Summary
Este protocolo descreve uma técnica de impressão 3D para fabricar estruturas semelhantes a ossos, depositando uma tinta de fosfato de cálcio em um suporte granular à base de gelatina. Os análogos ósseos impressos são depositados em forma livre, com flexibilidade para a colheita direta da impressão ou reticulação dentro de uma matriz celular viva para construções multifásicas.
Abstract
Estruturalmente, o tecido ósseo é um composto inorgânico-orgânico contendo células metabolicamente ativas embutidas dentro de uma matriz hierárquica e altamente mineralizada. Essa organização é difícil de replicar devido ao ambiente heterogêneo do osso. A bioimpressão omnidirecional cerâmica em suspensões celulares (COBICS) é uma técnica de bioimpressão baseada em microgel que replica exclusivamente a estrutura mineral e celular do osso. A COBICS imprime construções complexas e biologicamente relevantes sem a necessidade de materiais de suporte sacrificiais ou etapas severas de pós-processamento (por exemplo, radiação e sinterização a alta temperatura), que são dois dos maiores desafios na fabricação aditiva de construções miméticas ósseas. Esta técnica é habilitada através da extrusão de forma livre de uma nova tinta à base de fosfato de cálcio dentro de uma suspensão de microgel à base de gelatina. As propriedades de rendimento-tensão da suspensão permitem a deposição e suportam a estrutura óssea impressa. A reticulação UV e a nanoprecipitação então a "bloqueiam" no lugar. A capacidade de imprimir cerâmicas miméticas ósseas nanoestruturadas em biomateriais carregados de células fornece controle espaço-temporal sobre macro e microarquitetura e facilita a fabricação em tempo real de construções ósseas complexas em ambientes clínicos.
Introduction
O osso tem notáveis habilidades de regeneração como uma das poucas estruturas do corpo que podem cicatrizar recriando sua composição celular normal, orientação e força mecânica até um tamanho de defeito crítico, quando a capacidade de cicatrização endógena é comprometida1. O osso, juntamente com a cartilagem e o ligamento, suporta e facilita o movimento do corpo, além de armazenar minerais e gorduras e produzir células sanguíneas. Como um tecido conjuntivo duro e denso, o osso é composto principalmente de uma fase inorgânica, água e material orgânico composto principalmente de fibras colágenas2. As células estão embutidas dentro dessa matriz altamente mineralizada de fibras colágenas I e cristais de hidroxiapatita (HA), formando uma estrutura hierárquica3.
A complexa organização desse tecido torna a fabricação de alternativas sintéticas para replicar os heterogêneos micro e nanoambientes ósseos excepcionalmente desafiadores3. Para este propósito, uma variedade de materiais, incluindo biocerâmica, hidrogéis carregados de células e materiais sintéticos foram propostos como soluções para criar matrizes ósseas. Entre as técnicas de fabricação de andaimes, as técnicas baseadas em impressão 3D surgiram recentemente e receberam muita atenção da comunidade de engenharia de tecidos devido à sua notável capacidade de permitir a fabricação de estruturas altamente sofisticadas e precisas com grande promessa de tratamento específico do paciente 4,5,6 . Os hidrogéis têm sido a escolha mais popular de mímicos de matriz e biotintas, uma vez que podem ser impressos em conjunto com células e moléculas bioativas, gerando construtos funcionais6. No entanto, os hidrogéis não possuem as propriedades funcionais do osso, como resistência mecânica e uma fase inorgânica altamente calcificada contendo células metabolicamente ativas.
Os andaimes cerâmicos impressos em 3D normalmente requerem etapas de pós-processamento, incluindo sinterização, tratamentos a alta temperatura ou o uso de produtos químicos agressivos que devem ser cuidadosamente lavados antes de aplicações in vitro ou in vivo 5. Para abordar essas limitações, Lode et al.7 desenvolveram recentemente uma pasta à base de fosfato α-tricálcico formada por hidroxiapatita, que pode ser impressa e ajustada em condições fisiológicas. No entanto, este material ainda não pode ser impresso em conjunto com células vivas, pois requer pós-tratamento em um ambiente úmido e subsequente imersão em solução aquosa por um longo período.
Alternativamente, hidrogéis carregados de células com partículas inorgânicas incorporadas têm sido propostos como substitutos da matriz óssea 3D 8,9. Apesar de sua grande capacidade de suportar a viabilidade celular, eles não são capazes de recapitular o ambiente de tecido ósseo densamente mineralizado. Thrivikarman et al.10 adotaram uma abordagem biomimética na qual um meio supersaturado de cálcio e fosfato foi utilizado com um análogo proteico não colagenoso para melhor mimetizar a deposição de apatita em nanoescala. No entanto, suas construções ainda não podem gerar construções 3D rígidas com arquitetura de micro e macroescala semelhante a ossos.
O presente estudo aborda essas deficiências por meio do desenvolvimento de uma estratégia de impressão para fabricar construtos que imitam ossos, em fases inorgânica e orgânica, que sejam capazes de integrar tanto células quanto fatores de crescimento11. O COBICS recapitula exclusivamente a estrutura mineral e celular do osso usando uma técnica de bioimpressão baseada em microgel. O protocolo aqui descrito descreve o processo de síntese dos microgéis cerâmicos à base de tinta óssea e gelatina e, em seguida, a combinação de células que permitem o COBICS. O processo começa com a síntese do principal material precursor da tinta óssea. O hidrogel reticulável é então sintetizado e formado em microgéis. Por fim, a tinta óssea é depositada omnidirecionalmente em um banho de suporte dos microgéis carregados de células (Figura 1).
A tinta óssea pode ser impressa em qualquer suspensão de microgéis que tenham as características apropriadas de tensão de rendimento, ou seja, a capacidade de fluidizar a uma taxa de cisalhamento específica e, posteriormente, apoiar a estrutura depositada. Foram demonstradas duas abordagens flexíveis: uma suspensão constituída por microgéis de gelatina e uma suspensão constituída por microgéis de metacrilato de gelatina (GelMA). A primeira suspensão dissolve-se quando a temperatura é elevada para 37 °C, a forma livre de incorporação reversível de hidrogéis suspensos (FRESH) técnica12, enquanto a última pode ser fotoreticulada após a impressão, efetivamente "costurando" os microgéis juntos e travando a tinta óssea impressa no lugar. O presente estudo se concentra no uso de GelMA como matriz, pois fornece a vantagem única de ser capaz de suportar o crescimento celular com impressão in situ de estruturas miméticas ósseas complexas. Em última análise, essa abordagem permite a geração de modelos de tecidos complexos com altos níveis de biomimética e amplas implicações para a modelagem de doenças, descoberta de medicamentos e engenharia regenerativa.
Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho . (A) A tinta óssea é sintetizada a partir da síntese de fosfato α-tricálcico e sua subsequente combinação com glicerol, polissorbato 80 e fosfato de amônio dibásico. (B) Os microgéis GelMA são fabricados pelo método de emulsão de água em óleo. Os microgéis obtidos são então (C) hidratados e (D) combinados com células. Os compósitos de célula-microgel são então usados como um banho granular no qual a tinta óssea é depositada. (E) Toda a construção é então reticulada por UV e transferida para a incubadora para cultura. Abreviaturas: α-TCP = fosfato α-tricálcico; GelMA = metacrilato de gelatina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. Fabricação de tinta de osso
- Síntese de fosfato α-tricálcico
- Pesar os pós de hidrogenofosfato de cálcio (CaHPO4) e carbonato de cálcio (CaCO 3) numa proporção molar de Ca:P de3:2. Usando uma espátula, homogeneize completamente os dois pós.
- Adicione a mistura de hidrogenofosfato de cálcio e carbonato de cálcio em pó a um cadinho de zircônia de modo que não esteja mais do que 75% cheio.
NOTA: Para evitar a contaminação, utilizar um cadinho novo ou um cadinho previamente utilizado para fabricar o mesmo material. Para limpar, enxágue com etanol a 100% e seque ao ar em um exaustor até secar completamente antes de adicionar os pós. - Transferir o cadinho para um forno. Aquecer a 1 400 °C a uma velocidade de 5 °C/min e manter durante 3 h.
- Apague a reação removendo o cadinho do forno e deixe-o em cima de um bloco refratário. Deixe esfriar completamente antes de manusear.
NOTA: Use pinças de cadinho de um comprimento apropriado e garanta uma proteção térmica adequada. - Use uma argamassa e pilão para quebrar e moer o bolo α-TCP de tal forma que os grânulos resultantes tenham um tamanho máximo de 200 μm.
NOTA: Use uma peneira de aço inoxidável padrão para garantir o tamanho correto das partículas. - Moer ainda mais os grânulos usando um moinho planetário em dois estágios. Primeiro, adicione bolas de zircônia estabilizadas com ítria de 3 mm em uma proporção de peso de 8:1 bolas:pó, depois 100% de etanol em uma relação de peso de 3:1 etanol:pó. Prenda a tampa e triture por 2 h a 180 rpm.
- Colete a suspensão e separe as esferas, utilizando etanol 100% para lavagem.
- Secar a suspensão num forno a 120 °C durante 24 h.
- Adicione o pó seco aos frascos de moagem com bolas de zircônia de 1 mm e etanol a 100% nas mesmas proporções de peso do primeiro estágio. Moer por 2 h a 180 rpm, separar e secar.
NOTA: Todo o procedimento de síntese é representado na Figura 1A.
- Formulação de tinta óssea
- Para fazer a tinta óssea, adicione 2 g de pó de α-TCP a um frasco de moinho de bolas que contenha 630 μL de glicerol e 130 μL de polissorbato 80 enquanto mexe continuamente com uma espátula.
- Adicionar 100 mg de fosfato de amónio dibásico ((NH 4)2HPO4, APD) e agitar para combinar.
NOTA: O resíduo excessivo de fases líquidas deixadas na espátula resultará em um desequilíbrio de proporção dos componentes da tinta e, portanto, da cinética de ajuste. - Adicione uma bola de zircônia de 25 mm, prenda a tampa e coloque-a dentro de um moinho planetário por 60 minutos a 180 rpm, parando no meio do caminho para raspar as laterais do frasco com uma espátula.
- Usando uma espátula, carregue a tinta em uma seringa de 1 mL. Envolva adequadamente para evitar o contato com a umidade. Conservar a -20 °C se não for utilizado imediatamente.
- Caracterização da microestrutura bone-ink
- Imprima a tinta de osso em água deionizada e deixe ajustada por 5 min.
- Lave a amostra 3x com etanol 100% e deixe secar completamente.
- Revestimento com uma fina camada (15 nm de espessura) de ouro.
- Capture micrografias usando um microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo a uma tensão de aceleração de 5 kV.
2. Fabricação de suspensões de microgel para impressão
- Síntese de GelMA
NOTA: Este procedimento foi testado para tamanhos de lote constituídos por 10 g e 20 g de gelatina. Este método detalha as medições de um lote usando 10 g.- Fazer uma solução a 10% p/p de gelatina tipo A (suína, resistência Bloom 300) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 1x, pesando 10 g de gelatina e adicionando-a a um balão cónico com 90 ml de PBS. Aqueça a 50 °C enquanto mexe até que a gelatina esteja completamente dissolvida.
- Adicionar 5.796 mL de anidrido metacrílico. Colocar uma tampa de borracha no balão cónico e continuar a agitar no escuro a 50 °C durante 90 minutos.
CUIDADO: O anidrido metacrílico é tóxico se inalado ou engolido e é irritante para a pele e os olhos. Manuseie apenas dentro de um exaustor e use EPIs apropriados. - Apagar a reacção diluindo o conteúdo do balão cónico duas vezes com PBS.
- Decante em tubos de 50 mL e centrifuga a 3.000 × g à temperatura ambiente por 3 min para remover anidrido metacrílico não reagido.
- Dializar o sobrenadante no interior de tubos de diálise de celulose de corte de 14 kDa contra a água desionizada a 40 °C durante 5 dias, agitando suavemente. Substitua a água deionizada todos os dias.
- Prepare-se para o armazenamento decantando em tubos de 50 mL, prendendo a tampa e colocando-a na geladeira por 12 h. Armazenar em geladeira por até 7 dias.
- Congelar com azoto líquido e liofilizar imediatamente durante 5 dias a -54 °C e 0,4 mbar.
NOTA: Certifique-se de que os tubos não contenham mais de 40 ml de líquido durante o congelamento. Uma vez congelada, substitua a tampa por uma cobertura que permita a troca gasosa, como uma delicada limpeza de tarefas presa com um elástico. - Conservar a espuma resultante num congelador a -20 °C até ser necessário para a síntese da suspensão de microgel.
- Síntese de microgéis GelMA
NOTA: Os microgéis são sintetizados usando um método de emulsão de água em óleo13 (Figura 2). Este método foi testado para volumes de solução de GelMA de 1-10 mL. O mesmo protocolo pode ser usado para sintetizar microgéis de gelatina usados para imprimir impressões ósseas autônomas.- Fazer uma solução de GelMA a 10% p/p em PBS pesando o GelMA liofilizado, adicionando-o a um tubo com PBS e aquecendo em banho-maria a 50 °C até ficar totalmente hidratado.
- Adicione 37 mL de óleo por 1 mL de solução de GelMA a um copo, garantindo que ele não esteja mais do que 65% cheio.
- Configure um sistema de copo duplo em uma placa quente com agitação magnética, colocando o copo contendo óleo dentro de um copo maior.
NOTA: O tamanho dos dois copos deve ser tal que o gelo possa ser facilmente jogado no espaço entre suas paredes. A configuração é mostrada na Figura 2. - Aqueça a 40 °C enquanto agita.
NOTA: Certifique-se de que o vórtice não é turbulento e tem uma profundidade de aproximadamente 1/3 da altura do óleo no béquer. - Carregue a solução de GelMA numa seringa e adicione-a gota a gota ao óleo de agitação através de um filtro de 0,45 μm. Deixe a emulsão se equilibrar por 10 min.
- Reduzir a temperatura da emulsão para 15 °C para estabilizar termicamente as esferas, adicionando gelo triturado no espaço entre os dois béqueres.
- Adicionar acetona à emulsão giratória numa proporção de volume de 1:11 GelMA solução para acetona.
NOTA: Adicione a acetona suavemente através de um funil para evitar interromper a emulsão. Mexa por 60 min. - Decantar o conteúdo do copo em tubos de 50 mL, certificando-se de lavar as paredes do copo com acetona. Deixe por 20 min para permitir que os microgéis desidratados se depositem no fundo.
- Descarte o sobrenadante e lave pelo menos 2x com acetona.
NOTA: O sobrenadante deve ser claro. - Consolide em um tubo, recarregue com acetona e sonicate por 10 s. Lave 2x com acetona.
- Conservar em acetona à temperatura ambiente até ser necessário para impressão.
- Preparação da suspensão de microgel GelMA para impressão
- Preparar uma solução a 1% p/p de GelMA no meio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, pesando GelMA liofilizado num tubo, adicionando DMEM e aquecendo em banho-maria a 50 °C até ficarem totalmente hidratados.
- Evaporar a acetona dos microgéis desidratados e pesar o pó resultante num tubo. Adicione acetona e transfira para um ambiente estéril.
- Para formar a suspensão de microgel, evapore a acetona e adicione DMEM, solução de GelMA a 1% p/p em DMEM e solução de iniciador de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio a 2,5% p/p para obter uma fração de embalagem final de 30%. Deixe hidratar completamente por pelo menos 12 h à temperatura ambiente. Armazenar em geladeira por até 7 dias. Deixe subir à temperatura ambiente antes de usar.
NOTA: Os volumes desses reagentes são baseados no peso seco dos microgéis e podem ser calculados usando as equações da Tabela 1.
| Equação | |
| x = peso dos microgéis secos (mg) | |
| Volume de 1% p/p GelMA em DMEM, a (μL) | a = 21,93x |
| Volume de DMEM, b (μL) | b = 8,773x |
| Volume de solução de LAP a 2,5% p/p, c (μL) | c = 0,6267x |
| Volume total de suspensão de microgel produzido (μL) | a + b + c |
Tabela 1: Equações para o cálculo dos volumes de reagentes necessários para hidratar as suspensões de microgel GelMA. Abreviaturas: GelMA = metacrilato de gelatina; LAP = fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio.
Figura 2: Esquema do método óleo-emulsão utilizado para a síntese de microgel. A configuração de copo duplo mostra um copo contendo a emulsão de agitação (indicada por seta) colocada dentro de um copo maior para permitir o resfriamento. Abreviação: GelMA = metacrilato de gelatina Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Impressão de tinta de osso em suspensões celulares
NOTA: Os microgéis à base de gelatina suportam a adesão de muitos tipos diferentes de células, o que torna esta abordagem passível de células únicas e múltiplas dentro da matriz de microgel. Este protocolo descreve o procedimento para o uso de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (ADSCs), pois este é um tipo de célula popular e robusto para a engenharia de tecidos musculoesqueléticos.
- Culturar os ADSCs em DMEM de baixa glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C e 5% de CO2 até confluente.
- Retirar os ADSCs do balão de cultura de tecidos, removendo o meio, lavando com PBS estéril e incubando a 37 °C e 5% de CO2 com tripsina a 0,25% por 3 min.
- Pellet as células por centrifugação a 150 × g à temperatura ambiente durante 5 min.
- Conte as células e calcule 5 × 105 células para cada 1 ml de microgéis GelMA. Aloque o volume necessário de suspensão de células a um tubo e pellet separados, como acima.
- Retire cuidadosamente o máximo de sobrenadante possível usando uma pipeta, deixando apenas a pastilha celular. Adicione o volume necessário de suspensão de microgel ao pellet e aspirar suavemente para garantir uma distribuição celular uniforme.
NOTA: Se houver excesso de bolhas de ar na suspensão, centrifugar suavemente para remover e pipetar para cima e para baixo para redistribuir as células. - Carregue a suspensão de microgel carregada de células em um reator usando uma pipeta.
NOTA: No presente estudo, foram impressos em 3D reatores de 10 mm x 10 mm x 3 mm com capacidade de volume de 100 μL. - Deposite tinta óssea usando uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 23 G.
NOTA: Isso pode ser feito com uma impressora 3D adaptando um sistema de extrusão que permita imprimir diretamente da seringa de 1 mL ou carregando a tinta óssea diretamente no cartucho de extrusão da impressora (Figura 3). - Cruze a construção de microgel GelMA carregada de tinta celular e óssea com uma lâmpada de reticulação UV (405 nm) por 90 s. Transfira imediatamente para uma placa de poço de tamanho apropriado e cubra com DMEM completo.
NOTA: Os reatores impressos em 3D acima mencionados cabem dentro de placas de cultura de células de 24 poços. - Incubar a 37 °C e 5% de CO2. Substitua o meio de cultura após 24 h, depois a cada 48-72 h, conforme necessário.
Figura 3: Representação esquemática do procedimento COBICS mostrando a hidratação dos microgéis, incorporação de células e posterior impressão de tinta óssea na suspensão de microgel carregada de células. Abreviação: COBICS = bioimpressão omnidirecional cerâmica em suspensões celulares; GelMA = metacrilato de gelatina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Avaliação da viabilidade celular e da proliferação
- Para avaliar a citotoxicidade da tinta óssea, mantenha as construções COBICS carregadas de células em meio de cultura completo. Realize um ensaio Live Dead às 24 h, 72 h e 120 h (ou pontos de tempo relevantes).
- Em cada ponto de tempo, lave as construções com PBS e, em seguida, adicione uma solução de DMEM livre de fenol contendo calceína 4 mM e brometo de etídio 2 mM. Incubar durante 1 h a 37 °C e 5% de CO2.
- Lavar com PBS e transferir para um prato com fundo de vidro para obtenção de imagens com um microscópio confocal nos espectros Ex/Em de 494/517 nm e 528/617 nm.
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Representative Results
A COBICS imprime construções complexas e biologicamente relevantes sem a necessidade de materiais de suporte sacrificiais ou etapas severas de pós-processamento (por exemplo, radiação e sinterização a alta temperatura), que são dois dos maiores desafios na fabricação aditiva de construções miméticas ósseas. Para demonstrar a formação de COBICS de estruturas ósseas complexas e a co-impressão de células em suspensões de microgel, foram obtidas imagens representativas de compósitos ósseos feitos de tinta óssea e realizada uma análise semiquantitativa da viabilidade do ADSC no COBICS por até 7 dias. A Figura 4 mostra a capacidade de fabricar estruturas ósseas complexas pela deposição de tinta óssea no banho de suporte composto por microgéis de gelatina, que se comportam como um fluido não newtoniano, respondendo como um sólido que começa a fluir como um fluido viscoso sob alta tensão de cisalhamento. Os construtos impressos podem então ser isolados do banho viscoso (Figura 4A,B).
A impressora usada para realizar as construções que imitam ossos na Figura 4 é uma impressora multihead equipada com uma extrusora personalizada. Um mililitro de tinta óssea foi carregado em uma seringa de impressão de 3 mL, que foi encaixada na extrusora. Todas as agulhas utilizadas tinham diâmetro interno de 0,2-0,8 mm. Modelos computacionais das estruturas imitadas por ossos foram criados usando um software de modelagem CAD e convertidos em arquivos STL, após o que o código G foi gerado. Os construtos foram impressos em placas de cultura celular de 96 poços contendo microgéis de gelatina e meio completo utilizando uma agulha de 0,2 mm. Após a impressão, os construtos foram autorizados a se fixar dentro dos banhos de suporte por 6 min antes de serem removidos usando uma pinça.
Microgéis de gelatina têm sido reticulados com glutaraldeído para permitir sua cultura sob as condições fisiológicas de 37 °C e 5% de CO2, juntamente com as células11. No presente estudo, o sistema foi implementado pela fabricação de microgéis GelMA, o que permitiu que todo o construto fosse reticulado UV (Figura 4C) para estabilidade térmica e liofilizado para armazenamento e transporte a longo prazo (Figura 4D,E). Amostras liofilizadas podem ser reidratadas em água destilada, PBS ou meio de cultura celular para recuperar sua estrutura original (Figura 4E). A tinta óssea foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) para determinação de sua microestrutura (Figura 4F), que evidenciou a formação de cristal de hidroxiapatita após ajuste de tinta, particularmente visível em condição seca (Figura 4Fii).
Neste estudo, as células foram misturadas com microgéis GelMA e mantidas em cultura por até 5 dias, seja apenas em suspensão de microgel (Figura 5A) ou no sistema COBICS, conforme detalhado na seção 3 do protocolo. As células apresentaram boa viabilidade na presença da tinta óssea, tanto no dia 1 quanto no dia 5, confirmando que os produtos de lixiviação da tinta não foram prejudiciais às células (Figura 5B). A impressão de cerâmicas miméticas ósseas nanoestruturadas em biomateriais carregados de células fornece controle espaço-temporal sobre macro e microarquitetura, o que facilita a fabricação em tempo real de construções ósseas complexas em ambientes clínicos.
Figura 4: Exemplo de construções impressas em 3D impressas pela COBICS. (A) Labirinto ósseo humano; (B) canal Harversiano helicoidal. (C) Imagens de tinta óssea impressas em microgéis GelMA; D) Amostra liofilizada e (E) reidratada. (F) Imagens MEV de tinta óssea pós-impressa que mostram a formação de cristais de AH, em (i) condições úmidas e (ii) secas. Barras de escala = (A,E) 3 mm, (C) 2 mm, (B) 1 mm, (Fi) 100 μm, (Fii) 3 μm. Figura 4A,B são de Romanazzo et al.11. Abreviaturas: COBICS = bioimpressão cerâmica omnidirecional em suspensões celulares; GelMA = metacrilato de gelatina; MEV = microscopia eletrônica de varredura; AH = hidroxiapatita. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Coloração Viva/Morta. (A) ADSCs cultivados com microgéis GelMA; (B) ADSCs cultivados na presença de tinta óssea (ilustrada em branco), mostrando alta viabilidade celular tanto no dia 1 quanto no dia 5. Imagens tiradas com uma ampliação de 10x. As imagens inseridas mostram z-stacks das respectivas construções no dia 5 com a tinta de osso ilustrada em branco. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: ADSCs = células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo; GelMA = metacrilato de gelatina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A técnica de impressão 3D COBICS foi desenvolvida para permitir a fabricação de estruturas mineralizadas semelhantes a ossos por extrusão em uma suspensão de microgel reticulável contendo células vivas. A técnica tem sido aplicada a uma suspensão de microgel degradável, e as células apresentam boa viabilidade, disseminação e capacidade de diferenciação osteogênica dentro do sistema11. Um determinante chave do sucesso de construções criadas usando essa técnica é a síntese adequada da tinta óssea baseada em α-TCP. Primeiro, a formação de α-TCP é fortemente dependente do controle adequado da temperatura. Para a formação da fase correta do fosfato tricálcico, é vital extinguir a reação dentro da faixa de 1.400-1.200 °C antes de cruzar o limite de fase para o campo de fase β-TCP14. A análise de difração de raios X pode ser usada para confirmar a composição monofásica α-TCP. Posteriormente, a mistura de todos os precursores de tinta óssea nas proporções corretas é crucial para a formação de uma tinta óssea com características de fluxo ideais para impressão por extrusão, tempo de ajuste e formação de nanomicroestrutura. Uma vez que a suspensão de microgel GelMA permite o "bloqueio" das estruturas impressas através de fotocrosslinking, as proporções de materiais precursores podem ser ajustadas para otimizar a impressora 3D que está sendo usada. No entanto, é altamente recomendável realizar testes completos para garantir que isso não comprometa a integridade da técnica.
Uma consideração crucial durante a síntese de GelMA é que todos os subprodutos de anidrido metacrílico e ácido não reagidos sejam removidos através de centrifugação e diálise adequadas. A diálise deve ser realizada pelo menos pelo tempo especificado, pois o anidrido metacrílico e os subprodutos ácidos são citotóxicos e podem afetar a viabilidade celular. Além disso, um pH mais baixo comprometerá a integridade estrutural dos géis e poderá afetar a configuração da tinta óssea. A liofilização pelo período de tempo especificado é crucial para o cálculo da porcentagem de peso correta ao preparar soluções de GelMA para a síntese da suspensão de microgel. A liofilização por um período menor do que o especificado pode fazer com que a água adsorvida seja contabilizada no peso seco do GelMA, fazendo com que os microgéis resultantes contenham uma porcentagem de peso menor de GelMA e, portanto, sejam muito mais fracos do que o pretendido. O grau de funcionalização (DoF) do GelMA afeta a formação de hidrogel covalente e, portanto, a estabilidade do hidrogel. O DoF ideal foi encontrado para ser de 95%.
Outro passo crítico é a síntese de emulsão de água em óleo de microgéis. A velocidade de rotação afeta o tamanho dos microgéis formados. Velocidades de rotação mais rápidas permitirão a fabricação de microgéis menores; no entanto, se o vórtice for turbulento, a emulsão não se estabilizará e a síntese de microgel falhará. Por outro lado, uma velocidade de rotação muito baixa fará com que a solução de GelMA coalesca em uma massa em vez de formar uma emulsão estável. No presente estudo, a combinação da viscosidade do óleo e da velocidade de fiação utilizada gerou microgéis com diâmetro médio de 100 μm quando hidratados. Recomenda-se vivamente a realização de ensaios adequados para marcar a combinação do tipo de óleo e a velocidade de agitação para dar resultados desejáveis consistentes.
Uma limitação da técnica COBICS é que os parâmetros da formulação da tinta podem exigir algum ajuste fino para otimizar a extrusão com diferentes impressoras. Embora o design da técnica permita que ela seja modular, isso também significa que um grau de tentativa e erro pode precisar ser exercido pelos usuários para alcançar os resultados desejados com o equipamento disponível para eles. Como dito anteriormente, o uso de uma suspensão de microgel fotocrosslinkable fornece leniência sobre os parâmetros através do bloqueio das estruturas impressas. Além disso, o tamanho atual do lote é limitado a 2 mL de tinta óssea por frasco. Isso pode ser resolvido por ter vários frascos, permitindo a síntese de vários lotes da formulação. Isso também pode não ser necessário, dependendo das características específicas de fluxo exigidas pelo usuário para seu equipamento e aplicação. Novamente, recomenda-se o teste apropriado por parte do usuário.
Em conclusão, o COBICS facilita a impressão de uma tinta cerâmica otimizada, nanoestruturada e mimética de ossos dentro de biomateriais carregados de células. Esta técnica fornece controle espaço-temporal sobre macro e microarquitetura enquanto fabrica estruturas ósseas complexas. O uso de microgéis permite a estabilização da tinta óssea, enquanto os microgéis GelMA, em particular, melhoram a integridade da impressão por meio de bloqueio mediado por fotocrosslinking e fornecem espaços vazios adequados para proliferação e migração celular. A abordagem descrita aqui tem aplicações potenciais em engenharia de tecido ósseo, modelagem de doenças e triagem de medicamentos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (Grant no. GNT1111694 e GNT1141602) e ao Australian Research Council (Grant no. FT180100417, FL150100060 e CE14100036). Os autores gostariam de agradecer o Biomedical Imaging Facility da Universidade de Nova Gales do Sul. As figuras foram criadas com Biorender.com, Adobe Photoshop e Adobe Illustrator e foram exportadas sob uma assinatura paga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer Extruder | Hyrel3D | EMO-25 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | BDAA352070 | |
| Absolute Ethanol 100% Denatured | Chem-Supply | ||
| Acetone | Chem-Supply | 154871 | |
| Alumina crucible | Coors | ||
| Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4) | Sigma | A5764 | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | ||
| Biosafety cabinet level 2 | |||
| Calcium carbonate | Sigma | 239216 | |
| Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4) | Sigma | C7263 | |
| Cell culture flasks | Corning | various volumes used | |
| Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off | Sigma | D9777 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL | |
| Dispensing Tip, 23 G | Nordson | 7018302 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo FIsher | 11885084 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo FIsher | 14190144 | |
| Elevator furnace | Labec | ||
| Engine HR Multihead Printer | Hyrel3D | ||
| Fetal Bovine Serum | Bovogen | ||
| Gelatin type A, from porcine skin | Sigma | G2500 | |
| General Purpose Stainless Steel Tips | Nordson EF | ||
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Human adipose derived stem cells | ATCC | PCS-500-011 | |
| LSM 800 Confocal Microscope | ZEISS | ||
| Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus) | Christ | 101541 | |
| Magnetic hot plate and stirrer | |||
| Methacrylic anhydride | Sigma | 276685 | |
| Mini 2 Desktop 3D Printer | LulzBot | ||
| Parafilm sealing film | Parafilm | PM996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo FIsher | 15140122 | |
| Planetary ball mill | |||
| Planetary ball mill jar | |||
| Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80 | Sigma | P6224 | |
| Scanning electron microscope | FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM | ||
| Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech | 18813156 | |
| Stainless steel standard test sieve | |||
| Sunflower Oil | Community Co | ||
| Trypsin-EDTA 0.25% phenol red | Thermo FIsher | 25200056 | |
| ZEN Microscope Software | ZEISS | ||
| Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
| DMEM, low glucose, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 |
References
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