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Neuroscience

Entrega intracerebroventricular de metabólitos microbianos derivados do intestino em camundongos em movimento livre

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

Os metabólitos microbianos derivados do intestino têm efeitos multifacetados, levando a um comportamento complexo em animais. Nosso objetivo é fornecer um método passo-a-passo para delinear os efeitos dos metabólitos microbianos derivados do intestino no cérebro através da entrega intracerebroventricular através de uma cânula guia.

Abstract

O impacto da microbiota intestinal e seus metabólitos na fisiologia e no comportamento do hospedeiro tem sido extensivamente investigado nesta década. Numerosos estudos revelaram que os metabólitos derivados da microbiota intestinal modulam as funções fisiológicas mediadas pelo cérebro através de intrincadas vias intestino-cérebro no hospedeiro. Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são os principais metabólitos derivados de bactérias produzidos durante a fermentação de fibras alimentares pelo microbioma intestinal. Os AGCCs secretados do intestino podem atuar em vários locais da periferia, afetando as respostas imunológicas, endócrinas e neurais devido à vasta distribuição de receptores SCFAs. Portanto, é um desafio diferenciar os efeitos centrais e periféricos dos AGCCs por meio da administração oral e intraperitoneal de AGCC. Este artigo apresenta um método baseado em vídeo para interrogar o papel funcional dos AGCCs no cérebro através de uma cânula guia em camundongos em movimento livre. A quantidade e o tipo de AGCCs no cérebro podem ser ajustados controlando o volume e a taxa de infusão. Este método pode fornecer aos cientistas uma maneira de apreciar o papel dos metabólitos derivados do intestino no cérebro.

Introduction

O trato gastrointestinal humano abriga diversos microrganismos que impactam o hospedeiro 1,2,3. Essas bactérias intestinais podem secretar metabólitos derivados do intestino durante a utilização de componentes dietéticos consumidos pelo hospedeiro 4,5. Curiosamente, os metabólitos intestinais não metabolizados na periferia podem ser transportados para outros órgãos via circulação6. Vale ressaltar que esses metabólitos secretados podem servir como mediadores para o eixo intestino-cérebro, definido como a comunicação bidirecional entre o sistema nervoso central e o intestino7. Estudos prévios mostraram que metabólitos derivados do intestino podem modular o comportamento complexo e a emoção em animais 8,9,10,11.

Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são os principais metabólitos produzidos pela microbiota intestinal durante a fermentação de fibras alimentares e carboidratos indigestos6. Acetato, propionato e butirato são os AGCCs mais abundantes no intestino12. Os AGCCs servem como fonte de energia para as células do trato gastrointestinal. AGCCs não metabolizados no intestino podem ser transportados para o cérebro através da veia porta, modulando assim o cérebro e o comportamento 6,12. Estudos prévios sugeriram que os AGCCs podem desempenhar um papel crítico nos transtornos neuropsiquiátricos 6,12. Por exemplo, a injeção intraperitoneal de butirato em camundongos BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), um modelo animal de transtorno do espectro autista (TEA), resgatou seus déficits sociais13. Ratos tratados com antibióticos que receberam microbiota de indivíduos depressivos mostraram um aumento nos comportamentos semelhantes à ansiedade e nos AGCCs fecais14. Clinicamente, alterações nos níveis de AGCCs fecais foram observadas em pessoas com TEA em comparação com controles com desenvolvimento típico15,16. Pessoas com depressão apresentam níveis mais baixos de AGCCs fecais do que indivíduos saudáveis17,18. Esses estudos sugeriram que os AGCCs podem alterar o comportamento em animais e humanos através de várias rotas.

Os metabólitos microbianos exercem diversos efeitos em múltiplos locais do corpo, impactando a fisiologia e os comportamentos do hospedeiro 4,19, incluindo o trato gastrointestinal, o nervo vago e o nervo simpático. É difícil identificar o papel preciso dos metabólitos derivados do intestino no cérebro ao administrar os metabólitos por vias periféricas. Este trabalho apresenta um protocolo baseado em vídeo para investigar os efeitos de metabólitos derivados do intestino no cérebro de um rato em movimento livre (Figura 1). Mostramos que os AGCCs poderiam ser administrados agudamente através da cânula-guia durante os testes comportamentais. O tipo, o volume e a taxa de infusão de metabólitos podem ser modificados dependendo da finalidade. O local da canulização pode ser ajustado para explorar o impacto dos metabólitos intestinais em uma região específica do cérebro. Nosso objetivo é fornecer aos cientistas um método para explorar o impacto potencial dos metabólitos microbianos derivados do intestino no cérebro e no comportamento.

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Protocol

Todos os protocolos experimentais e os cuidados com os animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional de Cheng Kung (NCKU).

1. Preparação para o animal experimental

  1. Obtenha camundongos machos C57BL/6JNarl do tipo selvagem de 6 a 8 semanas de idade de um fornecedor.
  2. Coloque os ratos em uma gaiola de rato padrão com ração de rato padrão e água esterilizada ad libitum.
    NOTA: As condições de alojamento para o Centro de Animais de Laboratório da NCKU são 22 ± temperatura de 1 °C, 55% ± 10% de umidade e um ciclo claro/escuro de 13 h/11 h.

2. Cirurgia estereotáxica

  1. Preparar e esterilizar o instrumento estereotáxico, instrumentos cirúrgicos e itens relacionados.
    NOTA: Todos os itens que entrarão em contato diretamente com o local cirúrgico devem ser esterilizados para evitar a infecção.
  2. Anestesiar o rato, colocando-o na gaiola de plexiglas com 1%-5% de isoflurano em oxigénio.
    NOTA: Observe atentamente o rato para garantir que a taxa de respiração é mantida em torno de uma respiração por segundo.
  3. Tire o rato da câmara de anestesia. Raspe o local cirúrgico (cabeça do rato) com um aparador de animais de estimação. Coloque o mouse sobre o quadro estereotáxico fixando os incisivos do mouse na barra do incisivo no suporte do incisivo estereotáxico. Cubra o nariz com a máscara do nariz.
  4. Anestesiar o camundongo com isoflurano de 1% a 2,5% em oxigênio durante toda a cirurgia estereotáxica. Avalie a nocicepção do rato através do reflexo da pinça do dedo do pé e assegure uma taxa de respiração constante antes de incidir o local cirúrgico.
  5. Coloque uma almofada de aquecimento (37,0 °C) por baixo do rato na estrutura estereotáxica para manter a temperatura corporal durante a cirurgia. Alternativamente, mantenha a temperatura central com o auxílio de uma sonda térmica retal conectando o aquecedor programado e a almofada de aquecimento.
  6. Remova o pelo aparado na cabeça usando fita adesiva. Injete o rato com o analgésico cetoprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea para aliviar a dor. Aplique pomada ocular para evitar olhos secos.
  7. Insira a barra auricular pontiaguda no canal auditivo para fixar a cabeça.
  8. Centralize a cabeça ajustando a escala da barra auricular.
  9. Aperte a braçadeira do nariz no suporte do incisivo para evitar o movimento vertical. Pressione a cabeça suavemente para verificar se a cabeça está fixa e evitar que a cabeça se solte durante a cirurgia subsequente.
  10. Desinfete o couro cabeludo com três esfoliantes alternados de clorexidina usando um cotonete. Inicie cada esfoliação do meio para o lado externo (da área central mais desinfetada para a área menos desinfetada).
    NOTA: O uso de esfoliantes do meio para o exterior pode ajudar os cientistas a minimizar a infecção e a contaminação da pele. A área externa está próxima à região da cabeça não raspada, que ainda tem uma grande quantidade de pelo e não é fácil de desinfetar completamente.
  11. Incidir o couro cabeludo de forma anterior/posterior (<1 cm) utilizando uma lâmina cirúrgica. Abra a incisão e limpe o crânio com um cotonete segurado por pinça de microdissecação.
    NOTA: A pinça microdissecante, a lâmina cirúrgica e os cotonetes devem ser esterilizados por autoclave antes da cirurgia. Durante o processo cirúrgico, esterilizar todo o equipamento cirúrgico utilizando um esterilizador de esferas de vidro (150 °C) durante pelo menos 5 s antes e depois de cada animal. Prepare um copo esterilizado para segurar a lâmina cirúrgica e a pinça durante o processo cirúrgico e entre os animais.
  12. Identifique o Bregma e o Lambda no crânio. Use o Bregma como referência para localizar a região de interesse.
    1. Opcional: Monte a broca estereotáxica no suporte da broca estereotáxica e use a ponta da broca para apontar Bregma como referência. Esterilizar a broca estereotáxica utilizando o esterilizador de esferas de vidro (150 °C) durante, pelo menos, 5 s.
  13. Calibrar e alinhar o plano horizontal do crânio plano nos planos esquerdo/direito e anterior/posterior por Bregma/Lambda.
    NOTA: Se não estiver em um plano horizontal correto, remonte o mouse no instrumento estereotáxico.

3. Implantação de cânula guia personalizada comercial

  1. Identificar e rotular a posição do ventrículo lateral direito, com base nas coordenadas estereotáxicas: Distância a Bregma, anterior/posterior (A/P): 0,26 mm, medial/lateral (M/L): -1,0 mm, dorsal/ventral (D/V): -2,0 mm20.
    NOTA: As coordenadas podem ser modificadas com base na região de interesse. As coordenadas para o ventrículo lateral foram baseadas em camundongos adultos C57BL/6J com uma faixa de peso de 26-30 g. Se ratos mais jovens forem usados, consulte a discussão.
  2. Faça um furo (diâmetro = 1,5 mm) através do crânio no local marcado usando uma broca estereotáxica para a implantação de uma cânula guia comercial.
  3. Faça mais dois a quatro furos (diâmetro = 1,5 mm) no crânio usando uma broca estereotáxica para a montagem de parafusos de aço inoxidável.
    NOTA: Esterilizar a broca estereotáxica utilizando um esterilizador de esferas de vidro (150 °C) durante, pelo menos, 5 s antes e depois de cada animal.
  4. Limpe os restos ósseos e pare de sangrar com um cotonete.
  5. Limpe o crânio com lidocaína (1 mg / kg) usando um cotonete para efeitos anestésicos locais, antipruriginosos e analgésicos. Se o sangramento não parar após a perfuração, coloque suavemente um cotonete no orifício para hemostasia.
  6. Monte dois a quatro parafusos inoxidáveis nos orifícios para fornecer âncoras para acrílico dental.
  7. Colocar a cânula guia comercial no suporte da cânula estereotáxica e desinfectar com o esterilizador de esferas de vidro (150 °C).
    NOTA: A cânula guia comercial, o manequim comercial e o injetor comercial (Figura 2A) foram personalizados com as especificações mostradas na Tabela de Materiais.
  8. Mova o suporte da cânula estereotáxica para o orifício perfurado para o ventrículo lateral e insira lentamente a cânula guia comercial no orifício até a profundidade desejada (2,5 mm).
    NOTA: A coordenada dorsal/ventral pode ser definida definindo a ponta da cânula guia comercial como referência quando a ponta mal é inserida no orifício.
  9. Aplique 10 μL de adesivo de n-butilcianoacrilato (cola adesiva de tecido) para fixar a cânula guia comercial no furo perfurado e aguarde 3-4 min. Solte a cânula guia comercial suavemente do suporte da cânula estereotáxica e afaste-o.
  10. Aplique o acrílico dentário no couro cabeludo incisado para fixar a cânula guia comercial e aguarde pelo menos 5 minutos. Implante o manequim comercial na cânula guia comercial para evitar o entupimento da cânula pelo sangue ou fluido corporal (Figura 2B).
  11. Solte a barra auricular do canal auditivo e remova o mouse do quadro estereotáxico.
  12. Coloque o rato numa nova gaiola com uma almofada de aquecimento por baixo para recuperação da anestesia e observe continuamente até que o rato acorde completamente.
    NOTA: Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Um animal que tenha sido submetido a cirurgia não deve retornar à companhia de outros animais até que seja totalmente recuperado.
  13. Devolver o rato a um alojamento único ou a um alojamento em grupo, dependendo do protocolo institucional da IACUC e do desenho experimental. Para alojamento em grupo, certifique-se de que menos ratos estão alojados em uma gaiola para minimizar lesões indesejadas ou o descolamento da cânula.
  14. Administrar ibuprofeno (0,2 mg/mL) na água potável por pelo menos 3 dias para cuidados pós-operatórios e monitorar duas vezes ao dia sinais de dor e angústia por pelo menos 3 dias.
    1. Durante os cuidados pós-operatórios, aplique pomada de roxitromicina ao redor da pele para prevenir a inflamação e a infecção nos camundongos.
    2. Continue monitorando o estado do animal e dê uma injeção intraperitoneal oportuna de glicose a 5% e / ou cloreto de sódio a 0,9% para fornecer energia suficiente.
    3. Se o estado de dor, angústia ou infecção se deteriorar constantemente, eutanasie o rato por inalação de CO2 .
  15. Aguarde 1 semana após a operação para que o rato esteja pronto para a entrega intracerebroventricular de AGCCs e testes comportamentais.

4. Preparação dos SCFAs

  1. Dissolva o acetato de sódio, o butirato de sódio e o propionato de sódio no líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Certifique-se de que os produtos químicos estejam totalmente dissolvidos, ajuste o pH para 7,4 e filtre a mistura de SCFAs através de um filtro de 0,22 μm para esterilização.

5. Configurar o sistema de infusão para a entrega intracerebroventricular de AGCCs durante o teste comportamental

  1. Monte uma câmera de teto para registrar o comportamento. Conecte a câmera a um computador para controlar o software de gravação de vídeo (Figura 3).
  2. Encha uma seringa de 10 μL com água destilada.
    NOTA: Evite bolhas de ar na seringa de microlitro.
  3. Conecte uma bomba de microinjeção com o controlador de microinjeção.
  4. Monte a seringa de microlitro na bomba de microinjeção. Para instalar a seringa, prima o botão para soltar a braçadeira e instale a seringa na posição correspondente. Feche a braçadeira e aperte o parafuso de retenção do êmbolo na bomba de microinjeção (Figura 4A).
  5. Inserir o injetor comercial no tubo de polietileno (Figura 2A).
  6. Pendure o tubo de polietileno na câmera de teto acima da arena de testes.
  7. Encha o tubo de polietileno com água destilada usando uma seringa de insulina. Ligue a seringa de microlitros ao tubo de polietileno suspenso.
    NOTA: Certifique-se de que o tubo de polietileno seja longo o suficiente para permitir que o mouse se mova livremente por toda a arena de teste.

6. Configurações do sistema do controlador de microinjeção

  1. Ligue o controlador de microinjeção e pressione Display All Channels para acessar a tela Command (Figura 4C). Pressione Configuração e defina Volume Target para 9.800 nL com Delivery Rate para 100 nL/s. Infundir 9.800 nL de água destilada do tubo de polietileno conectado à seringa de microlitro (pressione Direção para alternar para o modo Infusão e pressione RUN) (veja quadrados vermelhos na tela de comando da Figura 4C).
  2. Pressione Configuração e defina Volume Target como 3.000 nL com Delivery Rate para 100 nL/s. Retire 3.000 nL de óleo mineral (pressione Direction para alternar para o modo Withdraw e pressione RUN) (veja quadrados vermelhos na tela Command da Figura 4C).
    NOTA: Uma separação clara da fase óleo-água deve ser observada no tubo de polietileno.
  3. Desmonte o tubo de polietileno da agulha da seringa de microlitro. Cuspa 3.000 nL de água destilada da agulha da seringa de microlitro (pressione Direção para alternar para o modo Infusão e pressione RUN).
  4. Insira a seringa de microlitro de volta no tubo de polietileno. Pressione Configuração e defina Volume Target para 9.500 nL com Delivery Rate para 100 nL/s. Retire 9.500 nL de SCFAs (pressione Direção para alternar para o modo Retirar e pressione RUN). Rotule a fase óleo-SCFAs para validar se os SCFAs são infundidos com êxito.
  5. Pressione Configuration (Configuração ) e defina o Volume Target desejado com Delivery Rate para 7 nL/s. Pressione Direction para alternar para o modo Infuse (consulte quadrados vermelhos na tela Command da Figura 4C).
    NOTA: Determine o volume com base no tempo de perfusão. Por exemplo, se o tempo de perfusão for de 3 min para a taxa de administração de 7 nL/s, o volume alvo = 1.260 nL.
  6. Pressione RUN para infundir a seringa de microlitro para a frente até que o líquido saia na extremidade frontal do injetor comercial antes de inserir o injetor na cânula para injeção de SCFAs.

7. Infusão de AGCC no ventrículo lateral através da cânula guia comercial em camundongo em movimento livre

  1. Anestesiar o rato, colocando-o na gaiola de plexiglas com 1%-5% de isoflurano em oxigénio.
    NOTA: Observe atentamente o rato para garantir que a taxa de respiração é mantida em torno de uma respiração por segundo.
  2. Scruff o mouse e inserir o injetor comercial na cânula guia comercial (Figura 4B).
    NOTA: Se a cânula guia comercial estiver obstruída por sangue ou fluido corporal, desobstrua-a suavemente com uma pinça.
  3. Permita que o rato se recupere da anestesia por 15 minutos em uma gaiola antes do teste comportamental.
  4. Para o teste básico de locomoção, coloque o rato em uma nova gaiola e permita que ele explore livremente por 35 minutos. Infunda SCFAs usando uma Taxa de Entrega de 7 nL /s para um volume de destino de 2.100 nL nos primeiros 5 minutos (pressione Direção para o modo Infusão e pressione RUN).
    NOTA: A locomoção na nova gaiola pode ser analisada por meio de um software de rastreamento de vídeo do comportamento animal21,22.
  5. Anestesiar o rato (repetindo o passo 7.1) e retirar o injector comercial da cânula guia comercial.
    NOTA: O rato pode ser repetidamente injetado com diferentes controlos/metabolitos depois de administrar o período de tempo adequado para lavar a injeção anterior. Desde que a cânula esteja fixada na cabeça do rato, o rato pode ser repetidamente testado com diferentes metabolitos.

8. Restauração do sistema de microinjeção

  1. Desmonte o tubo de polietileno da seringa de microlitro.
  2. Injete ar no tubo usando a seringa de insulina para descartar a água destilada no tubo de polietileno. Esvazie a seringa de microlitro.
  3. Pressione Reset Pos na tela Configuration para abrir a tela Syringe Stop Definition (Figura 4C).
  4. Pressione Retirar até que ocorra um som de bipe para redefinir a bomba de microinjeção para a posição totalmente retirada (Figura 4C).
  5. Retorne à tela Command e desligue o controlador de microinjeção se houver um sinal ** END REACH** nesta tela (Figura 4C).

9. Opcional: Validação da injeção intracerebroventricular pelo traçador neural

  1. Infundir 2.100 nL do traçador neural com a Taxa de Entrega de 7 nL/s para verificar o local de perfusão.
    NOTA: Deixe o injetor na cânula guia por 5 minutos para evitar o refluxo.
  2. Anestesiar o rato com uma sobredosagem de isoflurano (5%) 30 min após a perfusão de marcador neural.
  3. Verifique a taxa de respiração e o reflexo de pinça da cauda / pata no rato anestesiado.
    Observação : os mouses devem parar de responder antes da próxima etapa.
  4. Faça uma incisão de 4-5 cm através da pele, músculo e parede abdominal abaixo da caixa torácica.
  5. Mova ligeiramente o fígado para longe do diafragma com cuidado.
  6. Incise o diafragma para expor o coração do rato.
  7. Perfundir o rato através do coração com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e paraformaldeído gelado a 4% em PBS.
  8. Decapitar o camundongo e dissecar o cérebro cuidadosamente com pinça de microdissecação e tesoura de microdissecação para retirar todo o cérebro23. Coloque as amostras de cérebro em paraformaldeído gelado a 4% em PBS por 3-4 dias e lave-as 3 x 5 min com PBS.
  9. Corte o cérebro em duas partes no suporte da fatia do cérebro do rato no oitavo corte do suporte da fatia do cérebro do rato (1 mm / seção) da direção anterior para posterior. Coloque o cérebro no molde de incorporação e incorpore as amostras de cérebro em agarose de baixo ponto de fusão (4% em PBS).
  10. Cole o cérebro embutido em agarose no palco do vibratome usando supercola. Separe o cérebro coronalmente em fatias cerebrais de 50 μm usando o vibratome.
  11. Incubar as fatias cerebrais no anticorpo visando o marcador neural diluído em tampão de bloqueio (diluição de 1:1.000) durante a noite à temperatura ambiente.
    NOTA: O tampão de bloqueio continha 10% de soro de cavalo, 0,1% de Triton X-100 e 0,02% de azida de sódio.
  12. Lave as fatias 3 x 5 min com PBST (PBS com 0,1% de tritão X-100).
  13. Incubar as fatias cerebrais em anticorpo secundário conjugado com fluorescência-corante diluído em tampão de bloqueio (diluição de 1:500) por 2 h à temperatura ambiente.
  14. Lave as fatias 3 x 5 min com PBS.
  15. Monte as fatias cerebrais na lâmina com um meio de montagem contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
  16. Cubra a lâmina com uma tampa de microscópio.
  17. Aplique esmalte na borda deslizante para evitar vazamento do meio de montagem.
  18. Após a incubação durante a noite à temperatura ambiente, protegida da luz, imagem do sinal de fluorescência no local de perfusão utilizando um microscópio de fluorescência.

10. Opcional: Infusão de metabólitos através de uma cânula guia de aço inoxidável personalizada no ventrículo lateral em camundongos

  1. Siga as seções de protocolo 1-8 e substitua a cânula guia comercial por uma cânula guia de aço inoxidável para infundir produtos químicos através de um injetor de aço inoxidável no mouse.
    NOTA: Os prós e contras das diferentes cânulas comerciais e de aço inoxidável são elaborados na seção de discussão.
  2. Realizar o protocolo cirúrgico da mesma forma descrita nas seções 2 e 3 do protocolo, exceto lembrar de substituir a cânula guia comercial por uma cânula guia de aço inoxidável (Figura 5B).
    NOTA: A cânula guia de aço inoxidável, o manequim de aço inoxidável e o injetor de aço inoxidável (Figura 5A) foram personalizados com as especificações mostradas na Tabela de Materiais. Insira a cânula guia de aço inoxidável personalizada no orifício até a profundidade desejada (2,0 mm).
  3. Infundir SCFAs através da cânula guia de aço inoxidável usando o sistema de microinjeção que consiste no controlador de microinjeção e na bomba de microinjeção (Figura 4B) (o mesmo que as seções de protocolo 4-7). Para o manequim de aço inoxidável da cânula guia de aço inoxidável, dobre um lado do injetor de aço inoxidável suavemente até que a ponta do outro lado seja 1 mm mais longa que a cânula guia de aço inoxidável.
  4. Infundir 2.100 nL do marcador neural através da cânula guia de aço inoxidável no ventrículo lateral em camundongos (o mesmo que a seção 9 do protocolo).
  5. Coletar a amostra por 30 minutos após a infusão do traçador neural (o mesmo que a seção 9 do protocolo).
  6. Realizar a aquisição de imagens nas fatias cerebrais infundidas do traçador neural (o mesmo que a seção 9 do protocolo).

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Representative Results

O camundongo foi infundido com AGCCs 1 semana após a recuperação do implante da cânula-guia para avaliar a atividade locomotora em uma nova gaiola. O camundongo foi colocado em uma nova gaiola e infundido com 2.100 nL de AGCCs ou ACSF nos primeiros 5 minutos (taxa de entrega de 7 nL/s) no cérebro através da cânula guia comercial implantada no ventrículo lateral do cérebro. A atividade locomotora em uma nova gaiola foi registrada por mais 30 minutos após a infusão. Não foi observada diferença na atividade locomotora na nova gaiola entre a infusão de AGCCs e ACSF (Figura 6) (n = 2 camundongos por grupo; os dados são apresentados como média ± e.m. e analisados por ANOVA two-way).

Para validar a precisão do implante da cânula-guia nas regiões cerebrais, um marcador neural fluorescente foi infundido nos camundongos através da cânula guia no mesmo volume e taxa de entrega que os AGCCs (2.100 nL em 5 min; 7 nL/s). Os cérebros foram coletados para histologia 30 min depois. O corante fluorescente foi detectado no ventrículo lateral e nas regiões circundantes do cérebro do camundongo (Figura 7A). Uma cânula guia de aço inoxidável foi implantada no ventrículo lateral do cérebro para a infusão de traçador neural nas mesmas condições. Semelhante à cânula-guia, os resultados mostraram que um sinal de corante fluorescente foi detectado no ventrículo lateral e nas regiões circundantes do cérebro do camundongo, mesmo após a infusão através da cânula guia de aço inoxidável (Figura 7B).

Figure 1
Figura 1: O procedimento para infusão intracerebroventricular em camundongos em movimento livre. O fluxograma para a entrega intracerebroventricular de metabólitos microbianos derivados do intestino em camundongos em movimento livre. Abreviação: SCFAs = ácidos graxos de cadeia curta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Implantação da cânula guia comercial em camundongos . (A) A imagem representativa da cânula-guia comercial, manequim e injetor. (B) A imagem representativa da cânula guia comercial e do manequim implantada no cérebro de camundongos por fixação com acrílico dental. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: A plataforma de infusão intracerebroventricular para teste de comportamento. O diagrama do sistema de microinjeção, sistema de gravação de vídeo e aparelho comportamental. Abreviação: SCFAs = ácidos graxos de cadeia curta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: O sistema de microinjeção. (A) A instalação da seringa de microlitro usando uma bomba de microinjeção. (B) A inserção do injetor comercial conectado com tubo de polietileno na cânula guia comercial (C) A tela sensível ao toque do controlador de microinjeção. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Implantação de cânula-guia de aço inoxidável no ventrículo lateral de camundongos . (A) A imagem representativa da cânula-guia, do manequim e do injetor de aço inoxidável. (B) A imagem representativa da cânula guia de aço inoxidável e manequim implantada no cérebro de camundongos por fixação com acrílico dental. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Atividade locomotora de camundongos com infusão de AGCCs na nova gaiola. (A) Esquema da linha do tempo do implante da cânula-guia e da locomoção da nova gaiola após a infusão de ACSF ou SCFAs. (B) Esquema da linha do tempo para colocação de seringa de infusão, janela de infusão (sombra azul) e o novo teste de comportamento da gaiola. (C) Distância total movida por camundongos com infusão de ACSF e SCFAs em uma nova gaiola por 35 min. A janela de tempo para infusão é indicada com sombra azul (0-5 min). (D) Imagens representativas de trajetórias para camundongos com infusão de ACSF e SCFAs em uma nova gaiola. n = 2 ratos por grupo. Os dados apresentados como média ± e.s.m. e analisados por ANOVA two-way. ns: não significativo. Abreviaturas: AGCCs = ácidos graxos de cadeia curta; ACSF = líquido cefalorraquidiano artificial. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: A histologia do corante fluorescente com infusão cerebral. Infusão através da cânula guia de aço inoxidável personalizada (A) comercial e (B) implantada no ventrículo lateral (VE) de camundongos. Barras de escala = 1 mm (esquerda) e 500 μm (direita). Azul: coloração DAPI; Verde: Etiquetagem de Ouro Antifluorescente. Abreviaturas: VE = ventrículo lateral; CA = comissura anterior; CPu = putâmen caudado; LS = septo lateral; SM = septo medial. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Metabólitos derivados do intestino têm sido associados a doenças mediadas pelo cérebro sem muito mecanismo preciso, em parte devido aos seus múltiplos sítios de ligação no organismo 6,12,24. Relatos anteriores indicaram que os AGCCs poderiam servir como ligantes para receptores acoplados à proteína G, reguladores epigenéticos e fontes de produção de energia em múltiplos locais do organismo 6,12. Para contornar os fatores de confusão que se originam da periferia (como células imunes, hormônios e sistema nervoso autônomo), um método foi desenvolvido adotando a injeção intracerebroventricular de AGCCs no cérebro através de uma cânula guia em camundongos em movimento livre. Além disso, os locais de canulização e infusão foram validados para explorar as áreas cerebrais potencialmente afetadas pelos AGCC. No total, este artigo apresenta um método preciso, meticuloso e validado para fornecer metabólitos derivados do intestino no cérebro para pesquisa do eixo intestino-cérebro.

A entrega intracerebroventricular de fármacos e produtos químicos por meio de cânula-guia em animais tem sido bem estabelecida 25,26,27,28,29 para diversos testes de drogas 29, modelagem de doenças 26,28 e delineamento específico de testes comportamentais 27 . Mais importante ainda, vários estudos entregaram metabólitos microbianos intestinais no cérebro através de injeção intracerebroventricular e testaram seus efeitos sobre as funções fisiológicas30,31,32,33. Este protocolo fornece um atributo adicional na administração de metabólitos intestinais de forma aguda para o cérebro em tempo real, o que permitiria aos cientistas compreender os efeitos dinâmicos dos metabólitos intestinais no cérebro e no comportamento.

A taxa de entrega para a infusão de metabólitos é crucial para simular o fluxo de líquido cefalorraquidiano nos ventrículos cerebrais. Um estudo indicou que a taxa de produção de líquido cefalorraquidiano em camundongos é de 5,3 nL/s34. Para controlar a vazão de AGCCs naturalmente em camundongos em movimento livre, avaliamos a vazão desse sistema de microinjeção (Figura 3 e Figura 4). Os SCFAs podiam ser infundidos suavemente sem muita resistência, mesmo quando o tubo de polietileno de 350 cm de comprimento era usado para infundir SCFAs em um mouse em movimento livre. Com o enchimento de água destilada e óleo mineral para diminuir a resistência líquida no tubo de polietileno (ver secções 5 e 6 do protocolo), o caudal pode ser reduzido de 100 nL/s para 7 nL/s. A infusão dos AGCCs ou ACSF a uma taxa de fluxo de 7 nL/s não resultou em nenhum comportamento anormal dos camundongos.

A quantidade e a dosagem de metabólitos derivados do intestino para injeção intracerebroventricular são críticas. Continua a ser um desafio analisar de forma abrangente os níveis absolutos de metabólitos derivados do intestino em várias regiões do cérebro. Por exemplo, pouquíssimos estudos têm demonstrado a detecção dos níveis fisiológicos de AGCCs no cérebro35,36. Um estudo mostrou que as concentrações de acetato, propionato e butirato no cérebro de camundongos são de aproximadamente 1640,6-3281,2 μg/g, 288,18-384,24 μg/g e 44,036-66,054 μg/g, respectivamente36. No entanto, outro estudo relatou níveis mais baixos de AGCCs no cérebro (acetato 128,1 μg/g, propionato 0,3883 μg/g e butirato 0,1640 μg/g)35. As quantidades de acetato, propionato e butirato infundidos adotadas neste protocolo foram de 5,81385 μg/g, 4,62378 μg/g e 2,6124 μg/g, respectivamente. Portanto, as concentrações dos AGCCs infundidos neste protocolo são comparáveis às concentrações fisiológicas. No entanto, não pudemos excluir a possibilidade de que as concentrações de AGCCs possam variar em regiões cerebrais distintas. Vários estudos mostraram que a entrega de propionato no ventrículo cerebral por injeção intracerebroventricular (4 μL de ácido propiônico 0,26 M em 1 min; aproximadamente 249.756 μg/g) prejudicou o comportamento social e a cognição em ratos30,31. A dosagem e a taxa de fluxo do propionato infundido foram relativamente altas, conforme relatado em camundongos35 e ratos37. Portanto, os avanços na análise de metabólitos e no perfil metabolômico no cérebro e na periferia ajudarão os pesquisadores a entender melhor as mudanças dinâmicas espaciais e temporais nos metabólitos derivados do intestino.

Dois tipos de cânulas-guia foram apresentados neste protocolo para injeção intracerebroventricular em camundongos - uma cânula-guia comercial e uma cânula-guia de aço inoxidável. A cânula guia comercial e o manequim são bem projetados para implantação. Não é fácil para os ratos removerem o manequim personalizado devido à tampa. Pelo contrário, o manequim de aço inoxidável pode ser facilmente removido da cânula guia de aço inoxidável por camundongos durante a recuperação de 1 semana, causando a coagulação do sangue / líquido cefalorraquidiano na cânula. No entanto, a cânula personalizada comercial é de 64 mg, e o manequim para esta cânula é de 86 mg. Assim, o peso total da cânula e manequim comercial personalizado é de 150 mg. Em contraste, a cânula guia de aço inoxidável personalizada é de 18,3 mg e o manequim para esta cânula é de 8,5 mg. Assim, o peso total da cânula guia de aço inoxidável personalizada é de 26,8 mg. Teoricamente, o baixo peso do conjunto de cânulas guia de aço inoxidável minimizaria o impacto da cânula no movimento do animal e no cérebro. Além disso, o custo da cânula guia comercial é maior do que a cânula guia de aço inoxidável e o injetor. Assim, recomendamos a cânula guia de aço inoxidável para pesquisadores inexperientes que realizam cirurgia estereotáxica em camundongos.

A cânula implantada pode ser obstruída pelo sangue e líquido cefalorraquidiano devido a danos cerebrais. Esse entupimento da cânula poderia ocorrer com mais frequência na cânula de aço inoxidável sobre a cânula comercial. O manequim pode ser rosqueado para apertar a cânula comercial com segurança (Figura 2A), mas não para a cânula de aço inoxidável (Figura 5A). Portanto, garantir a fixação do manequim durante o período de recuperação minimizaria o entupimento da cânula. Um novo manequim deve ser inserido se ocorrer descolamento durante a recuperação de 1 semana. Além disso, um injetor esterilizado descartável deve ser inserido várias vezes para desobstruir a cânula antes de montar o injetor que conecta o tubo de polietileno.

A escolha de drogas anestésicas influenciará fortemente a cirurgia e o teste de comportamento. Aqui, o anestésico inalatório isoflurano foi escolhido em vez dos anestésicos injetados porque o tempo de recuperação é menor e é menos prejudicial aos animais por razões humanas. No entanto, a dosagem para a inalação de isoflurano pode ser variada dependendo do estado do rato e do peso corporal. Portanto, o estado da anestesia deve ser observado de perto durante todo o procedimento cirúrgico e o vaporizador de isoflurano ajustado de acordo. A taxa de respiração otimizada deve ser de uma respiração por segundo durante todos os procedimentos. Além disso, o recipiente do filtro de gás preenchido com carvão ativado deve ser conectado à câmara de anestesia e à máscara do cone nasal para anular o isoflurano e a poluição dos gases de escape na área de operação. Isso protegerá o cirurgião do efeito tóxico do isoflurano.

Os resultados representativos demonstraram que a infusão de AGCCs não produziu nenhum efeito dramático sobre a locomoção em uma nova gaiola. Isso pode ser porque um pequeno número de animais foi utilizado para obter esse resultado (Figura 6). Além disso, nós só infundimos os SCFAs para os primeiros 5 minutos do novo teste de comportamento de locomoção da gaiola, mas não todo o teste, porque a maior parte do comportamento foi testada dentro de uma curta janela de tempo (5-15 min). A janela de tempo para os metabólitos microbianos derivados do intestino deve ser ajustada com base na hipótese dos investigadores.

O tempo para a anestesia e a recuperação da consciência da anestesia são críticos para testes comportamentais. Aqui, os camundongos foram anestesiados brevemente para o implante do injetor e infusão de SCFAs, e o teste de comportamento foi realizado após 15 min. O tempo de recuperação após a cessação da anestesia inalatória foi determinado com base em estudo prévio38. Um estudo piloto garantiu que os ratos estivessem ativos, em movimento livre e não desconfortáveis 15 minutos após a anestesia. Introduzimos a etapa de anestesia para a montagem do injetor pelos seguintes motivos. Primeiro, o medidor do injetor é de 33 G; é muito desafiador inserir um injetor tão delicado na cânula quando o animal está se movendo ativamente. Além disso, o desgaste de camundongos conscientes pode produzir estresse sobre os camundongos39, confundindo os resultados comportamentais. Em segundo lugar, a cânula é ocasionalmente obstruída devido à coagulação do sangue / líquido cefalorraquidiano. Desobstruir a cânula suavemente antes de montar o injetor seria ideal para a infusão de metabólitos. Com base nessas duas razões, recomenda-se anestesiar brevemente os camundongos para montar o injetor. Os investigadores podem esperar mais tempo (30 min) se houver alguma preocupação com a recuperação do animal da anestesia inalatória. Além disso, um conjunto separado de injetor de infusão conectando o tubo de polietileno pode ser configurado para acelerar os experimentos.

Este protocolo tem várias limitações. Primeiro, a implantação da cânula-guia e do tubo de polietileno de conexão limitaria a área cirúrgica para o implante de fibras ópticas para fotometria optogenética e de fibras na mesma coordenada, na área circundante ou mesmo no mesmo hemisfério do cérebro. Será ainda mais desafiador implantar a lente para microendoscopia na cabeça do rato, juntamente com a cânula guia implantada. Em segundo lugar, o implante da cânula guia pode gerar um peso significativo na cabeça do rato. O peso total de um conjunto de cânula personalizado é de 26,8-150 mg, um parafuso é ~ 48 mg e o acrílico dentário montado é de 450-500 mg. Todo o conjunto de instalação pode restringir os movimentos dos ratos. No entanto, estudos recentes implantaram um miniscópio para monitorar sinais de cálcio em camundongos em movimento livre40,41. O peso do miniscópio varia de 1,6 g a 4,5 g, excluindo os parafusos e o acrílico dental. Portanto, o peso da cânula guia pode ser considerado relativamente aceitável para o teste de comportamento do rato. Em terceiro lugar, o tubo de polietileno de conexão para a infusão tem ~ 350 cm de comprimento, o que pode limitar o movimento dos ratos durante o teste de comportamento. Para resolver essa preocupação, o pré-teste de locomoção em um teste de campo aberto pode ser necessário para avaliar o impacto do tubo de polietileno de conexão na função do motor do rato. Em quarto lugar, o acrilo dentário pode produzir um efeito neurotóxico nos camundongos. No entanto, é necessário anexar a cânula guia à cabeça do rato durante o período de ensaio. Para diminuir o potencial efeito neurotóxico do acrilo dentário em camundongos, os operadores devem estar familiarizados com o uso de acrilo dental. O acrilo dentário é melhor aplicado quando a mistura de acrilo dental (pó e líquido) é ligeiramente solidificada para reduzir a penetração do líquido acrílico dentário no cérebro.

A microbiota e seus metabólitos estão associados à função comportamental em marcos de desenvolvimento distintos. Embora este protocolo seja baseado em camundongos adultos C57BL/6 com pesos corporais variando de 26 g a 30 g, ele também pode ser aplicado em camundongos de diferentes idades e tamanhos. Estudos prévios adotaram a cirurgia estereotáxica em camundongos jovens42,43,44,45. No entanto, as coordenadas para as regiões do cérebro podem variar dependendo do tamanho e da idade dos ratos. Recomendamos referenciar o atlas correspondente à idade ou o recurso on-line (http://mouse.brain-map.org/static/atlas). Além disso, as coordenadas devem ser validadas injetando azul de tripano ou corante de fluorescência nos camundongos jovens de abate, otimizando assim o método antes de executá-lo nos camundongos experimentais. As cânulas guia usadas neste protocolo são todas personalizadas e podem ser ajustadas após a validação das coordenadas para diferentes tamanhos de camundongos.

Este protocolo será compatível com a maioria dos testes de comportamento de roedores com uma arena aberta no topo do aparelho, sem muita modificação. Os testes de comportamento de roedores podem ser realizados com uma fiação de tubo de polietileno no topo da cabeça do rato sem qualquer obstáculo, incluindo teste de campo aberto, labirinto elevado de mais / zero, teste de descida, interação social direta, vocalização ultra-sônica adulta, teste de natação forçada, suspensão de cauda, labirinto de água, labirinto T ou Y, reconhecimento de novos objetos, enterramento de mármore, teste de auto-limpeza, travessia de feixe, teste de polo e exposição ao estresse de prevenção de água. Testes usando câmaras ou tubos fechados precisarão ser modificados para permitir que o tubo de polietileno se mova livremente junto com os camundongos, como teste social de três câmaras, caixa claro-escuro, condicionamento de medo, preferência de sacarose, estresse de contenção, teste de sobressalto e inibição de pulso de pré-pulso. Sugerimos pré-testar e estimar o comprimento necessário para o tubo de polietileno nos camundongos de abate antes do teste.

Demonstrou-se que os metabólitos microbianos intestinais afetam os comportamentos do hospedeiro 8,46,47,48,49. Os cientistas podem adotar esse método para investigar diretamente os efeitos temporais e espaciais dos metabólitos derivados da microbiota intestinal no cérebro e os comportamentos em camundongos. Por exemplo, o metabólito microbiano 4-etilfenil sulfato (4EPS) foi aumentado em modelos pré-clínicos de camundongos com TEA e pessoas com TEA46,48,49. A injeção de 4EPS e a colonização das bactérias produtoras de 4EPS aumentaram o comportamento ansioso e prejudicaram a maturação dos oligodendrócitos no núcleo paraventricular do tálamo (PVT) em camundongos46,48. Seria fascinante avaliar o efeito direto do 4EPS no PVT de camundongos durante testes de comportamento semelhantes à ansiedade. No entanto, a concentração absoluta de 4EPS no PVT ainda é desconhecida. Portanto, um teste dose-resposta pode ser crítico para determinar os níveis adequados de 4EPS na TVP. Um conceito semelhante pode ser adotado para os efeitos de outros metabólitos microbianos no cérebro e no comportamento.

Neurotecnologias baseadas em circuitos, como optogenética, quimiogenética e imagem in vivo de cálcio, são métodos críticos que permitem aos cientistas compreender o circuito neural no controle do comportamento50,51,52. O eixo intestino-cérebro é uma conexão complicada crítica para os micróbios intestinais e seus metabólitos mediarem o comportamento do hospedeiro. Um número crescente de estudos tem empregado neurotecnologias baseadas em circuitos para entender o intrigante crosstalk entre o intestino e o cérebro 33,53,54,55,56,57,58,59. Este protocolo fornecerá uma maneira alternativa de entender o controle baseado na região do cérebro do comportamento causado pelos metabólitos intestinais. A combinação deste protocolo com neurotecnologias baseadas em circuitos permitirá que os pesquisadores obtenham informações sobre o controle baseado em circuitos do comportamento e da atividade cerebral contribuída pelos metabólitos intestinais.

Em conclusão, o conceito de eixo intestino-cérebro é bem aceito na comunidade científica e promove a possibilidade do envolvimento de metabólitos derivados do intestino em distúrbios neuropsiquiátricos 11,13,60,61,62,63,64,65 . Para interrogar como e quais metabólitos derivados do intestino afetam o cérebro e o comportamento dos camundongos, uma metodologia abrangente e baseada em fisiologia será necessária no campo. Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo para entregar metabólitos derivados do intestino no cérebro diretamente, o mais importante, em um rato em movimento livre. Este projeto pode ser adaptado para investigar os efeitos específicos da região pela entrega dos metabólitos derivados do intestino em várias regiões do cérebro.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este trabalho.

Acknowledgments

Reconhecemos a equipe do Centro de Animais de Laboratório da Universidade Nacional de Cheng Kung (NCKU) por cuidar dos animais. Este trabalho foi apoiado pela bolsa de estudos do Prof. Kun-Yen Huang Education Fund da CHENG-HSING Medical Foundation para C.-W.L.; os fundos do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST) em Taiwan: (Iniciação Científica MOST 109-2813-C-006-095-B) para T.-H.Y.; (MAIS 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) a W.-L.W.; e o Projeto Sprout de Ensino Superior, do Ministério da Educação para a Sede do Avanço Universitário na NCKU para W.-L.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Neurociência Edição 184
Entrega intracerebroventricular de metabólitos microbianos derivados do intestino em camundongos em movimento livre
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Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

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