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Immunology and Infection

Ibridazione in situ con fluorescenza dell'RNA (FISH) per visualizzare la colonizzazione microbica e l'infezione nell'intestino di Caenorhabditis elegans

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/63980
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2School of Biological Sciences, University of California, San Diego

Summary

I microbi intestinali, compresi i batteri extracellulari e gli agenti patogeni intracellulari come il virus Orsay e i microsporidi (funghi), sono spesso associati ai nematodi selvatici di Caenorhabditis . Questo articolo presenta un protocollo per rilevare e quantificare i microbi che colonizzano e / o infettano i nematodi C. elegans e per misurare il carico patogeno dopo infezioni controllate in laboratorio.

Abstract

Gli intestini dei nematodi selvatici di Caenorhabditis sono abitati da una varietà di microrganismi, tra cui batteri del microbioma intestinale e agenti patogeni, come microsporidi e virus. A causa delle somiglianze tra Caenorhabditis elegans e cellule intestinali di mammifero, nonché della potenza del sistema C. elegans , questo ospite è emerso come un sistema modello per studiare le interazioni intestino-microbo ospite in vivo. Mentre è possibile osservare alcuni aspetti di queste interazioni con la microscopia a campo chiaro, è difficile classificare con precisione i microbi e caratterizzare l'estensione della colonizzazione o dell'infezione senza strumenti più precisi. L'ibridazione in situ con fluorescenza dell'RNA (FISH) può essere utilizzata come strumento per identificare e visualizzare i microbi nei nematodi in natura o per caratterizzare e quantificare sperimentalmente l'infezione nei nematodi infetti da microbi in laboratorio. Le sonde FISH, che etichettano l'RNA ribosomiale a piccola subunità altamente abbondante, producono un segnale luminoso per batteri e cellule microsporidi. Le sonde progettate per colpire regioni conservate di RNA ribosomiale comune a molte specie possono rilevare una vasta gamma di microbi, mentre il targeting di regioni divergenti dell'RNA ribosomiale è utile per una rilevazione più ristretta. Allo stesso modo, le sonde possono essere progettate per etichettare l'RNA virale. Viene presentato un protocollo per la colorazione dell'RNA FISH con paraformaldeide (PFA) o fissazione dell'acetone. La fissazione PFA è ideale per i nematodi associati a batteri, microsporidia e virus, mentre la fissazione dell'acetone è necessaria per la visualizzazione delle spore di microsporidi. Gli animali sono stati prima lavati e fissati in paraformaldeide o acetone. Dopo la fissazione, le sonde FISH sono state incubate con campioni per consentire l'ibridazione delle sonde al bersaglio desiderato. Gli animali sono stati nuovamente lavati e poi esaminati su vetrini da microscopio o utilizzando approcci automatizzati. Nel complesso, questo protocollo FISH consente il rilevamento, l'identificazione e la quantificazione dei microbi che abitano l'intestino di C. elegans , compresi i microbi per i quali non sono disponibili strumenti genetici.

Introduction

Caenorhabditis elegans è emerso come un potente sistema modello per studiare l'immunità innata e le interazioni ospite-microbo nelle cellule epiteliali intestinali 1,2. Grazie ad avere un corpo trasparente e solo 20 cellule intestinali, C. elegans rappresenta un sistema conveniente per monitorare i processi di colonizzazione microbica intestinale e infezione nel contesto di un organismo intatto. Le cellule intestinali dei nematodi condividono molteplici somiglianze morfologiche e funzionali con le cellule epiteliali intestinali dei mammiferi, rendendole un modello trattabile in vivo per la dissezione dei processi che governano la colonizzazione del microbioma e l'infezione da patogeni 3,4,5,6.

I C. elegans selvatici si nutrono di una varietà di microbi che colonizzano e infettano l'intestino, e il campionamento di questi nematodi ha portato alla scoperta di virus, eucarioti (funghi, oomiceti) e batteri che si associano naturalmente a questo ospite 7,8,9,10. Il virus d'Orsay è stato trovato infettando l'intestino ed è attualmente l'unico virus naturale noto di C. elegans9. I microsporidi sono patogeni intracellulari obbligati correlati ai funghi che sono l'infezione più comunemente riscontrata nella Caenorhabditis catturata in natura, con diverse specie scoperte che infettano C. elegans e nematodi correlati 8,11. Molti batteri si trovano comunemente ad abitare il lume intestinale di C. elegans catturato in natura e diverse specie sono state stabilite come modello naturale per il microbioma di C. elegans (CeMbio)6,12,13,14. Scoprire e caratterizzare i microbi che colonizzano e / o infettano naturalmente C. elegans è essenziale per comprendere i meccanismi genetici che governano queste interazioni ospite-microbo, nonché visualizzare nuovi processi microbici che si verificano solo nel contesto di un animale ospite intatto.

Dopo il campionamento, i nematodi selvatici vengono sottoposti a screening tramite microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) per cercare fenotipi indicativi di infezione o colonizzazione. Ad esempio, i cambiamenti nell'aspetto granulato stereotipato delle cellule intestinali possono essere associati alla presenza di un'infezione parassitaria intracellulare8. In particolare, la perdita dei granuli intestinali e la diminuzione della viscosità citosolica sono segni di infezione virale, mentre la riorganizzazione dei granuli intestinali in "solchi" può indicare un'infezione da microsporidi nel genere Nematocida 8,9. Poiché esiste un'ampia varietà di microbi presenti nei campioni selvatici di C. elegans, può essere difficile distinguere tra i microbi attraverso la microscopia DIC. Le informazioni riguardanti la distribuzione spaziale dei microbi all'interno dell'ospite possono anche essere difficili da rilevare a causa delle piccole dimensioni di molti microbi15. Inoltre, la coltura di particolari microbi di interesse in vitro non è sempre possibile, con conseguenti difficoltà nel rilevamento e / o nella quantificazione.

L'ibridazione in situ con fluorescenza dell'RNA (FISH) fornisce un metodo per marcare i microbi in modo fluorescente utilizzando sonde fluorescenti che si legano all'RNA della piccola subunità ribosomiale (SSU) nelle cellule fisse. Se l'analisi delle caratteristiche morfologiche suggerisce una particolare classe di microbi, possono essere utilizzate sonde FISH che mirano a classi specifiche o ampie di tali microbi. Ad esempio, EUB338 è considerato una sonda universale per la SSU batterica ed è comunemente usato per rilevare una vasta gamma di batteri16. Il protocollo qui descritto utilizza sonde di DNA a singolo filamento che sono marcate con un fluoroforo e specificamente progettate per essere complementari alla SSU target del microbo di interesse, sebbene siano disponibili sonde precedentemente progettate16. Il principale vantaggio di colpire la SSU dei microbi è l'abbondanza relativamente grande di questo RNA, che in genere comprende l'80% -90% di tutto l'RNA nella cellula, portando alla colorazione con un rapporto segnale-rumore molto elevato17. Le sonde possono anche essere progettate per colpire l'RNA per rilevare virus, come il virus Orsay 9,18, che sono spesso presenti in copie molto elevate nelle cellule infette se il virus si replica attivamente.

A seconda dei risultati ottenuti con sonde note, potrebbe essere necessario ottenere ulteriori informazioni sulla sequenza per progettare sonde più specifiche per la conferma delle specie in situ. Un approccio comune è quello di utilizzare primer universali contro le regioni conservate della SSU (16S per i batteri e 18S per gli eucarioti) per amplificare (tramite PCR) le regioni che sono più divergenti8. Utilizzando queste informazioni di sequenza, è possibile progettare sonde con maggiore specificità di specie. Queste sonde FISH possono quindi consentire l'identificazione di microbi in modo indipendente dalla coltura8. Inoltre, RNA FISH può fornire informazioni sulle caratteristiche uniche di colonizzazione morfologica e infezione, inclusi i modelli di filamento o localizzazione dei tessuti19,20. Diverse sonde FISH colorate possono essere utilizzate contemporaneamente, il che consente la distinzione visiva tra i microbi nei campioni di nematodi selvatici, nonché l'osservazione della dinamica microbo-microbo all'interno di un ospite15,20. Inoltre, la colorazione dell'RNA FISH può essere applicata a studi di interazione ospite-patogeno in cui l'infezione e la colonizzazione di una specie nota possono essere facilmente quantificate manualmente o attraverso approcci automatizzati per fornire approfondimenti sul carico patogeno, ad esempio, confrontando i mutanti di C. elegans che hanno aumentato o diminuito la resistenza all'infezione21.

Protocol

NOTA: I nematodi possono essere fissati con una soluzione di paraformaldeide (PFA) o acetone. La PFA consente una migliore visualizzazione della morfologia rispetto all'acetone e può preservare i segnali della proteina fluorescente verde transgenica (GFP), che viene distrutta dall'acetone. Tuttavia, la fissazione dell'acetone è necessaria per permeabilizzare le spore dei microsporidi per consentire l'etichettatura di questa fase di vita. Inoltre, l'acetone può essere più conveniente del PFA perché è meno tossico e i campioni possono essere conservati per diversi giorni in acetone in un congelatore a -20 °C senza la necessità di rimuovere il fissativo. Di seguito sono riportati due protocolli separati, utilizzando la soluzione PFA o l'acetone come fissativo. Per una visualizzazione dei passaggi del protocollo, vedere la Figura 1.

1. Colorazione FISH con fissazione PFA

  1. Preparare i nematodi con microbi associati
    1. Coltiva i nematodi con il microbo desiderato di interesse su piastre standard di Nematode Growth Media (NGM) seminate con la fonte di cibo appropriata. Incubare i nematodi a 20 °C fino al raggiungimento della fase di vita desiderata.
    2. Aggiungere 2 mL di mezzi di sali minimi M9 (42 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH2PO 4, 8,6 mMNaCl, 19 mM NH 4 Cl) + 0,1% Tween 20 a piastre NGM contenenti il ceppo Caenorhabditis infetto o colonizzato con il microbo desiderato da visualizzare.
      NOTA: L'aggiunta di detergente serve a prevenire che i nematodi si attacchino alle pipette e ai tubi di microfuge e ad aiutare i nematodi in fase L1-L2 del pellet. Lo 0,1% di Triton-X può essere utilizzato al posto di Tween 20.
    3. Pipetta i nematodi dalle piastre usando una pipetta Pasteur di vetro e una lampadina e trasferirli in provette microfuge marcate da 1,5 ml.
      NOTA: le pipette in vetro sono preferite perché i nematodi possono attaccarsi alle pipette di plastica, ma l'aggiunta di detergente (Tween 20 o Triton-X) può ridurre al minimo questo problema.
    4. Utilizzando una microcentrifuga, spingiare i campioni contenenti i nematodi colonizzati o infetti a 2.000 x g per 60 s per gli animali L1 o 500 x g per 60 s per L4 o animali adulti. Tutte le successive fasi di centrifugazione verranno eseguite alla velocità selezionata.
    5. Rimuovere il surnatante dalle provette di microfuge utilizzando una pipetta. Evitare di disturbare il pellet di nematode rimuovendo con attenzione il surnatante fino a 100 μL sopra il pellet. Questo può essere stimato utilizzando provette microfughe marcate da 1,5 ml.
  2. Lavare i nematodi per eliminare la contaminazione esterna
    1. Aggiungere 1 mL di 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH2PO4) + 0,1% Tween20 (PBS-T) ai tubi microfuge.
    2. Far ruotare i campioni in una microcentrifuga alla velocità appropriata (cfr. punto 1.1.4). Utilizzando una pipetta, rimuovere tutti tranne 100 μL del surnatante. Questo può essere stimato utilizzando provette microfughe marcate da 1,5 ml.
    3. Ripeti i due passaggi precedenti 2-3x.
      NOTA: in genere sono sufficienti tre lavaggi totali; Tuttavia, è possibile eseguire lavaggi aggiuntivi per rimuovere qualsiasi contaminazione esterna in eccesso.
  3. Correggi i nematodi con PFA
    1. Nella cappa aspirante, aggiungere 33 μL di PFA al 16% al tubo di microfuge contenente 100 μL di surnatante sopra il pellet di nematode ottenuto dal punto 1.2.3 per una concentrazione finale del 4% di PFA.
      ATTENZIONE: il PFA è cancerogeno. Il contatto con PFA può provocare sensibilizzazione e irritazione cutanea e danni agli occhi. Il PFA rilascia fumi tossici che possono portare a irritazione o sensibilizzazione respiratoria. Quando si utilizza PFA, lavorare in una cappa aspirante con adeguati dispositivi di protezione individuale e fare riferimento alle schede di dati di sicurezza appropriate prima dell'uso.
    2. Incubare i campioni contenenti i nematodi colonizzati o infettati dal microbo di interesse per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, conservare i campioni in etanolo al 70% a 4 °C fino a quando il protocollo è pronto per essere continuato.
      NOTA: Un periodo di incubazione più breve è migliore per mantenere il segnale GFP nei ceppi transgenici a causa della degradazione della GFP da parte della PFA nel tempo. Tempi di incubazione più lunghi consentono al fissativo di permeabilizzarsi meglio nei campioni. È meglio determinare empiricamente il tempo di incubazione a seconda del campione.
  4. Rimuovere la soluzione PFA
    1. Far ruotare i campioni in una microcentrifuga alla velocità appropriata (cfr. punto 1.1.4). Con una pipetta, rimuovere il più possibile il surnatante senza disturbare il pellet.
      ATTENZIONE: Il surnatante contiene PFA, che è tossico. Eliminare il surnatante e almeno i primi due lavaggi come rifiuti tossici in una cappa aspirante.
    2. Aggiungere 0,5 ml di PBS-T ai campioni nelle provette di microfuge.
    3. Seguire e ripetere i passaggi 1.4.1 e 1.4.2 2-3x con PBS-T.
      NOTA: l'esecuzione di più lavaggi contribuirà a ridurre il segnale di fondo. Si consigliano almeno quattro lavaggi in totale.
    4. Dopo l'ultimo lavaggio, girare i campioni e rimuovere il surnatante, lasciando il pellet indisturbato.
  5. Preparare il tampone di ibridazione (HB) e lavare i nematodi
    1. Preparare 1 mL di HB (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,01% SDS) per campione.
      NOTA: HB deve essere preparato fresco prima di ogni utilizzo per evitare precipitazioni. Tuttavia, un tampone generale (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente fino a quando non è necessario HB. Prima dell'uso, preparare 1 mL per campione del tampone generale e aggiungere SDS a una concentrazione finale dello 0,01%.
    2. Aggiungere 800 μL di HB ai tubi di microfuge contenenti il pellet di nematode. Pellettare i campioni nella microcentrifuga (vedere punto 1.1.4). Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.
  6. Ibridare la sonda FISH alla sequenza target desiderata
    1. Miscelare 100 μL per campione di HB preparato con la sonda FISH desiderata fino ad una concentrazione finale di 5-10 ng/μL della sonda.
      NOTA: Le sonde FISH sono oligo 15-23-mer, antisenso alla SSU del microbo di interesse, ed etichettate con un fluoroforo colorato attaccato all'estremità 5' o 3' (vedere Tabella 1 per le sonde utilizzate qui). Generalmente, le sonde FISH stock sono conservate a 1 mg/ml.
    2. Aggiungere 100 μL di sonda HB contenente FISH a ciascun campione. Mescolare muovendo delicatamente o capovolgendo i tubi.
      NOTA: È possibile aggiungere simultaneamente sonde FISH di colore diverso per visualizzare più segnali fluorescenti nello stesso campione (vedere Figura 1B).
    3. Incubare i campioni per una notte (6-24 h) in un bagno asciutto a 46-54 °C o in un miscelatore termico a 46-54 °C a 1.200 giri/min.
      NOTA: L'incubazione a 46-48 °C viene tipicamente utilizzata per l'ibridazione. Tuttavia, potrebbe essere necessario regolare questa temperatura in base alla temperatura di fusione della sonda FISH. In generale, la temperatura di ibridazione è inferiore di 4 °C alla temperatura di fusione.
  7. Rimuovere la sonda FISH e lavare i nematodi
    1. Preparare 3 mL di tampone di lavaggio (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) per campione.
      NOTA: WB deve essere preparato fresco prima di ogni utilizzo per evitare precipitazioni. Tuttavia, un tampone generale (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente fino a quando non è necessario il tampone di lavaggio. Prima dell'uso, preparare 3 mL per campione del tampone generale e aggiungere l'EDTA a una concentrazione finale di 5 mM e la SDS a una concentrazione finale dello 0,01%.
    2. Centrifugare i campioni alla velocità appropriata (cfr. punto 1.1.4). Rimuovere l'HB con una pipetta, facendo attenzione a lasciare indisturbato il pellet di nematode.
    3. Aggiungere 1 mL di WB preparato a ciascun campione.
    4. Centrifugare i campioni alla velocità appropriata (cfr. punto 1.1.4). Rimuovere il WB utilizzando una pipetta, facendo attenzione a lasciare il pellet indisturbato.
    5. Aggiungere 1 mL di WB preparato a ciascun campione.
    6. Incubare i campioni per 1 h a 48-56 °C in bagno asciutto (o miscelatore termico a 48-56 °C a 1200 giri/min). Se si incuba in un bagno asciutto, capovolgere delicatamente i tubi ogni 15-20 minuti.
      NOTA: In generale, 48 °C viene utilizzato come temperatura di lavaggio standard; Tuttavia, potrebbe essere necessario regolare questa temperatura se c'è un segnale di fondo elevato. La temperatura di lavaggio è spesso superiore di 2 °C rispetto alla temperatura di ibridazione. Il tempo di incubazione in WB può essere ridotto a 30 minuti per ridurre ulteriormente lo sfondo, dopodiché i passaggi 1.7.4 e 1.7.5 devono essere ripetuti. Questo deve essere seguito da uno (per i batteri) o due (per gli sporoplasmi di microsporidi) periodi di incubazione di 30 minuti a 48 °C.
    7. Centrifugare i campioni alla velocità appropriata (cfr. punto 1.1.4). Utilizzando una pipetta, rimuovere il tampone di lavaggio, facendo attenzione a lasciare il pellet indisturbato.
    8. Aggiungere 100-500 μL di PBS-T a ciascuno dei campioni. A questo punto, i campioni possono essere conservati in PBS-T a 4 °C per un massimo di una settimana fino a quando il protocollo è pronto per essere continuato.
  8. Montare i nematodi
    1. Centrifugare i campioni alla velocità appropriata (cfr. punto 1.1.4). Rimuovere quanto più PBS-T possibile senza disturbare il pellet di nematode.
    2. (Facoltativo) Aggiungere 20 μL di mezzo di montaggio antisbiadimento con DAPI (Table of Materials) ai campioni.
    3. Caricare un pipettor da 20 μL con una punta della pipetta da 200 μL e utilizzare le forbici per tagliare la punta della pipetta in modo da consentire la pipetta dei nematodi più grandi.
    4. Con la punta della pipetta tagliata, trasferire 5-10 μL del pellet su un vetrino da microscopio. Coprire con un coprislip 22 x 22. Per conservare i vetrini, sigillare i bordi della copertina con lo smalto per unghie e conservarli in una scatola scura a 4 °C fino al momento di un ulteriore utilizzo.

2. Colorazione FISH con fissazione dell'acetone

  1. Preparare i nematodi con microbi associati come descritto al punto 1.1.
  2. Lavare i nematodi per eliminare la contaminazione esterna come descritto al punto 1.2.
  3. Correggi i nematodi con acetone
    1. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere 1 mL di acetone di laboratorio al campione.
      ATTENZIONE: L'acetone è un liquido e vapore altamente infiammabile. Sebbene possa essere acquistato al banco come solvente per unghie, è importante ricordare che l'acetone provoca gravi irritazioni agli occhi e può causare sonnolenza o vertigini.
    2. Incubare i campioni contenenti nematodi colonizzati o infettati dal microbo di interesse per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, i campioni possono essere conservati in acetone a -20 °C per un massimo di 2 settimane fino a quando il protocollo è pronto per essere continuato.
      NOTA: Non utilizzare questo protocollo con ceppi transgenici di C. elegans che esprimono GFP (o le sue forme alleliche mutate) se si desidera mantenere la fluorescenza, poiché l'acetone distrugge questo segnale.
  4. Rimuovere l'acetone
    1. Far ruotare i campioni in una microcentrifuga alla velocità appropriata (cfr. punto 1.1.4). Con una pipetta, rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.
      ATTENZIONE: Il surnatante contiene acetone. Eliminare il surnatante e almeno i primi due lavaggi come rifiuti tossici in una cappa aspirante.
    2. Aggiungere 0,5 ml di PBS-T ai campioni nelle provette di microfuge.
    3. Seguire e ripetere i passaggi 2.4.1 e 2.4.2 2-4x con PBS-T.
      NOTA: l'esecuzione di più lavaggi contribuirà a ridurre il segnale di fondo. Si consiglia di eseguire quattro lavaggi in totale.
    4. Dopo l'ultimo lavaggio, ruotare i campioni e rimuovere il surnatante, assicurandosi che il pellet sia indisturbato.
  5. Preparare il tampone di ibridazione (HB) e lavare i nematodi come descritto al punto 1.5.
  6. Ibridare la sonda FISH alla sequenza target desiderata come descritto al punto 1.6.
  7. Rimuovere la sonda FISH e lavare i nematodi
    1. Preparare 1,1 mL di tampone di lavaggio (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) per campione.
      NOTA: WB deve essere preparato fresco prima di ogni utilizzo per evitare precipitazioni. Tuttavia, un tampone generale (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente fino a quando non è necessario un tampone di lavaggio. Prima dell'uso, preparare 1,1 mL per campione del tampone generale e aggiungere EDTA a una concentrazione finale di 5 mM e SDS a una concentrazione finale dello 0,01%.
    2. Centrifugare i campioni alla velocità appropriata (cfr. punto 1.1.4). Rimuovere l'HB con una pipetta, facendo attenzione a lasciare indisturbato il pellet di nematode.
    3. Aggiungere 100 μL di WB preparato a ciascun campione.
    4. Centrifugare i campioni alla velocità appropriata (cfr. punto 1.1.4). Rimuovere il WB utilizzando una pipetta, facendo attenzione a lasciare il pellet indisturbato.
    5. Aggiungere 1 mL di WB preparato a ciascun campione.
    6. Incubare i campioni per 1 h a 48-56 °C in bagno asciutto (o miscelatore termico a 48-56 °C a 1.200 giri/min). Se si incuba in un bagno asciutto, capovolgere delicatamente i tubi ogni 15-20 minuti.
      NOTA: In generale, 48 °C viene utilizzato come temperatura di lavaggio standard; Tuttavia, potrebbe essere necessario regolare questa temperatura se c'è un segnale di fondo elevato. La temperatura di lavaggio è spesso superiore di 2 °C rispetto alla temperatura di ibridazione.
    7. Centrifugare i campioni alla velocità appropriata (cfr. punto 1.1.4). Utilizzando una pipetta, rimuovere il tampone di lavaggio, facendo attenzione a lasciare il pellet indisturbato.
    8. Aggiungere 100-500 μL di PBS-T a ciascuno dei campioni. A questo punto, i campioni possono essere conservati in PBS-T a 4 °C per un massimo di una settimana fino a quando il protocollo è pronto per essere continuato.
  8. Montare i nematodi come descritto al punto 1.8.

Representative Results

Per analizzare i batteri del microbioma, sono state utilizzate sonde FISH specifiche e universali per i batteri 16S su animali isolati in natura. Il ceppo selvatico di Caenorhabditis tropicalis (JU1848) è stato campionato dalla foresta di Nouragues vicino a un piccolo fiume nella Guyana francese dai frutti di palma in decomposizione22. Sotto il microscopio a contrasto di interferenza differenziale (DIC), questo ceppo di nematodi è stato trovato colonizzato con un batterio che sembra aderire direzionalmente all'epitelio intestinale (Figura 2A). JU1848 è stato quindi pulito selettivamente per eliminare altri contaminanti microbici e arricchire per il batterio aderente desiderato23. Utilizzando il metodo PCR universale, il batterio è stato identificato come una nuova specie nella classe degli alfaproteobatteri. Una sonda FISH marcata con Cal Fluor Red 610 è stata quindi progettata specificamente per la sequenza di rRNA 16S di questo batterio per consentire la visualizzazione fluorescente della colonizzazione all'interno di C. tropicalis (Figura 2B). Una sonda universale 16S rRNA FISH in grado di legare molte specie di batteri (EUB338) è stata marcata con 6-carbossifluorescin (FAM) ed è stata aggiunta a questo campione. I segnali fluorescenti verdi e rossi si sovrappongono completamente, suggerendo che la maggior parte dei batteri che colonizzano l'intestino sono il batterio Alphaproteobacteria aderente. Questi animali sono stati fissati in PFA prima della colorazione.

Per analizzare l'infezione sperimentale in laboratorio con patogeni intracellulari di identità nota, il virus Orsay e le sonde FISH specifiche per microsporidia sono state utilizzate su C. elegans con un background wild-type. Il virus Orsay è un virus a RNA a filamento positivo della famiglia Nodaviridae e l'unico patogeno virale naturale trovato in C. elegans. Il genoma bipartito dell'RNA del virus Orsay è costituito da segmenti di RNA1 e RNA2, e sono state sviluppate sonde FISH mirate a entrambi questi segmenti (Figura 3A,B)9,18. Nell'intestino, l'RNA virale viene rilevato dall'omologo RIG-I DRH-124, che è necessario per l'attivazione del programma di difesa trascrizionale denominato Intracellular Pathogen Response (IPR)25,26,27. La trascrizione dei geni IPR antivirali è almeno parzialmente controllata dal fattore di trascrizione ZIP-121. Qui, l'espressione di ZIP-1::GFP è vista localizzata nei nuclei intestinali delle cellule che mostrano una colorazione positiva del virus Orsay FISH nel citoplasma (Figura 3A)21. Diversi animali colorati con FISH specifico di Orsay indicano la forza di questo segnale per una facile quantificazione (Figura 3B). Gli animali mostrati nella figura 3A,B sono stati fissati in PFA.

Il parassita microsporidiano chiamato Nematocida parisii, che significa nematode-killer di Parigi, è un patogeno intracellulare obbligato dell'intestino. Sono state utilizzate diverse sonde FISH che marcano l'rRNA 18S di N. parisii, comprese sonde MicroA e MicroB marcate con fluorescenza. Diversi animali colorati con MicroB FISH sono mostrati per indicare la forza di questo segnale per una facile quantificazione (Figura 3C). Inoltre, C. elegans è infettato da altri microsporidi strettamente correlati. La co-infezione di N2 con N. parisii e il correlato N. ausubeli può essere distinta usando questo protocollo FISH progettando sonde FISH specie-specifiche che competono l'una contro l'altra per legarsi a una regione divergente sull'rRNA 18S (Figura 3D)28. In questo esempio, la sonda N. parisii FISH ha un perfetto accoppiamento di basi con l'rRNA N. parisii 18S, ma una mancata corrispondenza di 7 bp con l'rRNA N. ausubeli 18S. Il contrario è vero per la sonda N. ausubeli. In quanto tale, ogni sonda FISH specie-specifica supererà per il legame con la specie affine 18S rispetto alle specie non affini. Inoltre, l'uso di DAPI per colorare i nuclei consente una migliore localizzazione dell'infezione nel contesto dell'intero animale, in particolare per l'intestino che ha nuclei grandi e facilmente identificabili. La figura 3C,D contiene gli animali che sono stati fissati in PFA. Infezioni successive da N. parisii provocano lo sviluppo di meronti in spore. Per visualizzare le spore di N. parisii, gli animali devono essere fissati in acetone poiché penetra nella parete delle spore meglio del PFA (Figura 3E,F)8. La colorazione FISH risultante dimostra le piccole e grandi strutture a forma di bastoncello, che probabilmente corrispondono alle spore di N. parisii, che sono colorate con sonde specifiche di N. parisii in rosso.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione visiva del protocollo FISH. Creato con Biorender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Colorazione FISH del ceppo selvatico di C. tropicalis JU1848 colonizzato con batteri aderenti nell'intestino. (A) Immagine di Nomarski raffigurante migliaia di batteri bacilli sottili (bac) che si legano direzionalmente all'intestino (in) di JU1848, creando un fenotipo simile ai capelli all'interno del lume (lu). Questo pannello di figure è adattato da Morgan, E. et al. (2021)23. (B) Colorazione FISH di JU1848, fissata in PFA, utilizzando una sonda marcata in rosso (b002_16S_A-CF610) progettata per colpire la sequenza di rRNA 16S del batterio aderente (in alto) e una sonda FISH universale con etichetta verde (EUB338-FAM) progettata per colpire il 16S dei batteri (in basso). La colorazione DAPI dei nuclei ospiti è mostrata in blu. Vedere la Tabella 1 per le sequenze di sonda. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Colorazione FISH di C. elegans infettati da patogeni intracellulari. (A,B) Colorazione FISH di C. elegans che esprimono ZIP-1::GFP e infettati dal virus Orsay, che sono stati fissati con PFA prima della colorazione per preservare il segnale GFP. Le sonde Orsay 1 Red e Orsay 2 Red sono state utilizzate per la colorazione dei patogeni. (A) L'immagine composita è costituita da canali fluorescenti rossi e verdi uniti. L'espressione nucleare di ZIP-1::GFP è indotta dall'infezione da virus Orsay ed è mostrata in verde. L'autofluorescenza dai granuli intestinali è mostrata in giallo e indicata con frecce gialle. Le linee tratteggiate delineano il corpo del nematode. Barra di scala = 25 μm. (B) L'immagine composita è costituita da canali fluorescenti e DIC rossi uniti. Barra della scala = 200 μm. (C,D) Colorazione FISH di C. elegans selvatici infetti da microsporidi che sono stati fissati in PFA. (C) Colorazione FISH di C. elegans selvatiche infettate da N. parisii e fissate in PFA. La sonda MicroB-CF610 è stata utilizzata per la colorazione dei patogeni. L'immagine composita è costituita da canali fluorescenti e DIC rossi uniti. Barra della scala = 100 μm. (D) Colorazione FISH di C. elegans di tipo selvatico co-infettati con N. parisii e N. ausubeli nell'intestino. I due patogeni sono stati co-colorati utilizzando una coppia di sonde FISH specifiche che competono per il legame alla stessa regione dell'rRNA 18S. N. parisii è stato colorato usando MicroF-CF610 (rosso) e N. ausubeli è stato colorato usando MicroSp1A-FAM (verde). La colorazione DAPI dei nuclei ospiti è visibile in blu. Barra della scala = 25 μm. (E) Colorazione FISH con C. elegans selvatiche fissate con acetone infettate da spore di N. parisii. MicroA-CF610 (rosso) è stato utilizzato per la colorazione (rosso). Barra della scala = 15 μm. (F) Immagine di Nomarski raffigurante spore di N. parisii viste in (E). Barra della scala = 15 μm. In (E) e (F), le piccole e grandi strutture a forma di bastoncino sono etichettate con frecce piccole e grandi, rispettivamente, che corrispondono alle spore di N. parisii. Vedere la Tabella 1 per le sequenze di sonda. L'immagine mostrata in (A) è adattata da Lažetić, V. et al. (2022)21. Le immagini mostrate in (B) e (C) sono adattate da Reddy, K. C. et al. (2019)26. Le immagini mostrate in (E) e (F) sono adattate da Troemel, E. R. et al. (2008)8. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Nome della sonda Specificità della sonda Sonda fluorofora Sequenza della sonda
EUB338-FAM Batterico 16S (universale) 5' 6-fluoresceina (FAM) GCTGCCTCCCGTAGGAGT
b002_16S_A-CF610 Alphaproteobacteria 16S Cal Rosso Fluor 610 (CF610) TGTACCGACCCTTAACGTTC
Orsay1 Rosso Orsay virus RNA1 Cal Rosso Fluor 610 (CF610) GACATATGTGATGCCGAC
Orsay2 Rosso Orsay virus RNA2 Cal Rosso Fluor 610 (CF610) GTAGTGTCATTGTAGGCAGC
MicroA-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Rosso Fluor 610 (CF610) CTCTGTCCATCCTCGGCAA
MicroB-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Rosso Fluor 610 (CF610) CTCTCGGCACTCCTTCCTG
MicroF-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Rosso Fluor 610 (CF610) AGACAAATCAGTCCACGAATT
MicroSp1A-FAM Nematocida ausubeli 18S 5' 6-fluoresceina (FAM) CAGGTCACCCCACGTGCT

Tabella 1: Elenco delle sequenze di sonde FISH. Tutte le sonde FISH sono state acquistate commercialmente con il fluoroforo attaccato all'estremità 5' (tramite sintesi oligonucleotidica personalizzata; vedi Tabella dei materiali) e gli oligonucleotidi sono stati purificati mediante HPLC in fase inversa.

Discussion

Wild C. elegans sono naturalmente associati a una varietà di microbi. I ricercatori possono utilizzare RNA FISH per rilevare e identificare questi microbi e ottenere informazioni sulla loro localizzazione nel contesto di un intero animale. I microbi con fenotipi desiderabili o interessanti possono essere identificati attraverso questo metodo e quindi isolati per un'ulteriore caratterizzazione e sequenziamento. L'abbondanza di numerosi isolati batterici da C. elegans selvatici può anche essere quantificata tramite RNA FISH29. Utilizzando il protocollo qui descritto, è anche possibile osservare i microrganismi noti all'interno dei loro ospiti e saperne di più sulle loro interazioni. È importante sottolineare che il virus Orsay e la microsporidi sono parassiti obbligati e non possono essere coltivati indipendentemente dall'ospite, quindi FISH è lo strumento di visualizzazione standard. La colonizzazione o l'infezione possono anche essere quantificate attraverso RNA FISH utilizzando nematodi cresciuti su piastre seminate con un desiderato batterio coltivabile di interesse. Oltre a colorare i microrganismi nell'intestino di C. elegans, questo protocollo può essere utilizzato per altri ceppi di nematodi come C. tropicalis o Oscheius tipulae19,23.

Il vantaggio principale del protocollo FISH è che offre un metodo semplice, rapido e robusto per colorare i microbi associati a C. elegans. Le immagini prodotte dalla colorazione FISH hanno un elevato rapporto segnale-rumore, che si ottiene utilizzando sonde FISH che mirano all'abbondante RNA della SSU all'interno del campione. Poiché ci sono tipicamente livelli 30 volte o superiori di rRNA rispetto all'rDNA, la maggior parte del segnale dalla colorazione FISH con sonde che prendono di mira l'rRNA è dovuto all'rRNA piuttosto che all'rDNA30. Inoltre, RNA FISH consente di vedere l'infezione o la colonizzazione nel contesto dell'intero animale. Questa visualizzazione è facilitata attraverso la co-colorazione dei nuclei ospiti con DAPI e/o l'utilizzo di ceppi di C. elegans marcati con fluorescenza per evidenziare meglio la localizzazione dell'infezione o della colonizzazione all'interno del campione. Ad esempio, la FISH specifica per microsporidia è stata utilizzata per determinare il tropismo tissutale di Nematocida displodere utilizzando un pannello di ceppi di C. elegans con espressione di GFP in diversi tessuti20. Inoltre, questo protocollo è suscettibile di modifiche che consentono ai ricercatori di determinare le condizioni ideali adatte alle loro esigenze specifiche (ad esempio, regolando il periodo di fissazione, aumentando la temperatura di ibridazione).

Un passo fondamentale nel protocollo FISH è la fissazione dei campioni. Il periodo di incubazione successivo all'aggiunta del fissativo è necessario per consentire all'agente di permeabilizzare il campione. Tempi di incubazione più lunghi non sono ideali per campioni contenenti proteine fluorescenti transgeniche a causa della degradazione delle proteine da parte del PFA nel tempo. Per i campioni contenenti GFP, è imperativo determinare il tempo di fissazione ottimale per consentire la permeabilizzazione, pur mantenendo il segnale GFP.

FISH può essere usato per colorare batteri, virus o microsporidi in C. elegans. Tuttavia, il miglior tipo di agente fissativo utilizzato per la FISH dipende dal campione e dai requisiti a valle. Questo protocollo presenta una soluzione PFA come agente fissativo primario per colorare batteri e virus. Tuttavia, la PFA non è sufficiente per la visualizzazione delle spore microsporidi in quanto non può penetrare la parete delle spore. Per la visualizzazione delle spore, dovrebbe essere usato invece l'acetone. Tuttavia, la fissazione del PFA è efficiente per l'etichettatura FISH di altre fasi di vita dei microsporidi, inclusi sporoplasmi, meronti e sporonti. Altre importanti differenze si osservano tra la fissazione dell'acetone e la fissazione del PFA; L'acetone è più conveniente perché i campioni possono essere conservati rapidamente nel congelatore dopo l'aggiunta, senza la necessità di lavarli. Tuttavia, l'acetone uccide rapidamente qualsiasi GFP esistente in un ospite transgenico. Il PFA è il fissativo preferito se è importante preservare alcune strutture fisiologiche nell'ospite, poiché gli animali fissati con acetone sembrano essere più degradati, rendendo più difficile l'identificazione di alcuni tessuti. Poiché i campioni sono fissi, questo protocollo FISH non consente l'imaging dal vivo delle interazioni ospite-microbo in vivo. Tuttavia, un corso temporale di infezione da inseguimento del polso seguito dalla colorazione FISH dei campioni in vari punti temporali può consentire di vedere alcune dinamiche di infezione microbica 19,20,31.

Un altro passaggio critico in tutto il protocollo è il lavaggio accurato dei campioni prima e dopo l'ibridazione. Prima dell'ibridazione, quando si raccolgono i vermi nei tubi di microfuge, i batteri in eccesso o altri microbi dalle piastre NGM possono essere trasportati con il campione di vermi. Tre lavaggi con PBS-T sono standard; tuttavia, possono essere necessari più lavaggi per eliminare sufficientemente i microrganismi esterni, specialmente quando si utilizza C. elegans fortemente contaminata e isolata in natura. Quando si visualizzano i campioni montati dopo FISH, potrebbe esserci qualche sonda FISH residua che produce grandi quantità di segnale sullo sfondo del campione. La temperatura di lavaggio e il numero di lavaggi sono importanti per rimuovere la sonda in eccesso e non specificamente legata. Per ridurre la fluorescenza di fondo, è possibile eseguire due o tre lavaggi con 1 mL di WB ogni 30 min, invece di un lavaggio con 1 mL di WB per un'ora. Diverse sonde FISH possono richiedere temperature di lavaggio diverse. Tipicamente, la temperatura di lavaggio è di 2 °C superiore alla temperatura di ibridazione, ma può essere aumentata se c'è troppa fluorescenza di fondo (rumore elevato).

Il protocollo FISH utilizza sonde fluorescenti progettate per colpire l'RNA microbico specie-specifico, ma le sonde FISH possono essere progettate per altre trascrizioni ad alta copia. Altre sonde FISH possono avere temperature di fusione diverse, quindi potrebbe essere necessario eseguire fasi di incubazione a una temperatura superiore o inferiore a quella descritta. La colorazione FISH può identificare la distribuzione spaziale della colonizzazione microbica o dell'infezione all'interno dell'ospite, consentendo la caratterizzazione delle interazioni ospite-microbo e microbo-microbo. Una limitazione è che solo pochi fluorofori convenzionali possono essere utilizzati contemporaneamente, il che riduce il numero di diversi microrganismi che possono essere rilevati contemporaneamente tramite FISH. Ciò limita il suo uso per studi complessi sul microbioma in C. elegans. Tuttavia, la FISH mirata all'rRNA multicolore utilizza sonde marcate con fluorofori non canonici che possono aumentare il numero di etichette di gruppi microbici distinti15. Un'altra limitazione è che è difficile distinguere tra specie strettamente correlate, in particolare batteri, che hanno sequenze SSU molto simili. Tuttavia, l'estrema divergenza di sequenza tra le specie di microsporidi aiuta a facilitare la loro differenziazione con questo protocollo (Figura 3)32,33.

Nel complesso, questo protocollo FISH descrive una tecnica per rilevare microrganismi all'interno di C. elegans. Consente ai ricercatori di utilizzare un sistema modello trasparente e geneticamente trattabile per rilevare e quantificare la colonizzazione e l'infezione nel contesto di un animale intatto, nonché identificare il comportamento microbico o la morfologia unici all'interno dell'ospite. Una versione preprint di questo manoscritto è stata pubblicata durante la revisione34.

Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Grazie alla dottoressa Marie-Anne Félix per averci fornito ceppi di nematodi selvatici. Questo lavoro è stato supportato da NSF sotto CAREER Grant 2143718 e California State University sotto un CSUPERB New Investigator Award a RJL, NIH sotto R01 AG052622 e R01 GM114139 a ERT, e da un American Heart Association Fellowship a VL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS Invitrogen AM9822
Acetone Fisher Scientific A-11-1
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) Vectalab NC9524612
EDTA Fisher Scientific S311-500
FISH probes (see Table 1) LGC Biosearch Technologies FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis
KCl Fisher Scientific P217
KH2PO4 Fisher Scientific P-286
Na2HPO4 Fisher Scientific S375-500
NaCl Fisher Scientific S-671
NH4Cl Fisher Scientific A-661
Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 50-980-487 CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately
Thermal mixer Eppendorf 5384000020
Tris base Fisher Scientific BP152
Triton X-100 Fisher Scientific BP-151
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500

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Immunologia e infezione numero 185
Ibridazione in <em>situ</em> con fluorescenza dell'RNA (FISH) per visualizzare la colonizzazione microbica e l'infezione nell'intestino <em>di Caenorhabditis elegans</em>
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