Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) for at visualisere mikrobiel kolonisering og infektion i Caenorhabditis elegans tarme

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/63980
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2School of Biological Sciences, University of California, San Diego

Summary

Tarmmikrober, herunder ekstracellulære bakterier og intracellulære patogener som Orsay-virus og microsporidia (svampe), er ofte forbundet med vilde Caenorhabditis nematoder. Denne artikel præsenterer en protokol til påvisning og kvantificering af mikrober, der koloniserer og / eller inficerer C. elegans nematoder, og til måling af patogenbelastning efter kontrollerede infektioner i laboratoriet.

Abstract

Tarmene af vilde Caenorhabditis nematoder er beboet af en række mikroorganismer, herunder tarmmikrobiom bakterier og patogener, såsom microsporidia og vira. På grund af lighederne mellem Caenorhabditis elegans og pattedyrs tarmceller samt kraften i C. elegans-systemet er denne vært opstået som et modelsystem til at studere værtstarm-mikrobeinteraktioner in vivo. Selvom det er muligt at observere nogle aspekter af disse interaktioner med lysfeltmikroskopi, er det svært at klassificere mikrober nøjagtigt og karakterisere omfanget af kolonisering eller infektion uden mere præcise værktøjer. RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) kan bruges som et værktøj til at identificere og visualisere mikrober i nematoder fra naturen eller til eksperimentelt at karakterisere og kvantificere infektion i nematoder inficeret med mikrober i laboratoriet. FISH-sonder, der mærker det meget rigelige lille underenhed ribosomalt RNA, producerer et lyst signal til bakterier og mikrosporidiske celler. Sonder designet til at målrette mod konserverede regioner af ribosomalt RNA, der er fælles for mange arter, kan detektere en bred vifte af mikrober, mens målretning af divergerende regioner af det ribosomale RNA er nyttigt til smallere detektion. På samme måde kan sonder designes til at mærke viralt RNA. En protokol for RNA FISH-farvning med enten paraformaldehyd (PFA) eller acetonefiksering præsenteres. PFA-fiksering er ideel til nematoder forbundet med bakterier, mikrosporidi og vira, mens acetonefiksering er nødvendig for visualisering af microsporidasporer. Dyr blev først vasket og fastgjort i paraformaldehyd eller acetone. Efter fiksering blev FISH-sonder inkuberet med prøver for at muliggøre hybridisering af sonder til det ønskede mål. Dyrene blev igen vasket og derefter undersøgt på mikroskopglas eller ved hjælp af automatiserede tilgange. Samlet set muliggør denne FISH-protokol detektion, identifikation og kvantificering af de mikrober, der befinder sig i C. elegans tarm, herunder mikrober, for hvilke der ikke er genetiske værktøjer til rådighed.

Introduction

Caenorhabditis elegans er opstået som et kraftfuldt modelsystem til at studere medfødt immunitet og værtsmikrobeinteraktioner i tarmepitelcellerne 1,2. På grund af at have en gennemsigtig krop og kun 20 tarmceller repræsenterer C. elegans et bekvemt system til overvågning af processerne for mikrobiel intestinal kolonisering og infektion i forbindelse med en intakt organisme. Nematode tarmceller deler flere morfologiske og funktionelle ligheder med pattedyrs tarmepitelceller, hvilket gør dem til en medgørlig in vivo-model til dissektion af processer, der styrer mikrobiomkolonisering og patogeninfektion 3,4,5,6.

Wild C. elegans lever af en række mikrober, der koloniserer og inficerer tarmen, og prøveudtagning af disse nematoder har resulteret i opdagelsen af vira, eukaryoter (svampe, oomycetes) og bakterier, der naturligt forbinder med denne vært 7,8,9,10. Orsay-virussen blev fundet inficerende tarmen og er i øjeblikket den eneste kendte naturlige virus af C. elegans9. Microsporidia er svamperelaterede obligatoriske intracellulære patogener, der er den mest almindeligt forekommende infektion i vildtfanget Caenorhabditis, hvor flere arter er blevet opdaget, der inficerer C. elegans og relaterede nematoder 8,11. Mange bakterier findes almindeligvis i tarmens lumen af vildtfangede C. elegans, og flere arter er blevet etableret som en naturlig model for C. elegans mikrobiom (CeMbio)6,12,13,14. Opdagelse og karakterisering af mikrober, der naturligt koloniserer og / eller inficerer C. elegans, er afgørende for at forstå de genetiske mekanismer, der styrer disse værtsmikrobeinteraktioner, samt visualisere nye mikrobielle processer, der kun forekommer i forbindelse med et intakt værtsdyr.

Efter prøveudtagning screenes vilde nematoder via differentialinterferenskontrast (DIC) mikroskopi for at lede efter fænotyper, der er tegn på infektion eller kolonisering. For eksempel kan ændringer i det stereotype granulerede udseende af tarmcellerne være forbundet med tilstedeværelsen af en intracellulær parasitinfektion8. Specifikt er tabet af tarmgranulatet og nedsat cytosolisk viskositet tegn på virusinfektion, mens omorganisering af tarmgranulat til 'riller' kan indikere infektion med microsporidia i slægten Nematocida 8,9. Fordi der er en bred vifte af mikrober til stede i vilde C. elegans prøver, kan det være svært at skelne mellem mikrober gennem DIC mikroskopi. Oplysninger om den rumlige fordeling af mikrober inden for værten kan også være vanskelige at opdage på grund af den lille størrelse af mange mikrober15. Derudover er det ikke altid muligt at dyrke bestemte mikrober af interesse in vitro, hvilket fører til vanskeligheder med påvisning og / eller kvantificering.

RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) giver en metode til fluorescerende mærkning af mikrober ved at anvende fluorescerende sonder, der binder til RNA'et i den lille ribosomale underenhed (SSU) i faste celler. Hvis analyse af morfologiske egenskaber antyder en bestemt klasse af mikrober, kan FISH-sonder, der er målrettet mod specifikke eller brede klasser af sådanne mikrober, anvendes. For eksempel betragtes EUB338 som en universel sonde til bakteriel SSU og bruges almindeligvis til at detektere en lang række bakterier16. Protokollen beskrevet her bruger enkeltstrengede DNA-sonder, der er slutmærket med en fluorophore og specielt designet til at være komplementære til målet SSU for mikroben af interesse, selvom der er tidligere designede sonder tilgængelige16. Den største fordel ved at målrette mod SSU af mikrober er den relativt store overflod af dette RNA, som typisk omfatter 80% -90% af alt RNA i cellen, hvilket fører til farvning med et meget højt signal-støj-forhold17. Sonder kan også designes til at målrette RNA til at detektere vira, som Orsay-virus 9,18, som ofte er til stede i meget høje kopier i inficerede celler, hvis virussen aktivt replikerer.

Afhængigt af resultaterne med kendte sonder kan det være nødvendigt at indhente yderligere sekvensinformation for at designe mere specifikke sonder til artsbekræftelse in situ. En fælles tilgang er at bruge universelle primere mod konserverede regioner i SSU (16S for bakterier og 18S for eukaryoter) for at forstærke (via PCR) regioner, der er mere divergerende8. Ved hjælp af denne sekvensinformation kan sonder med mere artsspecificitet designes. Disse FISH-sonder kan derefter muliggøre identifikation af mikrober på en kulturuafhængig måde8. Derudover kan RNA FISH give indsigt i unikke morfologiske koloniserings- og infektionsegenskaber, herunder filamentations- eller vævslokaliseringsmønstre19,20. Forskellige farvede FISH-sonder kan bruges samtidigt, hvilket giver mulighed for visuel skelnen mellem mikrober i vilde nematodeprøver samt observation af mikrobe-mikrobedynamik inde i en vært15,20. Desuden kan RNA FISH-farvning anvendes til værtspatogeninteraktionsundersøgelser, hvor infektion og kolonisering af en kendt art let kan kvantificeres manuelt eller gennem automatiserede tilgange til at give indsigt i patogenbelastning, for eksempel ved sammenligning af C. elegans-mutanter, der enten har øget eller nedsat resistens over for infektion21.

Protocol

BEMÆRK: Nematoder kan fikseres med enten paraformaldehydopløsning (PFA) eller acetone. PFA giver mulighed for bedre visualisering af morfologi end acetone og kan bevare signaler fra transgent grønt fluorescerende protein (GFP), som ødelægges af acetone. Imidlertid er acetonefiksering nødvendig for at gennemtrænge mikrosporidiske sporer for at muliggøre mærkning af dette livsstadium. Desuden kan acetone være mere praktisk end PFA, fordi det er mindre giftigt, og prøver kan opbevares i flere dage i acetone i en -20 ° C fryser uden behov for at fjerne fikseringsmidlet. Nedenfor er to separate protokoller, der bruger enten PFA-opløsning eller acetone som fikseringsmiddel. Du kan finde en visualisering af protokoltrinnene i figur 1.

1. FISKEFARVNING med PFA-fiksering

  1. Forbered nematoder med tilhørende mikrober
    1. Dyrk nematoder med den ønskede mikrobe af interesse på standard Nematode Growth Media (NGM) plader podet med den passende fødekilde. Nematoderne inkuberes ved 20 °C, indtil det ønskede livsstadium er nået.
    2. Tilsæt 2 ml M9 minimale saltmedier (42 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH2PO 4, 8,6 mMNaCl, 19 mM NH 4 Cl) + 0,1% Tween 20 til NGM-plader indeholdende Caenorhabditis-stammen inficeret eller koloniseret med den ønskede mikrobe, der skal visualiseres.
      BEMÆRK: Tilsætning af vaskemiddel er for at forhindre nematoder i at klæbe til pipetter og mikrofugerør og for at hjælpe pellet L1-L2 trin nematoder. 0,1% Triton-X kan bruges i stedet for Tween 20.
    3. Pipetter nematoderne op fra pladerne ved hjælp af en pasteurpipette og pære af glas, og overfør dem til mærkede 1,5 ml mikrofugerør.
      BEMÆRK: Glaspipetter foretrækkes, fordi nematoder kan klæbe til plastpipetter, men tilsætning af vaskemiddel (Tween 20 eller Triton-X) kan minimere dette problem.
    4. Ved hjælp af en mikrocentrifuge drejes prøverne indeholdende de koloniserede eller inficerede nematoder ved 2.000 x g for 60 s for L1-dyr eller 500 x g for 60 s for L4 eller voksne dyr. Alle efterfølgende centrifugeringstrin udføres ved den valgte hastighed.
    5. Fjern supernatanten fra mikrofugerørene ved hjælp af en pipette. Undgå at forstyrre nematodepillen ved forsigtigt at fjerne supernatanten ned til 100 μL over pelleten. Dette kan estimeres ved hjælp af markerede 1,5 ml mikrofugerør.
  2. Vask nematoder for at eliminere ekstern forurening
    1. Tilsæt 1 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH2PO4) + 0,1% Tween20 (PBS-T) til mikrofugerør.
    2. Centrifugering af prøverne i mikrocentrifuge med den passende hastighed (se trin 1.1.4). Brug en pipette til at fjerne alle undtagen 100 μL af supernatanten. Dette kan estimeres ved hjælp af markerede 1,5 ml mikrofugerør.
    3. Gentag ovenstående to trin 2-3x.
      BEMÆRK: Tre vaske i alt er typisk tilstrækkelige; yderligere vask kan dog udføres for at fjerne overskydende ekstern forurening.
  3. Fix nematoder med PFA
    1. I røghætten tilsættes 33 μL 16% PFA til mikrofugerøret indeholdende 100 μL supernatant over nematodepellet opnået fra trin 1.2.3 for en endelig koncentration på 4% PFA.
      FORSIGTIG: PFA er kræftfremkaldende. Kontakt med PFA kan medføre hudsensibilisering og irritation og øjenskader. PFA frigiver giftige dampe, der kan føre til irritation af luftvejene eller sensibilisering. Når du bruger PFA, skal du arbejde i en røghætte med korrekt personligt beskyttelsesudstyr og henvise til passende sikkerhedsdatablade før brug.
    2. Inkubere prøverne indeholdende nematoderne koloniseret eller inficeret med mikroben af interesse i 30-45 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation opbevares prøverne i 70 % ethanol ved 4 °C, indtil protokollen er klar til at blive videreført.
      BEMÆRK: En kortere inkubationstid er bedre til at opretholde GFP-signalet i transgene stammer på grund af nedbrydning af GFP af PFA over tid. Længere inkubationstider gør det muligt for fikseringsmidlet bedre at gennemtrænge prøverne. Det er bedst at bestemme inkubationstiden empirisk afhængigt af prøven.
  4. Fjern PFA-opløsningen
    1. Centrifugering af prøverne i mikrocentrifuge med den passende hastighed (se trin 1.1.4). Fjern så meget af supernatanten som muligt med en pipette uden at forstyrre pelleten.
      FORSIGTIG: Supernatanten indeholder PFA, som er giftig. Kassér supernatanten, og mindst de to første vaskes som giftigt affald i en røghætte.
    2. Der tilsættes 0,5 ml PBS-T til prøverne i mikrofugerørene.
    3. Følg og gentag trin 1.4.1 og 1.4.2 2-3x med PBS-T.
      BEMÆRK: Udførelse af flere vaske hjælper med at reducere baggrundssignalet. Mindst fire vaske i alt anbefales.
    4. Efter den sidste vask skal du dreje prøverne ned og fjerne supernatanten, så pelleten forbliver uforstyrret.
  5. Forbered hybridiseringsbuffer (HB) og vask nematoderne
    1. Der fremstilles 1 ml HB (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,01 % SDS) pr. prøve.
      BEMÆRK: HB skal tilberedes frisk før hver brug for at undgå nedbør. En generel buffer (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) kan dog fremstilles på forhånd og opbevares ved stuetemperatur, indtil HB er nødvendig. Før brug fremstilles 1 ml pr. prøve af den generelle buffer, og der tilsættes SDS til en endelig koncentration på 0,01%.
    2. Der tilsættes 800 μL HB til mikrofugerørene indeholdende nematodepellet. Prøverne afpilles i mikrocentrifugen (se trin 1.1.4). Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten.
  6. Hybridiser FISH-sonden til den ønskede målsekvens
    1. Der blandes 100 μL pr. prøve af fremstillet HB med den ønskede FISH-sonde til en slutkoncentration på 5-10 ng/μL sonde.
      BEMÆRK: FISH-sonder er 15-23 -mer oligoer, antisense til SSU af mikroben af interesse og mærket med en farvet fluorophore fastgjort til 5' eller 3' enden (se tabel 1 for sonder, der anvendes her). Generelt opbevares FISH-sonder på lager ved 1 mg / ml.
    2. Der tilsættes 100 μL HB indeholdende FISH-sonde til hver prøve. Bland ved forsigtigt at svirpe eller vende rørene om.
      BEMÆRK: Forskellige farvede FISH-sonder kan tilføjes samtidigt for at visualisere flere fluorescerende signaler i samme prøve (se figur 1B).
    3. Prøverne inkuberes natten over (6-24 timer) i et tørt bad ved 46-54 °C eller en termisk mixer ved 46-54 °C ved 1.200 o/min.
      BEMÆRK: Inkubation ved 46-48 °C bruges typisk til hybridisering. Det kan dog være nødvendigt at justere denne temperatur afhængigt af FISH-sondens smeltetemperatur. Generelt er hybridiseringstemperaturen 4 °C under smeltetemperaturen.
  7. Fjern FISH-sonden og vask nematoder
    1. Der klargøres 3 ml vaskebuffer (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01 % SDS) pr. prøve.
      BEMÆRK: WB skal tilberedes frisk før hver brug for at undgå nedbør. En generel buffer (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) kan dog laves på forhånd og opbevares ved stuetemperatur, indtil vaskebufferen er nødvendig. Før brug fremstilles 3 ml pr. prøve af den generelle buffer, og EDTA tilsættes til en slutkoncentration på 5 mM og SDS til en endelig koncentration på 0,01%.
    2. Prøveemnerne centrifugeres med den passende hastighed (se trin 1.1.4). Fjern HB ved hjælp af en pipette, mens du er forsigtig med at lade nematodepillen være uforstyrret.
    3. Der tilsættes 1 ml forberedt WB til hver prøve.
    4. Prøveemnerne centrifugeres med den passende hastighed (se trin 1.1.4). Fjern WB ved hjælp af en pipette, mens du er forsigtig med at lade pelleten være uforstyrret.
    5. Der tilsættes 1 ml forberedt WB til hver prøve.
    6. Prøverne inkuberes i 1 time ved 48-56 °C i et tørt bad (eller termisk mixer ved 48-56 °C ved 1200 o/min.). Hvis du inkuberer i et tørt bad, skal du forsigtigt vende rørene hvert 15-20 minut.
      BEMÆRK: Generelt anvendes 48 °C som standard vasketemperatur; Det kan dog være nødvendigt at justere denne temperatur, hvis der er et højt baggrundssignal. Vasketemperaturen er ofte 2 °C højere end hybridiseringstemperaturen. Inkubationstiden i WB kan forkortes til 30 minutter for yderligere at reducere baggrunden, hvorefter trin 1.7.4 og 1.7.5 skal gentages. Dette efterfølges af en (for bakterier) eller to (for microsporidia sporoplasmer) 30 minutters inkubationsperioder ved 48 °C.
    7. Prøveemnerne centrifugeres med den passende hastighed (se trin 1.1.4). Brug en pipette til at fjerne vaskebufferen, mens du er forsigtig med at lade pelleten være uforstyrret.
    8. Der tilsættes 100-500 μL PBS-T til hver af prøverne. På dette tidspunkt kan prøverne opbevares i PBS-T ved 4 °C i op til en uge, indtil protokollen er klar til at blive videreført.
  8. Monter nematoderne
    1. Prøveemnerne centrifugeres med den passende hastighed (se trin 1.1.4). Fjern så meget PBS-T som muligt uden at forstyrre nematodepillen.
    2. (Valgfrit) Der tilsættes 20 μL antifademonteringsmedium med DAPI (Table of Materials) til prøverne.
    3. Læg en 20 μL pipettor med en 200 μL pipettespids, og brug en saks til at skære pipettens spids af, så større nematoder kan pipetteres.
    4. Med den afskårne pipettespids overføres 5-10 μL af pelleten til et mikroskopglas. Dæk med en 22 x 22 coverslip. For at opbevare lysbillederne skal du forsegle kanterne på dækslikket med neglelak og opbevare dem i en mørk kasse ved 4 °C, indtil de er klar til videre brug.

2. FISK farvning med acetone fiksering

  1. Forbered nematoder med tilhørende mikrober som beskrevet i trin 1.1.
  2. Vask nematoder for at eliminere ekstern kontaminering som beskrevet i trin 1.2.
  3. Fix nematoder med acetone
    1. Fjern supernatant uden at forstyrre pelleten og tilsæt 1 ml acetone af laboratoriekvalitet til prøven.
      FORSIGTIG: Acetone er en meget brandfarlig væske og damp. Selvom det kan købes i håndkøb som neglelakfjerner, er det vigtigt at huske, at acetone forårsager alvorlig øjenirritation og kan forårsage døsighed eller svimmelhed.
    2. Inkubere prøverne indeholdende nematoder koloniseret eller inficeret med mikroben af interesse i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation kan prøverne opbevares i acetone ved -20 °C i op til 2 uger, indtil protokollen er klar til at blive fortsat.
      BEMÆRK: Brug ikke denne protokol med transgene C. elegans-stammer , der udtrykker GFP (eller dets alleliske muterede former), hvis det ønskes at opretholde fluorescensen, da acetone ødelægger dette signal.
  4. Fjern acetone
    1. Centrifugering af prøverne i mikrocentrifuge med den passende hastighed (se trin 1.1.4). Fjern supernatanten med en pipette uden at forstyrre pelleten.
      FORSIGTIG: Supernatanten indeholder acetone. Kassér supernatanten, og mindst de to første vaskes som giftigt affald i en røghætte.
    2. Der tilsættes 0,5 ml PBS-T til prøverne i mikrofugerørene.
    3. Følg og gentag trin 2.4.1 og 2.4.2 2-4x med PBS-T.
      BEMÆRK: Udførelse af flere vaske hjælper med at reducere baggrundssignalet. Det anbefales at udføre fire vaske i alt.
    4. Efter den sidste vask skal du dreje prøverne ned og fjerne supernatanten, hvilket sikrer, at pelleten er uforstyrret.
  5. Forbered hybridiseringsbuffer (HB) og vask nematoderne som beskrevet i trin 1.5.
  6. Hybridiser FISH-sonden til den ønskede målsekvens som beskrevet i trin 1.6.
  7. Fjern FISH sonde og vask nematoder
    1. Der klargøres 1,1 ml vaskebuffer (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01 % SDS) pr. prøve.
      BEMÆRK: WB skal tilberedes frisk før hver brug for at undgå nedbør. En generel buffer (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) kan dog laves på forhånd og opbevares ved stuetemperatur, indtil der er behov for en vaskebuffer. Før brug fremstilles 1,1 ml pr. prøve af den generelle buffer, og EDTA tilsættes til en slutkoncentration på 5 mM og SDS til en endelig koncentration på 0,01%.
    2. Prøveemnerne centrifugeres med den passende hastighed (se 1.1.4). Fjern HB ved hjælp af en pipette, mens du er forsigtig med at lade nematodepillen være uforstyrret.
    3. Der tilsættes 100 μL forberedt WB til hver prøve.
    4. Prøveemnerne centrifugeres med den passende hastighed (se 1.1.4). Fjern WB ved hjælp af en pipette, mens du er forsigtig med at lade pelleten være uforstyrret.
    5. Der tilsættes 1 ml forberedt WB til hver prøve.
    6. Prøverne inkuberes i 1 time ved 48-56 °C i et tørt bad (eller termisk mixer ved 48-56 °C ved 1.200 o/min.). Hvis du inkuberer i et tørt bad, skal du forsigtigt vende rørene hvert 15-20 minut.
      BEMÆRK: Generelt anvendes 48 °C som standard vasketemperatur; Det kan dog være nødvendigt at justere denne temperatur, hvis der er et højt baggrundssignal. Vasketemperaturen er ofte 2 °C højere end hybridiseringstemperaturen.
    7. Prøveemnerne centrifugeres med den passende hastighed (se trin 1.1.4). Brug en pipette til at fjerne vaskebufferen, mens du er forsigtig med at lade pelleten være uforstyrret.
    8. Der tilsættes 100-500 μL PBS-T til hver af prøverne. På dette tidspunkt kan prøverne opbevares i PBS-T ved 4 °C i op til en uge, indtil protokollen er klar til at blive videreført.
  8. Monter nematoderne som beskrevet i trin 1.8.

Representative Results

Til analyse af mikrobiombakterier blev specifikke og universelle FISH-sonder til bakterielle 16S brugt på vildtisolerede dyr. Vild Caenorhabditis tropicalis stamme (JU1848) blev udtaget fra Nouragues-skoven nær en lille flod i Fransk Guyana fra rådne palmefrugter22. Under differentialinterferenskontrastmikroskopet (DIC) viste det sig, at denne nematodestamme blev koloniseret med en bakterie, der ser ud til at klæbe retningsbestemt til tarmepitelet (figur 2A). JU1848 blev derefter selektivt renset for at eliminere andre mikrobielle forurenende stoffer og berige for den ønskede klæbende bakterie23. Ved hjælp af den universelle PCR-metode blev bakterien identificeret som en ny art i Alphaproteobacteria-klassen. En FISH-sonde mærket med Cal Fluor Red 610 blev derefter designet specielt til 16S rRNA-sekvensen af denne bakterie for at muliggøre fluorescerende visualisering af kolonisering inden for C. tropicalis (figur 2B). En universel 16S rRNA FISH-sonde, der er i stand til at binde mange bakteriearter (EUB338), blev mærket med 6-carboxyfluorescin (FAM) og blev også tilsat til denne prøve. De grønne og røde fluorescerende signaler overlapper fuldstændigt, hvilket tyder på, at de fleste bakterier, der koloniserer tarmene, er den klæbende Alphaproteobacteria-bakterie. Disse dyr blev fikseret i PFA før farvning.

Til analyse af eksperimentel infektion i laboratoriet med intracellulære patogener af kendt identitet blev Orsay-virus og mikrosporidian-specifikke FISH-sonder anvendt på C. elegans med en vildtypebaggrund. Orsay-viruset er en positivstrenget RNA-virus fra Nodaviridae-familien og det eneste naturlige virale patogen, der findes i C. elegans. Orsay-virusets todelte RNA-genom består af RNA1- og RNA2-segmenter, og FISH-sonder rettet mod begge disse segmenter er blevet udviklet (figur 3A, B) 9,18. I tarmen registreres viralt RNA af RIG-I homolog DRH-124, hvilket er nødvendigt for aktivering af det transkriptionelle forsvarsprogram ved navn Intracellular Pathogen Response (IPR)25,26,27. Transkriptionen af antivirale IPR-gener styres i det mindste delvist af ZIP-1 transkriptionsfaktor21. Her ses ekspressionen af ZIP-1::GFP lokaliseret i tarmkernerne i celler, der viser positiv Orsay-virus FISH-farvning i cytoplasmaet (figur 3A)21. Flere dyr farvet med Orsay-specifik FISK er vist at indikere styrken af dette signal for nem kvantificering (figur 3B). Dyr vist i figur 3A,B blev fastsat i PFA.

Den mikrosporidiske parasit ved navn Nematocida parisii, der betyder nematodedræber fra Paris, er et obligatorisk intracellulært patogen i tarmen. Flere FISH-sonder, der mærker 18S rRNA af N. parisii, er blevet brugt, herunder fluorescerende mærkede MicroA- og MicroB-sonder. Flere dyr farvet med MicroB FISH er vist at angive styrken af dette signal for nem kvantificering (figur 3C). Derudover er C. elegans inficeret af andre nært beslægtede mikrosporidier. Co-infektion af N2 med N. parisii og den relaterede N. ausubeli kan skelnes ved hjælp af denne FISH-protokol ved at designe artsspecifikke FISH-sonder, der konkurrerer mod hinanden om binding til en divergerende region på 18S rRNA (figur 3D)28. I dette eksempel har N. parisii FISH-sonden perfekt baseparring til N. parisii 18S rRNA, men en 7 bp uoverensstemmelse med N. ausubeli 18S rRNA. Det omvendte gælder for N. ausubeli-sonden. Som sådan vil hver artsspecifik FISH-sonde udkonkurrere for at binde til den beslægtede art 18S over de ikke-beslægtede arter. Derudover giver brugen af DAPI til at plette kerner mulighed for bedre lokalisering af infektionen i sammenhæng med hele dyret, især for tarmen, der har store, let identificerbare kerner. Figur 3C,D indeholder dyr, der er fikseret i PFA. Senere infektioner med N. parisii resulterer i udvikling af meronts til sporer. For at visualisere N. parisii-sporer skal dyrene fastgøres i acetone, da det trænger bedre ind i sporevæggen end PFA (figur 3E, F)8. Den resulterende FISH-farvning viser de små og store stangformede strukturer, der sandsynligvis svarer til N. parisii-sporer, som er farvet med N. parisii-specifikke sonder i rødt.

Figure 1
Figur 1: Visuel repræsentation af FISH-protokollen. Oprettet med Biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: FISK farvning af vilde C. tropicalis JU1848 stamme koloniseret med klæbende bakterier i tarmene. (A) Nomarski-billede, der viser tusindvis af tynde bacillerbakterier (bac), der er retningsbestemt bindende til tarmen (i) af JU1848, hvilket skaber en hårlignende fænotype i lumen (lu). Dette figurpanel er tilpasset fra Morgan, E. et al. (2021)23. (B) FISH-farvning af JU1848, fastgjort i PFA, ved hjælp af en rød mærket sonde (b002_16S_A-CF610) designet til at målrette 16S rRNA-sekvensen af den klæbende bakterie (øverst) og en grønmærket universel FISH-sonde (EUB338-FAM) designet til at målrette mod 16S af bakterier (nederst). DAPI-farvning af værtskerner er vist med blåt. Se tabel 1 for sondesekvenser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: FISH-farvning af C. elegans inficeret med intracellulære patogener. (A,B) FISH-farvning af C. elegans, der udtrykker ZIP-1::GFP og inficeret med Orsay-viruset, som blev fikseret med PFA før farvning for at bevare GFP-signalet. Orsay 1 Red og Orsay 2 Red prober blev brugt til patogenfarvning. (A) Det sammensatte billede består af fusionerede røde og grønne fluorescerende kanaler. Nuklear ZIP-1::GFP-ekspression induceres ved Orsay-virusinfektion og vises med grønt. Autofluorescens fra tarmgranulatet er vist med gult og angivet med gule pile. Prikkede linjer skitserer nematodelegemet. Skalabjælke = 25 μm. (B) Det sammensatte billede består af fusionerede røde fluorescerende og DIC-kanaler. Skalabar = 200 μm. (C,D) FISKEFARVNING af vildtype C. elegans inficeret med mikrosporidia, der var fikseret i PFA. C) FISKEFARVNING af vildtype C. elegans inficeret med N. parisii og fikseret i PFA. MicroB-CF610 sonde blev brugt til patogenfarvning. Det sammensatte billede består af fusionerede røde fluorescerende og DIC-kanaler. Skalabar = 100 μm. (D) FISKFARVNING af vildtype C. elegans co-inficeret med N. parisii og N. ausubeli i tarmen. De to patogener blev co-farvet ved hjælp af et par specifikke FISH-sonder, der konkurrerer om binding til den samme region af 18S rRNA. N. parisii blev farvet ved hjælp af MicroF-CF610 (rød) og N. ausubeli blev farvet ved hjælp af MicroSp1A-FAM (grøn). DAPI-farvning af værtskerner ses i blåt. Skalabar = 25 μm. (E) FISKFARVNING med acetonefikseret vildtype C. elegans inficeret med N. parisii-sporer. MicroA-CF610 (rød) blev brugt til farvning (rød). Skalabjælke = 15 μm. (F) Nomarski-billede, der viser N. parisii-sporer set i (E). Skala bar = 15 μm. I (E) og (F) er de små og store stangformede strukturer mærket med henholdsvis små og store pile, der svarer til N. parisii sporer. Se tabel 1 for sondesekvenser. Billedet vist i (A) er tilpasset fra Lažetić, V. et al. (2022)21. Billeder vist i (B) og (C) er tilpasset fra Reddy, K. C. et al. (2019)26. Billeder vist i (E) og (F) er tilpasset fra Troemel, E. R. et al. (2008)8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Sonde navn Sonde specificitet Sonde fluorophore Sonde sekvens
EUB338-FAM Bakteriel 16S (universel) 5' 6-fluorescein (FAM) GCTGCCTCCCGTAGGAGT
b002_16S_A-CF610 Alphaproteobakterier 16S Cal Fluor Rød 610 (CF610) TGTACCGACCCTTAACGTTC
Orsay1 Rød Orsay virus RNA1 Cal Fluor Rød 610 (CF610) GACATATGTGATGCCGAGAC
Orsay2 Rød Orsay virus RNA2 Cal Fluor Rød 610 (CF610) GTAGTGTCATTGTAGGCAGC
MikroA-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Fluor Rød 610 (CF610) CTCTGTCCATCCTCGGCAA
MikroB-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Fluor Rød 610 (CF610) CTCTCGGCACTCCTTCCTG
MikroF-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Fluor Rød 610 (CF610) AGACAAATCAGTCCACGAATT
MicroSp1A-FAM Nematocida ausubeli 18S 5' 6-fluorescein (FAM) CAGGTCACCCCACGTGCT

Tabel 1: Liste over FISH-sondesekvenser. Alle FISH-sonder blev kommercielt købt med fluoroforen fastgjort til 5'-enden (via brugerdefineret oligonukleotidsyntese; se Materialetabel), og oligonukleotiderne blev renset ved omvendt fase HPLC.

Discussion

Wild C. elegans er naturligt forbundet med en række mikrober. Forskere kan bruge RNA FISH til at opdage og identificere disse mikrober samt få indsigt i deres lokalisering i sammenhæng med et helt dyr. Mikrober med ønskelige eller interessante fænotyper kan identificeres gennem denne metode og derefter isoleres til yderligere karakterisering og sekventering. Forekomsten af talrige bakterieisolater fra vilde C. elegans kan også kvantificeres via RNA FISH29. Ved at bruge protokollen beskrevet her er det også muligt at observere kendte mikroorganismer inde i deres værter og lære mere om deres interaktioner. Det er vigtigt, at Orsay-virus og microsporidia er obligatoriske parasitter og ikke kan dyrkes uafhængigt af værten, så FISH er standardvisualiseringsværktøjet. Kolonisering eller infektion kan også kvantificeres gennem RNA FISH ved hjælp af nematoder dyrket på plader podet med en ønsket dyrkningsbar bakterie af interesse. Ud over farvning af mikroorganismer i C. elegans tarm kan denne protokol bruges til andre nematodestammer som C. tropicalis eller Oscheius tipulae 19,23.

Den største fordel ved FISH-protokollen er, at den tilbyder en enkel, hurtig og robust metode til at plette mikrober forbundet med C. elegans. Billeder fremstillet af FISH-farvning har et højt signal-støj-forhold, hvilket opnås ved at bruge FISH-sonder, der er målrettet mod SSU'ens rigelige RNA i prøven. Fordi der typisk er 30x eller højere niveauer af rRNA end rDNA, skyldes det meste af signalet fra FISH-farvning med sonder, der er målrettet mod rRNA, rRNA snarere end rDNA30. Desuden gør RNA FISH det muligt at se infektion eller kolonisering inden for rammerne af hele dyret. Denne visualisering lettes ved at co-farvning af værtskerner med DAPI og / eller ved hjælp af fluorescerende markerede stammer af C. elegans for bedre at fremhæve lokaliseringen af infektion eller kolonisering i prøven. For eksempel blev mikrosporidian-specifik FISH brugt til at bestemme vævstropismen af Nematocida displodere ved hjælp af et panel af C. elegans stammer med GFP-ekspression i forskellige væv20. Derudover er denne protokol modtagelig for ændringer, der gør det muligt for forskere at bestemme de ideelle forhold, der passer til deres specifikke behov (f.eks. Justering af fikseringsperioden, forøgelse af hybridiseringstemperaturen).

Et kritisk skridt i FISH-protokollen er fastsættelse af prøverne. Inkubationsperioden efter tilsætning af fikseringsmidlet er nødvendig for at give agenten tid til at gennemtrænge prøven. Længere inkubationstider er ikke ideelle til prøver, der indeholder transgene fluorescerende proteiner på grund af proteinnedbrydning af PFA over tid. For prøver, der indeholder GFP, er det bydende nødvendigt at bestemme den optimale fikseringstid for at muliggøre permeabilisering, samtidig med at GFP-signalet opretholdes.

FISH kan bruges til at plette for bakterier, vira eller microsporidia i C. elegans. Den bedste type fikseringsmiddel, der anvendes til FISH, afhænger imidlertid af prøven og downstream-kravene. Denne protokol præsenterer en PFA-opløsning som det primære fikseringsmiddel til pletter af bakterier og vira. PFA er dog ikke tilstrækkelig til visualisering af mikrosporidiske sporer, da det ikke kan trænge igennem sporevæggen. Til visualisering af sporer bør acetone anvendes i stedet. Selvom PFA-fiksering er effektiv til FISH-mærkning af andre livsstadier af mikrosporidier, herunder sporoplasmer, meronter og sporonter. Andre store forskelle ses mellem acetonefiksering og PFA-fiksering; Acetone er mere praktisk, fordi prøver hurtigt kan opbevares i fryseren efter tilsætning uden behov for vask. Imidlertid dræber acetone hurtigt enhver eksisterende GFP i en transgen vært. PFA er det foretrukne fikseringsmiddel, hvis det er vigtigt at bevare nogle fysiologiske strukturer i værten, da acetonefikserede dyr ser ud til at være mere nedbrudte, hvilket gør identifikation af nogle væv vanskeligere. Fordi prøverne er faste, tillader denne FISH-protokol ikke levende billeddannelse af værtsmikrobeinteraktioner in vivo. Imidlertid kan et pulsjagt-infektionstidsforløb efterfulgt af FISH-farvning af prøver på forskellige tidspunkter give en mulighed for at se en vis dynamik i mikrobiel infektion 19,20,31.

Et andet kritisk trin i hele protokollen er grundig vask af prøverne før og efter hybridisering. Før hybridisering, når ormene opsamles i mikrofugerørene, kan overskydende bakterier eller andre mikrober fra NGM-pladerne bæres med ormprøven. Tre vaske med PBS-T er standard; flere vaske kan dog være nødvendige for tilstrækkeligt at eliminere eksterne mikroorganismer, især når der anvendes stærkt forurenede, vildtisolerede C. elegans. Når man ser de monterede prøver efter FISH, kan der være noget resterende FISH-sonde, der producerer store mængder signal i baggrunden af prøven. Vasketemperaturen og antallet af vaske er vigtige for at fjerne den overskydende og ikke-specifikt bundne sonde. For at reducere baggrundsfluorescensen er det muligt at udføre to eller tre vaske med 1 ml WB hvert 30. minut i stedet for en vask med 1 ml WB i en time. Forskellige FISH-sonder kan kræve forskellige vasketemperaturer. Typisk er vasketemperaturen 2 °C over hybridiseringstemperaturen, men dette kan øges, hvis der er for meget baggrundsfluorescens (høj støj).

FISH-protokollen anvender fluorescerende sonder designet til at målrette mod artsspecifikt mikrobielt RNA, men FISH-sonder kan designes til andre transkripter med høj kopi. Andre FISH-sonder kan have forskellige smeltetemperaturer, så inkubationstrin skal muligvis udføres ved en højere eller lavere temperatur end beskrevet. FISH-farvning kan identificere den rumlige fordeling af mikrobiel kolonisering eller infektion inden for værten, hvilket giver mulighed for karakterisering af værtsmikrobe og mikrobe-mikrobe-interaktioner. En begrænsning er, at kun få konventionelle fluorophorer kan anvendes samtidigt, hvilket reducerer antallet af forskellige mikroorganismer, der kan detekteres via FISH på samme tid. Dette begrænser dets anvendelse til komplekse mikrobiomundersøgelser i C. elegans. Imidlertid anvender flerfarvet rRNA-målrettet FISH sonder mærket med ikke-kanoniske fluorophorer, der kan øge antallet af forskellige mikrobielle gruppemærker15. En anden begrænsning er, at det er vanskeligt at skelne mellem nært beslægtede arter, især bakterier, der har SSU-sekvenser, der er meget ens. Den ekstreme sekvensdivergens mellem microsporidia-arter hjælper imidlertid med at lette deres differentiering med denne protokol (figur 3)32,33.

Samlet set beskriver denne FISH-protokol en teknik til at detektere mikroorganismer inden for C. elegans. Det giver forskere mulighed for at bruge et gennemsigtigt og genetisk medgørligt modelsystem til at opdage og kvantificere kolonisering og infektion inden for rammerne af et intakt dyr samt identificere unik mikrobiel adfærd eller morfologi inden for værten. En fortrykt version af dette manuskript blev offentliggjort under gennemgang34.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Tak til Dr. Marie-Anne Félix for at give os vilde nematodestammer. Dette arbejde blev støttet af NSF under CAREER Grant 2143718 og California State University under en CSUPERB New Investigator Award til RJL, NIH under R01 AG052622 og R01 GM114139 til ART og af et American Heart Association Fellowship til VL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS Invitrogen AM9822
Acetone Fisher Scientific A-11-1
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) Vectalab NC9524612
EDTA Fisher Scientific S311-500
FISH probes (see Table 1) LGC Biosearch Technologies FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis
KCl Fisher Scientific P217
KH2PO4 Fisher Scientific P-286
Na2HPO4 Fisher Scientific S375-500
NaCl Fisher Scientific S-671
NH4Cl Fisher Scientific A-661
Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 50-980-487 CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately
Thermal mixer Eppendorf 5384000020
Tris base Fisher Scientific BP152
Triton X-100 Fisher Scientific BP-151
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  2. Balla, K. M., Troemel, E. R. Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection. Cellular Microbiology. 15 (8), 1313-1322 (2013).
  3. Dimov, I., Maduro, M. F. The C. elegans intestine: organogenesis, digestion, and physiology. Cell and Tissue Research. 377 (3), 383-396 (2019).
  4. Bossinger, O., Fukushige, T., Claeys, M., Borgonie, G., McGhee, J. D. The apical disposition of the Caenorhabditis elegans intestinal terminal web is maintained by LET-413. Developmental Biology. 268 (2), 448-456 (2004).
  5. Szumowski, S. C., Botts, M. R., Popovich, J. J., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. The small GTPase RAB-11 directs polarized exocytosis of the intracellular pathogen N. parisii for fecal-oral transmission from C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 8215-8220 (2014).
  6. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  7. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  8. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6 (12), 2736-2752 (2008).
  9. Felix, M. A., et al. Natural and experimental infection of Caenorhabditis nematodes by novel viruses related to nodaviruses. PLoS Biology. 9 (1), 1000586 (2011).
  10. Osman, G. A., et al. Natural infection of C. elegans by an oomycete reveals a new pathogen-specific immune response. Current Biology. 28 (4), 640-648 (2018).
  11. Zhang, G. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLOS Pathogens. 12 (12), 1006093 (2016).
  12. Clark, L. C., Hodgkin, J. Commensals, probiotics and pathogens in the Caenorhabditis elegans model. Cell Microbiology. 16 (1), 27-38 (2014).
  13. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Michael, L., Markus, S., Petra, P., Holger, D. A multicolor fluorescence in situ hybridization approach using an extended set of fluorophores to visualize microorganisms. Frontiers in Microbiology. 10, 1383 (2019).
  16. Fuchs, B. M., et al. Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Applied and Environmental Microbiology. 64 (12), 4973-4982 (1998).
  17. O'Neil, D., Glowatz, H., Schlumpberger, M. Ribosomal RNA depletion for efficient use of RNA-seq capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 4-19 (2013).
  18. Franz, C. J., et al. Santeuil and Le Blanc viruses primarily infect intestinal cells in Caenorhabditis nematodes. Virology. 448, 255-264 (2014).
  19. Tran, T. D., Ali, M. A., Lee, D., Luallen, R. J. Bacterial filamentation as a mechanism for cell-to-cell spread within an animal host. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  20. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLOS Pathogens. 12 (6), 1005724 (2016).
  21. Lažetić, V., et al. et al The transcription factor ZIP-1 promotes resistance to intracellular infection in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 13 (1), 1-16 (2022).
  22. Félix, M. -A., et al. Species richness, distribution and genetic diversity of Caenorhabditis nematodes in a remote tropical rainforest. BMC Evolutionary Biology. 13 (1), 10 (2013).
  23. Morgan, E., Longares, J. F., Félix, M. A., Luallen, R. J. Selective cleaning of wild Caenorhabditis nematodes to enrich for intestinal microbiome bacteria. Journal of Visualized Experiments. (174), e62937 (2021).
  24. Sowa, J. N., et al. The Caenorhabditis elegans RIGI homolog DRH-1 mediates the intracellular pathogen response upon viral infection. Journal of Virology. 94 (2), 01173 (2020).
  25. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLOS Pathogens. 10 (6), 1004200 (2014).
  26. Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLoS Pathogens. 15 (1), 1007528 (2019).
  27. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  28. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PloS One. 14 (4), 0216011 (2019).
  29. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
  30. Fu, R., Gong, J. Single cell analysis linking ribosomal (r)DNA and rRNA copy numbers to cell size and growth rate provides insights into molecular protistan ecology. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 64 (6), 885-896 (2017).
  31. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  32. Cuomo, C. A., et al. Microsporidian genome analysis reveals evolutionary strategies for obligate intracellular growth. Genome Research. 22 (12), 2478-2488 (2012).
  33. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8 (1), 14023 (2017).
  34. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).

Tags

Immunologi og infektion udgave 185
RNA-fluorescens <em>in situ-hybridisering</em> (FISH) for at visualisere mikrobiel kolonisering og infektion i <em>Caenorhabditis elegans</em> tarme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rivera, D. E., Lažetić,… More

Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (185), e63980, doi:10.3791/63980 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter