Summary
Denne protokollen beskriver en 3D-utskriftsteknikk for å fremstille beinlignende strukturer ved å deponere et kalsiumfosfatblekk i en gelatinbasert granulær støtte. Trykte beinanaloger deponeres i friform, med fleksibilitet for direkte høsting av utskriften eller tverrbinding i en levende cellematrise for multifasiske konstruksjoner.
Abstract
Strukturelt er beinvev en uorganisk-organisk kompositt som inneholder metabolsk aktive celler innebygd i en hierarkisk, høyt mineralisert matrise. Denne organisasjonen er utfordrende å replikere på grunn av det heterogene miljøet av bein. Keramisk omnidireksjonell bioprinting i cellesuspensjoner (COBICS) er en mikrogelbasert bioprintingsteknikk som unikt replikerer mineral- og cellestrukturen i bein. COBICS skriver ut komplekse, biologisk relevante konstruksjoner uten behov for offerstøttematerialer eller harde etterbehandlingstrinn (f.eks. stråling og høytemperatur sintring), som er to av de største utfordringene i additiv produksjon av benmimetiske konstruksjoner. Denne teknikken er aktivert via friformekstrudering av et nytt kalsiumfosfatbasert blekk i en gelatinbasert mikrogelsuspensjon. Suspensjonens utbyttespenningsegenskaper tillater avsetning og støtte den trykte beinstrukturen. UV-tverrbinding og nanoprecipitation "låser" den deretter på plass. Evnen til å skrive ut nanostrukturert bein-mimetisk keramikk i cellebelastede biomaterialer gir spatiotemporal kontroll over makro- og mikroarkitektur og letter sanntidsfabrikasjon av komplekse beinkonstruksjoner i kliniske omgivelser.
Introduction
Ben har bemerkelsesverdige regenereringsevner som en av de få strukturer i kroppen som kan helbrede ved å gjenskape sin normale cellulære sammensetning, orientering og mekaniske styrke frem til en kritisk defektstørrelse, når endogen helbredelseskapasitet er kompromittert1. Ben, sammen med brusk og leddbånd, støtter og letter kroppsbevegelse, samtidig som det lagrer mineraler og fett og produserer blodceller. Som et hardt, tett bindevev består bein hovedsakelig av en uorganisk fase, vann og organisk materiale som hovedsakelig består av kollagenfibre2. Celler er innebygd i denne svært mineraliserte matrisen av kollagen I-fibre og hydroksyapatitt (HA) krystaller, og danner en hierarkisk struktur3.
Den komplekse organiseringen av dette vevet gjør fremstillingen av syntetiske alternativer for å replikere de heterogene beinmikro- og nanomiljøene eksepsjonelt utfordrende3. Til dette formål har en rekke materialer, inkludert biokeramikk, cellebelastede hydrogeler og syntetiske materialer blitt foreslått som løsninger for å lage beinmatriser. Blant stillasfabrikasjonsteknikkene har 3D-utskriftsbaserte teknikker nylig dukket opp og fått mye oppmerksomhet fra vevsteknikkmiljøet på grunn av deres bemerkelsesverdige evne til å tillate fabrikasjon av svært sofistikerte og presise strukturer med stort løfte om pasientspesifikk behandling 4,5,6 . Hydrogeler har vært det mest populære valget av matrisehermere og bioblekk siden de kan skrives ut sammen med celler og bioaktive molekyler, og genererer funksjonelle konstruksjoner6. Hydrogeler mangler imidlertid de funksjonelle egenskapene til bein, som mekanisk styrke og en svært forkalket, uorganisk fase som inneholder metabolsk aktive celler.
3D-printede keramiske stillaser krever vanligvis etterbehandlingstrinn, inkludert sintring, høytemperaturbehandlinger eller bruk av sterke kjemikalier som må vaskes grundig før in vitro eller in vivo applikasjoner5. For å løse disse begrensningene utviklet Lode et al.7 nylig en α-tricalciumfosfatbasert pasta dannet av hydroksyapatitt, som kan skrives ut og settes under fysiologiske forhold. Dette materialet kan imidlertid fortsatt ikke skrives ut sammen med levende celler, da det krever etterbehandling i et fuktig miljø og påfølgende vandig løsning nedsenking i lang tid.
Alternativt har cellebelastede hydrogeler med uorganiske partikler innlemmet blitt foreslått som erstatning for 3D benmatrise 8,9. Til tross for deres store evne til å støtte cellens levedyktighet, er de ikke i stand til å rekapitulere det tett mineraliserte beinvevsmiljøet. Thrivikarman et al.10 vedtok en biomimetisk tilnærming der et overmettet kalsium- og fosfatmedium ble brukt med en ikke-kollagenøs proteinanalog for bedre å etterligne nanoskala apatittavsetningen. Imidlertid kan konstruksjonene deres fortsatt ikke generere stive 3D-konstruksjoner med mikro- og makroskala arkitektur som ligner bein.
Denne studien adresserer disse manglene gjennom utvikling av en utskriftsstrategi for å fremstille beinlignende konstruksjoner, i uorganiske og organiske faser, som er i stand til å integrere både celler og vekstfaktorer11. COBICS rekapitulerer unikt mineral- og cellestrukturen i bein ved hjelp av en mikrogelbasert bioprintingsteknikk. Protokollen her beskriver prosessen med å syntetisere keramiske beinblekk og gelatinbaserte mikrogeler og deretter kombinere celler som muliggjør COBICS. Prosessen begynner med syntesen av det viktigste forløpermaterialet til beinblekket. Den tverrbundne hydrogelen syntetiseres deretter og dannes til mikrogeler. Til slutt avsettes beinblekket omnidireksjonelt i et støttebad av mikrogelene lastet med celler (figur 1).
Benblekket kan skrives ut i en hvilken som helst suspensjon av mikrogeler som har de riktige utbyttespenningsegenskapene, det vil si evnen til å fluidisere ved en bestemt skjærhastighet og deretter støtte den avsatte strukturen. To fleksible tilnærminger har blitt demonstrert: en suspensjon bestående av gelatinmikrogeler og en suspensjon bestående av gelatinmetakrylat (GelMA) mikrogeler. Den førstnevnte suspensjonen oppløses når temperaturen heves til 37 °C, den reversible innebyggingen av suspenderte hydrogeler (FRESH) teknikk12, mens sistnevnte kan fotokrysbindes etter utskrift, effektivt "sy" mikrogelene sammen og låse det trykte beinblekket på plass. Denne studien fokuserer på å bruke GelMA som matrise, da den gir den unike fordelen av å kunne støtte cellevekst med in situ-utskrift av komplekse benmimetiske strukturer. Til syvende og sist muliggjør denne tilnærmingen generering av komplekse vevsmodeller med høye nivåer av biomimicry og brede implikasjoner for sykdomsmodellering, narkotikaforskning og regenerativ engineering.
Figur 1: Skjematisk for arbeidsflyten . (A) Benblekket syntetiseres fra α-tricalciumfosfatsyntese og dets påfølgende kombinasjon med glyserol, polysorbat 80 og ammoniumfosfatdibasisk. (B) GelMA-mikrogeler fremstilles ved vann-i-olje-emulsjonsmetoden. De oppnådde mikrogelene blir deretter (C) hydrert og (D) kombinert med celler. Celle-mikrogelkompositter brukes deretter som et granulært bad der beinblekket blir avsatt. (E) Hele konstruksjonen blir deretter UV-tverrbundet og overført til inkubatoren for kultur. Forkortelser: α-TCP = α-tricalciumfosfat; GelMA = gelatinmetakrylat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produksjon av beinblekk
- Syntese av α-tricalciumfosfat
- Vei ut kalsiumhydrogenfosfat (CaHPO4) og kalsiumkarbonat (CaCO 3) pulver i et3: 2 Ca: P molforhold. Bruk en slikkepott, homogeniser de to pulverene grundig.
- Tilsett kalsiumhydrogenfosfat-kalsiumkarbonatpulverblandingen til en zirkoniumdigel slik at den ikke er mer enn 75% full.
MERK: For å unngå forurensning, bruk en ny smeltedigel eller en smeltedigel som tidligere ble brukt til å lage det samme materialet. For å rengjøre, skyll med 100% etanol og lufttørk i en avtrekkshette til den er helt tørr før du tilsetter pulverene. - Overfør smeltedigelen til en ovn. Varm opp til 1 400 °C med en hastighet på 5 °C/min og hold i 3 timer.
- Slukk reaksjonen ved å fjerne smeltedigelen fra ovnen og la den ligge på toppen av en ildfast blokk. La den avkjøles helt før håndtering.
NOTAT: Bruk digeltang av passende lengde og sørg for tilstrekkelig varmebeskyttelse. - Bruk en mørtel og pistill til å bryte og male α-TCP-kaken slik at de resulterende granulatene har en maksimal størrelse på 200 μm.
NOTAT: Bruk en standard sil i rustfritt stål for å sikre riktig partikkelstørrelse. - Slip granulatene ytterligere ved hjelp av en planetmølle i to trinn. Tilsett først 3 mm yttria-stabiliserte zirkoniumkuler i et vektforhold på 8: 1 baller: pulver, deretter 100% etanol i et vektforhold på 3: 1 etanol: pulver. Fest lokket og slip i 2 timer ved 180 o / min.
- Samle suspensjonen og skill ballene, bruk 100% etanol til vask.
- Tørk suspensjonen i en ovn ved 120 °C i 24 timer.
- Tilsett tørket pulver i freseglass med 1 mm zirkoniumkuler og 100% etanol i samme vektforhold som i første trinn. Slip i 2 timer ved 180 o / min, separat og tørk.
MERK: Hele synteseprosedyren er representert i figur 1A.
- Formulering av ben-blekk
- For å lage beinblekk, tilsett 2 g α-TCP-pulver til en kulemøllekrukke som inneholder 630 μL glyserol og 130 μL polysorbat 80 mens du kontinuerlig omrører med en slikkepott.
- Tilsett 100 mg ammoniumfosfatdibasisk ((NH 4)2HPO4, APD) og rør for å kombinere.
MERK: Overdreven rest av væskefaser igjen på slikkepotten vil resultere i en forholdsubalanse mellom blekkkomponentene og dermed kinetikken til innstillingen. - Legg til en 25 mm zirkoniumkule, fest lokket og plasser det inne i en planetmølle i 60 minutter ved 180 o / min, og ta en pause halvveis for å skrape ned sidene av krukken med en slikkepott.
- Bruk en slikkepott til å legge blekket i en 1 ml sprøyte. Pakk tilstrekkelig for å unngå kontakt med fuktighet. Oppbevares ved −20 °C hvis den ikke brukes umiddelbart.
- Karakterisering av bein-blekk mikrostruktur
- Skriv ut benblekket i avionisert vann og la det stivne i 5 minutter.
- Vask prøven 3x med 100% etanol og la den tørke helt.
- Frakk med et tynt lag (15 nm tykkelse) gull.
- Ta mikrografer ved hjelp av et feltemisjonsskanningselektronmikroskop ved en akselerasjonsspenning på 5 kV.
2. Fremstilling av mikrogel suspensjoner for utskrift
- Syntese av GelMA
MERK: Denne prosedyren er testet for batchstørrelser som består av 10 g og 20 g gelatin. Denne metoden beskriver målinger for en batch ved bruk av 10 g.- Lag en 10% w løsning av gelatin type A (svin, Bloom styrke 300) i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) ved å veie ut 10 g gelatin og legge den til en konisk kolbe med 90 ml PBS. Varm opp til 50 °C under omrøring til gelatinen er helt oppløst.
- Tilsett 5,796 ml metakrylanhydrid. Sett en gummihette på den koniske kolben og fortsett å røre i mørket ved 50 °C i 90 min.
FORSIKTIG: Metakrylanhydrid er giftig ved innånding eller svelging og er hud- og øyeirriterende. Håndter bare inne i en avtrekksvifte og bruk passende PPE. - Slukk reaksjonen ved å fortynne den koniske kolbens innhold to ganger med PBS.
- Dekanter i 50 ml rør og sentrifuge ved 3000 × g ved romtemperatur i 3 minutter for å fjerne uomsatt metakrylanhydrid.
- Dialyser supernatanten inne i 14 kDa cutoff cellulosedialyserør mot avionisert vann ved 40 ° C i 5 dager under forsiktig omrøring. Bytt ut det avioniserte vannet hver dag.
- Forbered deg på lagring ved å dekantere i 50 ml rør, feste hetten og plassere den i kjøleskapet i 12 timer. Oppbevares i kjøleskap i opptil 7 dager.
- Frys med flytende nitrogen og lyofiliser umiddelbart i 5 dager ved -54 °C og 0,4 mbar.
MERK: Sørg for at rørene ikke inneholder mer enn 40 ml væske ved frysing. Når den er frossen, setter du på lokket med et deksel som tillater gassutveksling, for eksempel en delikat oppgavetørk festet med et elastisk bånd. - Oppbevar det resulterende skummet i en fryser ved -20 °C til det er nødvendig for mikrogelsuspensjonssyntese.
- Syntese av GelMA mikrogeler
MERK: Mikrogelene syntetiseres ved hjelp av en vann-i-olje-emulsjonsmetode13 (figur 2). Denne metoden er testet for GelMA-løsningsvolumer på 1-10 ml. Den samme protokollen kan brukes til å syntetisere gelatinmikrogeler som brukes til å skrive ut frittstående beintrykk.- Lag en 10% w GelMA-løsning i PBS ved å veie den lyofiliserte GelMA, legge den til et rør med PBS og varme opp i et vannbad ved 50 ° C til den er fullstendig hydrert.
- Tilsett 37 ml olje per 1 ml GelMA-løsning til et beger, slik at det ikke er mer enn 65% fullt.
- Sett opp et dobbeltbegersystem på en kokeplate med magnetisk omrøring ved å plassere begeret som inneholder olje inne i et større beger.
MERK: Størrelsen på de to begerglassene skal være slik at is lett kan slippes ned i rommet mellom veggene. Oppsettet er vist i figur 2. - Varm opp til 40 °C under omrøring.
MERK: Forsikre deg om at virvelen ikke er turbulent og har en dybde på omtrent 1/3 av høyden på oljen i begeret. - Legg GelMA-løsningen i en sprøyte og tilsett den dråpevis i omrøringsoljen gjennom et 0,45 μm filter. La emulsjonen balansere i 10 minutter.
- Reduser temperaturen på emulsjonen til 15 °C for å termisk stabilisere kulene ved å tilsette knust is i rommet mellom de to begerglassene.
- Tilsett aceton til den spinnende emulsjonen i et volumforhold på 1:11 GelMA-løsning til aceton.
NOTAT: Tilsett acetonen forsiktig gjennom en trakt for å unngå å forstyrre emulsjonen. Rør i 60 min. - Dekanter innholdet i begeret i 50 ml rør, sørg for å vaske veggene i begeret med aceton. La stå i 20 minutter for å la de dehydrerte mikrogelene slå seg ned til bunnen.
- Kast supernatanten og vask minst 2x med aceton.
MERK: Supernatanten skal være tydelig. - Konsolider i ett rør, fyll opp med aceton og sonikere i 10 s. Vask 2x med aceton.
- Oppbevares i aceton ved romtemperatur til det er nødvendig for utskrift.
- Klargjøring av GelMA-mikrogelsuspensjonen for utskrift
- Klargjør en 1 % løsning av GelMA i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ved å veie lyofilisert GelMA inn i et rør, tilsette DMEM og varme opp i et vannbad ved 50 °C til den er fullstendig hydrert.
- Fordamp acetonet fra dehydrerte mikrogeler og vei det resulterende pulveret inn i et rør. Tilsett aceton og overfør til et sterilt miljø.
- For å danne mikrogelsuspensjonen, fordamp acetonet og tilsett DMEM, 1% w / w GelMA-løsning i DMEM og 2,5% w / w litiumfenyl-2,4,6-trimetylbenzoylfosfinat (LAP) initiatorløsning for å oppnå en endelig pakningsfraksjon på 30%. La det hydreres fullt ut i minst 12 timer ved romtemperatur. Oppbevares i kjøleskap i opptil 7 dager. La det komme opp til romtemperatur før bruk.
MERK: Volumene av disse reagensene er basert på mikrogelenes tørrvekt og kan beregnes ved hjelp av ligningene i tabell 1.
| Ligning | |
| x = vekt av tørre mikrogeler (mg) | |
| Volum på 1 % w/w GelMA i DMEM, a (μL) | a = 21,93x |
| Volum av DMEM, b (μL) | b = 8,773x |
| Volum på 2,5 % w/w LAP oppløsning, c (μL) | c = 0,6267x |
| Totalt volum av mikrogel suspensjon produsert (μL) | a + b + c |
Tabell 1: Ligninger for beregning av volumene av reagenser som kreves for å hydrere GelMA-mikrogelsuspensjonene. Forkortelser: GelMA = gelatinmetakrylat; LAP = litiumfenyl-2,4,6-trimetylbenzoylfosfinat.
Figur 2: Skjematisk av olje-emulsjonsmetoden som brukes til mikrogelsyntese. Dobbeltbegeroppsettet viser et beger som inneholder omrøringsemulsjonen (indikert med pil) plassert inne i et større beger for å tillate avkjøling. Forkortelse: GelMA = gelatinmetakrylat Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Utskrift av benblekk i cellesuspensjoner
MERK: Gelatinbaserte mikrogeler støtter adhesjon av mange forskjellige celletyper, noe som gjør denne tilnærmingen mottagelig for enkelt- og flere celler i mikrogelmatrisen. Denne protokollen beskriver prosedyren for bruk av fettavledede mesenkymale stamceller (ADSC), da dette er en populær og robust celletype for muskel- og skjelettvevsteknikk.
- Dyrk ADSC-ene i lavglukose DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C og 5% CO2 til sammenløpende.
- Løsne ADSC-ene fra vevskulturflasken ved å fjerne mediet, vaske med steril PBS og inkubere ved 37 °C og 5 % CO2 med 0,25 % trypsin i 3 minutter.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 150 × g ved romtemperatur i 5 minutter.
- Tell cellene og beregn 5 × 105 celler for hver 1 ml GelMA-mikrogeler. Allokere det nødvendige volumet av cellesuspensjon til et separat rør og pellet som ovenfor.
- Fjern forsiktig så mye supernatant som mulig ved hjelp av en pipette, og la bare cellepelleten være. Tilsett det nødvendige volumet av mikrogelsuspensjon til pelleten og aspirer forsiktig for å sikre jevn cellefordeling.
MERK: Hvis det er overflødige luftbobler i suspensjonen, sentrifuger du forsiktig for å fjerne og pipetter opp og ned for å omfordele cellene. - Legg den cellebelastede mikrogelsuspensjonen i en reaktor ved hjelp av en pipette.
MERK: I denne studien ble 10 mm x 10 mm x 3 mm reaktorer med en volumkapasitet på 100 μL 3D-trykt. - Pant benblekk med en 1 ml sprøyte utstyrt med en 23 G kanyle.
MERK: Dette kan gjøres med en 3D-skriver enten ved å ettermontere et ekstruderingssystem som gjør det mulig å skrive ut direkte fra 1 ml sprøyten, eller ved å legge benblekket direkte i skriverens ekstruderingskassett (figur 3). - Tverrbinding av celle- og beinblekkbelastet GelMA-mikrogelkonstruksjon med UV-tverrbindingslampe (405 nm) i 90 s. Overfør umiddelbart til en passende størrelse brønnplate og deksel med komplett DMEM.
MERK: De nevnte 3D-printede reaktorene passer inn i 24-brønns cellekulturplater. - Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2. Bytt ut kulturmediet etter 24 timer, deretter hver 48-72 timer etter behov.
Figur 3: Skjematisk fremstilling av COBICS-prosedyren som viser hydrering av mikrogeler, inkorporering av celler og påfølgende utskrift av benblekk i den cellebelastede mikrogelsuspensjonen. Forkortelse: COBICS = keramisk omnidireksjonell bioprinting i cellesuspensjoner; GelMA = gelatinmetakrylat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Cell levedyktighet og spredning vurdering
- For å vurdere cytotoksisitet med benblekk, hold cellebelastede COBIC-konstruksjoner i komplett kulturmedium. Utfør en Live Dead-analyse ved 24 timer, 72 timer og 120 timer (eller relevante tidspunkter).
- På hvert tidspunkt, vask konstruksjonene med PBS, og tilsett deretter en løsning av fenolfri DMEM som inneholder 4 mM calcein og 2 mM ethidiumbromid. Inkuber i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2.
- Vask med PBS og overfør til en glassbunnet tallerken for avbildning med et konfokalt mikroskop ved Ex/Em-spektra på 494/517 nm og 528/617 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
COBICS skriver ut komplekse, biologisk relevante konstruksjoner uten behov for offerstøttematerialer eller harde etterbehandlingstrinn (f.eks. stråling og høytemperatur sintring) som er to av de største utfordringene i additiv produksjon av benmimetiske konstruksjoner. For å demonstrere COBICS-dannelse av komplekse beinstrukturer og samtidig utskrift av celler i mikrogelsuspensjoner, ble det tatt representative bilder av beinlignende kompositter laget av beinblekk, og en semikvantitativ analyse av ADSC-levedyktighet i COBIC i opptil 7 dager ble utført. Figur 4 viser evnen til å fremstille komplekse beinlignende strukturer ved avsetning av beinblekk i støttebadet sammensatt av gelatinmikrogeler, som oppfører seg som en ikke-newtonsk væske, og reagerer som et fast stoff som begynner å strømme som en viskøs væske under høyt skjærspenning. De trykte konstruksjonene kan deretter isoleres fra det tyktflytende badet (figur 4A, B).
Skriveren som brukes til å realisere de beinlignende konstruksjonene i figur 4 , er en multihead-skriver utstyrt med en tilpasset ekstruder. En milliliter av beinblekket ble lastet inn i en 3 ml utskriftssprøyte, som ble montert i ekstruderen. Alle nålene som ble brukt hadde en indre diameter på 0,2-0,8 mm. Datamodeller av de beinlignende strukturene ble opprettet ved hjelp av en CAD-modelleringsprogramvare og konvertert til STL-filer, hvoretter G-koden ble generert. Konstruksjonene ble trykt i 96-brønns cellekulturplater som inneholdt gelatinmikrogeler og komplett medium ved hjelp av en 0,2 mm nål. Etter utskrift fikk konstruksjonene lov til å sette seg inne i støttebadene i 6 minutter før de ble fjernet med pinsett.
Gelatinmikrogeler har blitt tverrbundet med glutaraldehyd for å tillate deres kultur under de fysiologiske forholdene på 37 ° C og 5% CO2, sammen med celler11. I denne studien ble systemet implementert ved fremstilling av GelMA-mikrogeler, noe som gjorde at hele konstruksjonen kunne være UV-tverrbundet (figur 4C) for termisk stabilitet og frysetørket for langtidslagring og transport (figur 4D, E). Lyofiliserte prøver kan rehydreres i destillert vann, PBS eller cellekulturmedium for å gjenopprette sin opprinnelige struktur (figur 4E). Benblekket ble analysert ved å skanne elektronmikroskopi (SEM) for å bestemme mikrostrukturen (figur 4F), som viste dannelsen av hydroksyapatittkrystall etter blekkinnstilling, spesielt synlig i tørr tilstand (figur 4Fii).
I denne studien ble celler blandet med GelMA-mikrogeler og holdt i kultur i opptil 5 dager, enten bare i mikrogelsuspensjon (figur 5A) eller i COBICS-systemet, som beskrevet i protokollavsnitt 3. Cellene viste god levedyktighet i nærvær av beinblekk, både på dag 1 og dag 5, noe som bekreftet at utvaskingsproduktene til blekket ikke var skadelige for cellene (figur 5B). Utskrift av nanostrukturert benmimetisk keramikk i cellebelastede biomaterialer gir spatiotemporal kontroll over makro- og mikroarkitektur, noe som letter sanntidsfabrikasjon av komplekse beinkonstruksjoner i kliniske omgivelser.
Figur 4: Eksempel på 3D-printede konstruksjoner trykt av COBICS. (A) Menneskelig osseous labyrint; (B) spiralformet harversisk kanal. (C) Bilder av benblekk trykt i GelMA-mikrogeler; (D) frysetørket og (E) rehydrert prøve. (F) SEM-bilder av ettertrykt benblekk som viser dannelsen av HA-krystaller, i (i) våte og (ii) tørre forhold. Skalastenger = (A,E) 3 mm, (C) 2 mm, (B) 1 mm, (Fi) 100 μm, (Fii) 3 μm. Figur 4A,B er fra Romanazzo et al.11. Forkortelser: COBICS = keramisk omnidireksjonell bioprinting i cellesuspensjoner; GelMA = gelatinmetakrylat; SEM = skanning elektronmikroskopi; HA = hydroksyapatitt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Levende/døde flekker. (A) ADSC-er dyrket med GelMA-mikrogeler; (B) ADSC-er dyrket i nærvær av benblekk (illustrert i hvitt), som viser høy celle levedyktighet både på dag 1 og dag 5. Bilder tatt med 10x forstørrelse. Innfelte bilder viser z-stabler av de respektive konstruksjonene på dag 5 med beinblekk illustrert i hvitt. Skala barer = 200 μm. Forkortelser: ADSCs = fettavledede mesenkymale stamceller; GelMA = gelatinmetakrylat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D-utskriftsteknikken COBICS ble utviklet for å muliggjøre fremstilling av mineraliserte beinlignende strukturer via ekstrudering til en tverrbindingsbar mikrogelsuspensjon som inneholder levende celler. Teknikken har blitt brukt på en nedbrytbar mikrogelsuspensjon, og celler viser god levedyktighet, spredning og osteogen differensieringsevne i systemet11. En viktig determinant for suksessen til konstruksjoner opprettet ved hjelp av denne teknikken er riktig syntese av α-TCP-basert beinblekk. For det første er dannelsen av α-TCP sterkt avhengig av tilstrekkelig temperaturkontroll. For dannelsen av riktig fase av trikalsiumfosfat er det viktig å slukke reaksjonen innenfor området 1,400-1,200 °C før den krysser fasegrensen til β-TCP-fasefeltet14. Røntgendiffraksjonsanalyse kan brukes til å bekrefte enfaset α-TCP-sammensetning. Deretter er blandingen av alle benblekkforløperne i de riktige proporsjonene avgjørende for dannelsen av en beinblekk med optimale strømningsegenskaper for ekstruderingsutskrift, innstillingstid og nano-mikrostrukturdannelse. Siden GelMA-mikrogelsuspensjonen tillater "låsing" av de trykte strukturene via fotocrosslinking, kan proporsjonene av forløpermaterialer justeres for å optimalisere for 3D-skriveren som brukes. Det anbefales imidlertid sterkt å foreta grundig testing for å sikre at dette ikke kompromitterer integriteten til teknikken.
En avgjørende faktor under GelMA-syntese er at alle uomsatte metakrylanhydrid og sure biprodukter fjernes via tilstrekkelig sentrifugering og dialyse. Dialyse må utføres i minst den angitte tidsperioden, da metakrylanhydrid og sure biprodukter er cytotoksiske og kan påvirke cellens levedyktighet. Videre vil en lavere pH kompromittere gelenes strukturelle integritet og kan påvirke innstillingen av beinblekk. Lyofilisering for den angitte tidsperioden er avgjørende for beregning av riktig vektprosent ved fremstilling av GelMA-løsninger for syntese av mikrogelsuspensjonen. Lyofilisering i en kortere periode enn spesifisert kan føre til at adsorbert vann blir regnskapsført i tørrvekten til GelMA, noe som fører til at de resulterende mikrogelene inneholder en lavere vektprosent av GelMA og dermed er mye svakere enn beregnet. GelMA-graden av funksjonalisering (DoF) påvirker kovalent hydrogeldannelse og dermed hydrogelstabilitet. Den optimale DoF ble funnet å være 95%.
Et annet kritisk skritt er vann-i-olje-emulsjonssyntesen av mikrogeler. Spinnhastigheten påvirker størrelsen på mikrogelene som dannes. Raskere spinnhastigheter vil tillate fabrikasjon av mindre mikrogeler; Men hvis virvelen er turbulent, vil emulsjonen ikke stabilisere seg, og mikrogelsyntesen vil mislykkes. Omvendt vil en for lav spinnhastighet føre til at GelMA-løsningen samler seg til en masse i stedet for å danne en stabil emulsjon. I denne studien genererte kombinasjonen av viskositeten til oljen og spinnhastigheten som ble brukt mikrogeler med en gjennomsnittlig diameter på 100 μm når de ble hydrert. Det anbefales sterkt å utføre tilstrekkelig testing for å stille inn kombinasjonen av oljetype og omrøringshastighet for å gi konsistente ønskelige resultater.
En begrensning av COBICS-teknikken er at parametrene til blekkformuleringen kan kreve litt finjustering for å optimalisere ekstrudering med forskjellige skrivere. Selv om utformingen av teknikken gjør at den kan være modulær, betyr det også at en grad av prøving og feiling kanskje må utøves av brukere for å oppnå de ønskede resultatene med utstyret som er tilgjengelig for dem. Som tidligere nevnt gir bruken av en fotocrosslinkbar mikrogelsuspensjon mildhet over parametere via låsing av de trykte strukturene. Videre er den nåværende batchstørrelsen begrenset til 2 ml benblekk per krukke. Dette kan løses ved å ha flere krukker, noe som tillater syntese av flere partier av formuleringen. Dette kan heller ikke være nødvendig, avhengig av de spesifikke strømningsegenskapene som brukeren krever for utstyret og applikasjonen. Igjen anbefales passende testing fra brukerens side.
Avslutningsvis letter COBICS utskriften av et optimalisert, nanostrukturert, benmimetisk keramisk blekk i cellebelastede biomaterialer. Denne teknikken gir spatiotemporal kontroll over makro- og mikroarkitektur mens den fremstiller komplekse beinstrukturer. Bruken av mikrogeler muliggjør stabilisering av beinblekk, mens GelMA-mikrogeler spesielt forbedrer utskriftsintegriteten ved fotocrosslinking-mediert låsing og gir tilstrekkelige tomrom for celleproliferasjon og migrasjon. Tilnærmingen beskrevet her har potensielle anvendelser innen beinvevsteknikk, sykdomsmodellering og narkotikascreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne National Health and Medical Research Council (Grant nr. GNT1111694 og GNT1141602) og Australian Research Council (Grant nr. FT180100417, FL150100060 og CE14100036). Forfatterne ønsker å anerkjenne Biomedical Imaging Facility ved University of New South Wales. Figurene ble opprettet med Biorender.com, Adobe Photoshop og Adobe Illustrator og har blitt eksportert under et betalt abonnement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer Extruder | Hyrel3D | EMO-25 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | BDAA352070 | |
| Absolute Ethanol 100% Denatured | Chem-Supply | ||
| Acetone | Chem-Supply | 154871 | |
| Alumina crucible | Coors | ||
| Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4) | Sigma | A5764 | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | ||
| Biosafety cabinet level 2 | |||
| Calcium carbonate | Sigma | 239216 | |
| Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4) | Sigma | C7263 | |
| Cell culture flasks | Corning | various volumes used | |
| Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off | Sigma | D9777 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL | |
| Dispensing Tip, 23 G | Nordson | 7018302 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo FIsher | 11885084 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo FIsher | 14190144 | |
| Elevator furnace | Labec | ||
| Engine HR Multihead Printer | Hyrel3D | ||
| Fetal Bovine Serum | Bovogen | ||
| Gelatin type A, from porcine skin | Sigma | G2500 | |
| General Purpose Stainless Steel Tips | Nordson EF | ||
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Human adipose derived stem cells | ATCC | PCS-500-011 | |
| LSM 800 Confocal Microscope | ZEISS | ||
| Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus) | Christ | 101541 | |
| Magnetic hot plate and stirrer | |||
| Methacrylic anhydride | Sigma | 276685 | |
| Mini 2 Desktop 3D Printer | LulzBot | ||
| Parafilm sealing film | Parafilm | PM996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo FIsher | 15140122 | |
| Planetary ball mill | |||
| Planetary ball mill jar | |||
| Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80 | Sigma | P6224 | |
| Scanning electron microscope | FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM | ||
| Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech | 18813156 | |
| Stainless steel standard test sieve | |||
| Sunflower Oil | Community Co | ||
| Trypsin-EDTA 0.25% phenol red | Thermo FIsher | 25200056 | |
| ZEN Microscope Software | ZEISS | ||
| Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
| DMEM, low glucose, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 |
References
- Bates, P., Ramachandran, M. Bone injury, healing and grafting. Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , CRC Press. Boca Raton, FL. 123-134 (2007).
- Lin, X., et al. The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration. Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).
- Reznikov, N., et al. A materials science vision of extracellular matrix mineralization. Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).
- Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
- Lin, K., et al. 3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives. Materials. 12 (17), 2660 (2019).
- Qu, M., et al. Multi-dimensional printing for bone tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).
- Lode, A., et al. Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).
- Bernal, P. N., et al. Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds. Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).
- Diloksumpan, P., et al. Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces. Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).
- Thrivikraman, G., et al. Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization. Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Phromsopha, T., Baimark, Y. Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery. International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).
- Moreno, D., et al. Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications. Boletín de la Sociedad Española de Cerámica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).
