Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von Drosophila melanogaster , die eNpHR2.0 oder ReaChR-Opsine im Herzen exprimieren, für die OCT-Bildgebung und die optogenetische Herzschrittbildung. Detaillierte Anweisungen für die Drosophila OCT-Bildgebung und Herzschlagmodulation, einschließlich der Simulation von wiederherstellbarem Herzstillstand, Bradykardie und Tachykardie bei lebenden Tieren in verschiedenen Entwicklungsstadien, werden berichtet.
Die Verwendung von Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) als Modellorganismus hat in vielen Bereichen der biologischen Wissenschaft erhebliche Fortschritte erzielt, von zellulären Organisations- und genomischen Untersuchungen bis hin zu Verhaltensstudien. Aufgrund der gesammelten wissenschaftlichen Erkenntnisse wurde Drosophila in den letzten Jahren auf das Gebiet der Modellierung menschlicher Krankheiten, einschließlich Herzerkrankungen, gebracht. Die vorgestellte Arbeit beschreibt das experimentelle System zur Überwachung und Manipulation der Herzfunktion im Kontext eines ganzen lebenden Organismus mit rotem Licht (617 nm) und ohne invasive Verfahren. Die Kontrolle über das Herz wurde mit optogenetischen Werkzeugen erreicht. Die Optogenetik kombiniert die Expression lichtempfindlicher transgener Opsine und deren optische Aktivierung, um das interessierende biologische Gewebe zu regulieren. In dieser Arbeit wurde ein kundenspezifisches integriertes optisches Kohärenztomographie (OCT) Bildgebungs- und optogenetisches Stimulationssystem verwendet, um das funktionierende D. melanogaster Herz im 3. Larven- und frühen Puppenentwicklungsstadium zu visualisieren und zu modulieren. Das duale genetische System UAS/GAL4 wurde verwendet, um Halorhodopsin (eNpHR2.0) und rotverschobenes Kanalrhodopsin (ReaChR) zu exprimieren, speziell im Fliegenherzen. Einzelheiten zur Vorbereitung von D. melanogaster für die Live-OCT-Bildgebung und zur optogenetischen Stimulierung werden bereitgestellt. Eine im Labor entwickelte Integrationssoftware verarbeitete die Bilddaten, um visuelle Präsentationen und quantitative Merkmale der Drosophila-Herzfunktion zu erstellen. Die Ergebnisse zeigen die Machbarkeit der Einleitung von Herzstillstand und Bradykardie, die durch eNpHR2.0-Aktivierung verursacht werden, und der Durchführung von Herzschritten bei ReaChR-Aktivierung.
Ende 2010 wählte die Fachzeitschrift Nature Methods die Optogenetik zur Methode des Jahres1. Der Einsatz lichtregulierter genetischer Werkzeuge (transgener Opsine) zur Steuerung von biologischem Gewebe von Interesse mit bisher unerreichter Präzision und Geschwindigkeit öffnete eine Schleuse für neue Anwendungen. Bis heute gehört die Mehrheit der Errungenschaften den Neurowissenschaften. Die Technologie wurde als neue Methode zur präzisen Kontrolle einzelner Neuroneneingeführt 2 und hat Entdeckungen im Bereich der kognitiven Funktionen lebender Organismen3 gemacht. Neurowissenschaftler zeigten von Anfang an die Fähigkeit, das Verhalten des gesamten Organismus zu modulieren. Die Expression und Lichtaktivierung von ChR2-Opsin in dopaminergen Neuronen von Mäusen verursachte ihre Aktivierung und war ausreichend, um die Verhaltenskonditionierung voranzutreiben4. Die optogenetische Hemmung einer Untergruppe von Neuronen, die Halorhodopsin NpHR2.0 enthielten und an den epileptischen Fokus des Nagetiergehirns abgegeben wurden, führte zu einer Abschwächung elektroenzephalographischer Anfälle5.
Optogenetische Anwendungen in der Kardiologie entwickeln sich stetig6. ChR2 wurde erfolgreich in Kardiomyozyten-Zellkulturen und in Mäusen exprimiert; Die Herzfrequenz wurde durch blaue Lichtblitze durchgeführt (durchgeführt unter Verwendung einer implantierten Faser bei lebenden Tieren)7. Im Zebrafisch wurde ChR2 exprimiert und verwendet, um die Schrittmacher-Herzregion zu identifizieren; NpHR-Aktivierung induzierte Herzstillstand8. Die optogenetische kardiale Stimulation hat das einzigartige Potenzial für die Entwicklung neuer Pacing- und Resynchronisationstherapien9. Versuche, ein autogenes Arrhythmie-Abschlusssystem zu etablieren, wurden kürzlich ebenfalls berichtet10.
Umfangreiche Forschung und die Entwicklung neuer therapeutischer Therapien erfordern die Anwendung verschiedener Modellsysteme, von der Zellkultur bis hin zu Säugetieren. Das Herz eines Wirbeltieres ist ein sehr komplexes Organ. Kardiomyozyten (CM) machen ein Drittel aller Herzzellen aus; Andere Zellen umfassen Neuronen, vaskuläre glatte Muskelzellen und nicht erregbare Zellen (dh Endothelzellen, Fibroblasten und Immunzellen). Die Erforschung der CM-Zellkultur beschränkt die Translation der erhaltenen Ergebnisse auf humanmedizinische Anwendungen. Die genetischen Manipulationen von Säugetiermodellorganismen sind begrenzt und zeitaufwendig. Kleinere wirbellose Modelle haben viele Vorteile; Ihr Herz-Kreislauf-System trägt alle wesentlichen histologischen Elemente. Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) ist ein einfaches und leistungsfähiges genetisches Modellsystem, um die Rolle von Genen zu untersuchen, die mit menschlichen Krankheiten, einschließlich Herzerkrankungen, assoziiert sind11,12,13. Als kurzlebige Tiere stellen Fruchtfliegen eine hervorragende Möglichkeit dar, alters- oder krankheitsabhängige Veränderungen der Herzfunktion zu modellieren, die lebenslang verfolgt werden können14,15,16,17. Die Herzröhre der Fruchtfliege befindet sich auf der dorsalen Seite ihres Körpers innerhalb von 200 μm von der Nagelhautoberfläche, so dass sichtbares bis nahinfrarotes Licht die Herzröhre erreichen kann. Dieses anatomische Merkmal ermöglicht eine nicht-invasive optische Stimulation des Drosophila-Herzens mit vorhandenen optogenetischen Werkzeugen.
Zur Überwachung des Drosophila-Herzens wurde ein kundenspezifisches optisches Kohärenztomographie (SD-OCT) im Spektralbereich mit einem integrierten Rotlicht-LED-Anregungsmodul entwickelt18. Morphologische und rhythmische Veränderungen in einem relativ einfachen Fruchtfliegenherz können mit dieser nicht-invasiven biomedizinischen Bildgebungstechnologie 12,19,20,21 leicht analysiert werden. Mit verbesserter optischer Schnittleistung und räumlicher Auflösung im Mikrometerbereich wurde OCT erfolgreich eingesetzt, um die Struktur des Drosophila-Herzens in verschiedenen Entwicklungsstadien zu untersuchen und zu überwachen, einschließlich der 3. Instar-Larve und der frühen Puppe18. Dieses System ermöglicht auch die gleichzeitige Überwachung und Stimulation des Herzzustandes der Drosophila im intakten Tier. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des OAT-Systems. Das SD-OCT-System verwendet eine Superlumineszenzdiode (SLD) als Lichtquelle (Mittenwellenlänge: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, siehe Materialtabelle). Mit einem 10-fachen Objektiv kann das OCT-Bildgebungssystem eine axiale Auflösung von ~4,4 μm in Luft und ~3,3 μm im Gewebe und eine laterale Auflösung von ~2,8 μm erreichen, genug, um feine Details der Fliegenherzstrukturen aufzulösen18,22. Interferenzsignale des reflektierten Lichts vom Referenzarm und vom Probenarm werden mit einem Spektrometer mit einer 2048-Pixel-Zeilenkamera erfasst (max. Zeilenrate: 80 kHz, siehe Materialtabelle). Die gemessene Systemempfindlichkeit beträgt ~95,1 dB. Jeder B-Mode-OAT-Scan erzeugt ein Querschnittsbild in der xz-Bildebene. Wiederholte B-Mode-Bilder werden am selben Ort aufgenommen, um M-Mode-Bilder zu erstellen, die das schlagende Herz für über ~ 30 s 18,22,23 erfassen. Die Bildrate für die M-Mode-Bildgebung beträgt ~125 Bilder / s, genug, um die Herzschlagdynamik der Fruchtfliegen zu erfassen.
Zur optogenetischen Regulation der Drosophila-Herzfunktion ist ein Beleuchtungsmodul mit einer 617 nm LED-Lichtquelle in den Probenarm des SD-OCT-Systems integriert. Das Stimulationslicht wird auf einen Punkt mit einem Durchmesser von ~2,2 mm auf der Probenoberfläche fokussiert, an der gleichen Position wie der Bildfokuspunkt. Eine speziell geschriebene Software wird verwendet, um den Beleuchtungsmodus (Lichtintensität, Pulsbreite und Tastverhältnis) zu steuern, die Lichtimpulsstimulationsfrequenz anzupassen und die LED-Modulbeleuchtung und die M-Mode-OCT-Bildgebungserfassung zu synchronisieren22.
Neuere Publikationen beschrieben das transgene System Drosophila, bestehend aus raumzeitlich regulierten ChR2-, ReaChR- und eNpHR2.0-Opsinen unter Verwendung des UAS/GAL4-Gensystems. Die erhaltenen Ergebnisse haben die Fähigkeit gezeigt, Herzstillstand und Bradykardie zu initiieren, die durch Rotlichtaktivierung von eNpHR2.0 verursacht werden, und eine höhere Frequenz, die durch die Aktivierung von ChR2 mit blauem Licht verursacht wird. Ähnliche Stimulierungsexperimente wurden mit einem anderen Kanalrhodopsin, ReaChR, durchgeführt, das durch Rotlichtbeleuchtung22,23,24 induzierbar ist. Die Opsinexpression in allen beschriebenen Experimenten wurde durch 24B-GAL4 gesteuert, wobei die Opsinexpression in einem breiten Spektrum von Geweben, einschließlich Kardiomyozyten und umgebenden Muskelzellen, beobachtet wurde. In der aktuellen Studie wurde 24B-GAL4 durch einen Hand-GAL4-Treiber ersetzt, um eine herzspezifische eNpHR2.0- und ReaChR-Opsin-Expression zu erreichen.
Insgesamt zeigen die vorgestellten experimentellen Ergebnisse einen wiederherstellbaren Herzstillstand und induzierbare Bradykardie und Tachykardie-Herzerkrankungen. Ein detailliertes Protokoll mit Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Erstellung transgener Drosophila-Modelle und zur Durchführung simultaner OCT-Bildgebung und optogenetischer Stimuling-Experimente an lebenden Tieren wird bereitgestellt.
Im Vergleich zu unseren früheren Berichten, in denen die Expression von Opsinen nicht nur im Herzen, sondern auch im umgebenden Muskelgewebe gesteuert wurde, berichtet die vorliegende Arbeit über einen herzspezifischen Treiber, Hand-GAL4. Diese neue Hand> Opsin-Genkonfiguration , die für die optogenetische Herzregulation verwendet wird, bestätigt die zuvor berichteten Ergebnisse und etabliert ein besseres kardiovaskuläres Drosophila-Forschungsmodell .
Die Medienvorbereitung ist essentiell für den Erfolg der Experimente. Opsinproteine benötigen einen Liganden, all-trans retinal (ATR), um zu funktionieren28. Fliegen produzieren nicht genug ATR, daher muss ATR zu den Fliegenmedien ergänzt werden. In dieser Studie wurde das zuvor berichtete Instant-Food durch Semi-Defined media29 ersetzt. Die neue Rezeptur von ATR-haltigen Medien wurde eingeführt, um eine gleichmäßige Verteilung der ATR zu gewährleisten. ATR ist in Wasser nicht löslich; Wenn ethanolbasiertes 100 mM ATR-Material zu wasserbasierten Medien hinzugefügt wird, wird es durch Wirbeln der Fläschchen mit warmen halbdefinierten Medien dispergiert. Außerdem wurde die zuvor berichtete ATR-Konzentration von 10 mM für eNpHR2.0 und 3 mM für ReaChR22 auf eine Endkonzentration von 1 mM für beide reduziert. Diese Konzentration ist ausreichend, um eine ordnungsgemäße eNpHR2.0- und ReaChR-Funktion zu gewährleisten.
Ein wesentlicher Bestandteil des experimentellen Erfolgs ist die verbesserte Datenverarbeitung mit FlyNet 2.027. Das Labor hat diese Software weiterentwickelt, um sowohl die Recheneffizienz als auch die Genauigkeit des automatisierten Fliegenherz-Segmentierungsalgorithmus zu verbessern. Die von dieser Software erzeugten Querschnittsmasken werden verwendet, um physiologische Daten von Drosophila wie fraktionierte Verkürzung und Herzwandgeschwindigkeit abzuleiten. Dieser Ansatz hat eine effiziente Datenanalyse mit minimaler menschlicher Überwachung ermöglicht, wodurch es schneller und zuverlässiger wird, die Herzfunktion für große Fliegenherz-Bildgebungsdatensätze zu charakterisieren.
Myokardinfarkt bleibt die häufigste Todesursache, und Myokardischämie trägt zu zwei Dritteln aller Fälle von Herzinsuffizienz bei, die sich schnell zu den Hauptursachen für Mortalität und Morbidität in den Vereinigten Staaten entwickelt30. Die Entwicklung neuer Therapeutika und Medizinprodukte erfordert ein tiefes Wissen über die Mechanismen von Herzerkrankungen auf physiologischer und biochemischer Ebene. Diese Ziele können mit Hilfe von Modellorganismen erreicht werden. D. melanogaster hat sich als eines der zuverlässigsten und effizientesten Modelle 31,32,33,34,35 etabliert. Diese Arbeit hat die simulierten Drosophila-Herzerkrankungsmodelle hervorgebracht, die durch einen nicht-invasiven optogenetischen Ansatz induziert wurden. Die Entwicklung nicht-invasiver optischer Herzschrittmachertechnologien bildet die Grundlage für die Entwicklung einer Alternative zu herkömmlichen elektrischen Herzschrittmachern. Die Verwendung von OCT zur Beobachtung der Herzfunktion in Echtzeit ermöglicht es Studien, die relevante Herzphysiologie in Drosophila-Modellen für fortgeschrittene Untersuchungen, einschließlich des Screenings von Medikamentenkandidaten, genau zu charakterisieren. Die OCT-Bildgebung hat eine Eindringtiefe von ~ 1 mm, was für Drosophila-Herzstudien gut funktioniert, aber ihre Verwendung zur Charakterisierung der Herzfunktion in größeren Tiermodellen einschränkt. Darüber hinaus stellt die direkte Übertragung der Drosophila-Forschung auf Säugetiermodelle eine Herausforderung dar. Neue optogenetische Werkzeuge müssen entwickelt werden, um die Empfindlichkeit der Opsine zu verbessern und sie auf verschiedene Modellsysteme wie Zebrafische, Mäuse, Ratten und menschliche Herzorganoide für die kardiovaskuläre Forschung zu übertragen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Andrey Komarov, Yuxuan Wang und Jiantao Zhu für ihre Unterstützung bei der Datenanalyse und den Mitgliedern des Zhou-Labors für ihre wertvollen Diskussionen. Die Arbeit in Dr. Zhous Labor wurde durch einen Start-up-Fonds der Washington University in St. Louis, die National Institutes of Health (NIH) Grants R01-EB025209 und R01-HL156265 sowie den Clayco Foundation Innovative Research Award unterstützt.
All-trans retinal | Cayman Chemicals | 18449 | |
Bacto Peptone | Gibco | 02-10-2025 | |
BioLED Light Source Control Module, 4-channel | Migtex Systems | BLS-SA04-US | Part of the optogenetic stimulation module |
Broadband Light Source Module | Superlum | cBLMD-T-850-HP | Part of the SD-OCT imaging system |
Cobra-S 800 OCT Spectrometers | Wasatch Photonics | CS800-840/180-80-OC2K-U3 | Part of the SD-OCT imaging system |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professtional | 34155 | tissues |
Drosophila agar | Genesee Scientific | 66-103 | |
Drosophila culture bottles | Genesee Scientific | 32-131 | |
FlyNet 2.0 Software | Z-Lab | Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab | |
High-Power LED Collimator Sources | Migtex Systems | BLS-LCS-0617-03-22 | Part of the optogenetic stimulation module |
Inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-106 | |
Microscope slides | AmScope | BS-72P | |
Narrow plugs for Drosophila culture | Genesee Scientific | 59-200 | |
Narrow vials for Drosophila culture | Genesee Scientific | 32-116SB | |
Permanent double-sided tape | Scotch | ||
Plugs for Drosophila bottles | Genesee Scientific | 59-194 | |
Propionic Acid | Sigma | P1386-1L | |
SD-OCT control software | Z-Lab | Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab | |
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system | Z-Lab | Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM) | |
Sucrose | Carolina | 89-2871 | |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 41752 | eNpHR2.0 transgenic line |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 53748 | ReaChR transgenic line |
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 48396 | Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment |
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock #6658 | GFP reporter line |
Yeast extract | Lab Scientific bioKEMIX | 978-907-4243 |