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Neuroscience

स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों में आंत-व्युत्पन्न माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स का इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर डिलीवरी

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

आंत-व्युत्पन्न माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स में बहुआयामी प्रभाव होते हैं जो जानवरों में जटिल व्यवहार के लिए अग्रणी होते हैं। हमारा उद्देश्य एक गाइड कैनुला के माध्यम से इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर डिलीवरी के माध्यम से मस्तिष्क में आंत-व्युत्पन्न माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स के प्रभावों को चित्रित करने के लिए एक चरण-दर-चरण विधि प्रदान करना है।

Abstract

मेजबान शरीर विज्ञान और व्यवहार पर आंत माइक्रोबायोटा और उनके मेटाबोलाइट्स के प्रभाव की इस दशक में बड़े पैमाने पर जांच की गई है। कई अध्ययनों से पता चला है कि आंत माइक्रोबायोटा-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स मेजबान में जटिल आंत-मस्तिष्क मार्गों के माध्यम से मस्तिष्क-मध्यस्थता शारीरिक कार्यों को संशोधित करते हैं। शॉर्ट-चेन फैटी एसिड (एससीएफए) आंत माइक्रोबायोम द्वारा आहार फाइबर किण्वन के दौरान उत्पादित प्रमुख बैक्टीरिया-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स हैं। आंत से स्रावित एससीएफए परिधि में कई साइटों पर कार्य कर सकता है, एससीएफए रिसेप्टर्स के विशाल वितरण के कारण प्रतिरक्षा, अंतःस्रावी और तंत्रिका प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करता है। इसलिए, एससीएफए के मौखिक और इंट्रापरिटोनियल प्रशासन के माध्यम से एससीएफए के केंद्रीय और परिधीय प्रभावों को अलग करना चुनौतीपूर्ण है। यह पेपर स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों में एक गाइड कैनुला के माध्यम से मस्तिष्क में एससीएफए की कार्यात्मक भूमिका से पूछताछ करने के लिए एक वीडियो-आधारित विधि प्रस्तुत करता है। मस्तिष्क में एससीएफए की मात्रा और प्रकार को जलसेक मात्रा और दर को नियंत्रित करके समायोजित किया जा सकता है। यह विधि वैज्ञानिकों को मस्तिष्क में आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स की भूमिका की सराहना करने का एक तरीका प्रदान कर सकती है।

Introduction

मानव जठरांत्र संबंधी मार्ग मेजबान 1,2,3 को प्रभावित करने वाले विविध सूक्ष्मजीवों को आश्रय देता है। ये आंत बैक्टीरिया मेजबान 4,5 द्वाराउपभोग किए गए आहार घटकों के उपयोग के दौरान आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स का स्राव कर सकते हैं। दिलचस्प बात यह है कि परिधि में चयापचय नहीं किए गए आंत मेटाबोलाइट्स को परिसंचरण 6 के माध्यम से अन्य अंगों में ले जाया जा सकताहै। ध्यान दें, ये स्रावित मेटाबोलाइट्स आंत-मस्तिष्क अक्ष के लिए मध्यस्थ के रूप में काम कर सकते हैं, जिसे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और आंत 7 के बीच द्विदिश संचार के रूप में परिभाषित कियागया है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स जानवरों में जटिल व्यवहार और भावनाओं कोसंशोधित कर सकते हैं 8,9,10,11।

शॉर्ट-चेन फैटी एसिड (एससीएफए) आहार फाइबर और अपचनीय कार्बोहाइड्रेटके किण्वन के दौरान आंत माइक्रोबायोटा द्वारा उत्पादित मुख्य मेटाबोलाइट्स हैं। आंत12 में एसीटेट, प्रोपियोनेट और ब्यूटिरेट सबसे प्रचुर मात्रा में एससीएफए हैं। एससीएफए जठरांत्र संबंधी मार्ग में कोशिकाओं के लिए ऊर्जा स्रोत के रूप में काम करते हैं। आंत में अनमेटाबोलाइज्ड एससीएफए को पोर्टल नस के माध्यम से मस्तिष्क में ले जाया जा सकता है, इस प्रकार मस्तिष्क और व्यवहार को संशोधित किया जा सकताहै 6,12. पिछले अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि एससीएफए न्यूरोसाइकियाट्रिकविकारों 6,12 में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। उदाहरण के लिए, बीटीबीआर टी + आईटीपीआर 3टीएफ / जे (बीटीबीआर) चूहों में ब्यूटिरेट के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन, ऑटिज़्म स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर (एएसडी) का एक पशु मॉडल, ने उनके सामाजिक घाटेको बचाया। अवसादग्रस्त विषयों से माइक्रोबायोटा प्राप्त करने वाले एंटीबायोटिक-उपचारित चूहों ने चिंता जैसे व्यवहार और फेकल एससीएफए14 में वृद्धि देखी। नैदानिक रूप से, आमतौर पर विकासशील नियंत्रण15,16 की तुलना में एएसडी वाले लोगों में फेकल एससीएफए के स्तर में परिवर्तन देखा गया था। अवसाद वाले लोगों में स्वस्थ लोगों की तुलना में कम फेकल एससीएफए का स्तर होता है 17,18। इन अध्ययनों ने सुझाव दिया कि एससीएफए विभिन्न मार्गों के माध्यम से जानवरों और मनुष्यों में व्यवहार को बदल सकते हैं।

माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स शरीर में कई साइटों पर विविध प्रभाव डालते हैं, मेजबान शरीर विज्ञान और व्यवहार 4,19 को प्रभावित करते हैं, जिसमें जठरांत्र संबंधी मार्ग, वेगस तंत्रिका और सहानुभूति तंत्रिका शामिल हैं। परिधीय मार्गों के माध्यम से मेटाबोलाइट्स को प्रशासित करते समय मस्तिष्क में आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स की सटीक भूमिका को इंगित करना मुश्किल है। यह पेपर एक स्वतंत्र रूप से चलने वाले माउस के मस्तिष्क में आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स के प्रभावों की जांच करने के लिए एक वीडियो-आधारित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है (चित्रा 1)। हमने दिखाया कि व्यवहार परीक्षणों के दौरान गाइड कैनुला के माध्यम से एससीएफए को तीव्र रूप से दिया जा सकता है। मेटाबोलाइट्स के प्रकार, मात्रा और जलसेक दर को उद्देश्य के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र में आंत मेटाबोलाइट्स के प्रभाव का पता लगाने के लिए कैनुलाइजेशन की साइट को समायोजित किया जा सकता है। हम वैज्ञानिकों को मस्तिष्क और व्यवहार पर आंत-व्युत्पन्न माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स के संभावित प्रभाव का पता लगाने के लिए एक विधि प्रदान करना चाहते हैं।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और जानवरों की देखभाल को राष्ट्रीय चेंग कुंग विश्वविद्यालय (एनसीकेयू) संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. प्रयोगात्मक जानवर के लिए तैयारी

  1. एक विक्रेता से 6-8 सप्ताह के जंगली प्रकार C57BL/6JNarl नर चूहे प्राप्त करें।
  2. चूहों को मानक माउस चाउ और स्टरलाइज़्ड वाटर एड लिबिटम के साथ एक मानक माउस पिंजरे में रखें।
    नोट: एनसीकेयू के प्रयोगशाला पशु केंद्र के लिए आवास की स्थिति 22 ± 1 डिग्री सेल्सियस तापमान, 55% ± 10% आर्द्रता और 13 घंटे / 11 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र हैं।

2. स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी

  1. स्टीरियोटैक्सिक उपकरण, सर्जिकल उपकरणों और संबंधित वस्तुओं को तैयार और निष्फल करें।
    नोट: सभी आइटम जो सीधे सर्जिकल साइट से संपर्क करेंगे, उन्हें संक्रमण से बचने के लिए निष्फल किया जाना चाहिए।
  2. ऑक्सीजन में 1% -5% आइसोफ्लुरेन के साथ प्लेक्सीग्लास पिंजरे में रखकर माउस को एनेस्थेटाइज करें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए माउस का बारीकी से निरीक्षण करें कि श्वास दर प्रति सेकंड लगभग एक सांस पर बनाए रखी जाती है।
  3. माउस को संज्ञाहरण कक्ष से बाहर निकालें। एक पालतू ट्रिमर के साथ सर्जिकल साइट (माउस हेड) को शेव करें। स्टीरियोटैक्सिक छेदक धारक में छेदक पट्टी पर माउस छेदक को ठीक करके स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर रखें। नाक को नोजकोन मास्क से कवर करें।
  4. स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के दौरान ऑक्सीजन में 1% -2.5% आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स के माध्यम से माउस के नोसिसेप्शन का मूल्यांकन करें और सर्जिकल साइट को संक्रमित करने से पहले एक निरंतर श्वास दर सुनिश्चित करें।
  5. सर्जरी के दौरान शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर माउस के नीचे एक हीटिंग पैड (37.0 डिग्री सेल्सियस) रखें। वैकल्पिक रूप से, प्रोग्राम किए गए वार्मर और हीटिंग पैड को जोड़ने वाले रेक्टल थर्मल प्रोब की सहायता से कोर तापमान बनाए रखें।
  6. चिपकने वाला टेप का उपयोग करके सिर पर छंटनी किए गए फर को हटा दें। दर्द से राहत के लिए माउस को एनाल्जेसिक केटोप्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ इंजेक्ट करें। सूखी आंखों से बचने के लिए आंखों का मलहम लगाएं।
  7. सिर को ठीक करने के लिए कान नहर में नुकीले कान की पट्टी डालें।
  8. कान पट्टी के पैमाने को समायोजित करके सिर को केंद्रित करें।
  9. ऊर्ध्वाधर आंदोलन से बचने के लिए छेदक धारक पर नाक क्लैंप को कस लें। सिर को धीरे से दबाएं ताकि यह जांचा जा सके कि सिर ठीक है और बाद की सर्जरी के दौरान सिर ढीला होने से बचें।
  10. कपास के फाहे का उपयोग करके क्लोरहेक्सिडाइन के तीन वैकल्पिक स्क्रब के साथ खोपड़ी को कीटाणुरहित करें। प्रत्येक स्क्रब को बीच से बाहरी तरफ शुरू करें (सबसे कीटाणुरहित केंद्रीय क्षेत्र से कम से कम कीटाणुरहित क्षेत्र तक)।
    नोट: मध्य से बाहर तक स्क्रब का उपयोग वैज्ञानिकों को फर से संक्रमण और संदूषण को कम करने में मदद कर सकता है। बाहरी क्षेत्र बिना दाढ़ी वाले सिर क्षेत्र के करीब है, जिसमें अभी भी बड़ी मात्रा में फर है और अच्छी तरह से कीटाणुरहित करना आसान नहीं है।
  11. सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके खोपड़ी को पूर्वकाल / पीछे के तरीके (<1 सेमी) में इंजेक्ट करें। चीरा खोलें और खोपड़ी को सूती फाहे से पोंछें, जिसे सूक्ष्म विच्छेदन बल द्वारा रखा गया है।
    नोट: माइक्रोडिसेक्शन फोर्स, सर्जिकल ब्लेड और कपास स्वैब को सर्जरी से पहले ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल किया जाना चाहिए। सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान, प्रत्येक जानवर से पहले और बाद में कम से कम 5 सेकंड के लिए ग्लास बीड स्टेरलाइज़र (150 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें। सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान और जानवरों के बीच सर्जिकल ब्लेड और फोर्सप्स को पकड़ने के लिए एक स्टरलाइज़्ड बीकर तैयार करें।
  12. खोपड़ी पर ब्रेग्मा और लैम्ब्डा की पहचान करें। रुचि के क्षेत्र का पता लगाने के लिए संदर्भ के रूप में ब्रेग्मा का उपयोग करें।
    1. वैकल्पिक: स्टीरियोटैक्सिक ड्रिल होल्डर पर स्टीरियोटैक्सिक ड्रिल माउंट करें, और संदर्भ के रूप में ब्रेग्मा को इंगित करने के लिए ड्रिल की नोक का उपयोग करें। कम से कम 5 सेकंड के लिए ग्लास बीड स्टरलाइज़र (150 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके स्टीरियोटैक्सिक ड्रिल को निष्फल करें।
  13. ब्रेग्मा/लैम्ब्डा द्वारा फ्लैट खोपड़ी क्षैतिज विमान को बाएं/दाएं और पूर्ववर्ती/पीछे के विमानों में कैलिब्रेट और संरेखित करें।
    नोट: यदि एक सही क्षैतिज विमान में नहीं है, तो स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर माउस को फिर से भरें।

3. वाणिज्यिक अनुकूलित गाइड कैनुला आरोपण

  1. स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक के आधार पर दाएं पार्श्व वेंट्रिकल की स्थिति को पहचानें और लेबल करें: ब्रेग्मा से दूरी, पूर्ववर्ती / पीछे (ए / पी): 0.26 मिमी, औसत दर्जे का / पार्श्व (एम / एल): -1.0 मिमी, पृष्ठीय / उदर (डी / वी): -2.0 मिमी20।
    नोट: निर्देशांक को रुचि के क्षेत्र के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। पार्श्व वेंट्रिकल के लिए निर्देशांक वयस्क C57BL / 6J चूहों पर आधारित थे जिनका वजन 26-30 ग्राम था। यदि छोटे चूहों का उपयोग किया जाता है, तो चर्चा देखें।
  2. एक वाणिज्यिक गाइड कैनुला के आरोपण के लिए स्टीरियोटैक्सिक ड्रिल का उपयोग करके लेबल साइट पर खोपड़ी के माध्यम से एक छेद (व्यास = 1.5 मिमी) ड्रिल करें।
  3. स्टेनलेस स्टील स्क्रू के माउंटिंग के लिए स्टीरियोटैक्सिक ड्रिल का उपयोग करके खोपड़ी पर दो से चार और छेद (व्यास = 1.5 मिमी) ड्रिल करें।
    नोट: प्रत्येक जानवर से पहले और बाद में कम से कम 5 सेकंड के लिए ग्लास बीड स्टेरलाइज़र (150 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके स्टीरियोटैक्सिक ड्रिल को स्टरलाइज़ करें।
  4. हड्डी के टुकड़ों को पोंछें और कपास के फाहे से खून बहना बंद करें।
  5. स्थानीय एनेस्थेटिक, एंटीप्रुरिटिक और दर्द निवारक प्रभावों के लिए कपास के स्वैब का उपयोग करके लिडोकेन (1 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ खोपड़ी को पोंछें। यदि ड्रिलिंग के बाद रक्तस्राव बंद नहीं होता है, तो हेमोस्टेसिस के लिए छेद पर धीरे से एक कपास का फाहा रखें।
  6. दंत ऐक्रेलिक के लिए लंगर प्रदान करने के लिए छेद पर दो से चार स्टेनलेस स्क्रू माउंट करें।
  7. स्टीरियोटैक्सिक कैनुला धारक पर वाणिज्यिक गाइड कैनुला रखें और ग्लास बीड स्टेरलाइज़र (150 डिग्री सेल्सियस) के साथ कीटाणुरहित करें।
    नोट: वाणिज्यिक गाइड कैनुला, वाणिज्यिक डमी और वाणिज्यिक इंजेक्टर (चित्रा 2 ए) सामग्री की तालिका में दिखाए गए विनिर्देशों के साथ अनुकूलित किए गए थे।
  8. स्टीरियोटैक्सिक कैनुला धारक को पार्श्व वेंट्रिकल के लिए ड्रिल किए गए छेद में ले जाएं और धीरे-धीरे वांछित गहराई (2.5 मिमी) तक छेद में वाणिज्यिक गाइड प्रवेशनी डालें।
    नोट: पृष्ठीय / उदर समन्वय को वाणिज्यिक गाइड कैनुला की नोक को संदर्भ के रूप में सेट करके परिभाषित किया जा सकता है जब नोक को छेद में मुश्किल से डाला जाता है।
  9. ड्रिल किए गए छेद में वाणिज्यिक गाइड कैनुला को ठीक करने के लिए एन-ब्यूटाइल साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला (ऊतक चिपकने वाला गोंद) का 10 μL लागू करें और 3-4 मिनट तक प्रतीक्षा करें। स्टीरियोटैक्सिक कैनुला धारक से वाणिज्यिक गाइड कैनुला को धीरे से छोड़ दें और धारक को दूर ले जाएं।
  10. वाणिज्यिक गाइड कैनुला को ठीक करने के लिए इंजेक्शन वाली खोपड़ी पर दंत ऐक्रेलिक लागू करें और कम से कम 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। रक्त या शरीर के तरल पदार्थ (चित्रा 2 बी) द्वारा कैनुला क्लॉगिंग से बचने के लिए वाणिज्यिक डमी को वाणिज्यिक गाइड कैनुला में प्रत्यारोपित करें।
  11. कान की नहर से कान की पट्टी छोड़ दें और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से माउस को हटा दें।
  12. एनेस्थीसिया से उबरने के लिए माउस को एक हीटिंग पैड के साथ एक नए पिंजरे में रखें और लगातार तब तक निरीक्षण करें जब तक कि माउस पूरी तरह से जाग न जाए।
    नोट: जानवर को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले। एक जानवर जो सर्जरी से गुजरा है, उसे पूरी तरह से ठीक होने तक अन्य जानवरों की कंपनी में वापस नहीं आना चाहिए।
  13. संस्थागत आईएसीयूसी प्रोटोकॉल और प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर माउस को एकल आवास या समूह आवास पर वापस करें। समूह आवास के लिए, सुनिश्चित करें कि अवांछित चोटों या कैनुला की टुकड़ी को कम करने के लिए कम चूहों को पिंजरे में रखा गया है।
  14. पोस्टऑपरेटिव देखभाल के लिए कम से कम 3 दिनों के लिए पीने के पानी में इबुप्रोफेन (0.2 मिलीग्राम / एमएल) का प्रशासन करें, और कम से कम 3 दिनों के लिए दर्द और संकट के संकेतों के लिए दिन में दो बार निगरानी करें।
    1. पोस्टऑपरेटिव देखभाल के दौरान, चूहों में सूजन और संक्रमण को रोकने के लिए त्वचा के चारों ओर रोक्सिथ्रोमाइसिन मलहम लागू करें।
    2. जानवर की स्थिति की निगरानी करते रहें और पर्याप्त ऊर्जा प्रदान करने के लिए 5% ग्लूकोज और / या 0.9% सोडियम क्लोराइड का समय पर इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन दें।
    3. यदि दर्द, संकट या संक्रमण की स्थिति लगातार बिगड़ती है, तो सीओ2 इनहेलेशन द्वारा माउस को इच्छामृत्यु दें।
  15. एससीएफए और व्यवहार परीक्षण के इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर डिलीवरी के लिए माउस तैयार होने के लिए ऑपरेशन के 1 सप्ताह बाद तक प्रतीक्षा करें।

4. एससीएफए की तैयारी

  1. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) में सोडियम एसीटेट, सोडियम ब्यूटाइरेट और सोडियम प्रोपियोनेट को भंग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. सुनिश्चित करें कि रसायन पूरी तरह से घुल गए हैं, फिर पीएच को 7.4 में समायोजित करें, और नसबंदी के लिए 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से एससीएफए मिश्रण को फ़िल्टर करें।

5. व्यवहार परीक्षण के दौरान एससीएफए के इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर डिलीवरी के लिए जलसेक प्रणाली स्थापित करें

  1. व्यवहार को रिकॉर्ड करने के लिए एक छत कैमरा माउंट करें। वीडियो रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर को नियंत्रित करने के लिए कैमरे को कंप्यूटर से कनेक्ट करें (चित्रा 3)।
  2. आसुत जल के साथ 10 μL सिरिंज भरें।
    नोट: माइक्रोलीटर सिरिंज में हवा के बुलबुले से बचें।
  3. माइक्रोइंजेक्शन नियंत्रक के साथ एक माइक्रोइंजेक्शन पंप कनेक्ट करें।
  4. माइक्रोइंजेक्शन पंप पर माइक्रोलीटर सिरिंज माउंट करें। सिरिंज स्थापित करने के लिए, क्लैंप को ढीला करने के लिए बटन दबाएं और सिरिंज को संबंधित स्थिति पर स्थापित करें। क्लैंप को बंद करें और माइक्रोइंजेक्शन पंप (चित्रा 4 ए) पर प्लंजर-रिटेनिंग स्क्रू को कसें।
  5. पॉलीथीन ट्यूब (चित्रा 2 ए) में वाणिज्यिक इंजेक्टर डालें।
  6. परीक्षण क्षेत्र के ऊपर छत के कैमरे पर पॉलीथीन ट्यूब लटकाएं।
  7. इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके आसुत जल के साथ पॉलीथीन ट्यूब भरें। माइक्रोलिटर सिरिंज को हैंगिंग पॉलीथीन ट्यूब से कनेक्ट करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि पॉलीथीन ट्यूब माउस को परीक्षण क्षेत्र में स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त लंबा है।

6. माइक्रोइंजेक्शन नियंत्रक की सिस्टम सेटिंग्स

  1. माइक्रोइंजेक्शन नियंत्रक चालू करें और कमांड स्क्रीन (चित्रा 4 सी) तक पहुंचने के लिए सभी चैनल प्रदर्शित करें दबाएं। कॉन्फ़िगरेशन दबाएं और वॉल्यूम लक्ष्य को 9,800 nL पर सेट करें और डिलीवरी दर 100 nL/s तक सेट करें। माइक्रोलीटर सिरिंज से जुड़े पॉलीथीन ट्यूब से 9,800 एनएल आसुत पानी डालें (इन्फ्यूज मोड पर स्विच करने के लिए दिशा दबाएं और रन दबाएं) (चित्रा 4 सी की कमांड स्क्रीन में लाल वर्ग देखें)।
  2. कॉन्फ़िगरेशन दबाएं और वॉल्यूम लक्ष्य को 3,000 nL पर सेट करें और डिलीवरी दर 100 nL/s तक सेट करें. खनिज तेल के 3,000 nL को निकालें (निकासी मोड पर स्विच करने के लिए दिशा दबाएं और RUN दबाएं) (चित्रा 4C की कमांड स्क्रीन में लाल वर्ग देखें)।
    नोट: पॉलीथीन ट्यूब पर एक स्पष्ट तेल-पानी चरण पृथक्करण देखा जाना चाहिए।
  3. माइक्रोलिटर सिरिंज सुई से पॉलीथीन ट्यूब को अलग करें। माइक्रोलीटर सिरिंज सुई से 3,000 एनएल आसुत पानी को बाहर निकालें (इन्फ्यूज मोड पर स्विच करने के लिए दिशा दबाएं और रन दबाएं)।
  4. माइक्रोलीटर सिरिंज को पॉलीथीन ट्यूब में वापस डालें। कॉन्फ़िगरेशन दबाएं और वॉल्यूम लक्ष्य को 9,500 nL पर सेट करें और डिलीवरी दर 100 nL/s तक सेट करें। 9,500 nL SCCA निकालें (निकासी मोड पर स्विच करने के लिए निर्देश दबाएँ और RUN दबाएँ)। एससीएफए सफलतापूर्वक संक्रमित हैं या नहीं, यह सत्यापित करने के लिए तेल-एससीएफए चरण को लेबल करें।
  5. कॉन्फ़िगरेशन दबाएं और डिलीवरी दर के साथ वांछित वॉल्यूम लक्ष्य को 7 nL/ s पर सेट करें। इन्फ्यूज़ मोड पर स्विच करने के लिए दिशा दबाएं (चित्रा 4 सी की कमांड स्क्रीन में लाल वर्ग देखें)।
    नोट: जलसेक समय के आधार पर मात्रा निर्धारित करें। उदाहरण के लिए, यदि जलसेक समय 7 nL/s की वितरण दर के लिए 3 मिनट है, तो लक्ष्य मात्रा = 1,260 nL है।
  6. एससीएफए इंजेक्शन के लिए कैनुला में इंजेक्टर डालने से पहले माइक्रोलीटर सिरिंज को आगे बढ़ाने के लिए रन दबाएं जब तक कि तरल वाणिज्यिक इंजेक्टर के सामने के छोर पर बाहर न आ जाए।

7. स्वतंत्र रूप से गतिशील माउस में वाणिज्यिक गाइड कैनुला के माध्यम से पार्श्व वेंट्रिकल में एससीएफए का इन्फ्यूजन

  1. ऑक्सीजन में 1% -5% आइसोफ्लुरेन के साथ प्लेक्सीग्लास पिंजरे में रखकर माउस को एनेस्थेटाइज करें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए माउस का बारीकी से निरीक्षण करें कि श्वास दर प्रति सेकंड लगभग एक सांस पर बनाए रखी जाती है।
  2. माउस को स्कैन करें और वाणिज्यिक इंजेक्टर को वाणिज्यिक गाइड कैनुला (चित्रा 4 बी) में डालें।
    नोट: यदि वाणिज्यिक गाइड कैनुला रक्त या शरीर के तरल पदार्थ से प्लग किया जाता है, तो धीरे से इसे चिमटी के साथ अनलॉग करें।
  3. व्यवहार परीक्षण से पहले माउस को पिंजरे में 15 मिनट के लिए संज्ञाहरण से ठीक होने दें।
  4. बुनियादी हरकत परीक्षण के लिए, माउस को एक नए पिंजरे में रखें और इसे 35 मिनट के लिए स्वतंत्र रूप से अन्वेषण करने की अनुमति दें। पहले 5 मिनट में 2,100 nL की लक्ष्य मात्रा के लिए 7 nL/s की डिलीवरी दर का उपयोग करके SCFAs को शामिल करें (इन्फ्यूज़ मोड के लिए दिशा दबाएं और RUN दबाएँ)।
    नोट: पशु व्यवहार वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर21,22 का उपयोग करके उपन्यास पिंजरे में हरकत का विश्लेषण किया जा सकता है।
  5. माउस को एनेस्थेटाइज करें (चरण 7.1 को दोहराते हुए) और वाणिज्यिक गाइड कैनुला से वाणिज्यिक इंजेक्टर को हटा दें।
    नोट: माउस को पिछले इंजेक्शन को धोने के लिए उचित समय देने के बाद विभिन्न नियंत्रणों / मेटाबोलाइट्स के साथ बार-बार इंजेक्ट किया जा सकता है। जब तक कैनुला माउस सिर पर तय किया जाता है, तब तक माउस को बार-बार विभिन्न मेटाबोलाइट्स के साथ परीक्षण किया जा सकता है।

8. माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम की बहाली

  1. माइक्रोलीटर सिरिंज से पॉलीथीन ट्यूब को अलग करें।
  2. पॉलीथीन ट्यूब में आसुत पानी को त्यागने के लिए इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके ट्यूब में हवा इंजेक्ट करें। माइक्रोलीटर सिरिंज खाली करें।
  3. सिरिंज स्टॉप डेफिनिशन स्क्रीन (चित्रा 4C) खोलने के लिए कॉन्फ़िगरेशन स्क्रीन पर Pos रीसेट करें दबाएँ।
  4. माइक्रोइंजेक्शन पंप को पूरी तरह से वापस ले ली गई स्थिति में रीसेट करने के लिए बीपिंग ध्वनि होने तक वापस लें (चित्रा 4 सी)।
  5. कमांड स्क्रीन पर लौटें और माइक्रोइंजेक्शन कंट्रोलर को बंद करें यदि इस स्क्रीन पर ** एंड रीच ** साइन है (चित्रा 4 सी)।

9. वैकल्पिक: तंत्रिका अनुरेखक द्वारा इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन का सत्यापन

  1. जलसेक साइट को सत्यापित करने के लिए 7 एनएल / एस की डिलीवरी दर के साथ तंत्रिका ट्रेसर के 2,100 एनएल को शामिल करें।
    नोट: बैकफ्लो को रोकने के लिए इंजेक्टर को 5 मिनट के लिए गाइड कैनुला में छोड़ दें।
  2. न्यूरल ट्रेसर के जलसेक के 30 मिनट बाद आइसोफ्लुरेन (5%) के ओवरडोज से माउस को एनेस्थेटाइज करें।
  3. एनेस्थेटाइज्ड माउस में श्वास दर और पूंछ / पंजा चुटकी रिफ्लेक्स की जांच करें।
    नोट: अगले चरण से पहले चूहों को अनुत्तरदायी होना चाहिए।
  4. पसली के पिंजरे के नीचे त्वचा, मांसपेशियों और पेट की दीवार के माध्यम से 4-5 सेमी चीरा लगाएं।
  5. जिगर को डायाफ्राम से थोड़ा दूर ले जाएं।
  6. माउस के दिल को उजागर करने के लिए डायाफ्राम को इंजेक्ट करें।
  7. पीबीएस में फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) और बर्फ-ठंडा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ दिल के माध्यम से माउस को संक्रमित करें।
  8. माउस का सिर काट दें और पूरे मस्तिष्क को बाहर निकालने के लिए सूक्ष्म विच्छेदन बल और माइक्रोडिसेक्शन कैंची केसाथ मस्तिष्क को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें। मस्तिष्क के नमूनों को 3-4 दिनों के लिए पीबीएस में बर्फ-ठंडे 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में रखें और उन्हें पीबीएस के साथ 3 x 5 मिनट धोएं।
  9. माउस मस्तिष्क स्लाइस धारक (1 मिमी / खंड) के आठवें कट पर माउस मस्तिष्क स्लाइस धारक में मस्तिष्क को पूर्वकाल से पीछे की दिशा में दो भागों में काटें। मस्तिष्क को एम्बेडिंग मोल्ड में रखें और मस्तिष्क के नमूनों को कम पिघलने बिंदु अगारोस (पीबीएस में 4%) में एम्बेड करें।
  10. सुपरग्लू का उपयोग करके विब्राटोम के चरण पर अगारोस में एम्बेडेड मस्तिष्क को गोंद करें। वाइब्रेटोम का उपयोग करके मस्तिष्क को 50 μm मस्तिष्क स्लाइस में कोरोनल रूप से विभाजित करें।
  11. कमरे के तापमान पर रात भर ब्लॉकिंग बफर (1: 1,000 कमजोर पड़ने) में पतला तंत्रिका ट्रेसर को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी में मस्तिष्क स्लाइस को इनक्यूबेट करें।
    नोट: ब्लॉकिंग बफर में 10% घोड़े का सीरम, 0.1% ट्राइटन एक्स -100 और 0.02% सोडियम एज़ाइड था।
  12. स्लाइस को PBST के साथ 3 x 5 मिनट धोएं (0.1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ पीबीएस)।
  13. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए बफर (1: 500 कमजोर पड़ने) को अवरुद्ध करने में पतला प्रतिदीप्ति-डाई संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी में मस्तिष्क स्लाइस को इनक्यूबेट करें।
  14. पीबीएस के साथ स्लाइस को 3 x 5 मिनट धो लें।
  15. स्लाइड पर मस्तिष्क स्लाइस को 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) युक्त एक बढ़ते माध्यम के साथ माउंट करें।
  16. माइक्रोस्कोप कवरस्लिप के साथ स्लाइड को कवर करें।
  17. माउंटिंग माध्यम के रिसाव से बचने के लिए स्लाइड किनारे पर नेल पॉलिश लगाएं।
  18. कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेशन के बाद, प्रकाश से संरक्षित, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जलसेक साइट में प्रतिदीप्ति संकेत की छवि बनाएं।

10. वैकल्पिक: चूहों में पार्श्व वेंट्रिकल में एक अनुकूलित स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला के माध्यम से मेटाबोलाइट्स का इन्फ्यूजन

  1. प्रोटोकॉल अनुभाग 1-8 का पालन करें और माउस में स्टेनलेस स्टील इंजेक्टर के माध्यम से रसायनों को शामिल करने के लिए एक स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला के साथ वाणिज्यिक गाइड कैनुला को बदलें।
    नोट: विभिन्न वाणिज्यिक और स्टेनलेस स्टील कैनुला के पेशेवरों और विपक्षों को चर्चा अनुभाग में विस्तार से बताया गया है।
  2. सर्जिकल प्रोटोकॉल को प्रोटोकॉल अनुभाग 2 और 3 में वर्णित तरीके से निष्पादित करें, सिवाय इसके कि वाणिज्यिक गाइड कैनुला को स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला (चित्रा 5 बी) के साथ बदलना याद रखें।
    नोट: स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला, स्टेनलेस स्टील डमी, और स्टेनलेस स्टील इंजेक्टर (चित्रा 5 ए) सामग्री की तालिका में दिखाए गए विनिर्देशों के साथ अनुकूलित किए गए थे। अनुकूलित स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला को वांछित गहराई (2.0 मिमी) तक छेद में डालें।
  3. माइक्रोइंजेक्शन कंट्रोलर और माइक्रोइंजेक्शन पंप (चित्रा 4 बी) (प्रोटोकॉल सेक्शन 4-7 के समान) से युक्त माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम का उपयोग करके स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला के माध्यम से एससीएफए को शामिल करें। स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला के स्टेनलेस स्टील डमी के लिए, स्टेनलेस स्टील इंजेक्टर के एक तरफ धीरे से मोड़ें जब तक कि दूसरी तरफ की नोक स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला की तुलना में 1 मिमी लंबी न हो।
  4. चूहों में पार्श्व वेंट्रिकल में स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला के माध्यम से तंत्रिका अनुरेखक के 2,100 एनएल को शामिल करें (प्रोटोकॉल अनुभाग 9 के समान)।
  5. न्यूरल ट्रेसर इन्फ्यूजन (प्रोटोकॉल सेक्शन 9 के समान) के बाद 30 मिनट के लिए नमूना एकत्र करें।
  6. न्यूरल ट्रेसर इन्फ्यूज्ड-ब्रेन स्लाइस (प्रोटोकॉल सेक्शन 9 के समान) में छवि अधिग्रहण करें।

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Representative Results

एक नए पिंजरे में लोकोमोटर गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए गाइड कैनुला प्रत्यारोपण से वसूली के 1 सप्ताह बाद माउस को एससीएफए के साथ जोड़ा गया था। माउस को एक नए पिंजरे में रखा गया था और मस्तिष्क के पार्श्व वेंट्रिकल में प्रत्यारोपित वाणिज्यिक गाइड कैनुला के माध्यम से मस्तिष्क में पहले 5 मिनट (7 एनएल / एस की डिलीवरी दर) में 2,100 एनएल एससीएफए या एसीएसएफ के साथ इंजेक्ट किया गया था। एक नए पिंजरे में लोकोमोटर गतिविधि जलसेक के बाद अतिरिक्त 30 मिनट के लिए दर्ज की गई थी। एससीएफए और एसीएसएफ (चित्रा 6) (एन = 2 चूहों प्रति समूह; डेटा को औसत ± के रूप में दिखाया गया है और दो-तरफा एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया है) के बीच नए पिंजरे में लोकोमोटर गतिविधि में कोई अंतर नहीं देखा गया था।

मस्तिष्क क्षेत्रों में गाइड कैनुला के आरोपण की सटीकता को मान्य करने के लिए, एक फ्लोरोसेंट न्यूरल ट्रेसर को एससीएफए (5 मिनट में 2,100 एनएल; 7 एनएल / एस) के समान मात्रा और वितरण दर पर गाइड कैनुला के माध्यम से चूहों में डाला गया था। 30 मिनट बाद हिस्टोलॉजी के लिए दिमाग एकत्र किए गए थे। फ्लोरोसेंट डाई पार्श्व वेंट्रिकल और माउस मस्तिष्क के आसपास के क्षेत्रों में पाया गया था (चित्रा 7 ए)। एक ही स्थिति में तंत्रिका अनुरेखक के जलसेक के लिए मस्तिष्क के पार्श्व वेंट्रिकल में एक स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला प्रत्यारोपित किया गया था। गाइड कैनुला के समान, परिणामों से पता चला कि स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला (चित्रा 7 बी) के माध्यम से जलसेक के बाद भी पार्श्व वेंट्रिकल और माउस मस्तिष्क के आसपास के क्षेत्रों में एक फ्लोरोसेंट डाई सिग्नल का पता चला था।

Figure 1
चित्रा 1: स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों में इनट्रेसेरेब्रोवेंट्रिकुलर इन्फ्यूजन की प्रक्रिया। स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों में आंत-व्युत्पन्न माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स के इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर डिलीवरी के लिए प्रवाह चार्ट। संक्षिप्त नाम: एससीएफए = शॉर्ट-चेन फैटी एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: चूहों में वाणिज्यिक गाइड कैनुला का आरोपण। (ए) वाणिज्यिक गाइड कैनुला, डमी और इंजेक्टर की प्रतिनिधि छवि। (बी) डेंटल ऐक्रेलिक के साथ निर्धारण द्वारा चूहों के मस्तिष्क में प्रत्यारोपित वाणिज्यिक गाइड कैनुला और डमी की प्रतिनिधि छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: व्यवहार परीक्षण के लिए इनट्रेसेरेब्रोवेंट्रिकुलर इन्फ्यूजन रिग। माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम, वीडियो रिकॉर्डिंग सिस्टम और व्यवहार तंत्र का आरेख। संक्षिप्त नाम: एससीएफए = शॉर्ट-चेन फैटी एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम। (A) माइक्रोइंजेक्शन पंप का उपयोग करके माइक्रोलिटर सिरिंज की स्थापना। (बी) पॉलीइथिलीन ट्यूब से जुड़े वाणिज्यिक इंजेक्टर का सम्मिलन वाणिज्यिक गाइड कैनुला (सी) माइक्रोइंजेक्शन नियंत्रक की टच स्क्रीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: चूहों के पार्श्व वेंट्रिकल में स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला का आरोपण। (ए) स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला, डमी और इंजेक्टर की प्रतिनिधि छवि। (बी) दंत ऐक्रेलिक के साथ निर्धारण द्वारा चूहों के मस्तिष्क में प्रत्यारोपित स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला और डमी की प्रतिनिधि छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: नए पिंजरे में एससीएफए-संक्रमित चूहों की लोकोमोटर गतिविधि। (ए) एएसएसएफ या एससीएफए जलसेक पर गाइड कैनुला प्रत्यारोपण और नए पिंजरे की हरकत की समयरेखा योजनाबद्ध। (बी) इन्फ्यूजन सिरिंज, इन्फ्यूजन विंडो (नीली छाया), और नए पिंजरे व्यवहार परीक्षण के प्लेसमेंट के लिए समयरेखा योजनाबद्ध। (ग) एसीएसएफ- और एससीएफए-संक्रमित चूहों द्वारा 35 मिनट के लिए एक नए पिंजरे में कुल दूरी तय की जाती है। जलसेक के लिए समय विंडो नीली छाया (0-5 मिनट) के साथ इंगित की जाती है। (डी) एक नए पिंजरे में एसीएसएफ- और एससीएफए-संक्रमित चूहों के लिए प्रक्षेपपथ की प्रतिनिधि छवियां। एन = 2 चूहे प्रति समूह। डेटा को औसत ± के रूप में दिखाया गया है और दो-तरफा एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया है। एनएस: महत्वपूर्ण नहीं है। संक्षेप: एससीएफए = शॉर्ट-चेन फैटी एसिड; एसीएसएफ = कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: मस्तिष्क-संक्रमित फ्लोरोसेंट डाई की हिस्टोलॉजी। चूहों के पार्श्व वेंट्रिकल (एलवी) में प्रत्यारोपित अनुकूलित (ए) वाणिज्यिक और (बी) स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला के माध्यम से जलसेक। स्केल सलाखों = 1 मिमी (बाएं) और 500 μm (दाएं)। नीला: DAPI धुंधला; हरा: एंटी-फ्लोरोसेंट गोल्ड लेबलिंग। संक्षिप्तरूप: एलवी = पार्श्व वेंट्रिकल; एसी = पूर्ववर्ती अल्पविराम; सीपीयू = कॉडेट पुटामेन; एलएस = पार्श्व सेप्टम; एमएस = औसत दर्जे का सेप्टम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स को बहुत सटीक तंत्र के बिना मस्तिष्क-मध्यस्थता रोगों से जोड़ा गया है, आंशिक रूप से शरीर में उनके कई बाध्यकारी साइटोंके कारण 6,12,24। पिछली रिपोर्टों ने संकेत दिया कि एससीएफए जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स, एपिजेनेटिक नियामकों और शरीरमें कई साइटों पर ऊर्जा उत्पादन के स्रोतों के लिए लिगेंड के रूप में काम कर सकता है। परिधि (जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं, हार्मोन और स्वायत्त तंत्रिका तंत्र) से उत्पन्न होने वाले भ्रामक कारकों को बायपास करने के लिए, स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों में एक गाइड कैनुला के माध्यम से मस्तिष्क में एससीएफए के इनट्रेसेरेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन को अपनाकर एक विधि विकसित की गई थी। इसके अलावा, एससीएफए द्वारा संभावित रूप से प्रभावित मस्तिष्क क्षेत्रों का पता लगाने के लिए कैनुलाइजेशन और इन्फ्यूजन साइटों को मान्य किया गया था। कुल मिलाकर, यह पेपर आंत-मस्तिष्क अक्ष अनुसंधान के लिए मस्तिष्क में आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स को वितरित करने के लिए एक सटीक, सावधानीपूर्वक और मान्य विधि प्रस्तुत करता है।

जानवरों में एक गाइड कैनुला के माध्यम से दवाओं और रसायनों की इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर डिलीवरी को विभिन्न दवापरीक्षणों के लिए 25,26,27,28,29, रोग मॉडलिंग 26,28, और व्यवहार परीक्षणों के विशिष्ट डिजाइन के लिए अच्छी तरह से स्थापितकिया गया है। . सबसे महत्वपूर्ण बात, कई अध्ययनों ने आंत माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स को इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन के माध्यम से मस्तिष्क में पहुंचाया है और शारीरिककार्यों 30,31,32,33 पर उनके प्रभावों का परीक्षण किया है। यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय में मस्तिष्क को तीव्र तरीके से आंत मेटाबोलाइट्स को प्रशासित करने में एक ऐड-ऑन विशेषता प्रदान करता है, जो वैज्ञानिकों को मस्तिष्क और व्यवहार पर आंत मेटाबोलाइट्स के गतिशील प्रभावों को समझने की अनुमति देगा।

मेटाबोलाइट इन्फ्यूजन के लिए डिलीवरी दर मस्तिष्क वेंट्रिकल में मस्तिष्कमेरु द्रव के प्रवाह को अनुकरण करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक अध्ययन ने संकेत दिया कि चूहों में मस्तिष्कमेरु द्रव उत्पादन दर 5.3 nL / s34 है। स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों में स्वाभाविक रूप से एससीएफए की प्रवाह दर को नियंत्रित करने के लिए, हमने इस माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम (चित्रा 3 और चित्रा 4) के लिए प्रवाह दर का मूल्यांकन किया है। एससीएफए को बहुत प्रतिरोध के बिना आसानी से इंजेक्ट किया जा सकता है, भले ही 350 सेमी लंबी पॉलीथीन ट्यूब का उपयोग स्वतंत्र रूप से चलने वाले माउस में एससीएफए को शामिल करने के लिए किया गया था। पॉलीथीन ट्यूब में तरल प्रतिरोध को कम करने के लिए आसुत जल और खनिज तेल के भरने के साथ (प्रोटोकॉल खंड 5 और 6 देखें), प्रवाह दर को 100 एनएल / एस से 7 एनएल / एस तक कम किया जा सकता है। 7 एनएल /एस की प्रवाह दर पर एससीएफए या एसीएसएफ को शामिल करने से चूहों का कोई असामान्य व्यवहार नहीं हुआ।

इनट्रेसेरेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन के लिए आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स की मात्रा और खुराक महत्वपूर्ण हैं। विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स के पूर्ण स्तर का व्यापक रूप से विश्लेषण करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। उदाहरण के लिए, बहुत कम अध्ययनों ने मस्तिष्कमें एससीएफए के शारीरिक स्तरों का पता लगाया है 35,36। एक अध्ययन से पता चला है कि चूहों के दिमाग में एसीटेट, प्रोपियोनेट और ब्यूटिरेट की सांद्रता क्रमशः 366, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36,36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 36, 30, 30, 30, 30, 30, 30, 30, 30, 3, 3, 3, हालांकि, एक अन्य अध्ययन ने मस्तिष्क में एससीएफए के निम्न स्तर की सूचना दी (एसीटेट 128.1 μg / g, प्रोपियोनेट 0.3883 μg / g, और ब्यूटिरेट 0.1640 μg / g)35। इस प्रोटोकॉल में अपनाए गए संक्रमित एसीटेट, प्रोपियोनेट और ब्यूटिरेट की मात्रा क्रमशः 5.81385 μg / g, 4.62378 μg / g, और 2.6124 μg / g थी। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में शामिल एससीएफए की सांद्रता शारीरिक सांद्रता के बराबर है। हालांकि, हम इस संभावना को बाहर नहीं कर सके कि एससीएफए की सांद्रता अलग-अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में भिन्न हो सकती है। कई अध्ययनों से पता चला है कि इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन (1 मिनट में 0.26 एम प्रोपियोनिक एसिड का 4 μL; लगभग 249.756 μg / g) द्वारा मस्तिष्क वेंट्रिकल में प्रोपियोनेट की डिलीवरीने चूहों में सामाजिक व्यवहार और अनुभूति को प्रभावित किया। संक्रमित प्रोपियोनेट की खुराक और प्रवाह दर अपेक्षाकृत अधिक थी, जैसा कि चूहों35 और चूहों37 में बताया गया था। इसलिए, मस्तिष्क और परिधि में मेटाबोलाइट विश्लेषण और मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग में प्रगति शोधकर्ताओं को आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स में स्थानिक और अस्थायी गतिशील परिवर्तनों को बेहतर ढंग से समझने में मदद करेगी।

चूहों में इनट्रेसेरेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन के लिए इस प्रोटोकॉल में दो प्रकार के गाइड कैनुला प्रस्तुत किए गए हैं- एक वाणिज्यिक गाइड कैनुला और एक स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला। वाणिज्यिक गाइड कैनुला और डमी आरोपण के लिए अच्छी तरह से डिज़ाइन किए गए हैं। कैप के कारण चूहों के लिए अनुकूलित डमी को हटाना आसान नहीं है। इसके विपरीत, स्टेनलेस स्टील डमी को 1 सप्ताह की वसूली के दौरान चूहों द्वारा स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला से आसानी से हटाया जा सकता है, जिससे कैनुला में रक्त / मस्तिष्कमेरु द्रव का थक्का जम जाता है। हालांकि, वाणिज्यिक अनुकूलित प्रवेशनी 64 मिलीग्राम है, और इस कैनुला के लिए डमी 86 मिलीग्राम है। इस प्रकार, वाणिज्यिक अनुकूलित कैनुला और डमी का कुल वजन 150 मिलीग्राम है। इसके विपरीत, अनुकूलित स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला 18.3 मिलीग्राम है, और इस कैनुला के लिए डमी 8.5 मिलीग्राम है। इस प्रकार, अनुकूलित स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला का कुल वजन 26.8 मिलीग्राम है। सैद्धांतिक रूप से, स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला सेट का कम वजन जानवर के आंदोलन और मस्तिष्क पर कैनुला के प्रभाव को कम करेगा। इसके अलावा, वाणिज्यिक गाइड कैनुला की लागत स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला और इंजेक्टर से अधिक है। इसलिए, हम चूहों में स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी करने वाले अनुभवहीन शोधकर्ताओं के लिए स्टेनलेस स्टील गाइड कैनुला की सलाह देते हैं।

प्रत्यारोपित कैनुला मस्तिष्क क्षति के कारण रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव से भरा हो सकता है। कैनुला का यह क्लॉगिंग वाणिज्यिक प्रवेशनी पर स्टेनलेस स्टील कैनुला में अधिक बार हो सकता है। डमी को वाणिज्यिक प्रवेशनी को सुरक्षित रूप से कसने के लिए पिरोया जा सकता है (चित्रा 2 ए) लेकिन स्टेनलेस स्टील कैनुला (चित्रा 5 ए) के लिए नहीं। इसलिए, वसूली अवधि के दौरान डमी की संलग्नता सुनिश्चित करने से कैनुला के क्लॉगिंग को कम किया जा सकेगा। यदि 1 सप्ताह की वसूली के दौरान अलगाव होता है तो एक नया डमी डाला जाना चाहिए। इसके अलावा, पॉलीथीन ट्यूब को जोड़ने वाले इंजेक्टर को माउंट करने से पहले कैनुला को खोलने के लिए एक डिस्पोजेबल स्टरलाइज़्ड इंजेक्टर को कई बार डाला जाना चाहिए।

एनेस्थेटिक दवाओं की पसंद सर्जरी और व्यवहार परीक्षण को अत्यधिक प्रभावित करेगी। यहां, इंजेक्शन एनेस्थेटिक्स पर इनहेलेशन एनेस्थेटिक आइसोफ्लुरेन को चुना गया था क्योंकि वसूली का समय कम है और यह मानवीय कारणों से जानवरों के लिए कम हानिकारक है। हालांकि, माउस की स्थिति और शरीर के वजन के आधार पर आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन के लिए खुराक भिन्न हो सकती है। इसलिए, एनेस्थीसिया की स्थिति को पूरी शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान बारीकी से देखा जाना चाहिए, और आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। सभी प्रक्रियाओं के दौरान अनुकूलित श्वास दर प्रति सेकंड एक सांस होनी चाहिए। इसके अलावा, सक्रिय कार्बन से भरे गैस फिल्टर कनस्तर को एनेस्थीसिया कक्ष और नोजकोन मास्क से जोड़ा जाना चाहिए ताकि ऑपरेटिंग क्षेत्र में आइसोफ्लुरेन और निकास गैस प्रदूषण को शून्य किया जा सके। यह सर्जन को आइसोफ्लुरेन के विषाक्त प्रभाव से बचाएगा।

प्रतिनिधि परिणामों से पता चला कि एससीएफए जलसेक ने एक नए पिंजरे में हरकत पर कोई नाटकीय प्रभाव नहीं डाला। ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि इस परिणाम को प्राप्त करने के लिए जानवरों की एक छोटी संख्या का उपयोग किया गया था (चित्रा 6)। इसके अलावा, हमने केवल नए पिंजरे लोकोमोशन व्यवहार परीक्षण के पहले 5 मिनट के लिए एससीएफए को शामिल किया, लेकिन पूरे परीक्षण के लिए नहीं क्योंकि अधिकांश व्यवहार का परीक्षण थोड़े समय की खिड़की (5-15 मिनट) के भीतर किया गया था। आंत-व्युत्पन्न माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स के लिए समय खिड़की को जांचकर्ताओं की परिकल्पना के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए।

एनेस्थीसिया और एनेस्थीसिया से होश में आने का समय व्यवहार परीक्षणों के लिए महत्वपूर्ण है। यहां, इंजेक्टर आरोपण और एससीएफए जलसेक के लिए चूहों को संक्षेप में एनेस्थेटाइज किया गया था, और 15 मिनट के बाद व्यवहार परीक्षण किया गया था। इनहेलेशन एनेस्थीसिया की समाप्ति के बाद ठीक होने का समय पिछले अध्ययन38 के आधार पर निर्धारित किया गया था। एक पायलट अध्ययन ने सुनिश्चित किया कि एनेस्थीसिया के 15 मिनट बाद चूहे सक्रिय, स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ रहे थे, और असहज नहीं थे। हमने निम्नलिखित कारणों से इंजेक्टर के माउंटिंग के लिए संज्ञाहरण चरण पेश किया। सबसे पहले, इंजेक्टर गेज 33 जी है; जब जानवर सक्रिय रूप से आगे बढ़ रहा होता है तो कैनुला में इस तरह के नाजुक इंजेक्टर को सम्मिलित करना बहुत चुनौतीपूर्ण होता है। इसके अलावा, जागरूक चूहों की सूजन चूहों पर तनाव पैदा कर सकती है,व्यवहार संबंधी परिणामों को भ्रमित कर सकती है। दूसरा, रक्त / मस्तिष्कमेरु द्रव के थक्के के कारण कैनुला कभी-कभी अवरुद्ध हो जाता है। इंजेक्टर को माउंट करने से पहले कैनुला को धीरे से अनकोड करना मेटाबोलाइट इन्फ्यूजन के लिए आदर्श होगा। इन दो कारणों के आधार पर, इंजेक्टर को बढ़ाने के लिए चूहों को संक्षेप में एनेस्थेटाइज करने की सिफारिश की जाती है। जांचकर्ता लंबे समय तक (30 मिनट) इंतजार कर सकते हैं यदि इनहेलेशन एनेस्थीसिया से जानवर की वसूली के बारे में कोई चिंता है। इसके अलावा, प्रयोगों में तेजी लाने के लिए पॉलीथीन ट्यूब को जोड़ने वाले जलसेक-इंजेक्टर का एक अलग सेट स्थापित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल की कई सीमाएँ हैं. सबसे पहले, गाइड कैनुला और कनेक्टिंग पॉलीथीन ट्यूब का आरोपण ऑप्टोजेनेटिक और फाइबर फोटोमेट्री के लिए ऑप्टिक फाइबर को एक ही समन्वय, आसपास के क्षेत्र या यहां तक कि मस्तिष्क के एक ही गोलार्ध में प्रत्यारोपित करने के लिए सर्जिकल क्षेत्र को सीमित करेगा। प्रत्यारोपित गाइड कैनुला के साथ माउस सिर पर माइक्रोएंडोस्कोपी के लिए लेंस को प्रत्यारोपित करना और भी चुनौतीपूर्ण होगा। दूसरा, गाइड कैनुला का आरोपण माउस सिर पर एक महत्वपूर्ण वजन उत्पन्न कर सकता है। एक अनुकूलित कैनुला सेट का कुल वजन 26.8-150 मिलीग्राम है, एक स्क्रू ~ 48 मिलीग्राम है, और माउंटेड डेंटल ऐक्रेलिक 450-500 मिलीग्राम है। संपूर्ण स्थापना सेट चूहों के आंदोलनों को प्रतिबंधित कर सकता है। हालांकि, हाल के अध्ययनों ने स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों40,41 में कैल्शियम संकेतों की निगरानी के लिए एक मिनीस्कोप प्रत्यारोपित किया है। मिनिस्कोप का वजन 1.6 ग्राम से 4.5 ग्राम तक होता है, जिसमें स्क्रू और डेंटल ऐक्रेलिक शामिल नहीं होते हैं। इसलिए, माउस व्यवहार परीक्षण के लिए गाइड कैनुला का वजन अपेक्षाकृत स्वीकार्य माना जा सकता है। तीसरा, जलसेक के लिए कनेक्टिंग पॉलीथीन ट्यूब ~ 350 सेमी लंबा है, जो व्यवहार परीक्षण के दौरान चूहों के आंदोलन को सीमित कर सकता है। इस चिंता को दूर करने के लिए, माउस मोटर फ़ंक्शन पर कनेक्टिंग पॉलीथीन ट्यूब के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक ओपन-फील्ड टेस्ट में हरकत के लिए प्रीटेस्टिंग की आवश्यकता हो सकती है। चौथा, दंत एक्रिल चूहों पर एक न्यूरोटॉक्सिक प्रभाव पैदा कर सकता है। हालांकि, परीक्षण अवधि के दौरान गाइड कैनुला को माउस हेड से जोड़ना आवश्यक है। चूहों पर दंत एक्रिल के संभावित न्यूरोटॉक्सिक प्रभाव को कम करने के लिए, ऑपरेटरों को दंत एक्रिल के उपयोग से परिचित होना चाहिए। दंत एक्रिल को बेहतर ढंग से लागू किया जाता है जब दंत एक्रिल मिश्रण (पाउडर और तरल) मस्तिष्क में दंत एक्रिल तरल के प्रवेश को कम करने के लिए थोड़ा ठोस होता है।

माइक्रोबायोटा और उनके मेटाबोलाइट्स अलग-अलग विकास मील के पत्थर पर व्यवहार समारोह से जुड़े होते हैं। यद्यपि यह प्रोटोकॉल वयस्क C57BL/6 चूहों पर आधारित है, जिनके शरीर का वजन 26 ग्राम से 30 ग्राम तक है, इसे विभिन्न उम्र और आकार के चूहों पर भी लागू किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों ने युवा चूहों42,43,44,45 में स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी को अपनाया है। हालांकि, मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए निर्देशांक चूहों के आकार और उम्र के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। हम आयु-संबंधित एटलस या ऑनलाइन संसाधन (http://mouse.brain-map.org/static/atlas) को संदर्भित करने की सलाह देते हैं। इसके अलावा, निर्देशांक को युवा कुल चूहों में ट्रिपैन ब्लू या फ्लोरेसेंस डाई इंजेक्ट करके मान्य किया जाना चाहिए, इस प्रकार प्रयोगात्मक चूहों पर इसे निष्पादित करने से पहले विधि को अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले गाइड कैनुला सभी अनुकूलित हैं और चूहों के विभिन्न आकारों के लिए निर्देशांक को मान्य करने के बाद समायोजित किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल बहुत संशोधन के बिना उपकरण के शीर्ष पर एक खुले क्षेत्र के साथ अधिकांश कृंतक व्यवहार परीक्षण के साथ संगत होगा। कृंतक व्यवहार परीक्षण माउस सिर के शीर्ष पर बिना किसी बाधा के पॉलीथीन ट्यूब वायरिंग के साथ आयोजित किए जा सकते हैं, जिसमें ओपन-फील्ड टेस्ट, ऊंचा प्लस / शून्य भूलभुलैया, स्टेप डाउन टेस्ट, प्रत्यक्ष सामाजिक संपर्क, वयस्क अल्ट्रासोनिक मुखरता, मजबूर तैराकी परीक्षण, पूंछ निलंबन, पानी की भूलभुलैया, टी या वाई भूलभुलैया, उपन्यास वस्तु पहचान, संगमरमर दफन, स्व-सौंदर्य परीक्षण, बीम क्रॉसिंग शामिल हैं। पोल परीक्षण, और पानी से बचाव तनाव जोखिम। संलग्न कक्षों या ट्यूबों का उपयोग करने वाले परीक्षणों को संशोधित करने की आवश्यकता होगी ताकि पॉलीथीन ट्यूब को चूहों के साथ स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति मिल सके, जैसे कि तीन-कक्ष सामाजिक परीक्षण, प्रकाश-अंधेरे बॉक्स, भय कंडीशनिंग, सुक्रोज वरीयता, संयम तनाव, स्टार्टल परीक्षण, और प्रीपल्स-पल्स निषेध। हम परीक्षण से पहले चूहों पर पॉलीथीन ट्यूब के लिए आवश्यक लंबाई का पूर्व परीक्षण और अनुमान लगाने का सुझाव देते हैं।

आंत माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स को मेजबान व्यवहार 8,46,47,48,49 को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। वैज्ञानिक मस्तिष्क पर आंत माइक्रोबायोटा-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स के अस्थायी और स्थानिक प्रभावों और चूहों में व्यवहार की सीधे जांच करने के लिए इस विधि को अपना सकते हैं। उदाहरण के लिए, माइक्रोबियल मेटाबोलाइट 4-एथिलफेनिल सल्फेट (4ईपीएस) को एएसडी के प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल और एएसडी46,48,49 वाले लोगों में बढ़ाया गया था। चूहों में थैलेमस (पीवीटी) के पैरावेंट्रिकुलर न्यूक्लियस में 4ईपीएस के इंजेक्शन और4ईपीएस का उत्पादन करने वाले बैक्टीरिया के औपनिवेशीकरण ने चिंता जैसे व्यवहार और बिगड़ा हुआ ऑलिगोडेंड्रोसाइट परिपक्वता में वृद्धि की। चिंता जैसे व्यवहार परीक्षण के दौरान चूहों के पीवीटी पर 4ईपीएस के प्रत्यक्ष प्रभाव का मूल्यांकन करना आकर्षक होगा। हालांकि, पीवीटी में 4ईपीएस की पूर्ण एकाग्रता अभी भी अज्ञात है। इसलिए, पीवीटी में 4ईपीएस के पर्याप्त स्तर को निर्धारित करने के लिए एक खुराक-प्रतिक्रिया परीक्षण महत्वपूर्ण हो सकता है। मस्तिष्क और व्यवहार पर अन्य माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स के प्रभावों के लिए एक समान अवधारणा अपनाई जा सकती है।

सर्किट-आधारित न्यूरोटेक्नोलॉजीज, जैसे ऑप्टोजेनेटिक्स, केमोजेनेटिक्स और विवो कैल्शियम इमेजिंग में, महत्वपूर्ण तरीके हैं जो वैज्ञानिकों को व्यवहार50,51,52 के नियंत्रण में तंत्रिका सर्किट को समझने की अनुमति देते हैं। आंत-मस्तिष्क अक्ष एक जटिल संबंध है जो आंत रोगाणुओं और उनके मेटाबोलाइट्स के लिए मेजबान व्यवहार को मध्यस्थ करने के लिए महत्वपूर्ण है। अध्ययनों की बढ़ती संख्या ने आंत और मस्तिष्क के बीच पेचीदा क्रॉसस्टॉक को समझने के लिए सर्किट-आधारित न्यूरोटेक्नोलॉजीज को नियोजित कियाहै 33,53,54,55,56,57,58,59। यह प्रोटोकॉल आंत मेटाबोलाइट्स के कारण व्यवहार के मस्तिष्क क्षेत्र-आधारित नियंत्रण को समझने का एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करेगा। सर्किट-आधारित न्यूरोटेक्नोलॉजीज के साथ इस प्रोटोकॉल को संयोजित करने से शोधकर्ताओं को आंत मेटाबोलाइट्स द्वारा योगदान किए गए व्यवहार और मस्तिष्क गतिविधि के सर्किट-आधारित नियंत्रण में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति मिलेगी।

अंत में, आंत-मस्तिष्क अक्ष की अवधारणा को वैज्ञानिक समुदाय में अच्छी तरह से स्वीकार किया जाता है और न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों में आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स की भागीदारी की संभावना को बढ़ावा देता है 11,13,60,61,62,63,64,65 . यह पूछताछ करने के लिए कि आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स चूहों के मस्तिष्क और व्यवहार को कैसे और क्या प्रभावित करते हैं, क्षेत्र में एक व्यापक और शारीरिक-आधारित पद्धति की आवश्यकता होगी। यह लेख आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स को सीधे मस्तिष्क में वितरित करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है, सबसे महत्वपूर्ण बात, एक स्वतंत्र रूप से चलने वाले माउस में। इस डिजाइन को विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में आंत-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स के वितरण द्वारा क्षेत्र-विशिष्ट प्रभावों की जांच करने के लिए आगे अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास इस काम से संबंधित हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम जानवरों की देखभाल के लिए राष्ट्रीय चेंग कुंग विश्वविद्यालय (एनसीकेयू) में प्रयोगशाला पशु केंद्र के कर्मचारियों को स्वीकार करते हैं। इस काम को चेंग-एचएसिंग मेडिकल फाउंडेशन के प्रोफेसर कुन-येन हुआंग एजुकेशन फंड से सी-डब्ल्यूएल तक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था; ताइवान में विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (मोस्ट) से धन: (अंडरग्रेजुएट रिसर्च मोस्ट 109-2813-सी-006-095-बी) से टी-एचवाई; (सर्वाधिक 107-2320-बी-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) से W-L.W.; और उच्च शिक्षा स्प्राउट परियोजना, शिक्षा मंत्रालय से एनसीकेयू में विश्वविद्यालय उन्नति के मुख्यालय से डब्ल्यू-एलडब्ल्यू तक।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

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तंत्रिका विज्ञान अंक 184
स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों में आंत-व्युत्पन्न माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स का इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर डिलीवरी
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Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

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