Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

RNA-fluorescens in situ Hybridisering (FISH) för att visualisera mikrobiell kolonisering och infektion i Caenorhabditis elegans tarmar

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/63980
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2School of Biological Sciences, University of California, San Diego

Summary

Tarmmikrober, inklusive extracellulära bakterier och intracellulära patogener som Orsay-viruset och mikrosporidier (svampar), är ofta associerade med vilda Caenorhabditis-nematoder . Denna artikel presenterar ett protokoll för att upptäcka och kvantifiera mikrober som koloniserar och / eller infekterar C. elegans nematoder, och för att mäta patogenbelastning efter kontrollerade infektioner i laboratoriet.

Abstract

Tarmarna hos vilda Caenorhabditis nematoder är bebodda av en mängd olika mikroorganismer, inklusive tarmmikrobiombakterier och patogener, såsom mikrosporidier och virus. På grund av likheterna mellan Caenorhabditis elegans och däggdjurs tarmceller, liksom kraften i C. elegans-systemet , har denna värd dykt upp som ett modellsystem för att studera värdtarm-mikrobinteraktioner in vivo. Även om det är möjligt att observera vissa aspekter av dessa interaktioner med ljusfältmikroskopi, är det svårt att exakt klassificera mikrober och karakterisera omfattningen av kolonisering eller infektion utan mer exakta verktyg. RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) kan användas som ett verktyg för att identifiera och visualisera mikrober i nematoder från naturen eller för att experimentellt karakterisera och kvantifiera infektion i nematoder infekterade med mikrober i labbet. FISH-sonder, som märker den mycket rikliga lilla subenheten ribosomalt RNA, ger en ljus signal för bakterier och mikrosporidceller. Prober som är utformade för att rikta in sig på bevarade regioner av ribosomalt RNA som är gemensamt för många arter kan detektera ett brett spektrum av mikrober, medan inriktning på divergerande regioner i ribosomalt RNA är användbart för smalare detektion. På samma sätt kan sonder utformas för att märka viralt RNA. Ett protokoll för RNA FISH-färgning med antingen paraformaldehyd (PFA) eller acetonfixering presenteras. PFA-fixering är idealisk för nematoder associerade med bakterier, mikrosporidier och virus, medan acetonfixering är nödvändig för visualisering av mikrosporidasporer. Djur tvättades först och fixerades i paraformaldehyd eller aceton. Efter fixering inkuberades FISH-sonder med prover för att möjliggöra hybridisering av sonder till det önskade målet. Djuren tvättades igen och undersöktes sedan på mikroskopglas eller med hjälp av automatiserade metoder. Sammantaget möjliggör detta FISH-protokoll detektion, identifiering och kvantifiering av mikroberna som bor i C. elegans-tarmen , inklusive mikrober för vilka det inte finns några genetiska verktyg tillgängliga.

Introduction

Caenorhabditis elegans har vuxit fram som ett kraftfullt modellsystem för att studera medfödd immunitet och värd-mikrobinteraktioner i tarmepitelcellerna 1,2. På grund av att ha en transparent kropp och endast 20 tarmceller representerar C. elegans ett bekvämt system för övervakning av processerna för mikrobiell tarmkolonisering och infektion i samband med en intakt organism. Nematodtarmceller delar flera morfologiska och funktionella likheter med däggdjurs tarmepitelceller, vilket gör dem till en lätthanterlig in vivo-modell för dissektion av processer som styr mikrobiomkolonisering och patogeninfektion 3,4,5,6.

Vilda C. elegans matar på en mängd olika mikrober som koloniserar och infekterar tarmen, och provtagning av dessa nematoder har resulterat i upptäckten av virus, eukaryoter (svampar, oomycetes) och bakterier som naturligt associerar med denna värd 7,8,9,10. Orsay-viruset hittades infektera tarmen och är för närvarande det enda kända naturliga viruset av C. elegans9. Mikrosporidier är svamprelaterade obligatoriska intracellulära patogener som är den vanligaste infektionen vid vildfångad caenorhabdit, med flera arter som har upptäckts infektera C. elegans och besläktade nematoder 8,11. Många bakterier finns vanligtvis i tarmlumen hos vildfångade C. elegans och flera arter har etablerats som en naturlig modell för C. elegans mikrobiom (CeMbio)6,12,13,14. Att upptäcka och karakterisera mikrober som naturligt koloniserar och / eller infekterar C. elegans är viktigt för att förstå de genetiska mekanismerna som styr dessa värd-mikrobinteraktioner, samt visualisera nya mikrobiella processer som endast förekommer i samband med ett intakt värddjur.

Efter provtagning screenas vilda nematoder via differentiell interferenskontrast (DIC) mikroskopi för att leta efter fenotyper som indikerar infektion eller kolonisering. Till exempel kan förändringar i det stereotypa granulerade utseendet hos tarmcellerna associeras med närvaron av en intracellulär parasitinfektion8. Specifikt är förlusten av tarmgranuler och minskad cytosolisk viskositet tecken på virusinfektion, medan omorganisationen av tarmgranuler i "spår" kan indikera infektion med mikrosporidier i släktet Nematocida 8,9. Eftersom det finns en mängd olika mikrober närvarande i vilda C. elegans-prover kan det vara svårt att skilja mellan mikrober genom DIC-mikroskopi. Information om den rumsliga fördelningen av mikrober inom värden kan också vara svår att upptäcka på grund av den lilla storleken på många mikrober15. Dessutom är det inte alltid möjligt att odla vissa mikrober av intresse in vitro, vilket leder till svårigheter att upptäcka och/eller kvantifiera.

RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) tillhandahåller en metod för att fluorescerande märka mikrober genom att använda fluorescerande sonder som binder till RNA för den lilla ribosomala subenheten (SSU) i fasta celler. Om analys av morfologiska egenskaper tyder på en viss klass av mikrob, kan FISH-sonder som riktar sig mot specifika eller breda klasser av sådana mikrober användas. Till exempel anses EUB338 vara en universell sond för bakteriell SSU och används ofta för att detektera ett brett spektrum av bakterier16. Protokollet som beskrivs här använder enkelsträngade DNA-sonder som är slutmärkta med en fluorofor och speciellt utformade för att komplettera mål-SSU för mikroben av intresse, även om det finns tidigare utformade sonder tillgängliga16. Den största fördelen med att rikta in sig på SSU av mikrober är det relativt stora överflödet av detta RNA, som vanligtvis omfattar 80% -90% av allt RNA i cellen, vilket leder till färgning med ett mycket högt signal-brusförhållande17. Sonder kan också utformas för att rikta in sig på RNA för att upptäcka virus, som Orsay-viruset 9,18, som ofta finns i mycket höga kopior i infekterade celler om viruset aktivt replikerar.

Beroende på resultaten med kända sonder kan det vara nödvändigt att erhålla ytterligare sekvensinformation för att utforma mer specifika sonder för artbekräftelse in situ. Ett vanligt tillvägagångssätt är att använda universella primers mot bevarade regioner i SSU (16S för bakterier och 18S för eukaryoter) för att förstärka (via PCR) regioner som är mer divergerande8. Med hjälp av denna sekvensinformation kan sonder med mer artspecificitet utformas. Dessa FISH-sonder kan sedan möjliggöra identifiering av mikrober på ett kulturoberoende sätt8. Dessutom kan RNA FISH ge insikt i unika morfologiska koloniserings- och infektionsegenskaper, inklusive filamentation eller vävnadslokaliseringsmönster19,20. Olika färgade FISH-sonder kan användas samtidigt, vilket möjliggör visuell skillnad mellan mikrober i vilda nematodprover, samt observation av mikrob-mikrobdynamik inuti en värd15,20. Dessutom kan RNA FISH-färgning tillämpas på värd-patogeninteraktionsstudier där infektion och kolonisering av en känd art enkelt kan kvantifieras manuellt eller genom automatiserade metoder för att ge insikter om patogenbelastning, till exempel vid jämförelse av C. elegans-mutanter som antingen har ökat eller minskat resistens mot infektion21.

Protocol

OBS: Nematoder kan fixeras med antingen paraformaldehydlösning (PFA) eller aceton. PFA möjliggör bättre visualisering av morfologi än aceton och kan bevara signaler från transgent grönt fluorescerande protein (GFP), som förstörs av aceton. Acetonfixering är emellertid nödvändig för att permeabilisera mikrosporidsporer för att möjliggöra märkning av detta livsstadium. Dessutom kan aceton vara bekvämare än PFA eftersom det är mindre giftigt, och prover kan förvaras i flera dagar i aceton i en frys på -20 °C utan att fixeringsmedlet behöver tas bort. Nedan finns två separata protokoll, med antingen PFA-lösning eller aceton som fixeringsmedel. En visualisering av protokollstegen finns i bild 1.

1. FISKFÄRGNING med PFA-fixering

  1. Förbered nematoder med tillhörande mikrober
    1. Odla nematoder med önskad mikrob av intresse på standard Nematode Growth Media (NGM) plattor sådda med lämplig matkälla. Inkubera nematoderna vid 20 °C tills önskat livsstadium har uppnåtts.
    2. Tillsätt 2 ml M9 minimala saltmedier (42 mM Na2 HPO 4,22mM KH2PO 4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH4 Cl) + 0,1% Tween 20 till NGM-plattor som innehåller Caenorhabditis-stammen infekterad eller koloniserad med önskad mikrob som ska visualiseras.
      OBS: Tillsatsen av tvättmedel är för att förhindra att nematoder fastnar på pipetter och mikrofugerör och för att hjälpa pellets L1-L2-stadium nematoder. 0,1% Triton-X kan användas i stället för Tween 20.
    3. Pipettera upp nematoderna från plattorna med en pasteurpipett och glödlampa i glas och överför dem till märkta 1,5 ml mikrofugerör.
      OBS: Glaspipetter föredras eftersom nematoder kan hålla fast vid plastpipetter, men tillsats av tvättmedel (Tween 20 eller Triton-X) kan minimera problemet.
    4. Snurra ner proverna som innehåller de koloniserade eller infekterade nematoderna med hjälp av en mikrocentrifug vid 2 000 x g i 60 s för L1-djur, eller 500 x g för 60 s för L4 eller vuxna djur. Alla efterföljande centrifugeringssteg kommer att utföras med den valda hastigheten.
    5. Ta bort supernatanten från mikrofugerören med en pipett. Undvik att störa nematodpelleten genom att försiktigt ta bort supernatanten ner till 100 μL ovanför pelleten. Detta kan uppskattas med hjälp av märkta 1,5 ml mikrofugerör.
  2. Tvätta nematoder för att eliminera yttre förorening
    1. Tillsätt 1 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mMKH2PO4) + 0,1% Tween 20 (PBS-T) till mikrofugerör.
    2. Snurra ned proverna i en mikrocentrifug med lämplig hastighet (se steg 1.1.4). Ta bort alla utom 100 μl av supernatanten med en pipett. Detta kan uppskattas med hjälp av märkta 1,5 ml mikrofugerör.
    3. Upprepa ovanstående två steg 2-3x.
      OBS: Tre totala tvättar är vanligtvis tillräckliga; Ytterligare tvättar kan dock utföras för att avlägsna eventuellt överskott av yttre föroreningar.
  3. Fixa nematoder med PFA
    1. Tillsätt 33 μl 16 % PFA i dragskåpet till mikrofugeröret som innehåller 100 μl supernatant ovanför nematodpelleten erhållen från steg 1.2.3 för en slutlig koncentration av 4% PFA.
      VARNING: PFA är cancerframkallande. Kontakt med PFA kan leda till hudsensibilisering och irritation och ögonskador. PFA släpper ut giftiga ångor som kan leda till andningsirritation eller sensibilisering. När du använder PFA, arbeta i en dragskåp med korrekt personlig skyddsutrustning och hänvisa till lämpliga säkerhetsdatablad före användning.
    2. Inkubera proverna som innehåller nematoderna koloniserade eller infekterade med mikroben av intresse i 30-45 min vid rumstemperatur. Efter inkubation förvarar du proverna i 70 % etanol vid 4 °C tills protokollet är klart att fortsätta.
      OBS: En kortare inkubationsperiod är bättre för att upprätthålla GFP-signalen i transgena stammar på grund av nedbrytningen av GFP av PFA över tid. Längre inkubationstider gör att fixeringsmedlet bättre kan permeabilisera in i proverna. Det är bäst att bestämma inkubationstiden empiriskt beroende på provet.
  4. Ta bort PFA-lösningen
    1. Snurra ned proverna i en mikrocentrifug med lämplig hastighet (se steg 1.1.4). Ta bort så mycket av supernatanten som möjligt med en pipett utan att störa pelleten.
      VARNING: Supernatanten innehåller PFA, som är giftigt. Kassera supernatanten och åtminstone de två första tvättarna som giftigt avfall i en dragskåp.
    2. Tillsätt 0,5 ml PBS-T till proverna i mikrofugerören.
    3. Följ och upprepa steg 1.4.1 och 1.4.2 2-3x med PBS-T.
      OBS: Att utföra fler tvättar hjälper till att minska bakgrundssignalen. Minst fyra tvättar totalt rekommenderas.
    4. Efter den sista tvätten, snurra ner proverna och ta bort supernatanten och lämna pelleten ostörd.
  5. Förbered hybridiseringsbuffert (HB) och tvätta nematoderna
    1. Förbered 1 ml HB (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,01% SDS) per prov.
      HB bör beredas färskt före varje användning för att undvika nederbörd. En allmän buffert (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) kan dock göras i förväg och förvaras vid rumstemperatur tills HB behövs. Före användning, förbered 1 ml per prov av den allmänna bufferten och tillsätt SDS till en slutlig koncentration av 0,01%.
    2. Tillsätt 800 μl HB till mikrofugerören som innehåller nematodpelleten. Pelletera proverna i mikrocentrifugen (se steg 1.1.4). Ta bort supernatanten utan att störa pelleten.
  6. Hybridisera FISH-sonden till önskad målsekvens
    1. Blanda 100 μl per prov av beredd HB med önskad FISH-sond till en slutlig koncentration av 5-10 ng/μl sond.
      OBS: FISH-sonder är 15-23 -mer oligos, antisense till SSU för mikroben av intresse, och märkta med en färgad fluorofor fäst vid 5 'eller 3' änden (se tabell 1 för sonder som används här). I allmänhet lagras bestånds-FISH-sonder vid 1 mg / ml.
    2. Tillsätt 100 μl HB-innehållande FISH-sond till varje prov. Blanda genom att försiktigt snärta eller invertera rören.
      OBS: Olikfärgade FISH-sonder kan tillsättas samtidigt för att visualisera flera fluorescerande signaler i samma prov (se figur 1B).
    3. Inkubera proverna över natten (6–24 timmar) i ett torrt bad vid 46–54 °C eller en termisk blandare vid 46–54 °C vid 1 200 rpm.
      OBS: Inkubation vid 46-48 °C används vanligtvis för hybridisering. Denna temperatur kan dock behöva justeras beroende på FISH-sondens smälttemperatur. I allmänhet är hybridiseringstemperaturen 4 °C under smälttemperaturen.
  7. Ta bort FISH-sonden och tvätta nematoder
    1. Förbered 3 ml tvättbuffert (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) per prov.
      OBS: WB bör beredas färskt före varje användning för att undvika nederbörd. En allmän buffert (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) kan dock göras i förväg och förvaras vid rumstemperatur tills tvättbufferten behövs. Bered före användning 3 ml per prov av den allmänna bufferten och tillsätt EDTA till en slutlig koncentration på 5 mM och SDS till en slutlig koncentration på 0,01 %.
    2. Centrifugera provexemplaren med lämplig hastighet (se steg 1.1.4). Ta bort HB med pipett, samtidigt som du är noga med att lämna nematodpelleten ostörd.
    3. Tillsätt 1 ml beredd WB till varje prov.
    4. Centrifugera provexemplaren med lämplig hastighet (se steg 1.1.4). Ta bort WB med en pipett, samtidigt som du är noga med att lämna pelleten ostörd.
    5. Tillsätt 1 ml beredd WB till varje prov.
    6. Inkubera proverna i 1 timme vid 48–56 °C i torrt bad (eller termisk blandare vid 48–56 °C vid 1200 rpm). Om du inkuberar i ett torrt bad, vänd försiktigt rören var 15-20 min.
      OBS: I allmänhet används 48 °C som standard tvätttemperatur; Denna temperatur kan dock behöva justeras om det finns hög bakgrundssignal. Tvätttemperaturen är ofta 2 °C högre än hybridiseringstemperaturen. Inkubationstiden i WB kan förkortas till 30 min för att ytterligare minska bakgrunden, varefter steg 1.7.4 och 1.7.5 bör upprepas. Detta ska följas av en (för bakterier) eller två (för mikrosporidier sporoplasmer) 30 minuters inkubationsperioder vid 48 °C.
    7. Centrifugera provexemplaren med lämplig hastighet (se steg 1.1.4). Ta bort tvättbufferten med en pipett samtidigt som du är noga med att lämna pelleten ostörd.
    8. Tillsätt 100–500 μl PBS-T till vart och ett av proverna. Vid denna tidpunkt kan proverna förvaras i PBS-T vid 4 °C i upp till en vecka tills protokollet är redo att fortsätta.
  8. Montera nematoderna
    1. Centrifugera provexemplaren med lämplig hastighet (se steg 1.1.4). Ta bort så mycket PBS-T som möjligt utan att störa nematodpelleten.
    2. (Valfritt) Tillsätt 20 μl antifade monteringsmedium med DAPI (Materialtabell) till proverna.
    3. Ladda en pipettor på 20 μl med en pipettspets på 200 μl och använd en sax för att skära av pipettens spets så att större nematoder kan pipetteras.
    4. Med den skurna pipettspetsen överför du 5-10 μL av pelleten till ett mikroskopglas. Täck med en 22 x 22 täckglas. För att förvara glaskronorna, försegla kanterna på täckglaset med nagellack och förvara dem i en mörk låda vid 4 °C tills de är klara för vidare användning.

2. FISKFÄRGNING med acetonfixering

  1. Bered nematoder med tillhörande mikrober enligt beskrivningen i steg 1.1.
  2. Tvätta nematoder för att eliminera yttre kontaminering enligt beskrivningen i steg 1.2.
  3. Fixa nematoder med aceton
    1. Ta bort supernatant utan att störa pelleten och tillsätt 1 ml aceton av laboratoriekvalitet till provet.
      VARNING: Aceton är en mycket brandfarlig vätska och ånga. Även om det kan köpas över disk som nagellackborttagare, är det viktigt att komma ihåg att aceton orsakar allvarlig ögonirritation och kan orsaka dåsighet eller yrsel.
    2. Inkubera proverna innehållande nematoder koloniserade eller infekterade med mikroben av intresse i 15 minuter vid rumstemperatur. Efter inkubation kan proverna förvaras i aceton vid -20 °C i upp till 2 veckor tills protokollet är klart att fortsätta.
      OBS: Använd inte detta protokoll med transgena C. elegans-stammar som uttrycker GFP (eller dess alleliska muterade former) om det är önskvärt att bibehålla fluorescensen, eftersom aceton förstör denna signal.
  4. Ta bort acetonen
    1. Snurra ned proverna i en mikrocentrifug med lämplig hastighet (se steg 1.1.4). Ta bort supernatanten med en pipett utan att störa pelleten.
      VARNING: Supernatanten innehåller aceton. Kassera supernatanten och åtminstone de två första tvättarna som giftigt avfall i en dragskåp.
    2. Tillsätt 0,5 ml PBS-T till proverna i mikrofugerören.
    3. Följ och upprepa steg 2.4.1 och 2.4.2 2-4x med PBS-T.
      OBS: Att utföra fler tvättar hjälper till att minska bakgrundssignalen. Det rekommenderas att utföra fyra tvättar totalt.
    4. Efter den sista tvätten, snurra ner proverna och ta bort supernatanten, så att pelleten är ostörd.
  5. Bered hybridiseringsbuffert (HB) och tvätta nematoderna enligt beskrivningen i steg 1.5.
  6. Hybridisera FISH-sonden till önskad målsekvens enligt beskrivningen i steg 1.6.
  7. Ta bort FISH-sonden och tvätta nematoder
    1. Bered 1,1 ml tvättbuffert (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) per prov.
      OBS: WB bör beredas färskt före varje användning för att undvika nederbörd. En allmän buffert (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) kan dock göras i förväg och förvaras vid rumstemperatur tills en tvättbuffert behövs. Före användning, bereda 1,1 ml per prov av den allmänna bufferten och tillsätt EDTA till en slutlig koncentration på 5 mM och SDS till en slutlig koncentration på 0,01%.
    2. Centrifugera proverna med lämplig hastighet (se 1.1.4). Ta bort HB med pipett, samtidigt som du är noga med att lämna nematodpelleten ostörd.
    3. Tillsätt 100 μl beredd WB till varje prov.
    4. Centrifugera proverna med lämplig hastighet (se 1.1.4). Ta bort WB med en pipett, samtidigt som du är noga med att lämna pelleten ostörd.
    5. Tillsätt 1 ml beredd WB till varje prov.
    6. Inkubera proverna i 1 timme vid 48–56 °C i torrt bad (eller termisk blandare vid 48–56 °C vid 1 200 rpm). Om du inkuberar i ett torrt bad, vänd försiktigt rören var 15-20 min.
      OBS: I allmänhet används 48 °C som standard tvätttemperatur; Denna temperatur kan dock behöva justeras om det finns hög bakgrundssignal. Tvätttemperaturen är ofta 2 °C högre än hybridiseringstemperaturen.
    7. Centrifugera provexemplaren med lämplig hastighet (se steg 1.1.4). Ta bort tvättbufferten med en pipett samtidigt som du är noga med att lämna pelleten ostörd.
    8. Tillsätt 100–500 μl PBS-T till vart och ett av proverna. Vid denna tidpunkt kan proverna förvaras i PBS-T vid 4 °C i upp till en vecka tills protokollet är redo att fortsätta.
  8. Montera nematoderna enligt beskrivningen i steg 1.8.

Representative Results

För att analysera mikrobiombakterier användes specifika och universella FISH-sonder till bakteriella 16S på vildisolerade djur. Vild Caenorhabditis tropicalis stam (JU1848) provtogs från Nouragues-skogen nära en liten flod i Franska Guyana från ruttnande palmfrukter22. Under mikroskopet differentiell interferenskontrast (DIC) visade sig denna nematodstam vara koloniserad med en bakterie som verkar hålla sig i riktning mot tarmepitelet (figur 2A). JU1848 rengjordes sedan selektivt för att eliminera andra mikrobiella föroreningar och berika för den önskade vidhäftande bakterien23. Med hjälp av den universella PCR-metoden identifierades bakterien som en ny art i klassen Alphaproteobacteria. En FISH-sond märkt med Cal Fluor Red 610 designades sedan specifikt för 16S rRNA-sekvensen av denna bakterie för att möjliggöra fluorescerande visualisering av kolonisering inom C. tropicalis (Figur 2B). En universell 16S rRNA FISH-sond som kan binda många bakteriearter (EUB338) märktes med 6-karboxifluorescin (FAM) och tillsattes också till detta prov. De gröna och röda fluorescerande signalerna överlappar helt, vilket tyder på att de flesta bakterier som koloniserar tarmarna är den vidhäftande Alphaproteobacteria-bakterien. Dessa djur fixerades i PFA före färgning.

För att analysera experimentell infektion i labbet med intracellulära patogener med känd identitet användes Orsay-virus och mikrosporidspecifika FISH-sonder på C. elegans med en vildtypsbakgrund. Orsay-viruset är ett positivt RNA-virus från familjen Nodaviridae och den enda naturliga viruspatogenen som finns i C. elegans. Orsayvirusets bipartita -genom består av RNA1- och RNA2 -segment, och FISH -sonder riktade mot båda dessa segment har utvecklats (figur 3A,B)9,18. I tarmen känns viralt RNA av RIG-I homolog DRH-124, vilket krävs för aktivering av det transkriptionella försvarsprogrammet som heter Intracellular Pathogen Response (IPR)25,26,27. Transkriptionen av antivirala IPR-gener styrs åtminstone delvis av ZIP-1-transkriptionsfaktorn21. Här ses uttrycket av ZIP-1::GFP lokaliserat i tarmkärnorna i celler som visar positiv Orsay-virus-FISH-färgning i cytoplasman (figur 3A)21. Flera djur färgade med Orsay-specifik FISH visas för att indikera styrkan hos denna signal för enkel kvantifiering (figur 3B). De djur som visas i figur 3A,B har fastställts i PFA.

Den mikrosporidiska parasiten som heter Nematocida parisii, vilket betyder nematoddödare från Paris, är en obligatorisk intracellulär patogen i tarmen. Flera FISH-sonder som märker 18S rRNA av N. parisii har använts, inklusive fluorescerande märkta MicroA- och MicroB-sonder. Flera djur färgade med MicroB FISH visas för att indikera styrkan hos denna signal för enkel kvantifiering (figur 3C). Dessutom är C. elegans infekterad av andra närbesläktade mikrosporidier. Saminfektion av N2 med N. parisii och den relaterade N. ausubeli kan särskiljas med hjälp av detta FISH-protokoll genom att utforma artspecifika FISH-sonder som konkurrerar mot varandra om bindning till en divergerande region på 18S rRNA (figur 3D)28. I det här exemplet har N. parisii FISH-sonden perfekt basparning till N. parisii 18S rRNA, men en 7 bp-matchning till N. ausubeli 18S rRNA. Det omvända gäller för N. ausubeli-sonden. Som sådan kommer varje artspecifik FISH-sond att konkurrera om bindning till den kognata arten 18S över de icke-kognata arterna. Dessutom möjliggör användningen av DAPI för att fläcka kärnor bättre lokalisering av infektionen i samband med hela djuret, särskilt för tarmen som har stora, lätt identifierbara kärnor. Figur 3C,D innehåller djur som har fastställts i PFA. Senare infektioner med N. parisii resulterar i utveckling av meronter till sporer. För att visualisera N. parisii-sporer måste djuren fixeras i aceton eftersom det tränger in i sporväggen bättre än PFA (figur 3E,F)8. Den resulterande FISH-färgningen visar de små och stora stavformade strukturerna, som sannolikt motsvarar N. parisii-sporer, som är färgade med N. parisii-specifika sonder i rött.

Figure 1
Figur 1: Visuell representation av FISH-protokollet. Skapad med Biorender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: FISKFÄRGNING av vild C. tropicalis JU1848-stam koloniserad med vidhäftande bakterier i tarmarna. (A) Nomarski-bild som visar tusentals tunna bacillibakterier (bac) som binder riktningsmässigt till tarmen (i) av JU1848, vilket skapar en hårliknande fenotyp i lumen (lu). Denna figurpanel är anpassad från Morgan, E. et al. (2021) 23. (B) FISK-färgning av JU1848, fixerad i PFA, med hjälp av en rödmärkt sond (b002_16S_A-CF610) utformad för att rikta in sig på 16S rRNA-sekvensen för den vidhäftande bakterien (överst) och en grönmärkt universell FISH-sond (EUB338-FAM) utformad för att rikta in sig på bakteriernas 16S (botten). DAPI-färgning av värdkärnor visas i blått. Se tabell 1 för sondsekvenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: FISH-färgning av C. elegans infekterade med intracellulära patogener. (A,B) FISK-färgning av C. elegans som uttrycker ZIP-1::GFP och infekterades med Orsay-viruset, som fixerades med PFA före färgning för att bevara GFP-signalen. Orsay 1 Red och Orsay 2 Red sonder användes för patogenfärgning. (A) Den sammansatta bilden består av sammanslagna röda och gröna fluorescerande kanaler. Nukleärt ZIP-1::GFP-uttryck induceras vid Orsay-virusinfektion och visas i grönt. Autofluorescens från tarmgranulerna visas i gult och indikeras med gula pilar. Prickade linjer skisserar nematodkroppen. Skalstreck = 25 μm. (B) Den sammansatta bilden består av sammanslagna röda fluorescerande och DIC-kanaler. Skalstreck = 200 μm. (C,D) FISK-färgning av vildtyp C. elegans infekterade med mikrosporidier som fixerades i PFA. C) FISKFÄRGNING av vilda C. elegans infekterade med N. parisii och fastställda i PFA. MicroB-CF610-sonden användes för patogenfärgning. Den sammansatta bilden består av sammanslagna röda fluorescerande och DIC-kanaler. Skalstreck = 100 μm. (D) FISK-färgning av vildtyp C. elegans saminfekterade med N. parisii och N. ausubeli i tarmen. De två patogenerna färgades tillsammans med hjälp av ett par specifika FISH-sonder som tävlar om bindning till samma region av 18S rRNA. N. parisii färgades med MicroF-CF610 (röd) och N. ausubeli färgades med MicroSp1A-FAM (grön). DAPI-färgning av värdkärnor ses i blått. Skalstreck = 25 μm. (E) FISK-färgning med acetonfixerade vildtyp C. elegans infekterade med N. parisii-sporer. MicroA-CF610 (röd) användes för färgning (röd). Skalstreck = 15 μm. (F) Nomarski-bild som visar N. parisii-sporer som ses i (E). Skalstreck = 15 μm. I (E) och (F) är de små och stora stavformade strukturerna märkta med små respektive stora pilar som motsvarar N. parisii-sporer. Se tabell 1 för sondsekvenser. Bilden som visas i (A) är anpassad från Lažetić, V. et al. (2022)21. Bilder som visas i (B) och (C) är anpassade från Reddy, K. C. et al. (2019) 26. Bilder som visas i (E) och (F) är anpassade från Troemel, E. R. et al. (2008)8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Sondens namn Specificitet för sond Sond fluorofor Sekvens för sond
EUB338-FAM Bakteriell 16S (universell) 5' 6-fluorescein (FAM) GCTGCCTCCCGTAGGAGT
b002_16S_A-CF610 Alfaproteobakterier 16S Cal Fluor Röd 610 (CF610) TGTACCGACCCTTAACGTTC
Orsay1 Röd Orsayvirus RNA1 Cal Fluor Röd 610 (CF610) GACATATGTGATGCCGAGAC
Orsay2 Röd Orsayvirus RNA2 Cal Fluor Röd 610 (CF610) GTAGTGTCATTGTAGGCAGC
MikroA-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Fluor Röd 610 (CF610) CTCTGTCCATCCTCGGCAA
MicroB-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Fluor Röd 610 (CF610) CTCTCGGCACTCCTTCCTG
MicroF-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Fluor Röd 610 (CF610) AGACAAATCAGTCCACGAATT
MicroSp1A-FAM Nematocida ausubeli 18S 5' 6-fluorescein (FAM) CAGGTCACCCCACGTGCT

Tabell 1: Förteckning över FISH-sondsekvenser. Alla FISH-sonder köptes kommersiellt med fluoroforen fäst vid 5'-änden (via anpassad oligonukleotidsyntes; se materialtabell) och oligonukleotiderna renades med omvänd fas HPLC.

Discussion

Vilda C. elegans är naturligt förknippade med en mängd olika mikrober. Forskare kan använda RNA FISH för att upptäcka och identifiera dessa mikrober samt få insikt i deras lokalisering i samband med ett helt djur. Mikrober med önskvärda eller intressanta fenotyper kan identifieras genom denna metod och sedan isoleras för ytterligare karakterisering och sekvensering. Överflödet av många bakterieisolat från vilda C. elegans kan också kvantifieras via RNA FISH29. Genom att använda protokollet som beskrivs här är det också möjligt att observera kända mikroorganismer inuti sina värdar och lära sig mer om deras interaktioner. Det är viktigt att Orsay-virus och mikrosporidier är obligatoriska parasiter och inte kan odlas oberoende av värden, så FISH är standardvisualiseringsverktyget. Kolonisering eller infektion kan också kvantifieras genom RNA FISH med hjälp av nematoder odlade på plattor sådda med en önskad odlingsbar bakterie av intresse. Förutom färgning av mikroorganismer i C. elegans tarm kan detta protokoll användas för andra nematodstammar som C. tropicalis eller Oscheius tipulae19,23.

Den största fördelen med FISH-protokollet är att det erbjuder en enkel, snabb och robust metod för att fläcka mikrober associerade med C. elegans. Bilder som produceras från FISH-färgning har ett högt signal-brusförhållande, vilket uppnås genom att använda FISH-sonder som riktar sig mot SSU: s rikliga RNA i provet. Eftersom det vanligtvis finns 30x eller högre nivåer av rRNA än rDNA, beror det mesta av signalen från FISH-färgning med sonder som riktar sig mot rRNA snarare än rDNA30. Dessutom gör RNA FISH det möjligt att se infektion eller kolonisering inom ramen för hela djuret. Denna visualisering underlättas genom samfärgning av värdkärnor med DAPI och / eller användning av fluorescerande märkta stammar av C. elegans för att bättre markera lokaliseringen av infektion eller kolonisering i provet. Till exempel användes mikrosporidspecifik FISH för att bestämma vävnadstropismen hos Nematocida displodere genom att använda en panel av C. elegans-stammar med GFP-uttryck i olika vävnader20. Dessutom är detta protokoll mottagligt för förändringar som gör det möjligt för forskare att bestämma de ideala förhållandena som är lämpliga för deras specifika behov (t.ex. justering av fixeringsperioden, ökning av hybridiseringstemperaturen).

Ett kritiskt steg i FISH-protokollet är att fixera proverna. Inkubationstiden efter tillsatsen av fixeringsmedlet är nödvändig för att ge medel tid att permeabilisera provet. Längre inkubationstider är inte idealiska för prover som innehåller transgena fluorescerande proteiner på grund av proteinnedbrytning av PFA över tid. För prover som innehåller GFP är det absolut nödvändigt att bestämma den optimala fixeringstiden för att möjliggöra permeabilisering, samtidigt som GFP-signalen bibehålls.

FISH kan användas för att färga för bakterier, virus eller mikrosporidier i C. elegans. Den bästa typen av fixeringsmedel som används för FISH beror dock på prov- och nedströmskraven. Detta protokoll presenterar en PFA-lösning som det primära fixeringsmedlet för att fläcka bakterier och virus. PFA är dock inte tillräckligt för visualisering av mikrosporidsporer eftersom det inte kan tränga igenom sporväggen. För visualisering av sporer bör aceton användas istället. Även om PFA-fixering är effektiv för FISH-märkning av andra livsstadier av mikrosporidier, inklusive sporoplasmer, meronter och sporonter. Andra stora skillnader ses mellan acetonfixering och PFA-fixering; Aceton är bekvämare eftersom prover snabbt kan förvaras i frysen efter tillsats utan att behöva tvättas. Aceton dödar dock snabbt all befintlig GFP i en transgen värd. PFA är det föredragna fixeringsmedlet om det är viktigt att bevara vissa fysiologiska strukturer i värden, eftersom acetonfixerade djur verkar vara mer försämrade, vilket gör det svårare att identifiera vissa vävnader. Eftersom proverna är fixerade tillåter detta FISH-protokoll inte levande avbildning av värd-mikrobinteraktioner in vivo. En pulsjaktinfektionstidskurs följt av FISH-färgning av prover vid olika tidpunkter kan dock göra det möjligt för en att se en viss dynamik av mikrobiell infektion 19,20,31.

Ett annat kritiskt steg i hela protokollet är noggrann tvättning av proverna före och efter hybridisering. Före hybridisering, när man samlar maskarna i mikrofugerören, kan överskott av bakterier eller andra mikrober från NGM-plattorna bäras med maskprovet. Tre tvättar med PBS-T är standard; emellertid kan fler tvättar vara nödvändiga för att tillräckligt eliminera externa mikroorganismer, särskilt vid användning av kraftigt förorenade, vildisolerade C. elegans. När du tittar på de monterade proverna efter FISH kan det finnas någon kvarvarande FISH-sond som producerar stora mängder signal i bakgrunden av provet. Tvätttemperaturen och antalet tvättar är viktiga för att ta bort överflödig och icke-specifikt bunden sond. För att minska bakgrundsfluorescensen är det möjligt att utföra två eller tre tvättar med 1 ml WB var 30: e minut, istället för en tvätt med 1 ml WB i en timme. Olika FISH-sonder kan kräva olika tvättemperaturer. Vanligtvis är tvätttemperaturen 2 °C över hybridiseringstemperaturen, men detta kan ökas om det finns för mycket bakgrundsfluorescens (högt brus).

FISH-protokollet använder fluorescerande sonder utformade för att rikta in sig på artspecifikt mikrobiellt RNA, men FISH-sonder kan utformas för andra transkript med hög kopia. Andra FISH-sonder kan ha olika smälttemperaturer, så inkubationssteg kan behöva utföras vid en högre eller lägre temperatur än beskrivet. FISH-färgning kan identifiera den rumsliga fördelningen av mikrobiell kolonisering eller infektion inom värden, vilket möjliggör karakterisering av värd-mikrob- och mikrob-mikrobinteraktioner. En begränsning är att endast ett fåtal konventionella fluoroforer kan användas samtidigt, vilket minskar antalet olika mikroorganismer som kan detekteras via FISH samtidigt. Detta begränsar dess användning för komplexa mikrobiomstudier i C. elegans. Flerfärgad rRNA-riktad FISH använder dock sonder märkta med icke-kanoniska fluoroforer som kan öka antalet distinkta mikrobiella gruppetiketter15. En annan begränsning är att det är svårt att skilja mellan närbesläktade arter, särskilt bakterier, som har SSU-sekvenser som är mycket lika. Den extrema sekvensdivergensen mellan mikrosporidiarter bidrar dock till att underlätta deras differentiering med detta protokoll (figur 3)32,33.

Sammantaget beskriver detta FISH-protokoll en teknik för att detektera mikroorganismer inom C. elegans. Det gör det möjligt för forskare att använda ett transparent och genetiskt lätthanterligt modellsystem för att upptäcka och kvantifiera kolonisering och infektion inom ramen för ett intakt djur, samt identifiera unikt mikrobiellt beteende eller morfologi inom värden. En förtryckt version av detta manuskript publicerades under granskning34.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Tack till Dr. Marie-Anne Félix för att du förser oss med vilda nematodstammar. Detta arbete stöddes av NSF under CAREER Grant 2143718 och California State University under ett CSUPERB New Investigator Award till RJL, NIH under R01 AG052622 och R01 GM114139 till ERT, och av ett American Heart Association Fellowship till VL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS Invitrogen AM9822
Acetone Fisher Scientific A-11-1
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) Vectalab NC9524612
EDTA Fisher Scientific S311-500
FISH probes (see Table 1) LGC Biosearch Technologies FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis
KCl Fisher Scientific P217
KH2PO4 Fisher Scientific P-286
Na2HPO4 Fisher Scientific S375-500
NaCl Fisher Scientific S-671
NH4Cl Fisher Scientific A-661
Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 50-980-487 CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately
Thermal mixer Eppendorf 5384000020
Tris base Fisher Scientific BP152
Triton X-100 Fisher Scientific BP-151
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  2. Balla, K. M., Troemel, E. R. Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection. Cellular Microbiology. 15 (8), 1313-1322 (2013).
  3. Dimov, I., Maduro, M. F. The C. elegans intestine: organogenesis, digestion, and physiology. Cell and Tissue Research. 377 (3), 383-396 (2019).
  4. Bossinger, O., Fukushige, T., Claeys, M., Borgonie, G., McGhee, J. D. The apical disposition of the Caenorhabditis elegans intestinal terminal web is maintained by LET-413. Developmental Biology. 268 (2), 448-456 (2004).
  5. Szumowski, S. C., Botts, M. R., Popovich, J. J., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. The small GTPase RAB-11 directs polarized exocytosis of the intracellular pathogen N. parisii for fecal-oral transmission from C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 8215-8220 (2014).
  6. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  7. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  8. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6 (12), 2736-2752 (2008).
  9. Felix, M. A., et al. Natural and experimental infection of Caenorhabditis nematodes by novel viruses related to nodaviruses. PLoS Biology. 9 (1), 1000586 (2011).
  10. Osman, G. A., et al. Natural infection of C. elegans by an oomycete reveals a new pathogen-specific immune response. Current Biology. 28 (4), 640-648 (2018).
  11. Zhang, G. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLOS Pathogens. 12 (12), 1006093 (2016).
  12. Clark, L. C., Hodgkin, J. Commensals, probiotics and pathogens in the Caenorhabditis elegans model. Cell Microbiology. 16 (1), 27-38 (2014).
  13. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Michael, L., Markus, S., Petra, P., Holger, D. A multicolor fluorescence in situ hybridization approach using an extended set of fluorophores to visualize microorganisms. Frontiers in Microbiology. 10, 1383 (2019).
  16. Fuchs, B. M., et al. Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Applied and Environmental Microbiology. 64 (12), 4973-4982 (1998).
  17. O'Neil, D., Glowatz, H., Schlumpberger, M. Ribosomal RNA depletion for efficient use of RNA-seq capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 4-19 (2013).
  18. Franz, C. J., et al. Santeuil and Le Blanc viruses primarily infect intestinal cells in Caenorhabditis nematodes. Virology. 448, 255-264 (2014).
  19. Tran, T. D., Ali, M. A., Lee, D., Luallen, R. J. Bacterial filamentation as a mechanism for cell-to-cell spread within an animal host. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  20. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLOS Pathogens. 12 (6), 1005724 (2016).
  21. Lažetić, V., et al. et al The transcription factor ZIP-1 promotes resistance to intracellular infection in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 13 (1), 1-16 (2022).
  22. Félix, M. -A., et al. Species richness, distribution and genetic diversity of Caenorhabditis nematodes in a remote tropical rainforest. BMC Evolutionary Biology. 13 (1), 10 (2013).
  23. Morgan, E., Longares, J. F., Félix, M. A., Luallen, R. J. Selective cleaning of wild Caenorhabditis nematodes to enrich for intestinal microbiome bacteria. Journal of Visualized Experiments. (174), e62937 (2021).
  24. Sowa, J. N., et al. The Caenorhabditis elegans RIGI homolog DRH-1 mediates the intracellular pathogen response upon viral infection. Journal of Virology. 94 (2), 01173 (2020).
  25. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLOS Pathogens. 10 (6), 1004200 (2014).
  26. Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLoS Pathogens. 15 (1), 1007528 (2019).
  27. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  28. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PloS One. 14 (4), 0216011 (2019).
  29. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
  30. Fu, R., Gong, J. Single cell analysis linking ribosomal (r)DNA and rRNA copy numbers to cell size and growth rate provides insights into molecular protistan ecology. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 64 (6), 885-896 (2017).
  31. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  32. Cuomo, C. A., et al. Microsporidian genome analysis reveals evolutionary strategies for obligate intracellular growth. Genome Research. 22 (12), 2478-2488 (2012).
  33. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8 (1), 14023 (2017).
  34. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 185
RNA-fluorescens <em>in situ</em> Hybridisering (FISH) för att visualisera mikrobiell kolonisering och infektion i <em>Caenorhabditis elegans</em> tarmar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rivera, D. E., Lažetić,… More

Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (185), e63980, doi:10.3791/63980 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter