Summary
Detta protokoll beskriver en 3D-utskriftsteknik för att tillverka benliknande strukturer genom att deponera ett kalciumfosfatbläck i ett gelatinbaserat granulärt stöd. Tryckta benanaloger deponeras i friform, med flexibilitet för direkt skörd av utskriften eller tvärbindningen i en levande cellmatris för multifasiska konstruktioner.
Abstract
Strukturellt är benvävnad en oorganisk-organisk komposit som innehåller metaboliskt aktiva celler inbäddade i en hierarkisk, mycket mineraliserad matris. Den här organisationen är utmanande att replikera på grund av den heterogena miljön i ben. Keramisk rundstrålande bioprinting i cellsuspensioner (COBICS) är en mikrogelbaserad bioprintningsteknik som unikt replikerar benets mineral- och cellstruktur. COBICS skriver ut komplexa, biologiskt relevanta konstruktioner utan behov av offerstödmaterial eller hårda efterbehandlingssteg (t.ex. strålning och högtemperatursintring), som är två av de största utmaningarna vid additiv tillverkning av benmimetiska konstruktioner. Denna teknik möjliggörs genom friformsextrudering av ett nytt kalciumfosfatbaserat bläck i en gelatinbaserad mikrogelsuspension. Suspensionens utbytesspänningsegenskaper möjliggör avsättning och stöder den tryckta benstrukturen. UV-tvärbindning och nanoprecipitation "låser" den sedan på plats. Förmågan att skriva ut nanostrukturerad benmimetisk keramik i cellbelastade biomaterial ger spatiotemporal kontroll över makro- och mikroarkitektur och underlättar tillverkning i realtid av komplexa benkonstruktioner i kliniska miljöer.
Introduction
Ben har anmärkningsvärda regenereringsförmågor som en av få strukturer i kroppen som kan läka genom att återskapa sin normala cellulära sammansättning, orientering och mekaniska styrka fram till en kritisk defektstorlek, när endogen läkningskapacitet äventyras1. Ben, tillsammans med brosk och ligament, stöder och underlättar kroppens rörelse, samtidigt som det lagrar mineraler och fetter och producerar blodkroppar. Som en hård, tät bindväv består ben huvudsakligen av en oorganisk fas, vatten och organiskt material som huvudsakligen består av kollagenfibrer2. Celler är inbäddade i denna mycket mineraliserade matris av kollagen I-fibrer och hydroxiapatitkristaller (HA) och bildar en hierarkisk struktur3.
Den komplexa organisationen av denna vävnad gör tillverkningen av syntetiska alternativ för att replikera de heterogena benmikro- och nanomiljöerna exceptionellt utmanande3. För detta ändamål har en mängd olika material, inklusive biokeramik, cellbelastade hydrogeler och syntetiska material föreslagits som lösningar för att skapa benmatriser. Bland byggnadsställningstillverkningsteknikerna har 3D-utskriftsbaserade tekniker nyligen dykt upp och fått mycket uppmärksamhet från vävnadstekniksamhället på grund av deras anmärkningsvärda förmåga att möjliggöra tillverkning av mycket sofistikerade och exakta strukturer med stort löfte om patientspecifik behandling 4,5,6 . Hydrogeler har varit det mest populära valet av matrishärmningar och biobläck eftersom de kan skrivas ut tillsammans med celler och bioaktiva molekyler, vilket genererar funktionella konstruktioner6. Hydrogeler saknar emellertid de funktionella egenskaperna hos ben, såsom mekanisk hållfasthet och en mycket förkalkad, oorganisk fas innehållande metaboliskt aktiva celler.
3D-tryckta keramiska byggnadsställningar kräver vanligtvis efterbehandlingssteg, inklusive sintring, högtemperaturbehandlingar eller användning av hårda kemikalier som måste tvättas noggrant före in vitro - eller in vivo-applikationer 5. För att ta itu med dessa begränsningar utvecklade Lode et al.7 nyligen en α-tricalciumfosfatbaserad pasta bildad av hydroxiapatit, som kan skrivas ut och ställas in under fysiologiska förhållanden. Detta material kan emellertid fortfarande inte skrivas ut tillsammans med levande celler eftersom det kräver efterbehandling i fuktig miljö och efterföljande nedsänkning av vattenlösning under en lång period.
Alternativt har cellbelastade hydrogeler med oorganiska partiklar införlivade föreslagits som ersättning för 3D-benmatris 8,9. Trots sin stora förmåga att stödja cellviabilitet kan de inte rekapitulera den tätt mineraliserade benvävnadsmiljön. Thrivikarman et al.10 antog ett biomimetiskt tillvägagångssätt där ett övermättat kalcium- och fosfatmedium användes med en icke-kollagenös proteinanalog för att bättre efterlikna apatitavsättningen i nanoskala. Men deras konstruktioner kan fortfarande inte generera styva 3D-konstruktioner med mikro- och makroskalaarkitektur som liknar ben.
Denna studie adresserar dessa brister genom utvecklingen av en tryckstrategi för att tillverka benliknande konstruktioner, i oorganiska och organiska faser, som kan integrera både celler och tillväxtfaktorer11. COBICS rekapitulerar unikt benets mineral- och cellstruktur med hjälp av en mikrogelbaserad bioprintningsteknik. Protokollet häri beskriver processen att syntetisera de keramiska benbläck- och gelatinbaserade mikrogelerna och sedan kombinera celler som möjliggör COBICS. Processen börjar med syntesen av benbläckets huvudsakliga prekursormaterial. Den tvärbindande hydrogelen syntetiseras sedan och formas till mikrogeler. Slutligen avsätts benbläcket rundstrålande i ett stödbad av mikrogelerna lastade med celler (figur 1).
Benbläcket kan skrivas ut i vilken suspension som helst av mikrogeler som har lämpliga utbytesspänningsegenskaper, det vill säga förmågan att fluidisera med en specifik skjuvhastighet och därefter stödja den avsatta strukturen. Två flexibla tillvägagångssätt har påvisats: en suspension bestående av gelatinmikrogeler och en suspension bestående av gelatinmetakrylatmikrogeler (GelMA). Den förstnämnda suspensionen löses upp när temperaturen höjs till 37 °C, den reversibla friformsinbäddningen av suspenderade hydrogeler (FRESH) teknik12, medan den senare kan fotokorskopplas efter utskrift, effektivt "sy" ihop mikrogelerna och låsa det tryckta benbläcket på plats. Den aktuella studien fokuserar på att använda GelMA som matris eftersom det ger den unika fördelen att kunna stödja celltillväxt med in situ-utskrift av komplexa benmimetiska strukturer. I slutändan möjliggör detta tillvägagångssätt generering av komplexa vävnadsmodeller med höga nivåer av biomimik och breda konsekvenser för sjukdomsmodellering, läkemedelsupptäckt och regenerativ teknik.
Bild 1: Schematisk bild av arbetsflödet . (A) Ben-bläcket syntetiseras med utgångspunkt från α-tricalciumfosfatsyntes och dess efterföljande kombination med glycerol, polysorbat 80 och ammoniumfosfat dibasisk. (B) GelMA-mikrogeler tillverkas med vatten-i-olja-emulsionsmetoden. De erhållna mikrogelerna hydratiseras sedan (C) och (D) kombineras med celler. Cell-mikrogelkompositer används sedan som ett granulärt bad där benbläcket deponeras. (E) Hela konstruktionen är sedan UV-tvärbunden och överförs till inkubatorn för odling. Förkortningar: α-TCP = α-tricalciumfosfat; GelMA =gelatinmetakrylat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillverkning av benbläck
- Syntes av α-tricalciumfosfat
- Väg upp kalciumvätefosfat (CaHPO4) och kalciumkarbonat (CaCO3) pulver i ett molförhållande på 3:2 Ca:P. Använd en spatel och homogenisera de två pulverna noggrant.
- Tillsätt kalciumvätefosfat-kalciumkarbonatpulverblandningen till en zirkoniumdegel så att den inte är mer än 75% full.
OBS: För att undvika kontaminering, använd en ny degel eller en degel som tidigare använts för att tillverka samma material. För att rengöra, skölj med 100% etanol och lufttorka i en dragskåp tills den är helt torr innan du tillsätter pulverna. - Överför degeln till en ugn. Värm till 1 400 °C med en hastighet av 5 °C/min och håll i 3 timmar.
- Släck reaktionen genom att ta bort degeln från ugnen och lämna den ovanpå ett eldfast block. Låt den svalna helt innan du hanterar den.
OBS: Använd degeltång av lämplig längd och säkerställ tillräckligt värmeskydd. - Använd en mortel och stöt för att bryta och slipa α-TCP-kakan så att de resulterande granulerna har en maximal storlek på 200 μm.
OBS: Använd en standard sil i rostfritt stål för att säkerställa korrekt partikelstorlek. - Ytterligare slipa granulerna med hjälp av en planetkvarn i två steg. Tillsätt först 3 mm yttriastabiliserade zirkoniumoxidbollar i ett viktförhållande på 8: 1 bollar: pulver, sedan 100% etanol i ett viktförhållande på 3: 1 etanol: pulver. Säkra locket och slipa i 2 timmar vid 180 rpm.
- Samla suspensionen och separera bollarna med 100% etanol för tvätt.
- Torka suspensionen i ugn vid 120 °C i 24 timmar.
- Tillsätt det torkade pulvret i fräsburkar med 1 mm zirkoniumkulor och 100% etanol i samma viktförhållanden som i det första steget. Slipa i 2 timmar vid 180 rpm, separera och torka.
OBS: Hela syntesproceduren representeras i figur 1A.
- Formulering av benbläck
- För att göra benbläcket, tillsätt 2 g α-TCP-pulver till en kulkvarnsburk som innehåller 630 μl glycerol och 130 μl polysorbat 80 under kontinuerlig omrörning med en spatel.
- Tillsätt 100 mg ammoniumfosfatdibasiskt ((NH 4)2HPO4, APD) och rör om för att kombinera.
OBS: Överdriven rest av vätskefaser kvar på spateln kommer att resultera i en obalans mellan bläckkomponenterna och därmed inställningens kinetik. - Tillsätt en 25 mm zirkoniumoxidkula, säkra locket och placera den i en planetkvarn i 60 minuter vid 180 varv / min, pausa halvvägs för att skrapa ner burkens sidor med en spatel.
- Ladda bläcket med en spatel i en 1 ml spruta. Vik in tillräckligt för att undvika kontakt med fukt. Förvaras vid −20 °C om det inte används omedelbart.
- Karakterisering av benbläckmikrostruktur
- Skriv ut benfärgen i avjoniserat vatten och låt stelna i 5 minuter.
- Tvätta provet 3x med 100% etanol och låt det torka helt.
- Coat med ett tunt lager (15 nm tjocklek) av guld.
- Fånga mikrografer med hjälp av ett fältemissionssvepelektronmikroskop vid en accelerationsspänning på 5 kV.
2. Tillverkning av mikrogelsuspensioner för tryckning
- Syntes av GelMA
OBS: Denna procedur har testats för satsstorlekar bestående av 10 g och 20 g gelatin. Denna metod beskriver mätningar för en sats med 10 g.- Gör en 10 viktprocent lösning av gelatin typ A (svin, blomningsstyrka 300) i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att väga ut 10 g gelatin och tillsätta det till en E-kolv med 90 ml PBS. Värm till 50 °C under omrörning tills gelatinet är helt upplöst.
- Tillsätt 5.796 ml metakrylanhydrid. Placera ett gummilock på E-kolven och fortsätt omrörningen i mörker vid 50 °C i 90 minuter.
VARNING: Metakrylanhydrid är giftigt vid inandning eller förtäring och är irriterande för hud och ögon. Hantera endast inuti en dragskåp och använd lämplig personlig skyddsutrustning. - Släck reaktionen genom att dela ut innehållet i e-kolven tvåfaldigt med PBS.
- Häll i 50 ml rör och centrifugera vid 3 000 × g vid rumstemperatur i 3 minuter för att avlägsna oreagerade metakrylanhydrid.
- Dialysera supernatanten inuti 14 kDa cutoff cellulosadialysrör mot avjoniserat vatten vid 40 °C i 5 dagar under försiktig omrörning. Byt ut det avjoniserade vattnet varje dag.
- Förbered för förvaring genom att dekantera i 50 ml rör, säkra locket och placera det i kylen i 12 timmar. Förvaras i kylskåp i upp till 7 dagar.
- Frys med flytande kväve och frystorkas omedelbart i 5 dagar vid −54 °C och 0,4 mbar.
OBS: Se till att rören inte innehåller mer än 40 ml vätska vid frysning. När det är fryst, byt ut locket med ett lock som möjliggör gasutbyte, till exempel en känslig uppgiftsservett säkrad med ett elastiskt band. - Förvara det resulterande skummet i en frys vid −20 °C tills det krävs för mikrogelsuspensionssyntes.
- Syntes av GelMA mikrogeler
OBS: Mikrogelerna syntetiseras med hjälp av en vatten-i-olja-emulsionsmetod13 (figur 2). Denna metod har testats för GelMA-lösningsvolymer på 1-10 ml. Samma protokoll kan användas för att syntetisera gelatinmikrogeler som används för att skriva ut fristående benutskrifter.- Gör en 10% w / w GelMA-lösning i PBS genom att väga den frystorkade GelMA, lägga den i ett rör med PBS och värma i ett vattenbad vid 50 ° C tills den är helt hydratiserad.
- Tillsätt 37 ml olja per 1 ml GelMA-lösning till en bägare, så att den inte är mer än 65% full.
- Sätt upp ett dubbelbägaresystem på en värmeplatta med magnetisk omrörning genom att placera bägaren som innehåller olja i en större bägare.
OBS: Storleken på de två bägarna ska vara sådan att is lätt kan släppas i utrymmet mellan deras väggar. Inställningen visas i bild 2. - Värm till 40 °C under omrörning.
OBS: Se till att virveln inte är turbulent och har ett djup på ungefär 1/3 av oljans höjd i bägaren. - Fyll GelMA-lösningen i en spruta och tillsätt den droppvis i omrörningsoljan genom ett 0,45 μm filter. Låt emulsionen balansera i 10 minuter.
- Sänk emulsionens temperatur till 15 °C för att termiskt stabilisera sfärerna genom att tillsätta krossad is i utrymmet mellan de två bägarna.
- Tillsätt aceton till den snurrande emulsionen i ett volymförhållande på 1:11 GelMA-lösning till aceton.
OBS: Tillsätt acetonen försiktigt genom en tratt för att undvika att störa emulsionen. Rör om i 60 min. - Dekantera innehållet i bägaren i 50 ml rör, se till att tvätta bägarens väggar med aceton. Låt stå i 20 min så att de uttorkade mikrogelerna sätter sig i botten.
- Kassera supernatanten och tvätta minst 2x med aceton.
OBS: Supernatanten ska vara tydlig. - Konsolidera i ett rör, fyll på med aceton och sonika i 10 s. Tvätta 2x med aceton.
- Förvara i aceton vid rumstemperatur tills det behövs för utskrift.
- Förbereda GelMA mikrogelsuspension för utskrift
- Förbered en 1% w / w-lösning av GelMA i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) genom att väga frystorkad GelMA i ett rör, tillsätta DMEM och värma i ett vattenbad vid 50 ° C tills den är helt hydratiserad.
- Indunsta acetonen från de uttorkade mikrogelerna och väg det resulterande pulvret i ett rör. Tillsätt aceton och överför till en steril miljö.
- För att bilda mikrogelsuspensionen, avdunsta acetonen och tillsätt DMEM, 1% w / w GelMA-lösning i DMEM och 2,5% w litiumfenyl-2,4,6-trimetylbensoylfosfinat (LAP) initiatorlösning för att uppnå en slutlig förpackningsfraktion på 30%. Låt hydrera helt i minst 12 timmar vid rumstemperatur. Förvaras i kylskåp i upp till 7 dagar. Låt komma upp i rumstemperatur före användning.
OBS: Volymerna av dessa reagenser baseras på mikrogelernas torrvikt och kan beräknas med hjälp av ekvationerna i tabell 1.
| Ekvation | |
| x = vikten av torra mikrogeler (mg) | |
| Volym på 1 viktprocent GelMA i DMEM, a (μl) | a = 21,93x |
| Volym DMEM, b (μL) | b = 8,773x |
| Volym av 2,5% vikt / vikt LAP-lösning, c (μL) | c = 0,6267x |
| Total volym producerad mikrogelsuspension (μL) | A + B + C |
Tabell 1: Ekvationer för beräkning av de volymer reagenser som krävs för att hydrera GelMA-mikrogelsuspensionerna. Förkortningar: GelMA = gelatinmetakrylat; LAP = litiumfenyl-2,4,6-trimetylbensoylfosfinat.
Figur 2: Schematisk över den oljeemulsionsmetod som används för mikrogelsyntes. Dubbelbägarens inställning visar en bägare som innehåller omrörningsemulsionen (indikerad med pil) placerad i en större bägare för att möjliggöra kylning. Förkortning: GelMA = gelatinmetakrylat Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Skriva ut benbläck i cellsuspensioner
OBS: Gelatinbaserade mikrogeler stöder vidhäftningen av många olika celltyper, vilket gör detta tillvägagångssätt mottagligt för enstaka och flera celler i mikrogelmatrisen. Detta protokoll beskriver proceduren för användning av fett-härledda mesenkymala stamceller (ADSC), eftersom detta är en populär och robust celltyp för muskuloskeletal vävnadsteknik.
- Odla ADSC i DMEM med låg glukoshalt kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin vid 37 ° C och 5% CO2 tills det är sammanflytande.
- Lossa ADSC:erna från vävnadskolven genom att avlägsna mediet, tvätta med steril PBS och inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 med 0,25 % trypsin i 3 minuter.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 150 × g vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Räkna cellerna och beräkna 5 × 105 celler för varje 1 ml GelMA-mikrogeler. Fördela den erforderliga volymen cellsuspension till ett separat rör och pellets enligt ovan.
- Ta försiktigt bort så mycket supernatant som möjligt med en pipett och lämna endast cellpelleten. Tillsätt önskad volym mikrogelsuspension till pelleten och aspirera försiktigt för att säkerställa jämn cellfördelning.
OBS: Om det finns överflödiga luftbubblor i suspensionen, centrifugera försiktigt för att avlägsna och pipettera upp och ner för att omfördela cellerna. - Ladda den cellbelastade mikrogelsuspensionen i en reaktor med hjälp av en pipett.
OBS: I den aktuella studien 3D-printades 10 mm x 10 mm x 3 mm reaktorer med en volymkapacitet på 100 μL. - Sätt in benbläck med en 1 ml spruta försedd med en 23 G nål.
Detta kan göras med en 3D-skrivare antingen genom att eftermontera ett extruderingssystem som gör det möjligt att skriva ut direkt från sprutan på 1 ml eller genom att ladda benbläcket direkt i skrivarens extruderingspatron (bild 3). - Tvärbinda den cell- och benbläckbelastade GelMA-mikrogelkonstruktionen med en UV-tvärbindningslampa (405 nm) i 90 s. Överför omedelbart till en lämplig storlek på brunnsplattan och täck med komplett DMEM.
OBS: De ovannämnda 3D-tryckta reaktorerna passar inuti 24-brunns cellodlingsplattor. - Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2. Byt ut odlingsmediet efter 24 timmar, sedan var 48-72: e timme efter behov.
Figur 3: Schematisk representation av COBICS-proceduren som visar hydrering av mikrogeler, införlivande av celler och efterföljande utskrift av benbläck i den cellbelastade mikrogelsuspensionen. Förkortning: COBICS = keramisk rundstrålande bioprinting i cellsuspensioner; GelMA = gelatinmetakrylat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Bedömning av cellviabilitet och spridning
- För att bedöma cytotoxicitet med benbläck, håll cellbelastade COBICS-konstruktioner i komplett odlingsmedium. Utför en Live Dead-analys vid 24 h, 72 h och 120 h (eller relevanta tidpunkter).
- Tvätta konstruktionerna med PBS vid varje tidpunkt och tillsätt sedan en lösning av fenolfri DMEM innehållande 4 mM kalcein och 2 mM etidiumbromid. Inkubera i 1 timme vid 37 °C och 5 %CO2.
- Tvätta med PBS och överför till en glasbottnad skål för avbildning med ett konfokalmikroskop vid Ex / Em-spektra på 494/517 nm och 528/617 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
COBICS skriver ut komplexa, biologiskt relevanta konstruktioner utan behov av offerstödmaterial eller hårda efterbehandlingssteg (t.ex. strålning och högtemperatursintring) som är två av de största utmaningarna vid additiv tillverkning av benmimetiska konstruktioner. För att demonstrera COBICS-bildning av komplexa benstrukturer och samtryck av celler i mikrogelsuspensioner togs representativa bilder av benliknande kompositer gjorda av benbläcket och en semikvantitativ analys av ADSC-viabilitet i COBICS i upp till 7 dagar utfördes. Figur 4 visar förmågan att tillverka komplexa benliknande strukturer genom avsättning av benbläck i stödbadet bestående av gelatinmikrogeler, som beter sig som en icke-newtonsk vätska och svarar som ett fast ämne som börjar strömma som en viskös vätska under hög skjuvspänning. De tryckta konstruktionerna kan sedan isoleras från det viskösa badet (figur 4A,B).
Skrivaren som används för att realisera de benliknande konstruktionerna i figur 4 är en flerhuvudskrivare utrustad med en anpassad extruder. En milliliter av benbläcket laddades i en 3 ml tryckspruta, som monterades i extrudern. Alla nålar som användes hade en innerdiameter på 0,2-0,8 mm. Datormodeller av de benhärmade strukturerna skapades med hjälp av en CAD-modelleringsprogramvara och konverterades till STL-filer, varefter G-koden genererades. Konstruktionerna trycktes i 96-brunns cellodlingsplattor innehållande gelatinmikrogeler och komplett medium med en 0,2 mm nål. Efter tryckning fick konstruktionerna ställas in i stödbadet i 6 min innan de togs bort med pincett.
Gelatinmikrogeler har tvärbundits med glutaraldehyd för att möjliggöra deras odling under de fysiologiska förhållandena 37 ° C och 5%CO2, tillsammans med celler11. I den aktuella studien implementerades systemet genom tillverkning av GelMA-mikrogeler, vilket gjorde att hela konstruktionen kunde vara UV-tvärbunden (figur 4C) för termisk stabilitet och frystorkad för långvarig lagring och transport (figur 4D,E). Frystorkade prover kan rehydreras i destillerat vatten, PBS eller cellodlingsmedium för att återställa sin ursprungliga struktur (figur 4E). Benbläcket analyserades med svepelektronmikroskopi (SEM) för att bestämma dess mikrostruktur (figur 4F), som visade bildandet av hydroxiapatitkristall efter bläckinställning, särskilt synlig i torrt tillstånd (figur 4Fii).
I denna studie blandades celler med GelMA-mikrogeler och hölls i odling i upp till 5 dagar, antingen endast i mikrogelsuspension (figur 5A) eller i COBICS-systemet, som beskrivs i protokollavsnitt 3. Cellerna visade god livskraft i närvaro av benbläcket, både vid dag 1 och dag 5, vilket bekräftade att bläckets utlakningsprodukter inte var skadliga för cellerna (figur 5B). Utskrift av nanostrukturerad benmimetisk keramik inom cellbelastade biomaterial ger spatiotemporal kontroll över makro- och mikroarkitektur, vilket underlättar tillverkning i realtid av komplexa benkonstruktioner i kliniska miljöer.
Figur 4: Exempel på 3D-utskrivna konstruktioner som skrivits ut av COBICS. (A) Mänsklig osseous labyrint; (B) spiralformad Harversian-kanal. (C) Bilder av benbläck tryckta i GelMA-mikrogeler; D) Frystorkat och E) rehydratiserat prov. (F) SEM-bilder av postprintat benbläck som visar bildandet av HA-kristaller, under i) våta och ii) torra förhållanden. Skalstänger = (A,E) 3 mm, (C) 2 mm, (B) 1 mm, (Fi) 100 μm, (Fii) 3 μm. Figur 4A,B är från Romanazzo et al.11. Förkortningar: COBICS = keramisk rundstrålande bioprinting i cellsuspensioner; GelMA = gelatinmetakrylat; SEM = svepelektronmikroskopi; HA = hydroxiapatit. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Levande/död färgning. (A) ADSC odlade med GelMA-mikrogeler; (B) ADSC odlade i närvaro av benbläck (illustrerat med vitt) och som uppvisar hög cellviabilitet både vid dag 1 och dag 5. Bilder tagna med 10x förstoring. Infällda bilder visar z-staplar av respektive konstruktion vid dag 5 med benbläcket illustrerat i vitt. Skalstänger = 200 μm. Förkortningar: ADSC = fett-härledda mesenkymala stamceller; GelMA = gelatinmetakrylat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D-utskriftstekniken COBICS utvecklades för att möjliggöra tillverkning av mineraliserade benliknande strukturer via extrudering till en tvärbindbar mikrogelsuspension innehållande levande celler. Tekniken har tillämpats på en nedbrytbar mikrogelsuspension, och celler visar god livskraft, spridning och osteogen differentieringsförmåga inom systemet11. En viktig faktor för framgången för konstruktioner som skapats med denna teknik är korrekt syntes av det α-TCP-baserade benbläcket. För det första är bildandet av α-TCP starkt beroende av adekvat temperaturkontroll. För bildandet av den korrekta fasen av trikalciumfosfat är det viktigt att släcka reaktionen inom intervallet 1 400–1 200 °C innan den passerar fasgränsen till β-TCP-fasfält14. Röntgendiffraktionsanalys kan användas för att bekräfta enfas α-TCP-kompositionen. Därefter är blandningen av alla benbläckprekursorer i rätt proportioner avgörande för bildandet av ett benbläck med optimala flödesegenskaper för extruderingstryck, inställningstid och nano-mikrostrukturbildning. Eftersom GelMA-mikrogelsuspensionen möjliggör "låsning" av de tryckta strukturerna via fotocrosslinking, kan proportionerna av prekursormaterial ställas in för att optimera för den 3D-skrivare som används. Det rekommenderas dock starkt att genomföra grundliga tester för att säkerställa att detta inte äventyrar teknikens integritet.
Ett avgörande övervägande under GelMA-syntesen är att all oreagerad metakrylanhydrid och sura biprodukter avlägsnas via adekvat centrifugering och dialys. Dialys måste utföras under minst den angivna tiden, eftersom metakrylanhydrid och sura biprodukter är cytotoxiska och kan påverka cellviabiliteten. Dessutom kommer ett lägre pH att äventyra gelernas strukturella integritet och kan påverka inställningen av benbläcket. Lyofilisering under den angivna tiden är avgörande för beräkningen av rätt viktprocent vid framställning av GelMA-lösningar för syntes av mikrogelsuspensionen. Frystorkning under en period som är kortare än specificerad kan orsaka att adsorberat vatten redovisas i GelMA: s torrvikt, vilket gör att de resulterande mikrogelerna innehåller en lägre viktprocent av GelMA och därmed är mycket svagare än avsett. GelMA-graden av funktionalisering (DoF) påverkar kovalent hydrogelbildning och därmed hydrogelstabilitet. Den optimala DoF visade sig vara 95%.
Ett annat kritiskt steg är vatten-i-olja-emulsionssyntesen av mikrogeler. Centrifugeringshastigheten påverkar storleken på de bildade mikrogelerna. Snabbare centrifugeringshastigheter möjliggör tillverkning av mindre mikrogeler; Men om virveln är turbulent kommer emulsionen inte att stabiliseras, och mikrogelsyntesen kommer att misslyckas. Omvänt kommer en för låg centrifugeringshastighet att få GelMA-lösningen att samlas i en massa istället för att bilda en stabil emulsion. I den aktuella studien genererade kombinationen av oljans viskositet och den använda centrifugeringshastigheten mikrogeler med en medeldiameter på 100 μm när de hydratiserades. Det rekommenderas starkt att utföra adekvat testning för att ringa in kombinationen av oljetyp och omrörningshastighet för att ge konsekvent önskvärda resultat.
En begränsning med COBICS-tekniken är att parametrarna för bläckformuleringen kan kräva viss finjustering för att optimera extrudering med olika skrivare. Även om teknikens utformning gör att den kan vara modulär, betyder det också att en viss grad av försök och fel kan behöva utövas av användare för att uppnå de önskade resultaten med den utrustning som är tillgänglig för dem. Som tidigare nämnts ger användningen av en fotocrosslinkerbar mikrogelsuspension lenience över parametrar via låsning av de tryckta strukturerna. Vidare är den aktuella batchstorleken begränsad till 2 ml benbläck per burk. Detta kan åtgärdas genom att ha flera burkar, vilket möjliggör syntes av flera satser av formuleringen. Detta kanske inte heller krävs beroende på de specifika flödesegenskaper som krävs av användaren för deras utrustning och tillämpning. Återigen rekommenderas lämplig testning från användarens sida.
Sammanfattningsvis underlättar COBICS utskriften av ett optimerat, nanostrukturerat, benmimetiskt keramiskt bläck i cellbelastade biomaterial. Denna teknik ger spatiotemporal kontroll över makro- och mikroarkitektur samtidigt som komplexa benstrukturer tillverkas. Användningen av mikrogeler möjliggör stabilisering av benbläcket, medan GelMA-mikrogeler i synnerhet förbättrar utskriftsintegriteten genom fotocrosslinking-medierad låsning och ger tillräckliga tomrum för cellproliferation och migration. Tillvägagångssättet som beskrivs här har potentiella tillämpningar inom benvävnadsteknik, sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna National Health and Medical Research Council (Grant no. GNT1111694 och GNT1141602) och Australian Research Council (Grant no. FT180100417, FL150100060 och CE14100036). Författarna vill uppmärksamma den biomedicinska bildbehandlingsanläggningen vid University of New South Wales. Figurer skapades med Biorender.com, Adobe Photoshop och Adobe Illustrator och har exporterats under en betald prenumeration.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer Extruder | Hyrel3D | EMO-25 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | BDAA352070 | |
| Absolute Ethanol 100% Denatured | Chem-Supply | ||
| Acetone | Chem-Supply | 154871 | |
| Alumina crucible | Coors | ||
| Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4) | Sigma | A5764 | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | ||
| Biosafety cabinet level 2 | |||
| Calcium carbonate | Sigma | 239216 | |
| Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4) | Sigma | C7263 | |
| Cell culture flasks | Corning | various volumes used | |
| Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off | Sigma | D9777 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL | |
| Dispensing Tip, 23 G | Nordson | 7018302 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo FIsher | 11885084 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo FIsher | 14190144 | |
| Elevator furnace | Labec | ||
| Engine HR Multihead Printer | Hyrel3D | ||
| Fetal Bovine Serum | Bovogen | ||
| Gelatin type A, from porcine skin | Sigma | G2500 | |
| General Purpose Stainless Steel Tips | Nordson EF | ||
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Human adipose derived stem cells | ATCC | PCS-500-011 | |
| LSM 800 Confocal Microscope | ZEISS | ||
| Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus) | Christ | 101541 | |
| Magnetic hot plate and stirrer | |||
| Methacrylic anhydride | Sigma | 276685 | |
| Mini 2 Desktop 3D Printer | LulzBot | ||
| Parafilm sealing film | Parafilm | PM996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo FIsher | 15140122 | |
| Planetary ball mill | |||
| Planetary ball mill jar | |||
| Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80 | Sigma | P6224 | |
| Scanning electron microscope | FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM | ||
| Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech | 18813156 | |
| Stainless steel standard test sieve | |||
| Sunflower Oil | Community Co | ||
| Trypsin-EDTA 0.25% phenol red | Thermo FIsher | 25200056 | |
| ZEN Microscope Software | ZEISS | ||
| Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
| DMEM, low glucose, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 |
References
- Bates, P., Ramachandran, M. Bone injury, healing and grafting. Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , CRC Press. Boca Raton, FL. 123-134 (2007).
- Lin, X., et al. The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration. Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).
- Reznikov, N., et al. A materials science vision of extracellular matrix mineralization. Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).
- Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
- Lin, K., et al. 3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives. Materials. 12 (17), 2660 (2019).
- Qu, M., et al. Multi-dimensional printing for bone tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).
- Lode, A., et al. Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).
- Bernal, P. N., et al. Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds. Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).
- Diloksumpan, P., et al. Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces. Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).
- Thrivikraman, G., et al. Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization. Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Phromsopha, T., Baimark, Y. Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery. International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).
- Moreno, D., et al. Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications. Boletín de la Sociedad Española de Cerámica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).
