Summary
Posttranskripsjonelle modifikasjoner av RNA representerer et undervurdert lag av oversettelsesregulering som nylig har vært knyttet til plastisitet i sentralnervesystemet. Her er prøvepreparering og flytende kromatografi-tandem massespektrometri tilnærming beskrevet for samtidig karakterisering av mange RNA-modifikasjoner i enkelte nevroner.
Abstract
Posttranskripsjonelle modifikasjoner (PTMer) av RNA representerer en undervurdert mekanisme involvert i regulering av oversettelse i sentralnervesystemet (CNS). Nyere bevis har knyttet spesifikke nevronale RNA-modifikasjoner til læring og minneparadigmer. Dessverre er konvensjonelle metoder for påvisning av disse epitranskriptomiske egenskapene bare i stand til å karakterisere svært rikelige RNA-modifikasjoner i bulkvev, og utelukker vurderingen av unike PTM-profiler som kan eksistere for individuelle nevroner innenfor de aktiverte atferdskretsene. I denne protokollen beskrives en tilnærming – en-nevron RNA-modifikasjonsanalyse ved massespektrometri (SNRMA-MS) – for samtidig å oppdage og kvantifisere mange modifiserte ribonukleotider i enkeltnevroner. Tilnærmingen er validert ved hjelp av individuelle nevroner av den marine mollusk, Aplysia californica, som begynner med kirurgisk isolasjon og enzymatisk behandling av store CNS ganglia for å eksponere nevroncellelegemer, etterfulgt av manuell enkelt-neuron isolasjon ved hjelp av skarpe nåler og en mikropipette. Deretter gjøres mekanisk og termisk behandling av prøven i et lite volum buffer for å frigjøre RNA fra en individuell celle for etterfølgende RNA-fordøyelse. Modifiserte nukleosider identifiseres og kvantifiseres deretter ved hjelp av en optimalisert væskekromatografi-massespektrometrimetode. SNRMA-MS brukes til å etablere RNA-modifikasjonsmønstre for enkeltstående, identifiserte nevroner fra A. californica som har kjente morfologier og funksjoner. Eksempler på kvalitativ og kvantitativ SNRMA-MS presenteres som fremhever den heterogene fordelingen av RNA-modifikasjoner på tvers av individuelle nevroner i nevronnettverk.
Introduction
Modifikasjoner i kanoniske nukleosider av RNA har blitt stadig mer anerkjent for sine utallige roller i reguleringen av proteinoversettelse. Over 150 unike RNA modifikasjoner har blitt rapportert til dags dato som spenner i kompleksitet fra metylering, heteroatom tillegg, til konjugering med cellulære metabolitter 1,2. Dette utvidede RNA-alfabetet, også kjent som epitranscriptomet, genereres av enzymatiske forfattere og er ansvarlig for å endre stabiliteten3, folde4 og oversettelseseffektivitet 5,6 av cellulære RNAer. Utvalgte RNA-modifikasjoner kan også reverseres via enzymatiske viskelær 7,8, mens andre legges til RNAs substoichiometrisk 9,10, noe som gjør et komplekst landskap av modifiserte og umodifiserte RNA-sekvenser i biologiske systemer.
Betydningen av RNA-modifikasjoner i biologisk funksjon er indikert ved ulik fordeling av modifikasjoner på tvers av forskjellige organer og vev, inkludert underregioner i sentralnervesystemet (CNS)11. Denne kjemiske heterogeniteten har vært knyttet til CNS-utvikling12, stressrespons13 og aktivitetsavhengig plastisitet14. CNS-underregionene består videre av heterogene populasjoner av celler der individuelle celler viser distinkte kjemiske profiler 15,16,17,18. Selv enkeltceller av samme type kan vise unike transkripsjoner, delvis på grunn av vevsmikromiljøet19 og stokastisk genuttrykk20. Selv om karakterisering av encellet transkripsjon er noe rutinemessig, er det imidlertid ingen analoge metoder for å etablere encellede epitranskriptomer for flere RNA-modifikasjoner. Nye tilnærminger som er i stand til å profilere fordelingen av RNA-modifikasjoner i individuelle celler er nødvendig for omfattende analyse av cellulær heterogenitet og regulatorisk påvirkning av posttranskripsjonelle modifikasjoner (PTMer) i CNS og andre biologiske systemer.
Samtidig måling av mange RNA-modifikasjoner i bulkceller/vev oppnås enkelt ved hjelp av flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) teknikker. For LC-MS/MS-analyse av modifiserte ribonukleosider ekstraheres RNA fra celler (vanligvis 103-10 6 celler), renset av nedbør og resuspensjon, og deretter fordøyes i nukleosider. Prøveblandingen som består av kanoniske og modifiserte nukleosider injiseres deretter i LC-MS-systemet for analyttseparasjon og deteksjon, noe som fører til bestemmelse av hele komplementet av RNA-modifikasjoner i en organisme 21,22,23. LC-MS/MS ble nylig brukt til å bestemme 26 RNA-modifikasjoner i CNS i den nevrobiologiske modellen Aplysia californica (A. californica). Overfloden av noen av disse epitranscriptomiske merkene viste tids- og regionavhengig dynamikk som korrelerte med atferdsendringer i dyret24. Det var imidlertid bare mulig å oppdage RNA-modifikasjoner i bulkprøver som inneholder > 103 celler på grunn av metodens begrensede følsomhet. Disse større prøvene skjulte sannsynligvis unike og funksjonelt viktige RNA-modifikasjonsprofiler av individuelle celler med befolkningsgjennomsnitt. Selv om nøye kontroll av prøveprepareringsforholdene har forbedret deteksjonsgrensene for RNA-modifikasjoner i små volumprøver 25,26,27,28, er det fortsatt behov for analytiske metoder som kan oppdage og kvantifisere flere modifiserte ribonukleotider i enkeltceller.
Denne protokollen introduserer en-neuron RNA modifikasjon analyse av masse spektrometri (SNRMA-MS), som tillater påvisning av over et dusin RNA modifikasjoner i enkelt nevroner fra CNS av A. californica29. Tilnærmingen består av kirurgisk isolasjon av enkeltstående, identifiserte celler fra store CNS ganglia etterfulgt av en optimalisert prøveprepareringsarbeidsflyt som involverer mekanisk cellelyse, RNA-denaturering og enzymatisk hydrolyse i en MS-kompatibel buffer. Identifisering og kvantifisering av posttranskripsjonsmodifiserte nukleosider oppnås deretter ved hjelp av LC-MS/MS. SNRMA-MS oppfyller et udekket behov innen RNA-modifikasjonsanalyse ved å legge til rette for anskaffelse av posttranskripsjonelle RNA-modifikasjonsprofiler for enkeltnevroner og har potensial for fremtidig anvendelse på andre celletyper.
Protocol
1. Utarbeidelse av materialer og løsninger
- Forbered kunstig sjøvann (ASW) med 460 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 22 mM MgCl2, 26 mM MgSO4 og 10 mM HEPES i vann hentet fra et strengt rensesystem. Juster pH til 7,8 ved hjelp av 1 M NaOH eller HCl. Klargjør vanligvis 1 L ASW og oppbevar ved 14 °C til bruk.
- Forbered en ASW-antibiotikaløsning med 10 000 U/ml penicillin G, 10 μg/μL streptomycin og 10 μg/μL gentamicin og oppbevar ved -20 °C. Umiddelbart før eksperimentet tiner og fortynner den frosne antibiotikabestandsløsningen 1:100 i 20-40 ml ASW. Den endelige konsentrasjonen av antibiotika i den fungerende ASW-løsningen er 100 U /ml penicillin G, 100 μg/ml streptomycin og 100 μg/ml gentamicin.
- Forbered en RNA-fordøyelsesbuffer ved å kombinere 1 μL 10 μg/μL bovint serumalbumin, 0,5 μL 0,5 μg/μL pentostatin, 0,495 μL av 2 alkaliske fosfatase i U/μL, 1 μL 0,1 U fosfodiesterase I (i 10 mM MgCl2) og 0,38 μL endonuklease fra Serratia marcescens (25 U) per prøve. Hvis du analyserer flere prøver, lag en masterblanding i et separat rør som inneholder volumet av hvert reagens multiplisert med antall prøver som skal analyseres, pluss en til for å ta hensyn til tilfeldig reagenstap fra pipetoverføringstrinn.
- Forbered flere skarpe nåler (enten glass eller metall) for manuell isolering av nevroner. Lag metallnåler internt ved elektrokjemisk etsning av wolframtråd som i30 eller kjøp dem. Forbered glassnåler fra tykke eller standard vegg borosilikatglass kapillærer (1 mm ytre diameter) ved hjelp av en mikropipettetrekker. For den nåværende metoden, hold nålespissdiameteren mellom 1-5 μm, med en nakkelengde på 100-150 μm.
MERK: Fabrikasjon av både metall- og glassnåler kan optimaliseres for å produsere verktøy som passer til forskerens individuelle behov og den spesifikke biologiske modellen som undersøkes.
2. Isolering av enkelt neuron
- Avkjøl en 0,33 M MgCl2 oppløsning til 14 °C. Bruk en 50 ml sprøyte, bedøv A. californica (150-250 g) ved å injisere MgCl2-løsningen i dyrets kroppshule. Beste resultater oppnås med 1: 3 forhold mellom løsningsvolum (ml) og dyrekroppsmasse (g). Vent ca 3 min for at dyret skal bli avslappet, og sørg for at det ikke viser kroppssammentrekninger som svar på taktil stimulering.
- Plasser dyrets ventrale side (fotside) opp i en dissekeringsbrett. Disseker dyret ved hjelp av kirurgisk saks med en stump spiss plassert mot dyret, og gjør forsiktig et langsgående kutt gjennom foten.
- Fest rostral-, kaudale og laterale sider av dyrekroppen for å eksponere de indre organene og CNS ganglia som ligger i kroppshulen. Isoler store CNS ganglia fra dyret ved kirurgisk å kutte nerver og noen bindemidler som stammer fra ganglia.
- Senk ganglia i en løsning av protease type XIV fra Streptomyces griseus (10 mg / ml i ASW-antibiotikaoppløsning) og inkuber ved 34 ° C i 30 min eller 1 time (for cerebral ganglion).
MERK: Varigheten av inkubasjon avhenger av sesong, dyrestørrelse og tilstand, samt målrettede nevroner. Isolering av noen nevroner krever lengre inkubasjon enn andre og bør bestemmes eksperimentelt. - Skyll ganglia 6x med ASW-antibiotika løsning og overfør alle ganglia til i en silikon polymerbelagt tallerken fylt med ASW-antibiotika løsning ved hjelp av en polypropylen overføring pipet som har blitt kuttet til en åpning på ~ 5 mm. Behandle røret med 1 mg/ml bovint serumalbumin i ASW for å minimere klebende ganglia til pipetten (valgfritt). Hold ganglia nedsenket i ASW til enhver tid.
MERK: Enzymatisk behandling reduserer den mekaniske stabiliteten til nevroner og omkringliggende bindevev, og som et resultat kan nevronmembraner bli skadet på grunn av eksponering for luft under gangliaoverføring. - Fest ganglia og bruk mikro saks og fine tang for å fjerne ganglion skjede. Med tilstrekkelig sterk enzymatisk behandling, bruk glass- eller metallnåler til desheathing.
- Identifiser visuelt A. californica nevroner av interesse. I dette arbeidet ble følgende celler studert: R2 i abdominal ganglion, LPl1 i pleural ganglion, metacerebralceller (MCCs) i cerebral ganglion, og B2 celler i buccal ganglion. Ta optiske bilder av alle nevrale og gangioniske preparater ved hjelp av et kalibrert mikroskop ved 20x total forstørrelse for å bestemme størrelsene og volumene til hver celletype.
- Bruk en trukket glasskapillær eller skarpe wolframnåler, og isoler forsiktig den identifiserte cellen fra bulk ganglion.
- Tegn en liten mengde (1 μL) ASW inn i en mikropipette i plast, og overfør deretter den isolerte cellen til et PCR-prøverør som inneholder 4 μL 0,365 M ammoniumacetat (pH 9,2). For blanke målinger, samle 5 μL aliquots av ASW-antibiotikaoppløsningen fra parabolen som inneholder ganglion og bland med fordøyelsesbufferen (beskrevet nedenfor).
3. Cellelys og RNA-fordøyelse for SNRMA-MS
- Lyse de isolerte nevronene ved gjentatt aspirasjon og dispensering med en mikropipette (~ 100 μm indre diameter) i 0,365 M ammoniumacetat. Noen mindre celler kan ikke umiddelbart briste; for å lyse dem, legg trykk over cellens diameter med en trukket glasskapillær.
- Bruk en termisk syklist til å varme opp prøvene med følgende temperaturprogram: 95 °C i 3 minutter, 10 °C i 3 minutter, hold ved 10 °C. Fjern prøverøret fra den termiske syklisten.
- Tilsett 3,375 μL RNA fordøyelsesbuffer for hver prøve og bland løsningen ved hjelp av en mikropipette ved å trekke ut og dispensere løsningen flere ganger. Bruk en miniatyr bentrifuge på 2700 x g i 30 s for å spinne ned eventuelle flytende dråper som klamrer seg til veggene i PCR-røret.
- Inkuber prøvene i den termiske syklisten ved 37 °C i 3 timer, etterfulgt av et tak ved 10 °C (oppvarmet lokk satt til PÅ). Umiddelbart etter at prøven er avkjølt til 10 °C, overfører du 7 μL av oppløsningen til et autosampler hetteglass utstyrt med en 250 μL innsats, og pass på at du unngår bobledannelse i autosamplerrøret.
4. Flytende kromatografi-tandem massespektrometri
MERK: Analyser enkelt-neuron-fordøye og autentiske modifiserte nukleosidestandarder ved hjelp av et LC-MS/MS-system utstyrt med en elektrosprayioniseringskilde og seksports avlederventil.
- For å forberede LC-systemet for separasjon av kanoniske og modifiserte nukleosider, likevekt en C18-kolonne (150 mm x 2,1 mm, 2,2 μm partikkelstørrelse, 120 Å pore diameter) med 99% mobil fase A (5 mM ammoniumacetat, pH 5,6) og 1% mobil fase B (60/40 mobil fase A/acetonitril (ACN)) med en strømningshastighet på 0,2 ml/min i 12 min ved 36 °C. Bruk LC-MS-løsemidler for fremstilling av mobile faser.
- Mens LC likevekter, kalibrer massespektrometeret ved å introdusere en 1 mM løsning av natriumacetat i 50/50 ACN/vann til massespektrometeret via sprøytepumpe med en strømningshastighet på 5 μL/min. Etter kalibrering kobler du LC-strømmen til massespektrometeret på nytt.
- Programmer følgende lineære gradientparametere: 1% B i 0-5 min, 5% B ved 9 min, 7% B ved 11 min, 10% B ved 13 min, 15% B ved 32 min, 40% B ved 38 min, 50% B ved 43 min, 100% B ved 50 min, 100% B på 60 min, 1% B ved 61 min, og en 12 min re-likevekt ved 1% B før neste injeksjon.
- Bruk MS-instrumentet i positiv modus med følgende parametere: kapillærspenning satt til 4500 V, tørketemperatur 275 °C, N2 tørkegass 5 L/min og forstøver gass 1 bar. Sett omkasterventilen til avfall for de første 2 min med analyse og til kilde for resten av løpet.
- Samle massespektra over et m / z-område på 110-600. Velg ioner for kollisjonsindusert dissosiasjon ved 35-40 eV over en 3 s syklustid ved hjelp av en foretrukket masseliste konstruert ved hjelp av database2 og et isolasjonsvindu på ± 0,5. Bruk aktiv ekskludering for å utelukke ioner fra fragmentering etter tre spektra.
- Angi dynamisk MS/MS-spektraoppkjøp for ioner med intensiteter over og under 50 000 tellinger på henholdsvis 4 Hz og 1 Hz, og en minimumsterskel for ionvalg ved 1990 tellinger.
- For kvantitative SNRMA-MS konstruerer du kalibreringskurver ved hjelp av ekstrahert ionkromatogram (EIC) toppområder oppnådd for modifiserte nukleosidestandarder ved minst fem konsentrasjoner for å tillate interpolering av ukjente endogene analytkonsentrasjoner.
MERK: Nevroner hentet fra dyr med kroppsmasser på 150-250 g krever vanligvis kalibreringskurver for modifiserte nukleosider fra 0,02 pmol til 2 pmol, men disse verdiene kan variere avhengig av instrumentets følsomhet.
5. Dataanalyse
- Generer EIC-er for modifiserte nukleosider (m/z fra databaseverdiene2). Kontroller identiteten til putative modifiserte nukleosider ved å sammenligne MS2-spektra- og LC-oppbevaringsegenskapene meddatabaseverdiene 2. Se tabell 1 for en liste over typiske RNA-modifikasjoner som er påvist i enkeltnevroner fra A. californica.
- Integrer topper manuelt som tilsvarer endrede og kanoniske nukleosider, og registrer disse verdiene i et regneark. Normaliser toppområdet for hver modifiserte nukleoside med summen av toppområdene for kanonisk cytidin, uridin og guanosin som oppdages i prøven.
MERK: Adenosin er ikke inkludert i normaliseringen på grunn av sin rolle i CNS som en dynamisk nevromodulator31. - Lag en datamatrise som består av hver enkelt nevronprøve og de tilsvarende normaliserte toppområdene for modifiserte nukleosider som viste signal-til-støy-forhold >10. Utfør hovedkomponentanalyse (PCA) og vis de to første hovedkomponentene i poengsumplottet. Konstruer lineære kalibreringskurver fra EIC-toppområdene hentet fra seriell fortynning av nukleosidestandarder og beregn konsentrasjonene av påviste analytter.
Representative Results
SNRMA-MS innebærer manuell isolering av identifiserte nevroner i små prøvevolumer for lysis- og LC-MS/MS-analyse (figur 1A). Denne arbeidsflyten oppdaget rutinemessig over et dusin RNA-modifikasjoner i enkle nevroner fra CNS av A. californica (figur 1B), som representerer en dekning av nesten halvparten av det kjente epitranskriptomet til dette dyret24 i en enkelt celle. Hvis du for eksempel utsetter LPl1-nevronen (~500 μm diameter) for SNRMA-MS, ble det oppdaget 15 ± 1 RNA-modifikasjoner (n = 3). Modifiserte nukleosider ble positivt identifisert på grunnlag av tre attributter: LC-oppbevaringsegenskaper, eksakt masse og MS2-fragmenteringsprofiler sammenlignet med verdiene i databasen2. Tabell 1 viser en liste over alle RNA-modifikasjonene som er oppdaget i LPl1-nevronen. Den høyoppløselige quadrupole tid-of-flight massespektrometeret som brukes til disse forsøkene, muliggjorde en massenøyaktighet på 4 ppm samt deteksjon av den karakteristiske MS2 fragmention ved m / z 164 for den modifiserte nukleoside N6,6-dimethyladenosine (m66A, figur 1B). Kombinert med LC-separasjonsdataene, som er enige med funn deponert i databasen (m66A elutes etter N6-metyladenosin (m6A)), viste SNRMA-MS-tilnærmingen riktig tildeling av modifiserte nukleosideidentiteter.
SNRMA-MS-plattformen kan utnyttes for å etablere RNA-modifikasjonsprofiler av enkle nevroner og undersøke forholdet til bulkvev. R2 nevroner er store (~ 500 μm i diameter) kolinerge celler som ligger i abdominal ganglion. SNRMA-MS ble brukt til å analysere RNA-modifikasjoner i R2-nevroner samt den omkringliggende bulk abdominal ganglion (figur 2A). Normaliserte toppområder for RNA-modifikasjoner i hver neuron/ganglion-prøve (n = 7) ble brukt som innganger for PCA, noe som viste at R2-nevroner viser tydelige RNA-modifikasjonsprofiler sammenlignet med gangliaet de bor i (figur 2B). Dette fremgår av datapunkter for R2 nevroner og abdominal ganglia som opptar forskjellige regioner i PCA-scoreplottet. Ytterligere støtte for unike modifiserte nukleoside mønstre ble hentet fra en egen kohort av dyr (n = 7) der parvis sammenligninger ble utført for 13 RNA modifikasjoner som ofte ble oppdaget i både enkelt nevroner og bulkvev (figur 2C). To modifiserte nukleosider, pseudouridin (Ψ) og 2'-O-metylguanosin (Gm), var på betydelig høyere overflod i buk ganglia sammenlignet med R2 nevroner. Ved visning av en undergruppe av RNA modifikasjoner med R2 neuron-ganglion par indikert, alle abdominal ganglia viste høyere nivåer av Ψ og Gm, og alle unntatt en av R2 nevroner hadde høyere overflod av 2'-O-metyladenosin (Am) enn deres tilsvarende ganglion (Figur 2D). Totalt sett avslører SNRMA-MS-resultatene for første gang at RNA-modifikasjonsprofiler av enkeltceller kan avvike fra bulkceller i samme vev.
Bruk av SNRMA-MS for å undersøke modelldyret A. californica gir en unik mulighet til å karakterisere RNA-modifikasjonsprofiler i identifiserte, funksjonelt distinkte nevroner. RNA-modifikasjoner ble evaluert av SNRMA-MS i fire identifiserte celler: R2 og LPl1 (homologe, kolinerge celler involvert i defensiv slimfrigjøring)32, MCCer (serotonerge modulære nevroner involvert i fôring)33 og B2-celler (peptidergiske nevroner involvert i tarmmotilitet)34. PCA av seks RNA-modifikasjoner i disse identifiserte nevronene, enten isolert umiddelbart etter enzymatisk behandling eller dyrket i et ganglionpreparat i 48 timer, viste stabiliteten og dynamikken i encellede epitranscriptomer. RNA-modifikasjoner i funksjonelt forskjellige celler dannet unike klynger i scoreplottet mens homologe R2/LPl1-nevroner var gruppert sammen (figur 3A). Lasteplottet viser at forskjellene først og fremst var drevet av overflod av posisjonsfiomer av metyladenosin, inkludert 2'-O-metyladenosin (Am) og N1-metyladenosin (m1A) (figur 3B). I samme analyse ble det utført en sammenligning av nyisolerte celler og celler dyrket in situ (dvs . i deres respektive ganglia) i 48 timer. Som vist i PCA-scoreplottet, forble funksjonelt forskjellige celler preget av deres RNA-modifikasjonsprofiler.
Kvantitativ SNRMA-MS kan brukes til å bestemme absolutte mengder utvalgte RNA-modifikasjoner som autentiske standarder er tilgjengelige for. Eksterne kalibreringskurver ble generert for m1A, Ψ, 2'-O-metylcytidin (Cm), Am og m6A, og mengden av hver modifisert kjerneside i MCC- og R2/LPl1-celleparene ble bestemt ved interpolering (figur 4A-E). De intracellulære mengdene m1A og Ψ i to par symmetriske MCCer så ut til å være like, mens større forskjeller i mengdene av disse modifikasjonene ble observert i tre par R2 / LPl1-celler. For å gjøre rede for forskjeller på grunn av den fysiske størrelsen på cellene som ble studert, ble RNA-modifikasjonsmengder normalisert av cellevolumer beregnet fra optisk måling av cellediametre for å gi intracellulære konsentrasjoner av modifiserte nukleosider. Signifikante forskjeller i intracellulære konsentrasjoner av Cm og Am ble observert mellom MCCer og R2/LPl1 nevroner. Totalt sett muliggjør SNRMA-MS både kvalitativ og kvantitativ profilering av RNA-modifikasjoner i enkeltnevroner.
Figur 1: Arbeidsflyt for SNRMA-MS og påvisning av flere RNA-modifikasjoner i enkeltnevroner av LC-MS/MS. (A) Fotografier av desheathed buccal ganglion og single neuron isolation into a sample tube. Skalalinje = 200 μm, piler indikerer identifisert B1 celle. Det vises også et diagram over prøveforberedelsesprosedyren for LC-MS/MS-analyse. (B) Overlaid EIC for RNA modifikasjoner i en enkelt LPl1 neuron, med innfelling viser MS1 og MS2 spektra for N6, N6-dimethyladenosine (m66A). Se tabell 1 for m/z-verdier som brukes til å generere EIC-er for modifiserte nukleosider. Dette tallet er endret fra29. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: SNRMA-MS skiller RNA-modifikasjonsprofiler av enkle nevroner og bulkvev. (A) Skjematisk for A. californica CNS og arbeidsflyt for å analysere R2-nevroner og den omkringliggende abdominal ganglion. Bildet viser abdominal ganglion og R2 neuron (injisert med Fast Green fargestoff for synlighet). (B) Relative toppområder fra 13 RNA modifikasjoner ble brukt til å generere PCA score (topp) og lasting (bunn) tomter. (C) Parvis sammenligning av RNA modifikasjoner i abdominal ganglion og R2 neuron. Feilfelt representerer ±1 standardavvik (SD), *p < 0,05, ***p < 5 x 10−4, sammenkoblet t-test med Bonferroni−Holm-korreksjon. (D) Sammenligning av utvalgte RNA modifikasjoner fra panel C der R2-abdominal ganglion par for hvert dyr vises med droplines. Dette tallet er endret fra29. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Profilering av RNA-modifikasjoner i identifiserte, funksjonelt forskjellige nevroner fra A. californica CNS. (A) PCA score plot for MCCs, og B2, R2, og LPl1 celler som enten var fersk isolert eller isolert etter in situ kultur for 48 h (betegnet av cMCC, cB2, cR2, cLPl1), og (B) lasting plott for seks RNA modifikasjoner ofte oppdaget i disse cellene. Dette tallet er endret fra29. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kvantitative SNRMA-MS i A. californica-nevroner . Kvantitativ SNRMA-MS gir absolutte mengder og intracellulære konsentrasjoner for flere modifiserte nukleosider i enkle, identifiserte A. californica-nevroner . Fotografier av (A) venstre og høyre MCC (henholdsvis LMCC og RMCC) i cerebral ganglion og (B) R2 i abdominal ganglion og LPl1 i pleural ganglion. Celler sirkles inn for å forbedre synligheten. Lineære kalibreringsplott for (C) m1A og (D) Ψ (trekanter) som brukes til interpolering av modifiserte nukleosidemengder i enkeltceller (fargede prikker). Cellepar fra hvert dyr er merket 1-3. (E) Intracellulære konsentrasjoner av fem modifiserte nukleosider i MCC- og R2/LPl1-cellepar. Tykke linjer forbinder cellepar. *p < 0,05, **p < 0,005, parret t-test med Bonferroni−Holm-korreksjon, n = 2 dyr (totalt fire celler) for MCC og n = 3 dyr (totalt seks celler) for R2/LPl1. Dette tallet er endret fra29. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| RNA-modifikasjon | Forkortelse | Elution rekkefølge (C18) | m/z for EIC | m/z for MS2 |
| dihydrouridin | D | 1 | 247.09 | 115 |
| pseudouridin | Y | 2 | 245.08 | 209/179/155 |
| 3-metylcyklin | m3C | 3 | 258.11 | 126 |
| N1-metyladenosin | m1A | 4 | 282.12 | 150 |
| 5-metylcytidin | m5C | 5 | 258.11 | 126 |
| N7-metylguanosin | m7G | 6 | 298.12 | 166 |
| 2'-O-metylcytidin | Centimeter | 7 | 258.11 | 112 |
| inosin | I6A | 8 | 269.09 | 137 |
| 2'-O-metylguanosin | Gm | 9 | 298.12 | 152 |
| N2-metylguanosin | m2G | 10 | 298.12 | 166 |
| N2,N2,N7-trimetylguanosin | m227G | 11 | 326.15 | 194 |
| N2,N2,-dimetylguanosin | m22G | 12 | 312.13 | 180 |
| 2'-O-metyladenosin | Er | 13 | 282.12 | 136 |
| N6-metyladenosin | m6A | 14 | 282.12 | 150 |
| N6,N6-dimetyladenosin | m66A | 15 | 296.14 | 164 |
| N6-isopentenyladenosin | i6A | 16 | 336.17 | 204/136/148 |
Tabell 1: RNA-modifikasjoner påvist i enkeltnevroner fra A. californica. Attributter for karakterisering av modifiserte nukleosider leveres, inkludert LC-oppbevaringsordre, m/z for generering av EIC-er og tilsvarende CID-fragmenter.
Discussion
SNRMA-MS bruker en optimalisert prøveforberedelsestilnærming, noe som resulterer i et lite, MS-kompatibelt eksempelvolum som kan leveres til LC-MS-plattformen. Den første enzymatiske forbehandlingen av CNS ganglia dikterer både hvor enkelt de kan desheathed og holdbarheten til enkeltnevroner under isolasjon. Cerebral ganglion krever ofte utvidet enzymatisk behandling på grunn av sin relativt tykke kappe sammenlignet med bukkal, pleural og abdominal ganglia. Individuelle forskere som utfører de enkle nevronisolasjonene kan ha forskjellige preferanser for hvor holdbar kappen skal være når man bruker mikroscissorer og fine tang. Det er imidlertid viktig at ganglia ikke er overfordøyd, da dette kan føre til tap av strukturell integritet, tap av posisjonsinformasjon som er kritisk for å identifisere målceller, og / eller cellelys. Etter isolasjon fra ganglion er det viktig å sikre at et minimalt volum isolasjonsmedium aspireres når du overfører nevronen til prøverøret. ASW-mediet inneholder en høy konsentrasjon av salter som kan forstyrre fordøyelsesenzymer under RNA hydrolyse og vil også fortynne prøven.
Under det mekaniske lysistrinnet er det vanlig at store nevroner (>250 μm diameter) brister ved gjentatte ganger å passere gjennom en mikropipette. Mindre nevroner kan kreve ekstra oppmerksomhet for å sikre cellelys, noe som vanligvis innebærer å trykke på en glasskapillær på cellen. I dette tilfellet er det mulig at et delvis volum av prøvebufferen vil bli trukket inn i kapillæren på grunn av kapillære krefter. Dette volumet kan leveres tilbake i prøverøret ved å trykke på enden av glasskapillæren for å sikre at ingen prøve går tapt.
De beste resultatene oppnås ved å inkludere et oppvarmingstrinn før du legger til enzymer for RNA-fordøyelsen. Dette skyldes sannsynligvis oppvarming ved 95 °C denaturer RNA sekundære strukturer som kan hindre aktiviteten til RNases35 og redusere mengden nukleosider frigjort fra RNA biopolymerer. Kontrolleksperimenter med prøver med stabil isotopmerket metionin ble tidligere utført for å undersøke om varmeinduserte RNA-modifikasjonsartefakter var årsaken til de økte toppområdene som ble observert for RNA-modifikasjoner i forhold til en SNRMA-MS-protokolluten varme 29. Ingen slik merking ble observert, noe som indikerer at de forbedrede signalene for RNA-modifikasjoner ved hjelp av den optimaliserte SNRMA-MS-metoden skyldtes overlegen fordøyelse av RNA.
Konvensjonelle metoder for å isolere total RNA fra celler innebærer væske-væske utvinning (LLE) med fenol-kloroform og påfølgende RNA nedbør, vask og resuspension. Disse tilnærmingene har vist seg nyttige for omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjonseksperimenter der uttrykket av utvalgte gener lett kan overvåkes i identifiserte A. californica nevroner 36,37. LLE-metoder kan imidlertid ikke gjenopprette tilstrekkelig RNA for påvisning av modifiserte ribonukleotider av LC-MS, mens SNRMA-MS-metoden som er beskrevet her, muliggjør deteksjon av mange RNA-modifikasjoner29. For å vurdere modifikasjonsprofiler av spesifikke RNA-typer (f.eks. rRNA, tRNA, mRNA) i bulkvevs-/celleprøver, anionutveksling av fastfaseutvinning24, hybridiseringssondebasert berikelse38 og kromatografisk fraksjonering39 tilnærminger er brukt, men lignende metoder er ennå ikke tilgjengelige for encellet RNA-rensing. Utviklingen av RNA-fraksjoneringsmetoder som er i stand til å isolere spesifikke RNA-typer fra enkeltceller, vil gi ytterligere innsikt i funksjonen til RNA-modifikasjoner.
SNRMA-MS avslørte tidligere ukarakterisert heterogenitet i RNA-modifikasjonslandskapet til enkeltnevroner i A. californica , og det kan tenkes at tilsvarende distinkte PTM-profiler eksisterer på tvers av pattedyrceller. Fordi pattedyrceller er relativt små sammenlignet med de store A. californica-nevronene som analyseres i denne protokollen, er det nødvendig med forbedringer i håndteringen av små prøvevolumer for å lette lavere deteksjonsgrenser. Selv om SNRMA-MS for tiden er begrenset til volumer på ~ 5 μL, forventes det at betydelige forbedringer kan oppnås ved å innlemme mikrofluidiske væskehåndteringsenheter i arbeidsflyten. Videre vil implementeringen av automatiserte eller halvautomatiske celleisolasjoner øke prøvegjennomstrømningen og tillate encellet RNA-modifikasjonsanalyse av større cellepopulasjoner. Ved å interfacing med nanoflow LC separasjoner27, karakterisering av epitranscriptomiske merker i enda mindre celler vil være oppnåelig.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Institute on Drug Abuse under Award no. P30DA018310 og National Human Genome Research Institute under Pris nr. RM1HG010023. K.D.C. anerkjenner støtte fra et Beckman Institute Postdoctoral Fellowship. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til finansieringsbyråene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Aplysia californica | National Resource for Aplysia (Miami, FL) | 150–250 g (adult) | |
| Benchtop equipment | |||
| Glass capillary puller | Sutter | P-97 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | ||
| Minicentrifuge for PCR tubes | LW Scientific | ZS-1 | |
| Optical Microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Thermocycler | Techne | EW-93945-01 | |
| HPLC column and consumables | |||
| Acclaim RSLC 120 C18 column | Thermo Scientific | 71399 | |
| Autosampler vials | Thermo Scientific | C4011-13 | |
| LC and MS Instrumentation and Software | |||
| DataAnalysis 4.4 software | Bruker | ||
| Dionex Ultimate 3000 nanoLC | Thermo Scientific | Equipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment | |
| Impact HD UHR QqTOF mass spectrometer | Bruker | Equipped with ESI source | |
| RStudio | RStudio | ||
| Microdissection tools | |||
| Microscissors extra fine vannas 3.5” | Roboz | RS-5640 | |
| Tungsten needles | Roboz | RS-6065 | |
| Reagents/Materials | |||
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | H3375 | |
| Alkaline phosphatase | Worthington Biochemical Corp. | LS004081 | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 17836 | |
| Benzonase (endonuclease from S. marcescens) | EMD Millipore | 70746-4 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Gentamycin sulfate | Fisher Scientific | G1264 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| Nucleosides test mix | Sigma-Aldrich | 47310-U | |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P7794 | |
| Pentostatin | Sigma-Aldrich | SML0508 | |
| Phosphodiesterase I | Worthington Biochemical Corp. | LS003926 | |
| Protease type XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Standard glass capillaries | A-M Systems | 626000 | 1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 |
References
- Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, suppl_1 195-201 (2011).
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46, 303-307 (2017).
- Kimura, S., Waldor, M. K. The RNA degradosome promotes tRNA quality control through clearance of hypomodified tRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (4), 1394-1403 (2019).
- Helm, M. Post-transcriptional nucleotide modification and alternative folding of RNA. Nucleic Acids Research. 34 (2), 721-733 (2006).
- Rezgui, V. A. N., et al. tRNA tKUUU, tQUUG, and tEUUC wobble position modifications fine-tune protein translation by promoting ribosome A-site binding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12289-12294 (2013).
- Shanmugam, R., et al. Cytosine methylation of tRNA-Asp by DNMT2 has a role in translation of proteins containing poly-Asp sequences. Cell Discovery. 1 (1), 1-10 (2015).
- Jia, G., et al. N 6-Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nature Chemical Biology. 7 (12), 885-887 (2011).
- Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N 1 -methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
- Krogh, N., et al. Profiling of 2′-O-Me in human rRNA reveals a subset of fractionally modified positions and provides evidence for ribosome heterogeneity. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7884-7895 (2016).
- Babaian, A., et al. Loss of m1acp3Ψ Ribosomal RNA Modification Is a Major Feature of Cancer. Cell Reports. 31 (5), 107611 (2020).
- Chang, M., et al. Region-specific RNA m6A methylation represents a new layer of control in the gene regulatory network in the mouse brain. Open Biology. 7 (9), 170166 (2017).
- Wang, C. -X., et al. METTL3-mediated m6A modification is required for cerebellar development. PLOS Biology. 16 (6), 2004880 (2018).
- Engel, M., et al. The role of m6A/m-RNA methylation in stress response regulation. Neuron. 99 (2), 389-403 (2018).
- Widagdo, J., et al. Experience-dependent accumulation of N6-Methyladenosine in the prefrontal cortex is associated with memory processes in mice. Journal of Neuroscience. 36 (25), 6771-6777 (2016).
- Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
- Cong, Y., et al. Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies >1000 protein groups per mammalian cell. Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).
- Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), 20-29 (2011).
- Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (17), 6810-6817 (2011).
- Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nature Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
- Kærn, M., Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 451-464 (2005).
- Chan, C. T. Y., et al. A quantitative systems approach reveals dynamic control of tRNA modifications during cellular stress. PLOS Genetics. 6 (12), 1001247 (2010).
- Sun, C., Jora, M., Solivio, B., Limbach, P. A., Addepalli, B. The effects of ultraviolet radiation on nucleoside modifications in RNA. ACS Chemical Biology. 13 (3), 567-572 (2018).
- Heiss, M., Hagelskamp, F., Marchand, V., Motorin, Y., Kellner, S. Cell culture NAIL-MS allows insight into human tRNA and rRNA modification dynamics in vivo. Nature Communications. 12 (1), 389 (2021).
- Clark, K. D., Lee, C., Gillette, R., Sweedler, J. V. Characterization of neuronal RNA modifications during non-associative learning in aplysia reveals key roles for tRNAs in behavioral sensitization. ACS Central Science. 7 (7), 1183-1190 (2021).
- Basanta-Sanchez, M., Temple, S., Ansari, S. A., D'Amico, A., Agris, P. F. Attomole quantification and global profile of RNA modifications: Epitranscriptome of human neural stem cells. Nucleic Acids Research. 44 (3), 26 (2016).
- Huang, W., et al. Determination of DNA and RNA methylation in circulating tumor cells by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (2), 1378-1384 (2016).
- Sarin, L. P., et al. Nano LC-MS using capillary columns enables accurate quantification of modified ribonucleosides at low femtomol levels. RNA. 24 (10), 1403-1417 (2018).
- Clark, K. D., Philip, M. C., Tan, Y., Sweedler, J. V. Biphasic liquid microjunction extraction for profiling neuronal RNA modifications by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (18), 12647-12655 (2020).
- Clark, K. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry: Characterizing RNA modification patterns and dynamics with single-cell resolution. Analytical Chemistry. 93 (43), 14537-14544 (2021).
- Guise, O. L., Ahner, J. W., Jung, M. -C., Goughnour, P. C., Yates, J. T. Reproducible electrochemical etching of tungsten probe tips. Nano Letters. 2 (3), 191-193 (2002).
- Peng, W., Wu, Z., Song, K., Zhang, S., Li, Y., Xu, M. Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons. Science. 369 (6508), (2020).
- Rayport, S. G., Ambron, R. T., Babiarz, J. Identified cholinergic neurons R2 and LPl1 control mucus release in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 49 (4), 864-876 (1983).
- Rosen, S. C., Weiss, K. R., Goldstein, R. S., Kupfermann, I. The role of a modulatory neuron in feeding and satiation in Aplysia: effects of lesioning of the serotonergic metacerebral cells. Journal of Neuroscience. 9 (5), 1562-1578 (1989).
- Lloyd, P. E., Kupfermann, I., Weiss, K. R. Central peptidergic neurons regulate gut motility in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 59 (5), 1613-1626 (1988).
- Crain, P. F. Preparation and enzymatic hydrolysis of DNA and RNA for mass spectrometry. Methods in Enzymology. 193, 782-790 (1990).
- Kadakkuzha, B. M., et al. Age-associated bidirectional modulation of gene expression in single identified R15 neuron of Aplysia. BMC Genomics. 14 (1), 880 (2013).
- Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51075 (2014).
- Tardu, M., Jones, J. D., Kennedy, R. T., Lin, Q., Koutmou, K. S. Identification and quantification of modified nucleosides in saccharomyces cerevisiae mRNAs. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1403-1409 (2019).
- Heiss, M., Reichle, V. F., Kellner, S. Observing the fate of tRNA and its modifications by nucleic acid isotope labeling mass spectrometry: NAIL-MS. RNA Biology. 14 (9), 1260-1268 (2017).
