Summary
세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
야생 Caenorhabditis 선충류의 내장에는 장내 미생물 군집 박테리아와 미생물 포자충 및 바이러스와 같은 병원체를 포함한 다양한 미생물이 서식합니다. Caenorhabditis elegans와 포유류 장 세포 사이의 유사성과 C. elegans 시스템의 힘으로 인해이 숙주는 생체 내에서 숙주 장-미생물 상호 작용을 연구하는 모델 시스템으로 부상했습니다. 명시야 현미경으로 이러한 상호 작용의 일부 측면을 관찰하는 것은 가능하지만 보다 정확한 도구 없이는 미생물을 정확하게 분류하고 집락 또는 감염 정도를 특성화하기가 어렵습니다. RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)는 야생의 선충류에서 미생물을 식별 및 시각화하거나 실험실에서 미생물에 감염된 선충의 감염을 실험적으로 특성화하고 정량화하는 도구로 사용할 수 있습니다. 매우 풍부한 작은 서브유닛 리보솜 RNA를 표지하는 FISH 프로브는 박테리아와 미세포자충 세포에 대한 밝은 신호를 생성합니다. 많은 종에 공통적 인 리보솜 RNA의 보존 영역을 표적으로 삼도록 설계된 프로브는 광범위한 미생물을 검출 할 수있는 반면, 리보솜 RNA의 발산 영역을 표적화하는 것은 더 좁은 검출에 유용합니다. 유사하게, 프로브는 바이러스 RNA를 표지하도록 설계될 수 있다. 파라포름알데히드(PFA) 또는 아세톤 고정을 사용한 RNA FISH 염색을 위한 프로토콜이 제시됩니다. PFA 고정은 박테리아, 미세 포자 및 바이러스와 관련된 선충류에 이상적이며 아세톤 고정은 미세 포자 포자의 시각화에 필요합니다. 동물을 먼저 세척하고 파라포름알데히드 또는 아세톤으로 고정시켰다. 고정 후, FISH 프로브를 샘플과 함께 인큐베이션하여 프로브를 원하는 표적에 혼성화할 수 있도록 하였다. 동물을 다시 세척한 다음 현미경 슬라이드 상에서 또는 자동화된 접근법을 사용하여 검사하였다. 전반적으로이 FISH 프로토콜은 유전 도구가없는 미생물을 포함하여 C. elegans 장에 서식하는 미생물의 검출, 식별 및 정량화를 가능하게합니다.
Introduction
Caenorhabditis elegans는 장 상피 세포에서 선천성 면역과 숙주-미생물 상호 작용을 연구하는 강력한 모델 시스템으로 부상했습니다 1,2. 투명한 몸체와 20 개의 장 세포 만 가지고 있기 때문에 C. elegans는 손상되지 않은 유기체의 맥락에서 미생물 장내 식민지화 및 감염 과정을 모니터링하는 편리한 시스템을 나타냅니다. 선충류 장 세포는 포유류의 장 상피 세포와 여러 형태학적 및 기능적 유사성을 공유하므로 마이크로바이옴 집락 화 및 병원체 감염 3,4,5,6을 제어하는 과정의 해부를 위한 다루기 쉬운 생체 내 모델입니다.
Wild C. elegans는 장에 서식하고 감염시키는 다양한 미생물을 먹으며 이러한 선충류를 샘플링하여 바이러스, 진핵 생물 (곰팡이, 난균류) 및이 숙주와 자연적으로 관련된 박테리아를 발견했습니다 7,8,9,10. 오르세 바이러스는 장을 감염시키는 것으로 밝혀졌으며 현재 C. elegans9의 유일한 알려진 천연 바이러스입니다. Microsporidia는 야생 포획 Caenorhabditis에서 가장 흔하게 발견되는 감염인 곰팡이 관련 절대 세포 내 병원체로, C. elegans 및 관련 선충류 8,11을 감염시키는 여러 종이 발견되었습니다. 많은 박테리아가 야생에서 포획 된 C. elegans의 장 내강에 서식하는 것으로 일반적으로 발견되며 여러 종은 C. elegans microbio (CeMbio)6,12,13,14의 자연 모델로 확립되었습니다. 자연적으로 C. elegans를 식민지화 및/또는 감염시키는 미생물을 발견하고 특성화하는 것은 이러한 숙주-미생물 상호 작용을 지배하는 유전적 메커니즘을 이해하고 온전한 숙주 동물의 맥락에서만 발생하는 새로운 미생물 과정을 시각화하는 데 필수적입니다.
샘플링 후 야생 선충류는 감염 또는 식민지화를 나타내는 표현형을 찾기 위해 차등 간섭 대비(DIC) 현미경을 통해 스크리닝됩니다. 예를 들어, 장 세포의 고정 관념적인 과립 모양의 변화는 세포 내 기생충 감염8의 존재와 관련 될 수있다. 특히, 장 과립의 손실과 세포질 점도 감소는 바이러스 감염의 징후인 반면, 장 과립을 '홈'으로 재구성하는 것은 Nematocida 8,9 속의 미세포자충 감염을 나타낼 수 있습니다. 야생 C. elegans 샘플에는 다양한 미생물이 존재하기 때문에 DIC 현미경을 통해 미생물을 구별하기 어려울 수 있습니다. 숙주 내의 미생물의 공간적 분포에 관한 정보는 또한 많은 미생물(15)의 작은 크기로 인해 검출하기 어려울 수 있다. 또한, 시험관내에서 관심 있는 특정 미생물을 배양하는 것이 항상 가능한 것은 아니므로 검출 및/또는 정량화에 어려움이 있습니다.
RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)는 고정된 세포에서 작은 리보솜 서브유닛(SSU)의 RNA에 결합하는 형광 프로브를 활용하여 미생물을 형광 표지하는 방법을 제공합니다. 형태학적 특성의 분석이 특정 종류의 미생물을 시사하는 경우, 그러한 미생물의 특정 또는 광범위한 부류를 표적으로 하는 FISH 프로브를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, EUB338은 박테리아 SSU에 대한 범용 프로브로 간주되며 일반적으로 광범위한 박테리아16을 검출하는 데 사용됩니다. 여기에 기술된 프로토콜은 형광단으로 말단-표지되고 관심있는 미생물의 표적 SSU에 상보적으로 특별히 설계된 단일-가닥 DNA 프로브를 사용하지만, 이용가능한 프로브(16)가 있다. 미생물의 SSU를 표적화하는 주요 이점은 전형적으로 세포 내의 모든 RNA의 80%-90%를 구성하는 이 RNA의 상대적으로 큰 풍부함으로, 매우 높은 신호 대 잡음비(17)로 염색을 유도한다. 프로브는 또한 바이러스가 활발하게 복제하는 경우 감염된 세포에서 매우 높은 사본으로 종종 존재하는 Orsay 바이러스 9,18과 같은 바이러스를 검출하기 위해 RNA를 표적으로 하도록 설계할 수 있습니다.
알려진 프로브를 사용한 결과에 따라, 현장 종 확인을 위해 보다 구체적인 프로브를 설계하기 위해 추가 서열 정보를 획득해야 할 수도 있습니다. 일반적인 접근법은 SSU의 보존 영역 (박테리아의 경우 16S, 진핵 생물의 경우 18S)에 대해 보편적 인 프라이머를 사용하여 더 다양한 영역을 증폭하는것입니다 8. 이 서열 정보를 사용하여, 더 많은 종-특이성을 갖는 프로브가 설계될 수 있다. 이러한 FISH 프로브는 배양 독립적 인 방식으로 미생물을 식별 할 수 있습니다8. 또한, RNA FISH는 필라멘테이션 또는 조직 국소화 패턴(19,20)을 포함하는 독특한 형태학적 집락화 및 감염 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 서로 다른 색상의 FISH 프로브를 동시에 사용할 수 있으므로 야생 선충 샘플에서 미생물을 시각적으로 구별할 수 있을 뿐만 아니라 숙주15,20 내부의 미생물-미생물 역학을 관찰할 수 있습니다. 또한, RNA FISH 염색은 알려진 종의 감염 및 식민지화를 수동으로 또는 자동화된 접근 방식을 통해 쉽게 정량화할 수 있는 숙주-병원체 상호작용 연구에 적용될 수 있으며, 예를 들어 감염에 대한 내성이 증가하거나 감소한 C. elegans 돌연변이체를 비교할 때21.
Protocol
알림: 선충류는 파라포름알데히드 용액(PFA) 또는 아세톤으로 고정할 수 있습니다. PFA는 아세톤보다 형태를 더 잘 시각화할 수 있으며 아세톤에 의해 파괴되는 형질전환 녹색 형광 단백질(GFP)의 신호를 보존할 수 있습니다. 그러나 아세톤 고정은 이 수명 단계를 표지할 수 있도록 미세포자충 포자를 투과화하는 데 필요합니다. 또한, 아세톤은 독성이 적기 때문에 PFA보다 더 편리 할 수 있으며, 샘플은 정착액을 제거 할 필요없이 -20 °C 냉동고의 아세톤에 며칠 동안 보관할 수 있습니다. 다음은 PFA 용액 또는 아세톤을 정착액으로 사용하는 두 가지 개별 프로토콜입니다. 프로토콜 단계의 시각화는 그림 1을 참조하십시오.
1. PFA 고정으로 생선 염색
- 관련 미생물로 선충류 준비
- 적절한 식품 공급원이 뿌려진 표준 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에서 원하는 관심 미생물로 선충을 재배합니다. 원하는 수명 단계에 도달할 때까지 20°C에서 선충류를 배양합니다.
- 2 mL의 M9 최소 염 배지 (42 mM Na2HPO4, 22 mMKH2PO4, 8.6 mM NaCl, 19 mM NH4Cl) + 0.1% 트윈 20을 원하는 미생물로 감염 또는 집락화된 Caenorhabditis 균주를 함유하는 NGM 플레이트에 첨가하여 시각화한다.
알림: 세제를 첨가하는 것은 선충류가 피펫 및 미세 원심 분리 튜브에 달라붙는 것을 방지하고 L1-L2 단계 선충류를 펠릿화하는 데 도움이 됩니다. 트윈 20 대신 0.1% 트리톤-X를 사용할 수 있습니다. - 유리 파스퇴르 피펫과 전구를 사용하여 플레이트에서 선충류를 피펫팅하고 표시된 1.5mL 미세원심 튜브로 옮깁니다.
알림: 선충류가 플라스틱 피펫에 달라붙을 수 있으므로 유리 피펫이 선호되지만 세제(Tween 20 또는 Triton-X)를 추가하면 이 문제를 최소화할 수 있습니다. - 미세 원심 분리기를 사용하여 L1 동물의 경우 60 초 동안 2,000 x g, L4 또는 성인 동물의 경우 60 초 동안 500 x g에서 식민지화 또는 감염된 선충이 포함 된 샘플을 스핀 다운합니다. 모든 후속 원심분리 단계는 선택한 속도로 수행됩니다.
- 피펫을 사용하여 미세원심분리 튜브에서 상청액을 제거합니다. 펠릿 위의 100μL까지 상청액을 조심스럽게 제거하여 선충 펠릿을 방해하지 마십시오. 이는 표시된 1.5mL 미세원심분리 튜브를 사용하여 추정할 수 있습니다.
- 외부 오염을 제거하기 위해 선충류를 씻으십시오.
- 1mL의 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH 2PO4) + 0.1 % 트윈20(PBS-T)을 미세 원속 튜브에 첨가합니다.
- 마이크로 원심분리기에서 적절한 속도로 샘플을 회전시킵니다(1.1.4단계 참조). 피펫을 사용하여 상청액 100μL를 제외한 모든 것을 제거합니다. 이는 표시된 1.5mL 미세원심분리 튜브를 사용하여 추정할 수 있습니다.
- 위의 두 단계를 2-3x 반복합니다.
알림: 일반적으로 총 세 번의 세척으로 충분합니다. 그러나 과도한 외부 오염을 제거하기 위해 추가 세척을 수행 할 수 있습니다.
- PFA로 선충류 수정
- 흄 후드에서 1.2.3 단계에서 얻은 선충 펠릿 위의 상청액 100μL가 들어있는 미세 원속 튜브에 16 % PFA 33 μL를 첨가하여 최종 농도 4 % PFA를 만듭니다.
주의: PFA는 발암 물질입니다. PFA와 접촉하면 피부 감작, 자극 및 눈 손상이 발생할 수 있습니다. PFA는 호흡기 자극이나 감작을 유발할 수 있는 유독 가스를 방출합니다. PFA를 사용할 때는 적절한 개인 보호 장비와 함께 흄 후드에서 작업하고 사용하기 전에 적절한 안전 데이터 시트를 참조하십시오. - 관심있는 미생물에 집락되거나 감염된 선충류를 포함하는 샘플을 실온에서 30-45 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후, 프로토콜이 계속될 준비가 될 때까지 샘플을 4°C에서 70% 에탄올에 저장한다.
참고: 잠복기가 짧을수록 시간이 지남에 따라 PFA에 의한 GFP 분해로 인해 형질전환 균주에서 GFP 신호를 유지하는 데 더 좋습니다. 배양 시간이 길면 정착액이 샘플에 더 잘 투과 할 수 있습니다. 샘플에 따라 배양 시간을 경험적으로 결정하는 것이 가장 좋습니다.
- 흄 후드에서 1.2.3 단계에서 얻은 선충 펠릿 위의 상청액 100μL가 들어있는 미세 원속 튜브에 16 % PFA 33 μL를 첨가하여 최종 농도 4 % PFA를 만듭니다.
- PFA 용액 제거
- 마이크로 원심분리기에서 적절한 속도로 샘플을 회전시킵니다(1.1.4단계 참조). 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상청액을 제거하십시오.
주의: 상청액에는 독성이 있는 PFA가 포함되어 있습니다. 상청액과 적어도 처음 두 번의 세척은 흄 후드에서 독성 폐기물로 폐기하십시오. - 0.5mL의 PBS-T를 미세원심분리 튜브의 샘플에 추가합니다.
- PBS-T를 사용하여 1.4.1 및 1.4.2 2-3x 단계를 따르고 반복합니다.
알림: 더 많은 세척을 수행하면 배경 신호를 줄이는 데 도움이 됩니다. 총 4회 이상 세탁하는 것이 좋습니다. - 마지막 세척 후 샘플을 스핀다운하고 상청액을 제거하여 펠릿을 그대로 둡니다.
- 마이크로 원심분리기에서 적절한 속도로 샘플을 회전시킵니다(1.1.4단계 참조). 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상청액을 제거하십시오.
- 교잡 완충액 (HB)을 준비하고 선충류를 씻습니다.
- 샘플 당 HB (900 mM NaCl, 20 mM 트리스 pH 7.5, 0.01 % SDS) 1mL를 준비하십시오.
알림: HB는 강수량을 피하기 위해 매번 사용하기 전에 신선하게 준비해야합니다. 그러나, 일반적인 완충액(900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5)을 미리 만들어 HB가 필요할 때까지 실온에서 보관할 수 있다. 사용하기 전에 일반 완충액의 샘플 당 1mL를 준비하고 SDS를 최종 농도 0.01 %로 첨가하십시오. - 선충 펠릿이 들어 있는 미세원속 튜브에 800μL의 HB를 추가합니다. 마이크로 원심분리기에서 샘플을 펠릿화합니다(단계 1.1.4 참조). 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하십시오.
- 샘플 당 HB (900 mM NaCl, 20 mM 트리스 pH 7.5, 0.01 % SDS) 1mL를 준비하십시오.
- FISH 프로브를 원하는 표적 서열에 혼성화
- 준비된 HB의 샘플 당 100 μL를 원하는 FISH 프로브와 혼합하여 최종 농도 5-10 ng / μL 프로브로 만듭니다.
참고: FISH 프로브는 15-23-mer 올리고, 관심 미생물의 SSU에 대한 안티센스이며 5' 또는 3' 말단에 부착된 컬러 형광단으로 표지되어 있습니다(여기에 사용된 프로브는 표 1 참조). 일반적으로 스톡 FISH 프로브는 1 mg / mL로 보관됩니다. - 각 샘플에 100μL의 HB 함유 FISH 프로브를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 튕기거나 뒤집어 섞습니다.
참고: 동일한 샘플에서 여러 형광 신호를 시각화하기 위해 서로 다른 색상의 FISH 프로브를 동시에 추가할 수 있습니다( 그림 1B 참조). - 샘플을 46-54°C의 건조 수조 또는 46-54°C의 열 혼합기에서 1,200rpm으로 밤새(6-24시간) 배양합니다.
참고: 46-48°C에서의 인큐베이션은 일반적으로 혼성화에 사용됩니다. 그러나 이 온도는 FISH 프로브의 용융 온도에 따라 조정해야 할 수 있습니다. 일반적으로, 혼성화 온도는 용융 온도보다 4°C 낮다.
- 준비된 HB의 샘플 당 100 μL를 원하는 FISH 프로브와 혼합하여 최종 농도 5-10 ng / μL 프로브로 만듭니다.
- FISH 프로브를 제거하고 선충류를 씻으십시오.
- 샘플당 3mL의 세척 완충액(WB)(900mM NaCl, 20mM 트리스 pH 7.5, 5mM EDTA, 0.01% SDS)을 준비합니다.
알림: WB는 강수량을 피하기 위해 매번 사용하기 전에 신선하게 준비해야합니다. 그러나, 일반적인 완충액(900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5)을 미리 만들어 세척 완충액이 필요할 때까지 실온에서 보관할 수 있다. 사용하기 전에 일반 완충액의 샘플 당 3mL를 준비하고 EDTA를 최종 농도 5mM 및 SDS를 최종 농도 0.01 %로 첨가하십시오. - 적절한 속도로 샘플을 원심분리합니다(1.1.4단계 참조). 피펫을 사용하여 HB를 제거하고 선충류 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 준비된 WB 1mL를 각 샘플에 추가합니다.
- 적절한 속도로 샘플을 원심분리합니다(1.1.4단계 참조). 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 피펫을 사용하여 WB를 제거합니다.
- 준비된 WB 1mL를 각 샘플에 추가합니다.
- 샘플을 건조 수조 (또는 1200 rpm에서 48-56 °C의 열 혼합기)에서 48-56 °C에서 1 시간 동안 배양합니다. 마른 욕조에서 배양하는 경우 15-20분마다 튜브를 부드럽게 뒤집습니다.
알림: 일반적으로 48°C가 표준 세척 온도로 사용됩니다. 그러나 배경 신호가 높으면 이 온도를 조정해야 할 수 있습니다. 세척 온도는 종종 혼성화 온도보다 2°C 높다. WB의 배양 시간을 30 분으로 단축하여 배경을 더욱 줄일 수 있으며, 그 후에 1.7.4 단계와 1.7.5 단계를 반복해야합니다. 그 다음에는 1개(박테리아의 경우) 또는 2개(미세포자충 포자형의 경우)가 48°C에서 30분 배양 기간이 이어집니다. - 적절한 속도로 샘플을 원심분리합니다(1.1.4단계 참조). 피펫을 사용하여 세척 버퍼를 제거하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 각 샘플에 100-500 μL의 PBS-T를 추가합니다. 이 시점에서, 샘플은 프로토콜이 계속될 준비가 될 때까지 최대 일주일 동안 4°C에서 PBS-T에 저장될 수 있다.
- 샘플당 3mL의 세척 완충액(WB)(900mM NaCl, 20mM 트리스 pH 7.5, 5mM EDTA, 0.01% SDS)을 준비합니다.
- 선충류 마운트
- 적절한 속도로 샘플을 원심분리합니다(1.1.4단계 참조). 선충 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 PBS-T를 제거하십시오.
- (선택 사항) DAPI(재료 표)가 있는 페이드 방지 장착 매체 20μL를 샘플에 추가합니다.
- 200μL 피펫 팁으로 20μL 피펫터를 로드하고 가위를 사용하여 피펫 끝을 잘라 더 큰 선충을 피펫팅할 수 있도록 합니다.
- 절단된 피펫 팁을 사용하여 펠릿의 5-10 μL를 현미경 슬라이드에 옮깁니다. 22 x 22 커버슬립으로 커버합니다. 슬라이드를 보관하려면 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉하고 나중에 사용할 준비가 될 때까지 4°C의 어두운 상자에 보관하십시오.
2. 아세톤 고정으로 FISH 염색
- 단계 1.1에 설명된 대로 관련 미생물이 있는 선충류를 준비합니다.
- 1.2 단계에서 설명한대로 외부 오염을 제거하기 위해 선충류를 세척하십시오.
- 선충류를 아세톤으로 고정
- 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하고 1mL의 실험실 등급 아세톤을 샘플에 추가합니다.
주의 : 아세톤은 가연성이 높은 액체 및 증기입니다. 매니큐어 리무버로 카운터에서 구입할 수 있지만 아세톤은 심각한 눈 자극을 유발하고 졸음이나 현기증을 유발할 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. - 관심있는 미생물에 집락되거나 감염된 선충류를 포함하는 샘플을 실온에서 15 분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 샘플은 프로토콜이 계속될 준비가 될 때까지 최대 2주 동안 -20°C에서 아세톤에 저장될 수 있다.
참고: 아세톤이 이 신호를 파괴하므로 형광을 유지하려는 경우 GFP(또는 대립유전자 돌연변이 형태)를 발현하는 형질전환 C. elegans 균주와 함께 이 프로토콜을 사용하지 마십시오.
- 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하고 1mL의 실험실 등급 아세톤을 샘플에 추가합니다.
- 아세톤 제거
- 마이크로 원심분리기에서 적절한 속도로 샘플을 회전시킵니다(1.1.4단계 참조). 피펫으로 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거하십시오.
주의 : 상청액에는 아세톤이 포함되어 있습니다. 상청액과 적어도 처음 두 번의 세척은 흄 후드에서 독성 폐기물로 폐기하십시오. - 0.5mL의 PBS-T를 미세원심분리 튜브의 샘플에 추가합니다.
- PBS-T를 사용하여 2.4.1 및 2.4.2 2-4x 단계를 따르고 반복합니다.
알림: 더 많은 세척을 수행하면 배경 신호를 줄이는 데 도움이 됩니다. 총 4 회 세척을하는 것이 좋습니다. - 마지막 세척 후 샘플을 스핀다운하고 상청액을 제거하여 펠릿이 방해받지 않도록 합니다.
- 마이크로 원심분리기에서 적절한 속도로 샘플을 회전시킵니다(1.1.4단계 참조). 피펫으로 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거하십시오.
- 혼성화 완충액(HB)을 준비하고 단계 1.5에 기재된 바와 같이 선충류를 세척한다.
- FISH 프로브를 단계 1.6에 설명된 바와 같이 원하는 표적 서열에 혼성화한다.
- FISH 프로브를 제거하고 선충류를 씻으십시오.
- 샘플당 1.1mL의 세척 완충액(WB)(900mM NaCl, 20mM 트리스 pH 7.5, 5mM EDTA, 0.01% SDS)을 준비합니다.
알림: WB는 강수량을 피하기 위해 매번 사용하기 전에 신선하게 준비해야합니다. 그러나 일반적인 완충액(900mM NaCl, 20mM Tris pH 7.5)을 미리 만들어 세척 완충액이 필요할 때까지 실온에서 보관할 수 있습니다. 사용하기 전에 일반 완충액의 샘플 당 1.1mL를 준비하고 EDTA를 최종 농도 5mM 및 SDS를 최종 농도 0.01 %로 첨가하십시오. - 적절한 속도로 샘플을 원심분리합니다(1.1.4 참조). 피펫을 사용하여 HB를 제거하고 선충류 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 준비된 WB 100μL를 각 샘플에 첨가합니다.
- 적절한 속도로 샘플을 원심분리합니다(1.1.4 참조). 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 피펫을 사용하여 WB를 제거합니다.
- 준비된 WB 1mL를 각 샘플에 추가합니다.
- 샘플을 건조 수조(또는 1,200rpm에서 48-56°C의 열 혼합기)에서 48-56°C에서 1시간 동안 배양합니다. 마른 욕조에서 배양하는 경우 15-20분마다 튜브를 부드럽게 뒤집습니다.
알림: 일반적으로 48°C가 표준 세척 온도로 사용됩니다. 그러나 배경 신호가 높으면 이 온도를 조정해야 할 수 있습니다. 세척 온도는 종종 혼성화 온도보다 2°C 높다. - 적절한 속도로 샘플을 원심분리합니다(1.1.4단계 참조). 피펫을 사용하여 세척 버퍼를 제거하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 각 샘플에 100-500 μL의 PBS-T를 추가합니다. 이 시점에서, 샘플은 프로토콜이 계속될 준비가 될 때까지 최대 일주일 동안 4°C에서 PBS-T에 저장될 수 있다.
- 샘플당 1.1mL의 세척 완충액(WB)(900mM NaCl, 20mM 트리스 pH 7.5, 5mM EDTA, 0.01% SDS)을 준비합니다.
- 1.8 단계에서 설명한대로 선충류를 장착하십시오.
Representative Results
마이크로바이옴 박테리아를 분석하기 위해 박테리아 16S에 대한 특이적이고 보편적인 FISH 프로브를 야생 분리 동물에 활용했습니다. 야생 Caenorhabditis tropicalis 균주 (JU1848)는 썩은 야자수 열매22에서 프랑스 령 기아나의 작은 강 근처의 Nouragues 숲에서 샘플링되었습니다. 미분 간섭 대조(DIC) 현미경에서 이 선충 균주는 장 상피에 방향적으로 부착되는 것으로 보이는 박테리아와 함께 식민지화되는 것으로 밝혀졌습니다(그림 2A). 이어서, JU1848을 선택적으로 세척하여 다른 미생물 오염물을 제거하고 원하는 부착 박테리아23을 농축하였다. 보편적 인 PCR 방법을 사용하여 박테리아는 알파 프로 테오 박테리아 클래스의 새로운 종으로 확인되었습니다. 그런 다음 Cal Fluor Red 610으로 표지된 FISH 프로브를 이 박테리아의 16S rRNA 서열에 특이적으로 설계하여 C. tropicalis 내 콜로니제이션의 형광 시각화를 가능하게 했습니다(그림 2B). 많은 종의 박테리아에 결합할 수 있는 범용 16S rRNA FISH 프로브(EUB338)를 6-카르복시플루오레신(FAM)으로 표지하고 이 샘플에도 첨가했습니다. 녹색과 빨간색 형광 신호가 완전히 겹쳐서 장에 서식하는 대부분의 박테리아가 부착 된 알파 프로테오 박테리아임을 시사합니다. 이들 동물을 염색 전에 PFA에 고정시켰다.
정체가 알려진 세포 내 병원체로 실험실에서 실험적 감염을 분석하기 위해 Orsay 바이러스 및 미세 포자충 특이 적 FISH 프로브가 야생형 배경을 가진 C. elegans에 사용되었습니다. 오르세 바이러스는 노다비리대과(Nodaviridae) 계열의 양성 가닥 RNA 바이러스이며 C. elegans에서 발견되는 유일한 천연 바이러스 병원체입니다. 오르세 바이러스의 이분법 RNA 게놈은 RNA1 및 RNA2 세그먼트로 구성되며, 이 두 세그먼트를 모두 표적으로 하는 FISH 프로브가 개발되었습니다(그림 3A,B)9,18. 장에서 바이러스 RNA는 세포 내 병원체 반응 (IPR) 25,26,27이라는 전사 방어 프로그램의 활성화에 필요한 RIG-I 동족체 DRH-1 24에 의해 감지됩니다. 항바이러스 IPR 유전자의 전사는 ZIP-1 전사 인자21에 의해 적어도 부분적으로 조절된다. 여기에서 ZIP-1::GFP의 발현은 세포질에서 양성 오르세 바이러스 FISH 염색을 보이는 세포의 장핵에 국한된 것으로 보입니다(그림 3A)21. 오르세 특이적 FISH로 염색된 여러 동물은 용이한 정량화를 위해 이 신호의 강도를 나타내는 것으로 나타났습니다(그림 3B). 도 3A, B에 나타낸 동물은 PFA에 고정하였다.
파리의 선충류 살인자를 의미하는 Nematocida parisii라는 미세 포자충 기생충은 장의 절대 세포 내 병원체입니다. 형광 태그가 붙은 MicroA 및 MicroB 프로브를 포함하여 N. parisii의 18S rRNA를 표지하는 여러 FISH 프로브가 사용되었습니다. MicroB FISH로 염색된 여러 동물은 용이한 정량화를 위해 이 신호의 강도를 나타내는 것으로 나타났습니다(그림 3C). 또한 C. elegans는 밀접하게 관련된 다른 미세 포자충에 감염됩니다. N2와 N. parisii 및 관련 N. ausubeli의 공동 감염은 18S rRNA의 발산 영역에 결합하기 위해 서로 경쟁하는 종 특이적 FISH 프로브를 설계함으로써 이 FISH 프로토콜을 사용하여 구별할 수 있습니다(그림 3D)28. 이 예에서, N. parisii FISH 프로브는 N. parisii 18S rRNA에 대한 완벽한 염기쌍을 갖지만, N. ausubeli 18S rRNA에 대해 7 bp 불일치한다. N. ausubeli 프로브의 경우 그 반대입니다. 이와 같이, 각각의 종-특이적 FISH 프로브는 비-동족 종에 비해 동족 종(18S)에 대한 결합을 위해 경쟁할 것이다. 또한 DAPI를 사용하여 핵을 염색하면 전체 동물의 맥락에서 감염의 더 나은 국소화를 허용하며, 특히 크고 쉽게 식별 할 수있는 핵이있는 장의 경우 더욱 그렇습니다. 그림 3C, D에는 PFA에 고정된 동물이 포함되어 있습니다. 나중에 N. parisii에 감염되면 메론트가 포자로 발달합니다. N. parisii 포자를 시각화하려면 동물이 PFA보다 포자 벽을 더 잘 관통하므로 아세톤에 고정해야합니다 (그림 3E, F)8. 결과 FISH 염색은 N. parisii 포자와 일치 할 수있는 작고 큰 막대 모양의 구조를 보여 주며, 이는 N. parisii 특이 적 프로브로 빨간색으로 염색됩니다.
그림 1: FISH 프로토콜의 시각적 표현. Biorender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 장내 부착 박테리아로 식민지화된 야생 C. 트로피칼리스 JU1848 균주의 FISH 염색. (A) JU1848의 장(in)에 방향적으로 결합하여 내강(lu) 내에 머리카락과 같은 표현형을 생성하는 수천 개의 얇은 간균 박테리아(bac)를 묘사한 Nomarski 이미지. 이 그림 패널은 Morgan, E. et al. (2021)23. (B) 부착 박테리아의 16S rRNA 서열을 표적으로 하도록 설계된 적색 표지된 프로브(b002_16S_A-CF610)와 박테리아의 16S를 표적으로 하도록 설계된 녹색 표지된 범용 FISH 프로브(EUB338-FAM)(아래)를 사용하여 PFA에 고정된 JU1848의 FISH 염색. 숙주 핵의 DAPI 염색은 파란색으로 표시됩니다. 프로브 서열에 대해서는 표 1 을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 세포 내 병원체에 감염된 C. elegans의 FISH 염색. (A,B) ZIP-1::GFP를 발현하고 오르세 바이러스에 감염된 C. 엘레간스의 FISH 염색을 GFP 신호를 보존하기 위해 염색하기 전에 PFA로 고정했습니다. Orsay 1 Red 및 Orsay 2 Red 프로브를 병원체 염색에 사용했습니다. (A) 합성 이미지는 병합된 적색 및 녹색 형광 채널로 구성됩니다. 핵 ZIP-1::GFP 발현은 오르세 바이러스 감염 시 유도되며 녹색으로 표시됩니다. 장 과립의자가 형광은 노란색으로 표시되고 노란색 화살표로 표시됩니다. 점선은 선충류의 윤곽을 그립니다. 스케일 바 = 25 μm. (B) 합성 이미지는 병합된 적색 형광등과 DIC 채널로 구성됩니다. 스케일 바 = 200 μm. (C, D) PFA에 고정 된 미세 포자충에 감염된 야생형 C. elegans의 FISH 염색. (C) N. parisii에 감염되고 PFA에 고정된 야생형 C. 엘레간스의 FISH 염색. MicroB-CF610 프로브는 병원체 염색에 사용되었다. 합성 이미지는 병합된 적색 형광등과 DIC 채널로 구성됩니다. 스케일 바 = 100 μm. (D) 장에서 N. parisii 및 N. ausubeli와 함께 감염된 야생형 C. elegans의 FISH 염색. 두 병원체는 18S rRNA의 동일한 영역에 결합하기 위해 경쟁하는 한 쌍의 특이적 FISH 프로브를 사용하여 공동 염색되었습니다. N. parisii는 MicroF-CF610 (적색)을 사용하여 염색하였고, N. ausubeli는 MicroSp1A-FAM (녹색)을 사용하여 염색하였다. 숙주 핵의 DAPI 염색은 파란색으로 보입니다. 스케일 바 = 25 μm. (E) N. parisii 포자에 감염된 아세톤 고정 야생형 C. 엘레 간스를 사용한 FISH 염색. MicroA-CF610(적색)을 염색(적색)에 사용하였다. 스케일 바 = 15 μm. (F) (E)에서 본 N. parisii 포자를 묘사한 Nomarski 이미지. 스케일 바 = 15 μm. (E)와 (F)에서 작고 큰 막대 모양의 구조는 각각 N. parisii 포자에 해당하는 작고 큰 화살표로 표시되어 있습니다. 프로브 서열에 대해서는 표 1을 참조하십시오. (A)에 표시된 이미지는 Lažetić, V. et al. (2022)21. (B)와 (C)에 표시된 이미지는 Reddy, KC et al. (2019)26. (E) 및 (F)에 표시된 이미지는 Troemel, E. R. et al. (2008) 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프로브 이름 | 프로브 특이성 | 프로브 형광단 | 프로브 시퀀스 |
| EUB338-FAM | 박테리아 16S (범용) | 5' 6-플루오레세인(FAM) | GCTGCCTCCCCCTAGGAGT |
| b002_16S_A-CF610 | 알파프로테오박테리아 16S | 칼 플루오르 레드 610 (CF610) | TGTACCGACCCTTAACGTTC |
| 오르세1 레드 | 오르세 바이러스 RNA1 | 칼 플루오르 레드 610 (CF610) | GACATATGTGATGCCGAGAC |
| 오르세2 레드 | 오르세 바이러스 RNA2 | 칼 플루오르 레드 610 (CF610) | GTAGTGTCATTGTAGGCAGC |
| 마이크로 A-CF610 | 네마토시다 파리시 18S | 칼 플루오르 레드 610 (CF610) | CTCTGTCCATCCTCGGCAA |
| 마이크로B-CF610 | 네마토시다 파리시 18S | 칼 플루오르 레드 610 (CF610) | CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| 마이크로 F-CF610 | 네마토시다 파리시 18S | 칼 플루오르 레드 610 (CF610) | AGACAAATCAGTCCACGAATT |
| 마이크로 Sp1A-FAM | 네마토시다 아우수벨리 18S | 5' 6-플루오레세인(FAM) | CAGGTCACCCCACGTGCT |
표 1: FISH 프로브 서열 목록. 모든 FISH 프로브는 5' 말단에 부착된 형광단으로 상업적으로 구입하고(맞춤형 올리고뉴클레오티드 합성을 통해 ; 재료 표 참조) 올리고뉴클레오티드는 역상 HPLC로 정제했습니다.
Discussion
야생 C. 엘레 간스는 자연적으로 다양한 미생물과 관련이 있습니다. 연구원들은 RNA FISH를 사용하여 이러한 미생물을 검출 및 식별할 수 있을 뿐만 아니라 전체 동물의 맥락에서 미생물의 위치에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 바람직하거나 흥미로운 표현형을 갖는 미생물은 이 방법을 통해 식별된 다음 추가 특성화 및 시퀀싱을 위해 분리될 수 있습니다. 야생 C. elegans로부터의 수많은 박테리아 분리 물의 풍부함은 또한 RNA FISH29를 통해 정량화 될 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 숙주 내부의 알려진 미생물을 관찰하고 상호 작용에 대해 더 많이 알 수도 있습니다. 중요한 것은 오르세 바이러스와 미세포자충은 절대 기생충이며 숙주와 독립적으로 배양할 수 없으므로 FISH가 표준 시각화 도구라는 것입니다. 집락화 또는 감염은 또한 원하는 배양 가능한 관심 박테리아가 파종된 플레이트에서 자란 선충을 사용하여 RNA FISH를 통해 정량화할 수 있습니다. C. elegans 장에서 미생물을 염색하는 것 외에도이 프로토콜은 C. tropicalis 또는 Oscheius tipulae19,23과 같은 다른 선충 균주에 사용할 수 있습니다.
FISH 프로토콜의 주요 장점은 C. elegans와 관련된 미생물을 염색하는 간단하고 빠르고 강력한 방법을 제공한다는 것입니다. FISH 염색에서 생성된 이미지는 샘플 내 SSU의 풍부한 RNA를 표적으로 하는 FISH 프로브를 활용하여 달성되는 높은 신호 대 잡음비를 갖습니다. 일반적으로 rDNA보다 30배 이상의 rRNA 수준이 있기 때문에 rRNA를 표적으로 하는 프로브를 사용한 FISH 염색에서 발생하는 대부분의 신호는 rDNA30이 아닌 rRNA 때문입니다. 또한 RNA FISH는 전체 동물의 맥락에서 감염 또는 식민지화를 볼 수 있습니다. 이 시각화는 DAPI와 숙주 핵을 공동 염색하거나 형광 표시 C. elegans 균주를 사용하여 샘플 내 감염 또는 집락의 국소화를 더 잘 강조함으로써 촉진됩니다. 예를 들어, 마이크로스포리디안 특이적 FISH를 사용하여 상이한 조직20에서 GFP 발현을 갖는 C. elegans 균주의 패널을 사용하여 Nematocida displodere의 조직 향성을 결정하는 데 사용하였다. 또한 이 프로토콜은 연구자가 특정 요구에 적합한 이상적인 조건(예: 고정 기간 조정, 혼성화 온도 증가)을 결정할 수 있도록 하는 변경이 가능합니다.
FISH 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 샘플을 수정하는 것입니다. 정착액 첨가 후 배양 기간은 제제가 샘플을 투과화할 시간을 허용하기 위해 필요합니다. 더 긴 배양 시간은 시간이 지남에 따라 PFA에 의한 단백질 분해로 인해 형질전환 형광 단백질을 포함하는 샘플에 이상적이지 않습니다. GFP가 포함된 샘플의 경우, GFP 신호를 유지하면서 투과화를 허용할 수 있는 최적의 고정 시간을 결정하는 것이 필수적입니다.
FISH는 C. elegans의 박테리아, 바이러스 또는 미세 포자충을 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 FISH에 사용되는 가장 좋은 유형의 고정제는 샘플 및 다운스트림 요구 사항에 따라 다릅니다. 이 프로토콜은 박테리아와 바이러스를 염색하는 주요 정착제로 PFA 용액을 제시합니다. 그러나 PFA는 포자 벽을 관통 할 수 없기 때문에 미세 포자충 포자의 시각화에 충분하지 않습니다. 포자의 시각화를 위해서는 대신 아세톤을 사용해야합니다. 그러나 PFA 고정은 포자형, 메론트 및 포자를 포함한 미세포자충의 다른 수명 단계의 FISH 라벨링에 효율적입니다. 아세톤 고정과 PFA 고정 사이에는 다른 주요 차이점이 있습니다. 아세톤은 세척 할 필요없이 샘플을 첨가 한 후 냉동실에 신속하게 저장할 수 있기 때문에 더 편리합니다. 그러나 아세톤은 형질전환 숙주에서 기존 GFP를 빠르게 죽입니다. PFA는 아세톤 고정 동물이 더 분해되어 일부 조직의 식별을 더 어렵게 만드는 것처럼 보이기 때문에 숙주에서 일부 생리적 구조를 보존하는 것이 중요한 경우 선호되는 고정제입니다. 샘플이 고정되어 있기 때문에 이 FISH 프로토콜은 생체 내에서 숙주-미생물 상호 작용의 라이브 이미징을 허용하지 않습니다. 그러나, 맥박-추적 감염 시간 과정에 이어 다양한 시점에서 샘플의 FISH 염색을 통해 미생물 감염 19,20,31의 일부 역학을 볼 수 있습니다.
프로토콜 전반에 걸친 또 다른 중요한 단계는 하이브리드화 전후에 샘플을 철저히 세척하는 것입니다. 혼성화 전에 웜을 미세원심분리 튜브로 수집할 때 NGM 플레이트에서 과도한 박테리아 또는 기타 미생물을 웜 샘플과 함께 운반할 수 있습니다. PBS-T를 사용한 세 번의 세척이 표준입니다. 그러나 외부 미생물을 충분히 제거하기 위해, 특히 심하게 오염되고 야생에서 분리 된 C. elegans를 사용하는 경우 더 많은 세척이 필요할 수 있습니다. FISH 후 장착 된 샘플을 볼 때 샘플의 배경에서 많은 양의 신호를 생성하는 잔류 FISH 프로브가있을 수 있습니다. 세척 온도와 세척 횟수는 과량 및 비특이적으로 결합된 프로브를 제거하는 데 중요합니다. 배경 형광을 줄이기 위해 1시간 동안 1mL의 WB로 1회 세척하는 대신 30분마다 1mL의 WB로 2회 또는 3회 세척을 수행할 수 있습니다. 다른 FISH 프로브는 다른 세척 온도가 필요할 수 있습니다. 전형적으로, 세척 온도는 혼성화 온도보다 2°C 높지만, 너무 많은 배경 형광(고잡음)이 있는 경우 증가될 수 있다.
FISH 프로토콜은 종 특이적 미생물 RNA를 표적으로 하도록 설계된 형광 프로브를 사용하지만 FISH 프로브는 다른 고복제 전사체용으로 설계할 수 있습니다. 다른 FISH 프로브는 용융 온도가 다를 수 있으므로 배양 단계는 설명된 것보다 높거나 낮은 온도에서 수행해야 할 수 있습니다. FISH 염색은 숙주 내 미생물 집락 또는 감염의 공간적 분포를 식별하여 숙주-미생물 및 미생물-미생물 상호 작용의 특성을 분석할 수 있습니다. 한 가지 한계는 소수의 종래의 형광단만 동시에 사용할 수 있어 동시에 FISH를 통해 검출할 수 있는 다양한 미생물의 수를 줄일 수 있다는 것입니다. 이것은 C. elegans의 복잡한 미생물 군집 연구에 대한 사용을 제한합니다. 그러나, 다색 rRNA 표적 FISH는 별개의 미생물 그룹 표지(15)의 수를 증가시킬 수 있는 비-정준 형광단으로 표지된 프로브를 이용한다. 또 다른 한계는 매우 유사한 SSU 서열을 갖는 밀접하게 관련된 종, 특히 박테리아를 구별하기가 어렵다는 것입니다. 그러나 microsporidia 종 간의 극단적 인 서열 차이는 이 프로토콜로 분화를 촉진하는 데 도움이 됩니다(그림 3)32,33.
전반적으로이 FISH 프로토콜은 C. elegans 내에서 미생물을 검출하는 기술을 설명합니다. 이를 통해 연구자들은 투명하고 유전적으로 다루기 쉬운 모델 시스템을 사용하여 온전한 동물의 맥락에서 식민지화와 감염을 검출 및 정량화할 수 있을 뿐만 아니라 숙주 내에서 고유한 미생물 행동이나 형태를 식별할 수 있습니다. 이 원고의 출판 전 논문은 리뷰34 중에 게시되었다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
야생 선충 균주를 제공해 주신 Marie-Anne Félix 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 CAREER Grant 2143718의 NSF와 RJL에 CSUPERB New Investigator Award, R01 AG052622 및 R01 GM114139에 따라 ERT에 대한 NIH, VL에 대한 American Heart Association Fellowship의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A-11-1 | |
| Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) | Vectalab | NC9524612 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| FISH probes (see Table 1) | LGC Biosearch Technologies | FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S375-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 50-980-487 | CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately |
| Thermal mixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
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