Summary
細胞外細菌やオルセーウイルスや微胞子虫(真菌)などの細胞内病原体を含む腸内微生物は、野生の カエノラブディティス 線虫と関連していることがよくあります。この記事では、 C.エレガンス 線虫にコロニー形成および/または感染する微生物を検出および定量化するためのプロトコルを提示し、実験室で制御された感染後の病原体負荷を測定します。
Abstract
野生の カエノラブディティス 線虫の腸には、腸内細菌叢細菌や微胞子虫やウイルスなどの病原体など、さまざまな微生物が生息しています。 カエノラブディティス・エレガンスと 哺乳類の腸細胞の類似性、および C.エレガンス システムの力により、この宿主は宿主の腸と微生物の相互作用を in vivoで研究するためのモデルシステムとして浮上しています。明視野顕微鏡でこれらの相互作用のいくつかの側面を観察することは可能ですが、より正確なツールなしで微生物を正確に分類し、コロニー形成または感染の程度を特徴付けることは困難です。RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)は、野生の線虫中の微生物を同定および視覚化するためのツールとして、または実験室で微生物に感染した線虫の感染を実験的に特徴付けおよび定量化するためのツールとして使用できます。FISHプローブは、非常に豊富な低サブユニットリボソームRNAを標識し、細菌および小胞子体細胞に対して明るいシグナルを生成します。多くの種に共通するリボソームRNAの保存領域を標的とするように設計されたプローブは、広範囲の微生物を検出できますが、リボソームRNAの異なる領域を標的とするプローブは、より狭い検出に役立ちます。同様に、プローブは、ウイルスRNAを標識するように設計することができる。パラホルムアルデヒド(PFA)またはアセトン固定のいずれかによるRNA FISH染色のプロトコルが提示されています。PFA固定は細菌、微胞子虫、ウイルスに関連する線虫に最適ですが、アセトン固定は小胞子胞子の可視化に必要です。動物を最初に洗浄し、パラホルムアルデヒドまたはアセトンで固定した。固定後、FISHプローブをサンプルと共にインキュベートして、所望の標的へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にした。動物を再び洗浄し、次いで顕微鏡スライド上でまたは自動化されたアプローチを用いて検査した。全体として、このFISHプロトコルは、利用可能な遺伝的ツールがない微生物を含む、 C.エレガンス 腸に生息する微生物の検出、同定、および定量を可能にします。
Introduction
Caenorhabditis elegansは、腸上皮細胞における自然免疫および宿主-微生物相互作用を研究するための強力なモデルシステムとして浮上しています1,2。透明な体とわずか20個の腸細胞を有するため、C.エレガンスは、無傷の生物の状況における微生物の腸のコロニー形成および感染の過程を監視するための便利なシステムを表す。線虫の腸細胞は、哺乳類の腸管上皮細胞と複数の形態学的および機能的類似性を共有しているため、微生物叢のコロニー形成と病原体感染を支配するプロセスの解剖のための扱いやすいin vivoモデルとなっています3,4,5,6。
野生のC.エレガンスは、腸にコロニーを形成して感染するさまざまな微生物を食べ、これらの線虫のサンプリングにより、この宿主に自然に関連するウイルス、真核生物(真菌、卵菌)、および細菌が発見されました7,8,9,10。オルセーウイルスは腸に感染していることが判明し、現在C.エレガンス9の唯一の既知の天然ウイルスです。微胞子虫は、野生のカエノラブディティスで最も一般的に見られる感染症である真菌関連の偏性細胞内病原体であり、いくつかの種がC.エレガンスおよび関連する線虫に感染することが発見されています8,11。野生のC.エレガンスの腸管腔には多くの細菌が生息しており、C.エレガンスマイクロバイオーム(CeMbio)の自然モデルとしていくつかの種が確立されています6,12,13,14。C.エレガンスに自然にコロニー形成および/または感染する微生物の発見と特性評価は、これらの宿主と微生物の相互作用を支配する遺伝的メカニズムを理解し、無傷の宿主動物の状況でのみ発生する新しい微生物プロセスを視覚化するために不可欠です。
サンプリング後、野生線虫を微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡でスクリーニングし、感染またはコロニー形成を示す表現型を探します。例えば、腸細胞の定型顆粒化外観の変化は、細胞内寄生虫感染の存在と関連し得る8。具体的には、腸顆粒の喪失と細胞質粘性の低下はウイルス感染の兆候ですが、腸顆粒の「溝」への再編成は、線虫属の微胞子虫による感染を示している可能性があります8,9。野生のC.エレガンスサンプルには多種多様な微生物が存在するため、DIC顕微鏡で微生物を区別することは困難です。宿主内の微生物の空間分布に関する情報も、多くの微生物のサイズが小さいため、検出が困難な場合があります15。さらに、目的の特定の微生物をin vitroで培養することが常に可能であるとは限らず、検出および/または定量が困難になります。
RNA蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)は、固定細胞内の小リボソームサブユニット(SSU)のRNAに結合する蛍光プローブを利用して、微生物を蛍光標識する方法を提供します。形態学的特徴の分析が特定のクラスの微生物を示唆する場合、そのような微生物の特定または広いクラスを標的とするFISHプローブを使用することができる。例えば、EUB338は、細菌SSUのための普遍的なプローブと考えられており、広範囲の細菌16を検出するために一般的に使用されている。ここで説明するプロトコルは、蛍光色素で末端標識され、目的の微生物の標的SSUに相補的になるように特別に設計された一本鎖DNAプローブを使用しますが、以前に設計されたプローブが利用可能です16。微生物のSSUを標的とする主な利点は、このRNAが比較的豊富に存在することであり、これは通常、細胞内のすべてのRNAの80%〜90%を含み、非常に高いS/N比で染色することにつながります17。プローブは、ウイルスが活発に複製している場合、感染した細胞内で非常に高いコピーで存在することが多いOrsayウイルス9,18のようなウイルスを検出するためにRNAを標的とするように設計することもできます。
既知のプローブの結果によっては、in situでの種確認のために、より特異的なプローブを設計するために、さらなる配列情報を取得する必要があるかもしれません。一般的なアプローチは、SSUの保存領域(細菌の場合は16S、真核生物の場合は18S)に対してユニバーサルプライマーを使用して、より発散する領域を(PCRを介して)増幅することです8。この配列情報を用いて、より種特異性を有するプローブを設計することができる。これらのFISHプローブは、培養に依存しない方法で微生物の同定を可能にすることができる8。さらに、RNA FISHは、フィラメント形成または組織局在パターンを含む、独特の形態学的コロニー形成および感染特性に関する洞察を与えることができる19,20。異なる色のFISHプローブを同時に使用することができ、野生線虫サンプル中の微生物間の視覚的区別、ならびに宿主内の微生物−微生物動態の観察を可能にする15,20。さらに、RNA FISH染色は、既知の種の感染およびコロニー形成を手動または自動化されたアプローチによって容易に定量化できる宿主-病原体相互作用研究に適用することができ、例えば、感染に対する耐性が増加または減少したC.エレガンス変異体を比較する際に、病原体負荷に関する洞察を提供することができる21。
Protocol
注:線虫は、パラホルムアルデヒド溶液(PFA)またはアセトンのいずれかで固定できます。PFAは、アセトンよりも形態の可視化が容易で、アセトンによって破壊されるトランスジェニック緑色蛍光タンパク質(GFP)からのシグナルを保存することができます。しかし、このライフステージを標識できるように小胞子胞子を透過処理するにはアセトン固定が必要です。さらに、アセトンは毒性が低いためPFAよりも便利であり、サンプルは固定液を除去することなく-20°Cの冷凍庫でアセトン中で数日間保存することができます。以下は、固定剤としてPFA溶液またはアセトンのいずれかを使用する2つの別々のプロトコルです。プロトコルのステップの視覚化については、 図1を参照してください。
1. PFA固定による魚染色
- 関連微生物を含む線虫を準備する
- 適切な食物源を播種した標準的な線虫増殖培地(NGM)プレート上で、目的の微生物とともに線虫を増殖させます。目的のライフステージに達するまで、線虫を20°Cでインキュベートします。
- 2 mLのM9最小塩培地(42 mM Na 2 HPO 4、22mM KH2PO 4、8.6 mM NaCl、19 mM NH 4 Cl)+ 0.1% Tween 20を、視覚化する目的の微生物に感染またはコロニー化したカエノラブディティス株を含むNGMプレートに追加します。
注:洗剤の添加は、線虫がピペットやマイクロフュージチューブに付着するのを防ぎ、L1-L2段階の線虫のペレット化を助けるためです。0.1%のTriton-XをTween 20の代わりに使用できます。 - ガラス製のパスツールピペットとバルブを使用してプレートから線虫をピペットで送り、マークされた1.5 mLマイクロフュージチューブに移します。
注:線虫はプラスチックピペットに付着する可能性があるため、ガラスピペットが推奨されますが、洗剤(Tween 20またはTriton-X)を添加すると、この問題を最小限に抑えることができます。 - 微量遠心分離機を使用して、コロニー形成または感染した線虫を含むサンプルを、L1動物の場合は2,000 x gで60秒間、L4または成体動物の場合は500 x gで60秒間スピンダウンします。その後のすべての遠心分離ステップは、選択した速度で実行されます。
- ピペットを使用して微量遠心チューブから上清を取り除きます。ペレットの上100 μLまで上清を注意深く除去することにより、線虫ペレットを乱さないようにしてください。.これは、マークされた1.5 mLマイクロフュージチューブを使用して推定できます。
- 線虫を洗って外部汚染を除去する
- 1 mLの1x PBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2 HPO 4、1.8 mM KH2PO4)+ 0.1%トゥイーン20(PBS-T)をマイクロフュージチューブに加えます。
- マイクロ遠心分離機でサンプルを適切な速度で回転させます(ステップ1.1.4を参照)。ピペットを使用して、100 μL以外の上清をすべて除去します。これは、マークされた1.5 mLマイクロフュージチューブを使用して推定できます。
- 上記の2つの手順を2〜3回繰り返します。
注意: 通常、合計3回の洗浄で十分です。ただし、余分な外部汚染を除去するために、追加の洗浄を実行できます。
- PFAで線虫を固定する
- ヒュームフード内で、ステップ1.2.3で得られた線虫ペレットの上に100 μLの上清を含むマイクロフュージチューブに33 μLの16%PFAを追加し、最終濃度4%PFAにします。
注意:PFAは発がん性物質です。PFAと接触すると、皮膚感作や刺激、眼の損傷を引き起こす可能性があります。PFAは、呼吸器の炎症や感作を引き起こす可能性のある有毒ガスを放出します。PFAを使用する場合は、適切な個人用保護具を備えたヒュームフードで作業し、使用前に適切な安全データシートを参照してください。 - 目的の微生物にコロニー形成または感染した線虫を含むサンプルを室温で30〜45分間インキュベートします。インキュベーション後、プロトコルを継続する準備ができるまで、サンプルを70%エタノールに4°Cで保存します。
注:PFAによるGFPの経時的な分解により、トランスジェニック株のGFPシグナルを維持するには、インキュベーション期間が短いほど優れています。インキュベーション時間を長くすることで、固定液がサンプルによりよく浸透します。サンプルに応じて経験的にインキュベーション時間を決定するのが最善です。
- ヒュームフード内で、ステップ1.2.3で得られた線虫ペレットの上に100 μLの上清を含むマイクロフュージチューブに33 μLの16%PFAを追加し、最終濃度4%PFAにします。
- PFA ソリューションを削除する
- マイクロ遠心分離機でサンプルを適切な速度で回転させます(ステップ1.1.4を参照)。ピペットで、ペレットを乱すことなくできるだけ多くの上清を取り除きます。
注意:上清には有毒なPFAが含まれています。上清と少なくとも最初の2回の洗浄液をヒュームフード内の有毒廃棄物として廃棄します。 - 0.5 mLのPBS-Tをマイクロフュージチューブ内のサンプルに加えます。
- PBS-Tを使用して、手順1.4.1および1.4.2を2〜3x実行して繰り返します。
注意: より多くの洗浄を実行すると、バックグラウンド信号を減らすのに役立ちます。合計で少なくとも4回の洗浄をお勧めします。 - 最後の洗浄に続いて、サンプルをスピンダウンして上清を除去し、ペレットを乱さないままにします。
- マイクロ遠心分離機でサンプルを適切な速度で回転させます(ステップ1.1.4を参照)。ピペットで、ペレットを乱すことなくできるだけ多くの上清を取り除きます。
- ハイブリダイゼーションバッファー(HB)を調製し、線虫を洗浄する
- サンプルあたり1 mLのHB(900 mM NaCl、20 mM Tris pH 7.5、0.01% SDS)を調製します。
注意: HBは、沈殿を避けるために、使用するたびに新鮮に準備する必要があります。ただし、一般的なバッファー(900 mM NaCl、20 mM Tris pH 7.5)を事前に作成し、HBが必要になるまで室温で保存することができます。使用前に、一般的なバッファーのサンプルあたり1 mLを調製し、最終濃度0.01%になるまでSDSを追加します。 - 線虫ペレットを含むマイクロフュージチューブに800μLのHBを追加します。マイクロ遠心分離機でサンプルをペレット化します(ステップ1.1.4を参照)。ペレットを乱すことなく上清を除去します。
- サンプルあたり1 mLのHB(900 mM NaCl、20 mM Tris pH 7.5、0.01% SDS)を調製します。
- FISHプローブを目的のターゲット配列にハイブリダイズする
- 調製したHBのサンプルあたり100 μLを目的のFISHプローブと混合し、最終濃度5〜10 ng / μLのプローブにします。
注:FISHプローブは15-23マーオリゴで、目的の微生物のSSUに対するアンチセンスであり、5'末端または3'末端に着色された蛍光色素で標識されています(ここで使用するプローブについては 表1 を参照してください)。通常、ストックFISHプローブは1 mg/mLで保存されます。 - HB含有FISHプローブ100 μLを各サンプルに加えます。チューブを軽くフリックまたは反転させて混ぜます。
注:異なる色のFISHプローブを同時に添加して、同じサンプル中の複数の蛍光シグナルを可視化することができます( 図1Bを参照)。 - サンプルを46〜54°Cのドライバスまたは46〜54°Cのサーマルミキサーで1,200rpmで一晩(6〜24時間)インキュベートします。
注:46〜48°Cでのインキュベーションは、通常、ハイブリダイゼーションに使用されます。ただし、この温度は、FISHプローブの溶融温度に応じて調整する必要がある場合があります。一般に、ハイブリダイゼーション温度は融解温度より4°C以下である。
- 調製したHBのサンプルあたり100 μLを目的のFISHプローブと混合し、最終濃度5〜10 ng / μLのプローブにします。
- FISHプローブを取り外し、線虫を洗浄します
- サンプルあたり3 mLの洗浄バッファー(WB)(900 mM NaCl、20 mM Tris pH 7.5、5 mM EDTA、0.01% SDS)を調製します。
注意: WBは、沈殿を避けるために、使用するたびに新鮮に準備する必要があります。ただし、一般的なバッファー(900 mM NaCl、20 mM Tris pH 7.5)を事前に作成し、洗浄バッファーが必要になるまで室温で保存することができます。使用前に、一般的なバッファーのサンプルあたり3 mLを調製し、EDTAを最終濃度5 mM、SDSを最終濃度0.01%まで添加します。 - 適切な速度でサンプルを遠心分離します(ステップ1.1.4を参照)。線虫ペレットを邪魔しないように注意しながら、ピペットを使用してHBを取り外します。
- 調製したWBを各サンプルに1 mL加えます。
- 適切な速度でサンプルを遠心分離します(ステップ1.1.4を参照)。ペレットが邪魔されないように注意しながら、ピペットを使用してWBを取り外します。
- 調製したWBを各サンプルに1 mL加えます。
- サンプルをドライバス(または1200rpmで48〜56°Cのサーマルミキサー)で48〜56°Cで1時間インキュベートします。ドライバスでインキュベートする場合は、15〜20分ごとにチューブを静かに反転させます。
注意: 一般に、48°Cが標準洗浄温度として使用されます。ただし、バックグラウンド信号が高い場合は、この温度を調整する必要がある場合があります。洗浄温度は、ハイブリダイゼーション温度よりも2°C高いことが多い。WBでのインキュベーション時間を30分に短縮してバックグラウンドをさらに減らすことができ、その後、ステップ1.7.4と1.7.5を繰り返す必要があります。これに続いて、48°Cで1回(細菌の場合)または2回(微胞子虫スポロプラズムの場合)30分間のインキュベーション期間が続きます。 - 適切な速度でサンプルを遠心分離します(ステップ1.1.4を参照)。ピペットを使用して、ペレットが邪魔されないように注意しながら、洗浄バッファーを取り除きます。
- 各サンプルに100〜500 μLのPBS-Tを追加します。この時点で、サンプルはプロトコルを継続する準備ができるまで、4°CのPBS-Tに最大1週間保存できます。
- サンプルあたり3 mLの洗浄バッファー(WB)(900 mM NaCl、20 mM Tris pH 7.5、5 mM EDTA、0.01% SDS)を調製します。
- 線虫をマウントする
- 適切な速度でサンプルを遠心分離します(ステップ1.1.4を参照)。線虫ペレットを乱すことなく、できるだけ多くのPBS-Tを除去します。
- (オプション)DAPI(材料表)を含む退色防止封入剤20 μLをサンプルに追加します。
- 20 μLのピペットチップを200 μLのピペットチップでロードし、はさみを使用してピペットの先端を切り取り、より大きな線虫をピペットで移すことができます。
- カットしたピペットチップを使用して、5〜10 μLのペレットを顕微鏡スライドに移します。22 x 22のカバーガラスで覆います。スライドを保管するには、カバーガラスの端をマニキュアで密封し、さらに使用する準備ができるまで4°Cの暗い箱に保管します。
2.アセトン固定によるFISH染色
- ステップ1.1に記載されているように、関連する微生物を持つ線虫を準備します。
- 線虫を洗浄して、ステップ1.2で説明されているように外部汚染を除去します。
- 線虫をアセトンで固定する
- ペレットを乱すことなく上清を除去し、1 mLのラボグレードのアセトンをサンプルに加えます。
注意: アセトンは非常に可燃性の液体および蒸気です。マニキュア液として店頭で購入できますが、アセトンは深刻な目の炎症を引き起こし、眠気やめまいを引き起こす可能性があることを覚えておくことが重要です。 - 目的の微生物にコロニー形成または感染した線虫を含むサンプルを室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルは、プロトコルを継続する準備ができるまで、-20°Cのアセトンに最大2週間保存できます。
注:アセトンはこのシグナルを破壊するため、蛍光を維持したい場合は、GFP(またはその対立遺伝子変異型)を発現するトランスジェニック C.エレガンス 株でこのプロトコルを使用しないでください。
- ペレットを乱すことなく上清を除去し、1 mLのラボグレードのアセトンをサンプルに加えます。
- アセトンを取り除く
- マイクロ遠心分離機でサンプルを適切な速度で回転させます(ステップ1.1.4を参照)。ピペットで、ペレットを乱すことなく上清を取り除きます。
注意: 上清にはアセトンが含まれています。上清と少なくとも最初の2回の洗浄液をヒュームフード内の有毒廃棄物として廃棄します。 - 0.5 mLのPBS-Tをマイクロフュージチューブ内のサンプルに加えます。
- PBS-Tを使用して、手順2.4.1および2.4.2を2〜4x実行して繰り返します。
注意: より多くの洗浄を実行すると、バックグラウンド信号を減らすのに役立ちます。合計4回の洗浄を行うことをお勧めします。 - 最後の洗浄後、サンプルをスピンダウンして上清を取り除き、ペレットが乱されていないことを確認します。
- マイクロ遠心分離機でサンプルを適切な速度で回転させます(ステップ1.1.4を参照)。ピペットで、ペレットを乱すことなく上清を取り除きます。
- ハイブリダイゼーションバッファー(HB)を調製し、ステップ1.5に記載されるように線虫を洗浄する。
- ステップ1.6に記載されるように、FISHプローブを所望の標的配列にハイブリダイズする。
- FISHプローブを除去し、線虫を洗浄する
- サンプルあたり1.1 mLの洗浄バッファー(WB)(900 mM NaCl、20 mM Tris pH 7.5、5 mM EDTA、0.01% SDS)を調製します。
注意: WBは、沈殿を避けるために、使用するたびに新鮮に準備する必要があります。ただし、一般的なバッファー(900 mM NaCl、20 mM Tris pH 7.5)を事前に作成し、洗浄バッファーが必要になるまで室温で保存することができます。使用前に、一般的なバッファーのサンプルあたり1.1 mLを調製し、EDTAを最終濃度5 mMに、SDSを最終濃度0.01%まで添加します。 - 適切な速度でサンプルを遠心分離します(1.1.4を参照)。線虫ペレットを邪魔しないように注意しながら、ピペットを使用してHBを取り外します。
- 調製したWBを各サンプルに100 μL加えます。
- 適切な速度でサンプルを遠心分離します(1.1.4を参照)。ペレットが邪魔されないように注意しながら、ピペットを使用してWBを取り外します。
- 調製したWBを各サンプルに1 mL加えます。
- サンプルをドライバス(または48〜56°Cのサーマルミキサー、1,200 rpm)で48〜56°Cで1時間インキュベートします。ドライバスでインキュベートする場合は、15〜20分ごとにチューブを静かに反転させます。
注意: 一般に、48°Cが標準洗浄温度として使用されます。ただし、バックグラウンド信号が高い場合は、この温度を調整する必要がある場合があります。洗浄温度は、ハイブリダイゼーション温度よりも2°C高いことが多い。 - 適切な速度でサンプルを遠心分離します(ステップ1.1.4を参照)。ピペットを使用して、ペレットが邪魔されないように注意しながら、洗浄バッファーを取り除きます。
- 各サンプルに100〜500 μLのPBS-Tを追加します。この時点で、サンプルはプロトコルを継続する準備ができるまで、4°CのPBS-Tに最大1週間保存できます。
- サンプルあたり1.1 mLの洗浄バッファー(WB)(900 mM NaCl、20 mM Tris pH 7.5、5 mM EDTA、0.01% SDS)を調製します。
- ステップ1.8の説明に従って線虫をマウントします。
Representative Results
マイクロバイオーム細菌を分析するために、細菌16Sに対する特異的で普遍的なFISHプローブを野生分離動物に利用しました。野生の カエノラブディティス・トロピカリス 株(JU1848)は、フランス領ギアナの小さな川の近くのヌーラグの森から腐ったヤシの木の果実からサンプリングされました22。微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡下で、この線虫株は、腸上皮に配向的に接着しているように見える細菌でコロニー形成されていることがわかりました(図2A)。次いで、JU1848を選択的に洗浄して、他の微生物汚染物質を除去し、所望の付着細菌23に対して濃縮した。ユニバーサルPCR法を使用して、細菌はアルファプロテオバクテリアクラスの新種として同定されました。次に、Cal Fluor Red 610で標識されたFISHプローブをこの細菌の16S rRNA配列に特異的に設計し、 C. tropicalis 内のコロニー形成を蛍光的に可視化できるようにしました(図2B)。多くの種の細菌に結合できるユニバーサル16S rRNA FISHプローブ(EUB338)を6-カルボキシフルオレシン(FAM)で標識し、このサンプルにも添加しました。緑と赤の蛍光シグナルは完全に重なり合っており、腸にコロニーを形成するほとんどの細菌が付着しているアルファプロテオバクテリア細菌であることを示唆しています。これらの動物を染色前にPFAで固定した。
既知の同一性の細胞内病原体を用いた実験室での実験的感染を分析するために、野生型のバックグラウンドを持つC.エレガンスでオルセーウイルスと微胞子虫特異的FISHプローブを利用しました。オルセーウイルスは、ノダウイルス科のプラス鎖RNAウイルスであり、C.エレガンスに見られる唯一の天然ウイルス病原体です。オルセーウイルスの二部RNAゲノムはRNA1セグメントとRNA2セグメントから構成されており、これらのセグメントの両方を標的とするFISHプローブが開発されています(図3A、B)9,18。腸内では、ウイルスRNAは、細胞内病原体応答(IPR)25,26,27と呼ばれる転写防御プログラムの活性化に必要なRIG-IホモログDRH-124によって感知されます。抗ウイルス性知的財産権遺伝子の転写は、ZIP-1転写因子21によって少なくとも部分的に制御される。ここで、ZIP-1::GFPの発現は、細胞質内のオルセイウイルスFISH染色陽性を示す細胞の腸内核に局在しているのが見られる(図3A)21。オルセー特異的FISHで染色された複数の動物は、容易に定量できるようにこのシグナルの強度を示すことが示されています(図3B)。図3A、Bに示す動物をPFAで固定した。
パリの線虫キラーを意味するNematocida parisiiという名前の小胞子寄生虫は、腸の絶対的な細胞内病原体です。蛍光タグ付きMicroAおよびMicroBプローブを含む、N. parisiiの18S rRNAを標識するいくつかのFISHプローブが使用されています。MicroB FISHで染色された複数の動物は、容易に定量できるようにこのシグナルの強度を示すことが示されています(図3C)。さらに、C.エレガンスは、他の密接に関連する微胞子虫に感染しています。N2とN. parisiiおよび関連するN. ausubeliとの共感染は、18S rRNA上の異なる領域に結合するために互いに競合する種特異的FISHプローブを設計することにより、このFISHプロトコルを使用して区別することができます(図3D)28。この例では、N. parisii FISH プローブは N. parisii 18S rRNA に対して完全な塩基対形成を有するが、N. ausubeli 18S rRNA に対して 7 bp の不一致を有する。逆のことは、N. ausubeliプローブにも当てはまります。そのため、各種特異的FISHプローブは、非同族種よりも同族種18Sへの結合をめぐって競合します。さらに、DAPIを使用して核を染色することで、動物全体、特に大きくて簡単に識別できる核を持つ腸の状況における感染のより良い局在化が可能になります。図3C、Dは、PFAで固定された動物を含む。その後のN. parisiiによる感染は、胞子へのメロンの発達をもたらす。N. parisiiの胞子を可視化するには、PFAよりも胞子壁に浸透するため、アセトンで固定する必要があります(図3E、F)8。得られたFISH染色は、赤のN.パリシイ特異的プローブで染色されたN.パリシイ胞子に対応する可能性が高い、大小の棒状構造を示しています。
図1:FISHプロトコルの視覚的表現。 Biorender.com で作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:腸内に付着菌を定着させた野生型 C.トロピカリス JU1848株のFISH染色。 (A)JU1848の腸(in)に方向に結合し、内腔(lu)内に毛のような表現型を作り出す何千もの薄い桿菌(bac)を描いたノマルスキー画像。この図パネルは、Morgan, E. et al. (2021)23から改作されています。(B)付着細菌の16S rRNA配列を標的とする赤色標識プローブ(b002_16S_A-CF610)(上)と細菌の16Sを標的とする緑色標識ユニバーサルFISHプローブ(EUB338-FAM)を用いたPFA固定JU1848のFISH染色(下)。宿主核のDAPI染色は青色で示されています。プローブ・シーケンスについては 、表 1 を参照してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:細胞内病原体に感染したC.エレガンスのFISH染色。 (A,B)ZIP-1::GFPを発現し、オルセーウイルスに感染したC.エレガンスをFISH染色し、GFPシグナルを保存するために染色する前にPFAで固定した。Orsay 1 RedおよびOrsay 2 Redプローブを病原体染色に使用しました。(A)合成画像は、赤と緑の蛍光チャンネルを合成して構成されています。核ZIP-1::GFP発現はオルセーウイルス感染時に誘導され、緑色で示されている。腸顆粒からの自家蛍光は黄色で示され、黄色の矢印で示される。点線は線虫の体の輪郭を描きます。スケールバー = 25 μm。 (B)合成画像は、赤色蛍光チャンネルとDICチャンネルを合成したものです。スケールバー= 200μm。 (C、D)PFAで固定された微胞子虫に感染した野生型C.エレガンスのFISH染色。(C)野生型C.エレガンスのFISH染色 N. parisiiに感染し、PFAで固定。病原体染色にはMicroB-CF610プローブを使用しました。合成画像は、赤色蛍光チャンネルとDICチャンネルを融合させたものです。スケールバー= 100μm。 (D)腸内でN.パリシイおよびN.アウスベリに同時感染した野生型C.エレガンスのFISH染色。2つの病原体を、18S rRNAの同じ領域への結合を競合する一対の特異的FISHプローブを用いて共染色した。N. parisiiはMicroF-CF610(赤色)を用いて染色し、N. ausubeliはMicroSp1A-FAM(緑色)を用いて染色した。宿主核のDAPI染色は青色で見られます。スケールバー= 25μm。 (E)N.パリシイ胞子に感染したアセトン固定野生型C.エレガンスによるFISH染色。染色にはMicroA-CF610(赤色)を用いた(赤色)。スケールバー= 15μm。 (F)(E)に見られるN. parisii胞子を描いたノマルスキー画像。スケールバー= 15μm。(E)および(F)において、小および大の棒状構造は、それぞれN. parisii胞子に対応する小矢印および大矢印でラベル付けされている。プローブ・シーケンスについては、表 1 を参照してください。(A)に示す画像は、Lažetić, V. et al. (2022)21から引用したものです。(B)および(C)に示す画像は、Reddy, K. C. et al. (2019)26から採用されています。(E)および(F)に示す画像は、Troemel, E. R. et al. (2008)8から翻案されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| プローブ名 | プローブの特異性 | プローブ蛍光色素 | プローブシーケンス |
| EUB338-FAM | バクテリア16S(ユニバーサル) | 5' 6-フルオレセイン | GCTGCCTCCCGTAGGAGT |
| b002_16S_A-CF610 | アルファプロテオバクテリア16S | カルフルアレッド 610 ( CF610 ) | TGTACCGACCCTTAACGTTC |
| オルセー1 レッド | オルセーウイルスRNA1 | カルフルアレッド 610 ( CF610 ) | ガカタットガットガットガガク |
| オルセー2 レッド | オルセーウイルスRNA2 | カルフルアレッド 610 ( CF610 ) | GTAGTGTCATTGTAGGCAGC |
| マイクロA-CF610 | 線虫パリシイ 18S | カルフルアレッド 610 ( CF610 ) | CTCTGTCCATCCTCGGCAA |
| マイクロビーCF610 | 線虫パリシイ 18S | カルフルアレッド 610 ( CF610 ) | CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| マイクロエフ-CF610 | 線虫パリシイ 18S | カルフルアレッド 610 ( CF610 ) | AGACAAATCAGTCCACGAATT |
| マイクロSp1A-FAM | 線虫アウスベリ 18S | 5' 6-フルオレセイン | CAGGTCACCCCACCGTGCT |
表1:FISHプローブ配列のリスト。 すべてのFISHプローブは、蛍光色素を5'末端に結合させた状態で(カスタムオリゴヌクレオチド合成;材料表を参照)商業的に購入し、オリゴヌクレオチドを逆相HPLCで精製しました。
Discussion
野生のC.エレガンスは、さまざまな微生物と自然に関連しています。研究者はRNA FISHを使用して、これらの微生物を検出および識別し、動物全体の状況での微生物の局在についての洞察を得ることができます。望ましいまたは興味深い表現型を有する微生物は、この方法で同定し、次いでさらなる特性評価および配列決定のために単離することができる。野生のC.エレガンスからの多数の細菌分離株の存在量も、RNA FISH29を介して定量化できます。ここで説明するプロトコルを使用することにより、宿主内の既知の微生物を観察し、それらの相互作用についてさらに学ぶこともできます。重要なのは、オルセーウイルスと微胞子虫は絶対寄生虫であり、宿主から独立して培養することができないため、FISHが標準的な視覚化ツールです。コロニー形成または感染は、目的の所望の培養可能な細菌を播種したプレート上で増殖させた線虫を用いてRNA FISHによって定量化することもできる。C.エレガンス腸内の微生物を染色することに加えて、このプロトコルは、C.トロピカリスやOscheius tipulaeなどの他の線虫株にも使用できます19,23。
FISHプロトコルの主な利点は、C.エレガンスに関連する微生物を染色するためのシンプルで迅速かつ堅牢な方法を提供することです。FISH染色から生成される画像は、サンプル内のSSUの豊富なRNAを標的とするFISHプローブを利用することによって達成される高いS/N比を有する。通常、rDNAの30倍以上のレベルのrRNAが存在するため、rRNAを標的とするプローブによるFISH染色からのシグナルのほとんどは、rDNA30ではなくrRNAによるものです。さらに、RNA FISHは、動物全体の状況内で感染またはコロニー形成を見ることを可能にする。この視覚化は、宿主核をDAPIで共染色したり、蛍光マークを付けたC.エレガンス株を使用して、サンプル内の感染またはコロニー形成の局在をより強調したりすることで促進されます。例えば、異なる組織においてGFP発現を有するC.エレガンス株のパネルを用いて、線虫特異的FISHを用いて線虫ディスプロデレの組織向性を決定するために使用した20。さらに、このプロトコルは、研究者が特定のニーズに適した理想的な条件を決定することを可能にする変更(例えば、固定期間の調整、ハイブリダイゼーション温度の上昇)に適しています。
FISHプロトコルの重要なステップの1つは、サンプルの修正です。固定液の添加後のインキュベーション期間は、薬剤がサンプルを透過処理する時間を確保するために必要である。インキュベーション時間が長いと、トランスジェニック蛍光タンパク質を含むサンプルでは、PFAによるタンパク質の経時的な分解のため理想的ではありません。GFPを含むサンプルの場合、GFPシグナルを維持しながら、透過処理を可能にする最適な固定時間を決定することが不可欠です。
FISHは、C.エレガンスの細菌、ウイルス、または微胞子虫の染色に使用できます。ただし、FISHに使用される最適なタイプの固定剤は、サンプルと下流の要件によって異なります。このプロトコルは、細菌やウイルスを染色するための主要な固定剤としてPFA溶液を提示します。しかし、PFAは胞子壁を貫通できないため、小胞子胞子の可視化には不十分である。胞子の可視化には、代わりにアセトンを使用する必要があります。ただし、PFA固定は、スポロプラズム、メロン、スポロントなど、微胞子虫の他のライフステージのFISH標識に効率的です。アセトン固定とPFA固定の間には他の大きな違いが見られます。アセトンは、サンプルを追加した後、洗浄を必要とせずに冷凍庫にすばやく保存できるため、より便利です。しかし、アセトンはトランスジェニック宿主の既存のGFPを迅速に殺します。アセトン固定動物はより分解され、一部の組織の同定がより困難になるため、PFAは宿主のいくつかの生理学的構造を保存することが重要である場合に好ましい固定剤です。サンプルは固定されているため、このFISHプロトコルでは、in vivoでの宿主と微生物の相互作用のライブイメージングはできません。しかし、パルスチェイス感染の時間経過とそれに続く様々な時点でのサンプルのFISH染色は、微生物感染のいくつかのダイナミクスを見ることを可能にすることができる19、20、31。
プロトコル全体の別の重要なステップは、ハイブリダイゼーションの前後にサンプルを徹底的に洗浄することです。ハイブリダイゼーションの前に、ワームをマイクロフュージチューブに集めるとき、NGMプレートからの過剰なバクテリアまたは他の微生物をワームサンプルと共に運ぶことができる。PBS-Tによる3回の洗浄が標準です。ただし、特に高度に汚染された野生分離された C.エレガンスを使用する場合は、外部の微生物を十分に排除するために、より多くの洗浄が必要になる場合があります。FISHの後にマウントされたサンプルを表示する場合、サンプルのバックグラウンドで大量のシグナルを生成するFISHプローブが残っている可能性があります。洗浄温度と洗浄回数は、過剰で非特異的に結合したプローブを除去するために重要です。バックグラウンド蛍光を低減するために、1mLのWBで1時間1回の洗浄を行う代わりに、30分ごとに1mLのWBで2〜3回の洗浄を行うことが可能である。FISHプローブが異なれば、必要な洗浄温度も異なる場合があります。通常、洗浄温度はハイブリダイゼーション温度より2°C高いが、バックグラウンド蛍光が多すぎる(高ノイズ)場合は、これを増やすことができる。
FISHプロトコルは、種特異的微生物RNAを標的とするように設計された蛍光プローブを利用しますが、FISHプローブは他の高コピー転写物用に設計することができます。他のFISHプローブは融解温度が異なる場合があるため、インキュベーションステップは、説明されているよりも高い温度または低い温度で実行する必要があるかもしれません。FISH染色は、宿主内の微生物のコロニー形成または感染の空間分布を識別し、宿主-微生物および微生物-微生物相互作用の特性評価を可能にします。1つの制限は、同時に使用できる従来の蛍光色素がごくわずかであるため、FISHを介して同時に検出できる異なる微生物の数が減ることです。これは、C.エレガンスの複雑な微生物叢研究での使用を制限します。しかし、マルチカラーrRNAを標的とするFISHは、非標準的な蛍光色素で標識されたプローブを利用しているため、異なる微生物群標識の数を増やすことができます15。別の制限は、非常に類似したSSU配列を有する密接に関連した種、特に細菌を区別することが困難であることである。しかし、微胞子虫種間の極端な配列の相違は、このプロトコルによるそれらの分化を促進するのに役立ちます(図3)32,33。
全体として、このFISHプロトコルは、 C.エレガンス内の微生物を検出する技術について説明しています。これにより、研究者は透明で遺伝的に扱いやすいモデルシステムを使用して、無傷の動物のコンテキスト内でのコロニー形成と感染を検出および定量化し、宿主内の固有の微生物の行動または形態を特定できます。この原稿のプレプリント版は、レビュー34中に投稿されました。
Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
野生線虫株を提供してくれたマリー・アン・フェリックス博士に感謝します。この研究は、キャリアグラント2143718の下でNSFによって、RJLにCSUPER新研究者賞の下でカリフォルニア州立大学によって、ERTにR01 AG052622およびR01 GM114139の下でNIH、およびVLにアメリカ心臓協会フェローシップによってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A-11-1 | |
| Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) | Vectalab | NC9524612 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| FISH probes (see Table 1) | LGC Biosearch Technologies | FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S375-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 50-980-487 | CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately |
| Thermal mixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
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