Summary
Os biobancos são recursos cruciais para a investigação biomédica e a Unidade Biobank for Translational and Digital Medicine do Instituto Europeu de Oncologia é um modelo neste domínio. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada dos procedimentos operacionais padrão dos biobancos para o manejo de diferentes tipos de amostras biológicas humanas.
Abstract
Os biobancos são infraestruturas de pesquisa fundamentais destinadas à coleta, armazenamento, processamento e compartilhamento de amostras biológicas humanas de alta qualidade e dados associados para pesquisa, diagnóstico e medicina personalizada. O Biobank for Translational and Digital Medicine Unit do Instituto Europeu de Oncologia (IEO) é um marco neste campo. Os biobancos colaboram com divisões clínicas, grupos de pesquisa internos e externos e a indústria, apoiando o tratamento e o progresso científico dos pacientes, incluindo diagnósticos inovadores, descoberta de biomarcadores e design de ensaios clínicos. Dado o papel central dos biobancos na pesquisa moderna, os procedimentos operacionais padrão (POPs) de biobancos devem ser extremamente precisos. SOPs e controles por especialistas certificados garantem a mais alta qualidade de amostras para a implementação de estratégias personalizadas baseadas em ciência, diagnóstico, prognóstico e terapêutico. No entanto, apesar dos inúmeros esforços para padronizar e harmonizar os biobancos, esses protocolos, que seguem um conjunto rigoroso de regras, controles de qualidade e diretrizes baseadas em princípios éticos e legais, não são facilmente acessíveis. Este trabalho apresenta os procedimentos operacionais padrão do biobanco de um grande centro oncológico.
Introduction
Os biobancos são biorrepositórios voltados para a coleta, armazenamento, processamento e compartilhamento de amostras biológicas humanas e dados associados para pesquisa e diagnóstico. Seu papel é crucial não apenas para a descoberta e validação de biomarcadores, mas também para o desenvolvimento de novos fármacos1. Assim, a grande maioria dos programas de pesquisa translacional e clínica depende do acesso a bioespécimes de alta qualidade. Nesse sentido, os biobancos são considerados uma ponte entre a pesquisa acadêmica e a indústria farmacêutica/biotecnológica 2,3,4,5. Devido às oportunidades sem precedentes proporcionadas pela coleta de big data e pela inteligência artificial, o papel dos biobancos na pesquisa do câncer está em constante evolução6.
O amplo espectro de biomateriais manuseados pelos biobancos é acoplado a informações clínico-patológicas, incluindo dados demográficos e ambientais, tipo de tumor, grau histológico, estágio, presença de invasão linfovascular e status dos biomarcadores 7,8. Quanto mais espécimes e dados de alta qualidade estiverem disponíveis, mais rápido a pesquisa avançará e impactará a prestação de cuidados de saúde9. Existe um marco regulatório rigoroso baseado em princípios éticos e legais que devem seguir POPs, controles de qualidade e diretrizes amplamente adotados (por exemplo, o Instituto Nacional do Câncer dos EUA, a Confederação de Biobancos do Câncer do Reino Unido e a Sociedade Internacional de Repositórios Biológicos e Ambientais da UE)10,11.
O desenvolvimento de POPs para todos os principais aspectos dos biobancos traz diversas vantagens em termos de qualidade, rastreabilidade, consistência, reprodutibilidade e tempos de resposta12,13. Outro aspecto importante da implementação do SOP é representado pela otimização da gestão do biobanco, que permite uma melhor resolução de problemas e procedimentos alternativos para os funcionários e pesquisadores do biobanco14. Todas essas facetas fazem parte do fluxo de trabalho do biobanco (Figura 1).
Figura 1: Diferentes fatores que contribuem para a otimização do biobanking. Abreviação: LIMS = sistema de gerenciamento de informações laboratoriais. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Esses dados altamente específicos e sensíveis exigem procedimentos rígidos de padrão gerencial no biobanking. Um formulário de projeto detalhado e validado deve ser disponibilizado a todos os pesquisadores que precisam ter acesso às amostras e dados do biobanco. As informações fornecidas na solicitação devem incluir a metodologia e o design do estudo, as metas, os objetivos e o orçamento. Deve ser criado um Comité Técnico-Científico do biobanco, com o papel capital da avaliação das candidaturas a projectos de investigação. Este órgão deve incluir membros da unidade de biobanco, divisões clínicas, grupos de pesquisa, proteção de dados, escritório jurídico e escritório de transferência de tecnologia.
O Biobanco para a Unidade de Medicina Translacional e Digital do Instituto Europeu de Oncologia (IEO) é uma referência mundial para os biobancos em termos de qualidade e quantidade de serviços prestados, bem como de inovação. Esta instalação totalmente certificada (UNI EN ISO 9001:2015-Certiquality) é parte integrante do nó italiano BBMRI-ERIC (ou seja, Biobanking e BioMolecular Resources Research Infrastructure) e interage com as unidades clínicas e a infraestrutura de pesquisa.
Há grande heterogeneidade nos tipos de bioespécimes armazenados pelos biobancos. Estes incluem amostras de tecido - frescos congelados ou preservados com parafina - biofluidos (por exemplo, plasma, soro, sangue, urina, fezes), culturas celulares e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). O nosso biobanco opera em sinergia com a infraestrutura europeia de investigação para biobancos (BBMRI-ERIC), que é uma das maiores redes de biobancos da Europa e fornece um portal de acesso a biobancos e recursos biomoleculares coordenados por nós nacionais15. Além do BBMRI-ERIC, a International Society for Biological and Environmental Repositories (ISBER) também tem desempenhado um papel importante na padronização dos procedimentos operacionais para o biobanking16.
A Unidade Biobanco, que integra a Divisão de Patologia, está comprometida com a centralidade do doente, o apoio ao desenvolvimento da investigação clínica, a melhoria contínua, a valorização dos recursos humanos, a colaboração internacional, o apoio a eventos de formação, a segurança no local de trabalho e o crescimento científico e tecnológico. A visão comum é estabelecer os marcos nacionais e europeus para os biobancos em termos de qualidade e quantidade de serviços e inovação. As amostras biológicas coletadas são usadas para identificar novos biomarcadores e novos medicamentos (por exemplo, para desenvolver terapias cada vez mais personalizadas) e para garantir o melhor tratamento disponível para os pacientes por meio da excelência em pesquisa.
Cada espécime biológico é coletado e manuseado após verificação prévia para a presença do Acordo de Participação em Pesquisa Científica expresso pelo paciente15. Os espécimes biológicos coletados são usados para conduzir projetos de pesquisa ou ensaios clínicos e incluem excesso (ou seja, não necessário para fins de diagnóstico) de amostras cirúrgicas patológicas e não patológicas, biópsias líquidas (por exemplo, sangue, soro, plasma e urina) e outras amostras biológicas. Estes biomateriais são armazenados de acordo com protocolos de criopreservação dedicados. Este artigo fornece os protocolos de biobanco de um grande centro de câncer.
Protocol
Este protocolo se concentra nos POPs usados para câncer de mama, ovário, próstata, pulmão e cólon. Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Técnico Científico, Comitê de Ética (CE) e pelos Diretores dos Programas de Mama, Ginecologia, Urologia, Cirurgia Torácica e Cirurgia do Sistema Digestivo. Os procedimentos do estudo seguem a Declaração de Helsinque de 1964, a lei do Regulamento Geral de Proteção de Dados (GDPR) de 2018 e as alterações subsequentes. Um Acordo de Participação em Pesquisa (RPA) institucional, derivado da lei GDPR, representa o consentimento informado obtido de todos os pacientes para coletar amostras biológicas e dados pessoais, clínicos e genéticos. A RPA foi obtida de todos os pacientes para armazenamento, processamento e uso dos dados obtidos para fins científicos.
1. Pré-requisitos das amostras biológicas
- Verifique se um paciente atende às condições para inscrição com base no protocolo RPA e projetos e forneça uma descrição detalhada do RPA a todos os pacientes.
- Aumentar o envolvimento do paciente, por exemplo, transmitir um vídeo de desenho animado educativo nas salas de espera para informar os pacientes sobre a importância e o impacto da RPA. Forneça marcadores de gadgets para todos os pacientes (veja a animação de desenho animado curta de livre acesso em https://www.ieo.it/it/PER-I-PAZIENTI/I-diritti-del-paziente/Consensi-informati/ e https://vimeo.com/679070846).
- Treinar o pessoal para realizar a administração do consentimento durante cada fase de hospitalização e fornecer informações adicionais se os pacientes participarem de um estudo específico.
NOTA: Se o RPA não estiver assinado, as amostras biológicas não serão recolhidas. - Evite incluir casos que tenham apresentado infecção por SARS-CoV-2 (COVID-19), hepatite B (HBV), hepatite C (HCV) e vírus da imunodeficiência humana (HIV).
2. Software do Biobanco
- Use o software de sistema de gerenciamento de informações laboratoriais (LIMS) para rastrear todas as amostras biológicas. Garantir a disponibilidade de um bom sistema operacional que obtenha automaticamente informações pessoais e clínicas no momento do registro do paciente e possa ser integrado aos prontuários, processos administrativos, RPA e dados patológicos do paciente, como mostra a Figura 2.
- Garantir o registro das amostras biológicas utilizando o software do biobanco.
- Identifique pacientes usando códigos. Atribua um código exclusivo a cada indivíduo, que corresponda ao número do prontuário (visita individual, tipo de serviço do paciente).
Observação : durante o registro, o RPA científico é atualizado eletronicamente no sistema operacional.
- Identifique pacientes usando códigos. Atribua um código exclusivo a cada indivíduo, que corresponda ao número do prontuário (visita individual, tipo de serviço do paciente).
- Gerar um ID de alíquota
- Indicar o ano e o sítio anatômico ou o tipo de biofluido (Tabela 1) de onde a amostra se origina (Tabela 2) e adicionar um número único progressivo por amostra.
- Para órgãos bilaterais, adicionar um número sequencial para distinguir a origem da amostra biológica do órgão direito ou esquerdo. Atribua a abreviatura com o sufixo 1 (para a esquerda) ou 2 (para a direita) - dois dígitos.
NOTA: Por exemplo, um ID detalhado se parece com "12-B-00100-01", onde 12 indica o ano e B indica o órgão = mama.
- Registre-se com um ID para cada alíquota
- Acompanhe dois tipos macro de amostras biológicas: sólidos e líquidos.
- Divida em subcategorias: amostras frescas e amostras congeladas.
Figura 2: Uma interface representativa do biobanco LIMS. O RPA científico é atualizado eletronicamente a partir do servidor de registros clínicos. Abreviaturas: LIMS = sistema de gestão da informação laboratorial; RPA = Acordo de Participação em Pesquisa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Tipos de biofluidos e códigos correspondentes. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Tipos de amostras de tecidos e códigos correspondentes. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
3. Coleta de amostras
- Preparação diária do plano de cirurgia
- Determine se o paciente assinou o RPA ou não e se eles são elegíveis.
- Verifique as seguintes condições:
- Verificar a conformidade do paciente com os critérios de inclusão: relatar qualquer caso positivo de HIV, HBV, HCV e COVID-19 no campo apropriado de risco infeccioso "IR" para evitar a coleta de amostras biológicas.
- Verifique se o paciente está inscrito em um ensaio clínico ou projeto de pesquisa aprovado específico, preenchendo corretamente o campo Estudo/Projeto em cada perfil de paciente.
- Informar os técnicos se o risco de infecção é desconhecido; descartar espécimes com resultados positivos ou riscos desconhecidos.
- Processar e armazenar amostras no biobanco, conforme apresentado na Figura 3.
- Coletar amostras de tecido fresco e congelado relacionadas a pacientes submetidos à cirurgia.
- Coletar amostras citológicas, seja por técnicas aspirativas ou esfoliativas, para pequenas lesões removidas cirurgicamente.
- Coletar fluidos biológicos (por exemplo, sangue, soro, plasma, CMSP, swab bucal, urina, fezes e ascite) de pacientes no estágio de pré-hospitalização, pacientes inscritos em ensaios clínicos e qualquer outro sujeito envolvido em projetos de triagem aprovados.
Figura 3: Exemplo de hierarquia. A partir de um único paciente, várias subcategorias de episódios são processadas e armazenadas no biobanco. Abreviaturas: PMBCs = células mononucleares do sangue periférico; LIMS = sistema de gerenciamento de informações laboratoriais. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Coleta de amostras de sangue
- Recolher o sangue do doente em 6 ml de vacutainers contendo o anticoagulante Na 2 EDTA (7,2 mg, seco por pulverização). Registre os vacutainers rotulados com o número do prontuário médico e o código do episódio e processe-os de duas maneiras diferentes: frescos ou congelados.
- Para amostras frescas, registre as amostras de sangue no software do biobanco. Rotule os vacutainers com o código de identificação do biobanco e entregue-os aos usuários autorizados.
- Para amostras congeladas armazenadas no biobanco, preparar dois tubos codificados Cryobank 2D, cada um com 900 μL de sangue (Figura 4). Registre as alíquotas no software do biobanco, coloque-as em uma placa de código de barras específica e armazene-as em freezers (-80 °C) para garantir uma temperatura constante.
Figura 4: Materiais de amostra congelados . (A) Tubos de código de barras 2D, (B) leitor de código de barras para tubo único e (C) placa de tubos para registro e armazenamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Coleta de amostras de soro
- Coletar o sangue do paciente em 6 mL vacutainer "tubos de soro plástico" contendo sílica revestida por spray para induzir a coagulação. Deixar os vacutainers durante 3 h à temperatura ambiente (RT) para induzir a coagulação e, em seguida, centrifugar a 828 x g durante 10 min a 20 °C.
- Armazenar soro (450 μL) em tubos codificados Cryobank 2D de 0,5 mL com um total de 3-4 alíquotas para cada amostra. Se o volume sérico da última alíquota for inferior a 450 μL, especifique-o como "SOBRA" durante o registo para rastrear a quantidade correta de soro congelado.
- Registre as alíquotas no software do biobanco, coloque-as em uma placa de código de barras específica e armazene-as em freezers (-80 °C) para garantir uma temperatura constante.
NOTA: O número de alíquotas depende da quantidade inicial de sangue total colhida e da quantidade de soro obtida.
6. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico
- Abra o exaustor de fluxo laminar e limpe-o com etanol a 70%. Prepare o saco para resíduos biológicos, solução salina estéril 1x tamponada com fosfato (PBS) e um tubo cônico estéril de 50 mL vazio.
- Despeje o sangue (dos tubos de coleta de EDTA) no tubo cônico estéril vazio de 50 mL e dilua-o 1:1 usando PBS estéril 1x (por exemplo, 15 mL de sangue + 15 mL de 1x PBS). Use o PBS para enxaguar o tubo de sangue.
- Centrifugar os tubos a 400 x g durante 30 minutos a 20 °C e processar os tubos sob um exaustor de risco biológico. Recupere a camada branca média contendo PBMCs usando uma pipeta Pasteur e coloque-a em um novo tubo cônico estéril de 50 mL. Adicionar até 45 mL de PBS para lavar os PBMCs, misturar e centrifugar a 400 x g por 10 min a 4 °C. Recupere o pellet, ressuspeite-o em PBS e conte as células usando câmaras de Burker descartáveis.
NOTA: O volume do PBS depende do pellet. A partir de 15 mL de sangue, certifique-se de um volume de ressuspensão de 2-3 mL e, em seguida, uma diluição de 1:10 para contar. Use a equação (1):
Média de 3 quadrados × 10.000 fatores de diluição × × mL de volume de ressuspensão = número total de células (1) - Lavar novamente os PBMCs com PBS, misturar e centrifugar a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Diluir os PBMCs a 2-3 x 106 células/mL em meio freezer (soro fetal bovino (FBS) + 10% de dimetilsulfóxido [DMSO]). Prepare os tubos codificados 2D do Cryobank transferindo 1 mL de células ressuspensas para cada criotubo, coloque-os em uma caixa de crio específica e armazene-os a -80 °C o mais rápido possível.
NOTA: O meio congelador é composto por FBS com DMSO estéril a 10% e armazenado em alíquotas a -20 °C por até 6 meses. Uma vez descongelado lentamente a 4 °C, deve ser utilizado no prazo de 2 semanas.
7. Coleta de amostras de plasma
- Recolher o sangue do doente em 6 ml de vacutainers contendo o anticoagulante Na 2 EDTA (7,2 mg, seco por pulverização). Centrifugar o vacutainer que contém o sangue total a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C para separar o plasma.
- Remova a camada superior do plasma usando uma pipeta Pasteur de 3 mL, transfira para um tubo estéril cônico estéril de 15 mL e centrifugar a 16.000 x g por 10 min a 4 °C para eliminar as células sanguíneas contaminantes. Transfira o plasma para tubos codificados Cryobank 2D de 1 mL.
- Registre as alíquotas no software do biobanco, coloque-as em uma placa de código de barras específica e armazene-as em um freezer (-80 °C) para garantir uma temperatura constante.
8. Coleta de amostras de fezes e swab bucal
- Coletar fezes e swabs bucais em tubos de 15 mL contendo a seguinte solução específica: 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl e 10 mM EDTA, pH 7,5.
- Registre os tubos no software do biobanco. Rotule os tubos com os códigos do biobanco.
- Conservar as fezes e as zaragatoas bucais a 4 °C no frigorífico do biobanco.
9. Processamento de tecidos
- Ter amostras de tecido examinadas por um patologista para determinar se o material que não é necessário para procedimentos de diagnóstico é suficiente para fins de pesquisa.
NOTA: Quando o volume de tecido é inferior a 1,5 mm3, é armazenado em OCT ou fornecido como uma nova amostra (A) ligada a um pedido de investigação específico. - Sempre que possível, colete até mesmo a contraparte não patológica (NP) do tecido patológico (P). Colocar as amostras em placas de Petri de cultura de células estéreis rotuladas como P e NP (Figura 5). Mantenha o tecido no gelo a 4 °C e divida-o em três partes cada (A, B e C) se houver material suficiente disponível.
- Amostras de tecido fresco (A): colocar alíquotas frescas de tecido P e NP em tubos com o meio de cultura apropriado definido em cada protocolo específico e enviá-las para unidades de pesquisa externas (por exemplo, laboratórios de pesquisa).
- Amostras de tecido OCT (B): colocar alíquotas frescas de tecido P e NP em criomoldes, preenchê-las com resina OCT (10,24% de álcool polivinílico, 4,26% de polietilenoglicol e 85,5% de ingredientes não reativos) e colocá-las imediatamente em um aparelho de congelamento instantâneo a -80 °C.
NOTA: A -80 °C, o tecido incorporado em OCT demora de 60 a 150 s para congelar. - Amostras de tecido (C): colocar as amostras de tecido restantes em tubos codificados 2D Cryobank no aparelho de congelamento flash.
- Conservar as placas a -80 °C.
NOTA: Para cada alíquota OCT congelada, efectuar um ensaio de verificação de qualidade antes da distribuição e da sua utilização para efectuar uma avaliação histológica, tal como descrito na secção 11.
Figura 5: Fluxo de trabalho do biobanco para amostras de tecido. Abreviaturas: LIMS = sistema de gestão da informação laboratorial; OCT = temperatura de corte ideal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
10. Congelamento de tecidos
- Congelar o tecido rapidamente em vapores de isopentano usando um aparelho de congelamento flash. Coloque as amostras de tecido em isopentano a -120 °C durante 3 min e guarde-as nas salas de criopreservação a -80 °C.
NOTA: Duas metodologias são usadas para congelar amostras de tumor e tecido saudável usando congelamento flash para manter a integridade dos ácidos nucleicos.
11. Controle de qualidade dos tecidos
- Posicione o instrumento de criostato em um recipiente refrigerado a uma temperatura entre -20 ° C e -40 ° C e corte algumas criosecções do blocoOCT 17. Realizar coloração de hematoxilina e eosina (H&E) na criosecção tecidual18. Analisar a morfologia do tecido sob microscópio óptico19.
NOTA: As seções têm uma espessura adequada de 3-12 μm.- Preencha um formulário específico (Tabela 3).
Tabela 3: Forma de controle de qualidade de seções de tecido congeladas e embutidas em OCT. Abreviação: OCT = temperatura de corte ideal. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
12. Solicitação e recuperação de espécimes para fins de pesquisa
- Solicite alíquotas armazenadas:
- Obtenha um formulário preenchido com o nome do projeto de pesquisa, o investigador principal (PI), a data de retirada e uma breve descrição. Execute uma consulta no banco de dados de software (DB), selecione a alíquota, gere uma lista de coleta para os técnicos e verifique o código de barras para cada alíquota recuperada.
NOTA: Para obter amostras do biobanco, pesquisadores de nosso instituto ou colaboradores externos (com ou sem fins lucrativos) devem se inscrever usando um formulário específico, e o projeto é avaliado por um comitê técnico-científico e pelo Comitê de Ética.
- Obtenha um formulário preenchido com o nome do projeto de pesquisa, o investigador principal (PI), a data de retirada e uma breve descrição. Execute uma consulta no banco de dados de software (DB), selecione a alíquota, gere uma lista de coleta para os técnicos e verifique o código de barras para cada alíquota recuperada.
Representative Results
Seguindo os POPs descritos acima, coletamos um total de 38.446 biópsias líquidas biológicas anotadas e um total de 10.205 amostras de tecido de abril de 2012 a dezembro de 2021 (Figura 6A). Além disso, foram analisadas detalhadamente as amostras coletadas das Divisões de Urologia, Ginecologia, Senologia, bem como das Divisões de Cabeça e Pescoço, Abdominal-Pélvica e Cirurgia Torácica. O maior número de amostras de tecido coletadas foram de tumores de mama (Figura 6B,C). Desde 2019, também iniciamos a coleta de outros espécimes biológicos, como urina, fezes e swabs bucais, acompanhando o aumento significativo da demanda ao longo dos anos (Figura 6D).
Como mostra a Figura 6A, a quantidade de amostras coletadas, especialmente tecidos, durante 2020-2021 sofreu devido à pandemia de COVID-19 e à redução relacionada nos procedimentos oncológicos. É importante ressaltar que o trabalho científico não diminuiu durante esse período devido ao uso de amostras de biobanco devidamente armazenadas e anotadas coletadas nos anos anteriores. A coleta adequada de espécimes biológicos e os dados clínico-patológicos associados permitiram ter um biobanco retrospectivo e prospectivo bem estruturado e competitivo. Para tanto, a seleção da peça cirúrgica deve ser realizada pelo patologista, tanto para garantir um diagnóstico correto quanto para ter a oportunidade de realizar pesquisas com amostras de tecido adequadas. Em nosso biobanco, procedimentos de trabalho específicos são firmemente estabelecidos e seguidos, para que apliquemos procedimentos padronizados que estejam em conformidade com a certificação ISO 9001 no contexto de biobancos para pesquisa.
Figura 6: Recolha cumulativa de bioespécimes no Biobanco no Instituto Europeu de Oncologia, de 2012 a 2021. Coleta cumulativa de (A) amostras de tecido (curva laranja) e sangue com amostras de soro (curva azul); coleta cumulativa de (B) amostras de tecido mamário (curva vermelha); coleção cumulativa de (C) amostras de tecido do ovário (curva verde), próstata (curva cinza), pulmão (curva azul clara) e amostras de tecido do cólon (curva amarela). De 2019 a 2021, coleta cumulativa de (D) amostras biológicas adicionais: fezes (linha azul), um cotonete bucal (linha rosa), plasma (linha verde clara) e urina (linha violeta). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Embora a oncologia tenha feito enormes avanços, o câncer continua sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo20. A compreensão da heterogeneidade tumoral, sua evolução temporal ao longo do tempo e os resultados do tratamento direcionado dependem estritamente da coleta de dados acurada no contexto do atendimento clínico de rotina21. Nesse sentido, a abordagem "multiômica" vem ganhando força na patologia preditiva oncológica22. A avaliação tradicional de biomarcadores teciduais está sendo integrada por meio de múltiplos novos bioanalitos, como sangue, plasma, urina, saliva e fezes23,24,25,26. Portanto, os biobancos são agora reconhecidos como infraestruturas fundamentais para melhorar a prática clínica. Olhando para a história da pesquisa do câncer, percebemos que as descobertas mais impressionantes e inovadoras nunca teriam sido possíveis sem o exame direto do tecido cancerígeno ou biópsias líquidas. Ao longo do tempo, a fonte de tecido cancerígeno e o tipo de biópsia líquida a ser examinada evoluíram de dissecações brutas, "encontros casuais" aleatórios e, em alguns casos, tráfico ilícito para coleções organizadas de câncer e bancos estratégicos modernos de oncologia. A consideração de muitas questões éticas mudou consideravelmente, tanto na prática quanto nos principais fatores que distinguem os bancos de oncologia modernos das coleções de oncologia do passado.
Devido aos avanços na pesquisa do câncer e à vasta quantidade de informações moleculares que agora são fornecidas pelas tecnologias modernas, está se tornando cada vez mais evidente que os biobancos, particularmente aqueles em centros de câncer, podem enfrentar vários tipos de problemas metodológicos. Dentre estes, a tecnologia tornou-se um desafio universal que ainda impede a padronização e harmonização do POP. Outro aspecto crítico para manter as principais atividades do biobanco é ter um software LIMS integrado capaz de receber e manter automaticamente todos os IDs hospitalares e todos os dados clínicos codificados provenientes do software do hospital. Ressalta-se que outros softwares valiosos utilizados para o gerenciamento de biobancos e alguns freeware podem ser obtidos para o gerenciamento de biobancos 27,28,29,30,31. Outro passo crítico nos biobancos é a implementação do pacto de participação para todos os pacientes e o acordo legal e ético necessário para o armazenamento de dados clínicos e bioespécimes10,32.
A este respeito, este protocolo tem diretrizes bem definidas que não permitem a coleta e armazenamento de bioespécimes na ausência de consentimento. Esta é também uma questão crítica, uma vez que os doentes podem retirar a sua participação mesmo depois de as suas amostras terem sido armazenadas; assim, métodos para retirar rapidamente essas amostras do sistema de biobanco foram implementados. Os bioespécimes que chegam de pacientes recrutados pelo nosso biobanco seguem rígidos protocolos de coleta e armazenamento. Nesse sentido, vários aspectos importantes foram avaliados para monitorar esse processo e estão sendo continuamente aprimorados. Em particular, a certificação ISO9001 requer vários indicadores de desempenho, como o tempo isquêmico quente, que deve ser mantido por menos de 30 min ou 60 min, dependendo da fonte do tecido. Além disso, biópsias líquidas e fluidos biológicos são coletados por meio de protocolos padronizados seguindo rigorosos procedimentos temporais 15,33,34,35,36.
Características específicas são de grande importância nos fluxos de trabalho dos biobancos. Estes incluem a presença de um patologista certificado, que garante a amostragem do tecido por razões diagnósticas, e a coleta de tecido para biobanco em um período de tempo compatível com uma alta qualidade de amostras (o tempo isquêmico é uma indicação importante para alguns tipos de pesquisa, como ensaios dependentes de RNA, que exigem menos tempo isquêmico quente). Além disso, o gerenciamento do espaço necessário para o armazenamento de espécimes é de grande importância em biobancos. O número de biópsias líquidas coletadas pode ser impulsionado pelo desenho do estudo. Muitas vezes, biópsias líquidas podem ser coletadas durante o pré-operatório e o período de acompanhamento, conforme definido por cada desenho de estudo.
Devido às campanhas de rastreamento para prevenção do câncer e ao diagnóstico precoce de tumores, ou seja, tumores de mama de pequeno porte em estágios iniciais de desenvolvimento, bem como a disponibilidade de técnicas cirúrgicas minimamente invasivas, reduziram o número de amostras de tecidos disponíveis para pesquisa (já que a maioria das amostras de tecido é sempre usada para fins de diagnóstico). A capacidade de recolha e armazenamento de espécimes biológicos melhorou consideravelmente nos últimos anos. Isso pôde ser observado para fluidos biológicos, refletindo o aumento da capacidade deste biobanco de apoiar os grupos de pesquisa deste instituto na crescente demanda por material anotado derivado do paciente. Apesar dessas melhorias, temos experimentado algumas limitações para estudos multicêntricos que exigem coordenação entre biobancos de diferentes partes do mundo, que só podem ser integrados através da implementação de procedimentos semelhantes.
Tendo descartado a maioria das questões éticas e técnicas relativas ao biobanco, incluindo a coleta de todas as informações clínicas e demográficas, o próximo objetivo é implementar a digitalização de todas as preparações histológicas e coloração usadas para fins de diagnóstico e pesquisa. Isso é de fundamental importância para a próxima geração de estudos que se beneficiarão muito de uma patologia digital e biobanco totalmente integrados, que se tornará o padrão para o futuro. Apenas uma grande série de pacientes com dados integrados e imagens digitais pode alimentar estudos multicêntricos e de grande inteligência artificial (IA) para a melhoria do atendimento ao paciente com câncer. Em conclusão, acreditamos que uma boa assistência à saúde não termina com o diagnóstico e o tratamento. As melhores práticas incluem encontrar as formas de diagnóstico contínuo e melhoria do tratamento para qualquer doença, em particular aquelas que afetam gravemente a expectativa de vida ou a qualidade.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a todos os pacientes que participaram ativamente durante a última década em nossos programas de pesquisa através da doação de seus bioespécimes. Sem eles, essa pesquisa não seria possível. Agradecemos também a todo o pessoal que trabalha no IEO, enfermeiros, técnicos, biólogos, médicos e diretores de todas as unidades clínicas e de pesquisa. Os autores agradecem ao Prof. Pier Paolo Di Fiore e ao Prof. Giancarlo Pruneri por sua orientação. Finalmente, dedicamos este trabalho ao Prof. Umberto Veronesi, fundador da IEO, e sua abordagem pioneira para integrar a pesquisa do câncer e o atendimento ao paciente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue Max Con Tubes 15 mL | Falcon B.D | 352096 | |
| Blue Max Con Tubes 50 mL | Euroclone Spa | FLC352070 | |
| Box with 81 position for tissue storage | Ettore Pasquali Srl. | 06.0945.00 | |
| cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes | Norgen Biotek | 63950 | Preservation and isolation of both cf-DNA and cf-RNA from a single tube and in particular preserve cf-DNA/ct-DNA for 30 days at ambient temperature and for up to 8 days at 37 °C |
| Cryomold Standard (25 X 20 X 5 mm) | Olympus Italia S.r.l. | 4557 | Disposable plastic Cryomold molds create a uniformly shaped, flat-surface specimen block when used with O.C.T |
| Dimethyl Sulfoxide Plastic Bottle - 1 L | Vwr International S.R.L. | MFCD00002089 | It acts to preserve the reconstitution of the medium for the storage of frozen cells |
| Dpbs 1x W/o Ca And Mg - 500 mL | Microtech Srl | TL1006-500ML | Washing Buffer cell |
| Dualfilter T.I.P.S 1,000 µL | Euroclone Spa | 4809 | |
| Dualfilter T.I.P.S 200 µL | Euroclone Spa | 4823 | |
| Easytrack Barcode Reader for single tube datamatrix | Twin Helix Srl | TH-ETR4400 | 2D barcode tubes reader with USB connection |
| Fetal Bovine Serum Origin Brazileu S/fil | Microtech S.R.L | RM10532-500ML | Defrost at +4 °C, usually for two days, and once melted, start decomplementation at 56 °C for 45 min Let it cool down to room temperature, and aliquot it. Refroze them to -20 °C, and remember to defrost them every time the aliquots are needed |
| Ficoll Paque Plus (ge) 6 x 500 mL | Euroclone Spa | GEH17144003 | Ficoll is a medium for density gradient, It is sterile and ready for use. It alloes to get peripheral blood mononuclear cells, bone marrow and umbilical cord blood |
| Fixing solution Killik of 100 mL (OCT) | Bio-optica Milano S.p.a. | 05-9801 | Gel inclusion medium that solidifies at cold the water-soluble tissue (e.g., biopsies, frustules) |
| FLASH-FREEZE | Milestone | n.a. | Freezing appliance |
| Forma 8600 Series Chest Freezers (Temperature Range: -50 °C to -86 °C) 85 liters | Thermo Fisher Scientific Srl | 803CV | Orizzontal freezer |
| Isopentane 500 mL | Vwr International S.R.L. | 24872260 | Liquid included in theFLASH-FREEZE camera for freezing |
| Nautilus Lims Software | Thermo Scientific™ | n.a. | The software implementation is able to track all patients’ biological samples. Receives Personal and Clinical information automatically during registration due to the integration with IEO operating systems. Nautilus is integrated with the web service through three IEO operative systems: BAC - IEO central registry with personal information, wHospital - medical record |
| Pasteur pipette 10 mL | Euroclone Spa | CC4488 | |
| Pasteur pipette 3 mL | Euroclone Spa | APT1502 | |
| PATHOX | Dedalus ItaliTesi Elettronica e Sistemi Informativi S.p.A.a S.p.A. | n.a. | PATHOX - management system for the Pathology unit where several factors are registered for the Biobank, such as the histological samples, the related diagnoses, and biomarkers |
| Petri dishes, polystyrene - size 100 mm x 20 mm, slippable | Euroclone Spa | FLC353003 | |
| Set of 4 adapters 19 x 5/7 mL vac | Thermo Fisher Scientific Srl | 75003680 | |
| Set of 4 adapters 4 x 50 conical | Thermo Fisher Scientific Srl | 75003683 | |
| Set of 4 adapters 9 x 15 mL conical | Thermo Fisher Scientific Srl | 75003682 | |
| Single-use slide for counting cell | Biosigma S.P.A. | 347143/001 | Specifically used for individual cell count |
| Stamps Freezerbondz for tissue boxes, nitrogen-liquid proof , H 9,53 mm x L 25,40 mm | Twin Helix Srl | THT-152-492-3 | |
| Thermo Scientific TSX Series Ultra-Low Freezers (-50 °C to -86 °C) 949 liters | Thermo Fisher Scientific Srl | TSX70086V | Vertical freezer |
| Thermo Scientific Refrigerated Centrifuge SL16R | Thermo Fisher Scientific Srl | 75004030 | |
| Tissue box labels in Permanent | Twin Helix Srl | THT-199-482-3 | |
| Tuerks Solution | Merck Life Science S.R.L. | 1092770100 | In light microscopy, it is specifically used as stain for leukocyte |
| TX-400 Rotor TX-400 swinging bucket hol | Thermo Fisher Scientific Srl | 75003181 | |
| White box for storage | Bio Optica | 07-7300 | |
| wHospital Software | wHealth Lutech Group | n.a. | wHospital - medical record management system with personal information, administrative cases, and the informed consent of the patients |
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