene som samles inn under den delen av eksperimentet. - Tøm kamrene igjen så snart sammentrekningsresponsen på høy K + -løsning når et platå og vask vevet med HEPES-PSS-løsning 3x.
- For å vurdere bidraget fra NO-produksjon til den observerte acetylkolininduserte vasorelaksasjonen (se avsnitt 6.), preinkuberer du på dette stadiet aortasegmentene med en generell hemmer av NO-produksjon (L-NAME) ved å tilsette 10 μL av den fremstilte 100 mM arbeidsstamløsningen av L-NAME til hvert myografkammer (inneholdende 5 ml bufferløsning) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 200 μM i hvert myografkammer.
MERK: L-NAME er en ikke-selektiv og potent hemmer av alle isoformer av NOS (et enzym som er ansvarlig for NO-produksjon), og derfor anses det som et effektivt verktøy for å blokkere produksjonen av NO i blodkarveggen9. - La aortasegmentene hvile i løpet av tiden før inkubasjon med L-NAME (30 min).
- Ikke vask på dette tidspunktet.
- Uten å fjerne L-NAME, legg til submaksimal dose fenylefrin (10 μM sluttkonsentrasjon) til kammeret for å indusere aortakontraksjon.
MERK: På grunn av den hemmende virkningen av L-NAME på endogen NO-produksjon, vil den nyregistrerte toppen for fenylefrinindusert aortakontraksjon være mye høyere enn den opprinnelige toppen som ble registrert før inkubering av vevet med L-NAME. Dette forventes på grunn av L-NAME sin effekt på basal NO-produksjon i aortaveggen, noe som fører til høyere kraftproduksjon (på grunn av høyere kontraktil kraftgenerering av glatt muskulatur). - Vent til den fenylefrininduserte kontraksjonskurven når et platå for utvikling av spenning (kontraktil kraft).
- På dette tidspunktet legger du acetylkolin til myografkammeret for å oppnå en endelig konsentrasjon på 500 nM (dette er den submaksimale konsentrasjonen av acetylkolin som ble etablert under forsøkene beskrevet i avsnitt 5. i protokollen).
- Vent noen minutter med å registrere eventuelle endringer i styrkeutviklingen til det dannede platået er stabilt (figur 7).
MERK: På grunn av den hemmende virkningen av L-NAME på endotellagets evne til å produsere NO som respons på acetylkolin, forventes det ikke å se noen endringer i registrert kraftgenerering som respons på fenylefrin, da aortaendotelet NOS (eNOS) ikke er i stand til å generere NO som respons på acetylkolinapplikasjon. - Tøm kamrene og vask vevet med varm, luftet HEPES-PSS-løsning 3x.
8. Bidrag av endotellaget til aorta vasorelaxation
- For å understreke endotellagets rolle i aortavasorelaksasjon, test acetylkolinindusert vasorelaksasjon i endotel-denuderte aortasegmenter, hvor endotellagene fjernes.
- Plasser myografkammeret under mikroskopet og pass forsiktig en liten ledning (den samme ledningen som brukes til trådmyografi kan brukes her) gjennom lumen i aorta. Beveg ledningen forsiktig gjennom lumen (forsiktig sirkulær bevegelse) i en kort periode. Dette er nok til å fjerne endotelet eller intima.
- Skjær aorta i 2 mm aortaringer og monter disse ringene på myografkammeret som beskrevet tidligere.
- Sett den optimale spenningen på 6 mN og la vevet hvile i 30 minutter i luftet, varm HEPES-PSS-buffer
- På slutten av 30 minutters likevektsperiode, tøm kamrene og tilsett 5 ml frisk, varm, luftet HEPES-PSS-løsning til hvert kammer.
- Null kraften for alle myografkamre ved å vri mikrometeret mot klokken.
- Roter mikrometeret sakte mot klokken for å øke avstanden mellom pinnene til den registrerte kraften når ønsket optimal spenning for museaorta (6 mN for C57BL / 6J museaorta). Hvil vevet i ytterligere 15-20 minutter ved optimal spenning (6 mN).
- Tøm kamrene 1 ganger mer før du tilsetter 5 ml høy K + -løsning til hvert kammer.
- Tøm kamrene igjen så snart sammentrekningsresponsen på høy K + -løsning når et platå og vask vevet med HEPES-PSS-løsning 3x. Hvil vevet i 15-20 minutter
- Forkontrakt aortasegmentene med vasokonstriktormiddelet fenylefrin (10 μM endelig konsentrasjon i kammeret).
MERK: På grunn av fjerning av endotelet reduseres den basale NO-produksjonen i aortaveggen betydelig; Derfor forventes toppen for fenylefrinindusert sammentrekning (toppen av kraftgenerering) å være høyere i aortavev som mangler endotellaget. - Når fenylefrin-indusert kraft når et platå, legg til sub-maksimal konsentrasjon av acetylkolin til myografkammeret for å oppnå en endelig konsentrasjon på 500 nM.
MERK: Hvis fjerningen av endotellaget gjøres riktig, vil det ikke være noen endringer i den registrerte fenylefrininduserte kraften, da den acetylkolininduserte NO-produksjonen av endotelet vil ha blitt redusert på grunn av fjerning av endotellaget. Det registrerte sporet vil være svært likt det som observeres i nærvær av L-NAME (avsnitt 7.). - Vent i 3 minutter for å sikre at det registrerte platået for fenylefrinindusert kraftutvikling ikke endrer seg før eksperimentet avsluttes (figur 8).
MERK: Hvis anvendelsen av acetylkolin forårsaker noen nedgang i fenylefrin-indusert sammentrekning mens i platået, er dette en indikasjon på at endotellaget ikke er helt fjernet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tensometriske småkammermyografiprotokollen som er forklart her, er standardmetoden for måling av vaskulær reaktivitet i små og store arterier og tillater samtidige målinger av vaskulær reaktivitet i opptil fire blodkarsegmenter fra samme eksperimentelle lille laboratoriedyr. I denne rapporten bruker vi spesifikt systemet til å måle endotelfunksjonen i den isolerte museaorta (figur 1). I denne protokollen er isolerte aortasegmenter montert på et lite orgelkammer (figur 2) mellom to små pinner i rustfritt stål (figur 3). Myografikammeret kan holde opptil 8 ml bufferløsning og gi et semi-fysiologisk miljø for de isolerte karene i løpet av forsøkene. Det er svært viktig at levedyktigheten til hvert isolerte segment testes og verifiseres før hvert eksperiment. Standardprotokollen for å etablere integriteten og levedyktigheten til hvert isolerte fartøysegment er å utfordre vevet med en høy konsentrasjon av kaliumklorid for å indusere depolarisering av glatt muskelmembran. I scenariet at det isolerte fartøyet er sunt og responsivt, vil vi kunne registrere kontraktil kraftgenerering på displayet (figur 4). Toppen av den registrerte kraften brukes senere til å normalisere kraftgenereringen for det samme segmentet som svar på agonistene som ble brukt under protokollen (f.eks. Fenylefrin). For å måle endotelmediert vasorelaxasjon er det nødvendig å pre-kontrakt aortavevet med sub-maksimal konsentrasjon (10 μM) av fenylefrin, noe som forårsaker glatt muskelmediert sammentrekning og kraftgenerering (figur 5). Når fenylefrinindusert sammentrekning når et platå (figur 6), påføres økende doser acetylkolin i flere trinn for å oppnå maksimal vasorelaxasjon i det isolerte segmentet (figur 6). Nivået på fartøyavslapping er en indirekte måling av endotelmediert nitrogenoksidproduksjon. For ytterligere å bekrefte at acetylkolinindusert vasorelaksasjon i aortaringer skyldes produksjon av nitrogenoksid, blir aortasegmenter forhåndsbehandlet med en generell hemmer av nitrogenoksidproduksjon (200 μM av L-NAME) i 30 minutter før fenylefrinapplikasjon. Som vist i figur 7, er L-NAME i stand til å fullstendig blokkere acetylkolinindusert vasorelaxasjon i pre-kontrahert aorta, fremhever det faktum at acetylkolin induserer aorta vasorelaxation gjennom økende nitrogenoksid produksjon. På den annen side blokkerer fjerning av endotellaget fra aortasegmentene også acetylkolinindusert vasorelaxasjon, noe som understreker hvilken rolle endotelet spiller i blodkaravslapping (figur 8).
Figur 1: Grovt anatomisk syn på hjertet, aortarot og synkende aorta isolert fra en 6 måneder gammel kontrollmus. Etter å ha fjernet ribbeholderen fra musen, isoleres hjertet og aorta fra ribbeholderen og overføres til en ren silikonelastomerbelagt petriskål. Før du isolerer aorta, er det viktig å fjerne alt fett og bindevev og eventuell blodpropp fra lumen i aorta. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Et representativt bilde av et kammer i myografenheten som viser monteringspinnene på 200 μm. Som vist er de to pinnene inne i myografkammeret knapt rørende. Før du bruker kammeret, er det viktig å sørge for at pinnene er riktig justert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forankring av aortasegmentene på myografkammeret. Et 2 mm museaortasegment isolert fra en 6 måneder gammel C57BL/6-mus holdes av to pinner inne i et myografkammer. Dette oppnås ved å skyve aorta forsiktig på de to monteringspinnene ved hjelp av tang. Den røde stiplede boksen viser det innzoomede bildet av 2 mm aortasegmentet som er montert mellom to pinner inne i myografkammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Aortakontraksjon på grunn av depolarisering av glatt muskelmembran. Representativt bilde som viser sporet for museaortakontraksjon (kraftgenerering) som respons på en høy konsentrasjon av K + (60 mM KCl) som ville indusere depolarisering og sammentrekning av glatt muskelmembran i det mediale laget av aorta. Påføringen av høy K + -løsning etterfølges umiddelbart av tre påfølgende vasker ved bruk av varm, luftet HEPES-PSS-løsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Aortakontraksjon som respons på det vasokonstriktive middelet fenylefrin. Representativt myografspor som viser kraftgenerering (kontraksjon) av aortaringen som respons på submaksimal konsentrasjon av fenylefrin (10 μM). Som vist, når toppen av fenylefrin-indusert sammentrekning til slutt et platå. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Dose-respons-effekter av acetylkolin på den prekontraktuelle aortaringen. Representativt myografspor som viser dose-respons (50 pM-1 μM) vasodilatorisk effekt av vasodilator-nevrotransmitteren acetylkolin på en 2 mm prekontraktuell aortaring. Aortaringen er pre-kontrahert med 10 μM fenylefrin før påføring av acetylkolin. Den første dosen av acetylkolin tilsettes når fenylefrinindusert spenning når et platå. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Effekter av en generell hemmer av NO-produksjon (L-NAME) på endotelmediert vasorelaxasjon i museaorta. Representativt myografspor som viser at preinkubering av aortasegmenter med en generell hemmer av NO-produksjon (L-NAME, 200 μM sluttkonsentrasjon) blokkerer acetylkolinindusert vasodilatasjon i en prekontrahert aortaring. Dette skyldes endotelets inhibering av NO-produksjon på grunn av den hemmende virkningen av L-NAME på eNOS. Acetylkolin ble tilsatt til det prekontraktuelle aortasegmentet ved submaksimal konsentrasjon på 500 nM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Effekter av mekanisk fjerning av endotel på endotelmediert vasorelaxasjon i museaorta. Representativt myografspor som viser at fjerning av endotelet fra aortasegmenter ved bruk av tråddenudasjon blokkerer acetylkolinindusert vasodilatasjon i en prekontrahert aortaring. Dette skyldes inhibering av endotelmediert vasorelaxation. Acetylkolin ble tilsatt til det prekontraktuelle aortasegmentet ved submaksimal konsentrasjon på 500 nM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innen vaskulær biologi er sterkt avhengig av verktøy som hjelper forskere til å vurdere den funksjonelle og strukturelle integriteten til blodkarveggen. Det krever også spesiell oppmerksomhet på de direkte og indirekte interaksjonene mellom de tre lagene av blodkar: intima, media og adventitia. Blant disse tre lagene dannes intima av et monolag av endotelceller og har en svært viktig funksjon i regulering av vaskulær helse og hemostase.
Det er godt etablert at enhver skade på endotellaget kan påvirke dets evne til å frigjøre NO og andre vasodilatoriske faktorer negativt, noe som fører til dysregulering av vaskulær funksjon, som observeres i forskjellige vaskulære lidelser som aterosklerose, aneurisme og vaskulitt10,11,12. For å forstå de underliggende mekanismene som styrer normal endotelfunksjon og vurdere endotelets vasodilatoriske funksjon og integritet i vaskulærveggen, er det viktig å bruke et standard eksperimentelt system som etterligner de in vivo fysiologiske forholdene.
For store arterier, som aorta, er den lille kammer tensometriske (isometriske) myografien i stor grad anerkjent som et pålitelig verktøy som skaper de beste tilgjengelige, nær-fysiologiske forholdene for blodkaret i en ex vivo-innstilling . Systemet gjør det også mulig å opprettholde vevets levedyktighet i betydelig lang tid (opptil 6-8 timer) i laboratorieinnstillingen, noe som gjør teknikken til et verdifullt og allsidig verktøy. En annen fordel er at myografkammeret gjør at blodkarringene kan holdes og gjenbrukes for back-to-back forskjellige eksperimenter, noe som gjør det til en kostnadseffektiv tilnærming samtidig som behovet for høyt antall eksperimentelle mus reduseres. Opptil fire blodkarsegmenter kan testes samtidig ved hjelp av et firekammer myografsystem, noe som øker konsistensen samtidig som variasjoner på tvers av eksperimenter reduseres.
Ulike farmakologiske og mekaniske verktøy kan brukes til å studere funksjonen til endotellaget i blodkar. Hovedmarkøren for et funksjonelt endotel er den normale produksjonen av NO, som er kjent som det viktigste vasodilatoriske middelet produsert og frigjort av endotellaget. Endoteldysfunksjon er hovedsakelig forbundet med en signifikant nedgang i NO-produksjonen og har vist seg å være involvert i utviklingen av forskjellige vaskulære lidelser som hypertensjon, trombose og aterosklerose.
I karsengen styres NO-produksjonen hovedsakelig av endringer i blodstrøm og trykk, eller av andre intracellulære hendelser som kan føre til endringer i cytoplasmatisk kalsiumkonsentrasjon eller aktivering av signalveier som respons på hormoner og vekstfaktorer13,14. Endringer i NO-produksjon regnes som en av de tidlige og pålitelige markørene for endoteldysfunksjon, og de kan vanligvis påvises tidlig i løpet av utviklingen av kardiovaskulære lidelser. Uavhengig av sykdomsmodellen er vaskulære biologer veldig interessert i verktøy og analyser som gjør det mulig å måle endotelfunksjonen. Det er spesielt viktig at man kan skille mellom bidraget fra ulike lag i blodkaret ved hjelp av en plattform som etterligner de fysiologiske forholdene.
I en liten kammermyograf kan forskere bruke farmakologiske og mekaniske verktøy for å måle endotelfunksjonen i et tett kontrollert miljø. Inne i myografkammeret opprettes et kunstig miljø som kan støtte blodkarets normale funksjon. I et slikt kunstig miljø, siden de isolerte blodkarsegmentene ikke støttes av det omkringliggende bindevevet og andre organer, er det viktig å bestemme den optimale passive spenningen der de isolerte segmentene kan generere maksimal mulig sammentrekning som respons på vasopressorer. Ved optimal spenning kan man måle den normale maksimale kontraktile responsen på vasokonstriktive midler som fenylefrin eller noradrenalin for å teste den strukturelle og funksjonelle integriteten til det glatte muskellaget i blodkarveggen. I laboratoriet ble det bestemt at den passive spenningen på 6 mN er en riktig spenning for 2 mm mus aortasegmenter15. Den optimale passive spenningen må imidlertid bestemmes for forskjellige typer arterier i forskjellige arter16.
I tillegg, før du utfører eksperimenter med isolerte blodkar, er det viktig å teste levedyktigheten til isolerte ringer for å sikre at de oppfyller inklusjons- og eksklusjonskriteriene for levedyktig og brukbart vev. Dette oppnås vanligvis ved å utsette de isolerte ringene for K+ -løsning med høy konsentrasjon (60 mM KCl). Dette resulterer i depolarisering av glatt muskelmembran på grunn av åpning av spenningsstyrte kalsiumkanaler (VGCC), noe som fører til glatt muskelkontraksjon og aortavasokonstriksjon. Denne metoden brukes til å validere levedyktigheten til aortasegmentene før disse segmentene brukes til videre eksperimenter.
På den annen side kan vasodilaterende midler som acetylkolin brukes til å teste de funksjonelle egenskapene til endotellaget. Hvis endotellaget er intakt og funksjonelt, kan en submaksimal konsentrasjon av acetylkolin indusere avslapning i et prekontrungert blodkarsegment17. Størrelsen på acetylkolinindusert relaksasjon er en indikasjon på nivået av NO-frigjøring fra endotellaget. Eventuell skade på endotellaget (mekanisk eller funksjonelt) vil ha innvirkning på NO-produksjonen og fartøyets vasodilatoriske respons. I denne protokollen viser de oppgitte dataene at acetylkolin kan indusere avslapning i den prekontraktuelle museaorta på en doseavhengig måte, med submaksimal avslapning oppnådd ved den endelige konsentrasjonen på 500 nM (figur 6).
I noen eksperimenter er forskere interessert i å måle glatt muskel direkte respons på vasodilatoren NO. Siden fokuset på slike eksperimenter bare er på glatt muskelfunksjon, er det en protokoll på plass som vil tillate forskere å omgå endotelbidraget ved å fjerne (denudere) endotellaget fra blodkarsegmentet. Endotelet kan fjernes ved hjelp av forskjellige metoder, inkludert luft, rulling mellom fingrene eller fjerning med ledning. I slike eksperimentelle innstillinger blir det denuderte blodkaret (uten endotellag) utsatt for NO-givere som nitroglyserin og natriumnitroprussid. Dette gjør det mulig å avgjøre om den glatte muskelcykliske GMP-proteinkinase G-signalveien som reagerer på NO, er intakt og funksjonell 7,18. Dette manuskriptet forklarte hvordan fjerning av endotellaget i det isolerte aortasegmentet fullstendig blokkerer acetylkolinvasodilatoriske effekter, og fremhevet viktigheten av NO-frigjøring i blodkaravslapping og vasodilatasjon (figur 8).
Mens tråd- og tensometriske myografteknikker har stor nytte i vaskulære biologiske eksperimenter, er det verdt å merke seg de potensielle begrensningene. Spesielt har det tensometriske systemet vevsstørrelsesbegrensninger (dvs. mindre vaskulatur). I tillegg tillater ex vivo naturen til denne teknikken ikke manipulering av intraluminalt trykk og strømning for mer presis etterligning av in vivo vaskulær funksjon og hemodynamiske parametere. Trykkmyografoppsett vil faktisk redegjøre for disse variablene og simulere vaskulær dynamikk i sanntid, samtidig som det tillater bruk av mindre motstandsarterier. I tillegg kan trådmyografeksperimenter ikke fullt ut replikere fysiologiske forhold eller nøyaktig modellere samspillet mellom sirkulerende blod, karvegger og omkringliggende vev, som også spiller viktige roller i regulering av vaskulær funksjon i kroppen.
Uavhengig av den eksperimentelle protokollen som ble brukt i myografieksperimentene eller den valgte vasokonstriktoren / vasodilatoren i forsøket, gir det lille kammermyografisystemet en pålitelig, reproduserbar og stabil semi-fysiologisk plattform for måling av blodkarreaktivitet og funksjonell integritet. Selv om fokuset i denne rapporten bare var på grunnleggende måling av endotelfunksjon, kan myografisystemet brukes til å vurdere mange andre funksjonelle egenskaper til blodkaret, for eksempel stress / belastningsforholdet, vaskulærveggstyrke, bruddpunkt og passiv og aktiv sammentrekning for å nevne noen. Dette fremhever verdien av myografsystemet som et pålitelig verktøy innen vaskulær biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra National Institutes of Health (R15HL145646) og Midwestern University College of Graduate Studies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
References
- Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Lerman, A., Zeiher, A. M.
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Galley, H. F., Webster, N. R.
- Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
- Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
- Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
- Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
- Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
- Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958 (2021).
- Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157 (2021).
- Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
- Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
- Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
- Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
- Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
- Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412 (2021).
