Summary
El presente protocolo describe un método para extraer vesículas extracelulares de la sangre periférica y tejidos sólidos con el posterior perfil de antígenos de superficie y cargas de proteínas.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EV) circulantes y residentes en tejidos representan objetivos prometedores como nuevos biomarcadores teranósticos, y emergen como actores importantes en el mantenimiento de la homeostasis del organismo y la progresión de un amplio espectro de enfermedades. Si bien la investigación actual se centra en la caracterización de exosomas endógenos con origen endosomal, las microvesículas que brotan de la membrana plasmática han ganado cada vez más atención en la salud y la enfermedad, que se caracterizan por una gran cantidad de moléculas de superficie que recapitulan la firma de membrana de las células madre. Aquí, se presenta un procedimiento reproducible basado en la centrifugación diferencial para extraer y caracterizar EVs del plasma y tejidos sólidos, como el hueso. El protocolo describe además el perfil posterior de antígenos de superficie y cargas de proteínas de EV, que por lo tanto son trazables para sus derivaciones e identificados con componentes relacionados con la función potencial. Este método será útil para el análisis correlativo, funcional y mecanicista de EV en estudios biológicos, fisiológicos y patológicos.
Introduction
Se han propuesto vesículas extracelulares (EV) para definir estructuras extracelulares liberadas por la bicapa lipídica liberada por células1, que desempeñan un papel importante en diversos eventos fisiológicos y patológicos2. Los EV liberados por las células sanas se pueden dividir ampliamente en dos categorías principales, a saber, exosomas (o EV pequeños) formados a través de una vía de tráfico endocítico intracelular3 y microvesículas (o EV grandes) desarrolladas por la gemación externa de la membrana plasmática de la célula4. Mientras que muchos estudios se centran en la función de las EV recolectadas a partir de células cultivadas in vitro5, las EV derivadas de la circulación o los tejidos son más complejas y heterogéneas, lo que tiene la ventaja de reflejar el verdadero estado del organismo in vivo6. Además, casi todos los tipos de tejidos pueden producir EVs in vivo , y estos EVs pueden actuar como mensajeros dentro del tejido o ser transferidos por diversos fluidos corporales, especialmente la sangre periférica, para facilitar la comunicación sistémica7. Las EV en la circulación y los tejidos también son objetivos para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades8.
Mientras que los exosomas han sido intensamente estudiados en los últimos años, las microvesículas también tienen importantes funciones biológicas, que pueden ser fácilmente extraídas sin ultracentrifugación, promoviendo así la investigación básica y clínica9. En particular, una cuestión crítica con respecto a las EV aisladas de la circulación y los tejidos es que se derivan de diferentes tipos de células10. Dado que las microvesículas son expulsadas de la membrana plasmática y se caracterizan por una abundancia de moléculas de superficie celular9, es factible utilizar marcadores de membrana celular parental para identificar el origen celular de estas EV. Específicamente, la técnica de citometría de flujo (FC) se puede aplicar para detectar marcadores de membrana. Además, los investigadores pueden aislar los vehículos eléctricos y realizar análisis adicionales basados en las cargas funcionales.
El presente protocolo proporciona un procedimiento exhaustivo para extraer y caracterizar EV de muestras in vivo. Los EV se aíslan mediante centrifugación diferencial, y la caracterización de los EV incluye la identificación morfológica mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y microscopía electrónica de transmisión (TEM), análisis de origen a través de FC y análisis de carga de proteínas mediante western blot. El plasma sanguíneo y el hueso maxilar de los ratones se utilizan como representantes. Los investigadores pueden consultar este protocolo para vehículos eléctricos de otras fuentes y realizar las modificaciones correspondientes.
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Protocol
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Cuarta Universidad Médica Militar y las directrices de ARRIVE. Para el presente estudio, se utilizaron ratones C57Bl/6 de 8 semanas de edad (sin preferencia por hembras o machos). Los pasos involucrados en el aislamiento de EV de plasma y tejido se ilustran en la Figura 1. El plasma se toma como un representante para describir el procedimiento de aislamiento EV de los fluidos corporales. El hueso maxilar se toma como representante para explicar el procedimiento de aislamiento EV de los tejidos sólidos.
1. Preparación del plasma y de las muestras de hueso maxilar
- Prepare las muestras de plasma siguiendo los pasos a continuación.
- Determine el peso corporal del ratón utilizando una balanza de laboratorio estándar.
- Agregue 20 μL, 2 mg/ml de heparina a un tubo de centrífuga de 1.5 ml y use el dispositivo mezclador (consulte la Tabla de materiales) para permitir que la heparina se adhiera a la pared del tubo.
NOTA: Los tubos anticoagulantes también se pueden usar directamente para recolectar la sangre. - Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico (ver Tabla de Materiales). Agarre el cuello del ratón con el pulgar y el índice, luego fije la cola y la pata trasera izquierda con el dedo meñique e inyecte el pentobarbital sódico con una jeringa de inyección de 1 ml después de exponer el vientre.
- Confirme que el ratón está correctamente anestesiado en función de la ausencia de reflejo corneal y reacción de las extremidades cuando se pellizca la almohadilla del pie.
- Afeita el pelo de la cara y las pestañas de los ojos con unas tijeras curvas.
- Agarre la piel del cuello del ratón y presione la piel alrededor de los ojos hasta la parte posterior del cuello para que el globo ocular sobresalga. Use pinzas oftálmicas para sujetar rápidamente el globo ocular y recolectar la salida de sangre con los tubos centrífugos de 1,5 ml preparados en el paso 1.1.2. Sacrifica el ratón dislocando la vértebra cervical.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado con los pelos y las pestañas porque pueden causar hemólisis. - Gire suavemente el tubo boca abajo varias veces para evitar la coagulación de la sangre.
PRECAUCIÓN: Gire el tubo boca abajo tan pronto como sea posible. - Centrifugar la muestra de sangre durante 15 min a 1.200 x g a 4 °C.
- Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a tubos de centrífuga nuevos y limpios de 1,5 ml, y utilice la muestra de plasma inmediatamente o guárdela a 4 °C durante unas horas.
- Diluir el sobrenadante con un volumen igual de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y mezclar bien.
NOTA: El protocolo proporcionado anteriormente para recolectar el plasma es fatal. La sangre también se puede recolectar a través de la punción de la vena subclavia11 sin sacrificar al ratón.
- Prepare las muestras de hueso maxilar siguiendo los pasos a continuación.
- Aísle el hueso maxilar con pinzas oftálmicas y tijeras y lávelas con PBS para deshacerse de los tejidos blandos con pinzas.
- Coloque el hueso maxilar en tubos de centrífuga de 1,5 ml y corte el hueso en trozos pequeños (el tamaño debe ser inferior a 1 mm de diámetro) con tijeras. Añadir una cierta cantidad de Liberasa (5 μg/ml, ver Tabla de materiales) para cubrir el tejido (generalmente 1 ml para muestras de hueso de un ratón de 8 semanas de edad), y luego incubar durante 30 min a 37 °C.
- Centrifugar la muestra a 800 x g durante 10 min a 4 °C.
- Transfiera cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta a tubos centrífugos nuevos y limpios de 1,5 ml.
2. Extracción de vehículos eléctricos
- Centrifugar las muestras (preparadas en los pasos 1.1.10 y 1.2.4) durante 15 min a 2.500 x g (4 °C) para eliminar los restos de células grandes y las plaquetas restantes.
- Transfiera cuidadosamente los sobrenadantes a tubos de centrífuga nuevos y limpios de 1,5 ml y centrífugo durante 30 min a 16.800 x g (4 °C).
NOTA: La velocidad de centrifugación se puede ajustar a más de 10.000 x g para extraer EVs12. Cuanto mayor sea la velocidad de la centrífuga, más cantidad de vehículos eléctricos se pueden obtener. Debido a que el límite de velocidad de la centrífuga que utilizamos es de 16.800 x g (ver Tabla de materiales), elegimos esta velocidad en este protocolo. - Deseche el sobrenadante y resuspenda los gránulos en cada tubo con 1 mL de PBS. Centrifugadora durante 30 min a 16.800 x g (4 °C).
- Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets en cada tubo con 50 μL de PBS. Conservar estas muestras a 4 °C durante menos de 24 h, o utilizar preferiblemente inmediatamente para los siguientes análisis (pasos 3-5).
PRECAUCIÓN: El almacenamiento a -80 °C es inaceptable, ya que esto reducirá la concentración de vehículos eléctricos y aumentará el tamaño de las partículas de los vehículos eléctricos13, influyendo así en el siguiente análisis de los vehículos eléctricos.
3. Identificación morfológica de los VE
- Realizar análisis NTA.
- De acuerdo con la cantidad de EV (juzgada aproximadamente por el tamaño de los pellets, las partículas de plasma de 50 μL son el mínimo), transfiera 5-50 μL de resuspensión (paso 2.4), diluya en 10 ml de solución tampón (PBS filtrado con filtro de 0.22 μm) y mezcle con puntas de micropipeta de 1 ml suficientemente. Utilice esta suspensión final para la medición de partículas.
- Utilice una jeringa estéril de 1 ml para inyectar al menos 5 ml de agua destilada con una velocidad moderada y constante hasta que el número de partículas mostradas en la interfaz de detección sea inferior a cinco.
NOTA: Después de inyectar 1 ml de agua destilada a través de todo el canal, el número de partículas se muestra directamente en la interfaz de detección. Si el número sigue siendo superior a cinco, continúe inyectando 1 ml de agua destilada hasta que se cumplan los criterios. - Reconstituir 1 μL de solución de calibración en 1 ml de agua destilada para generar una solución primaria, y luego tomar 100 μL de la solución primaria a 25 ml de agua destilada para preparar una solución madre patrón (1:250.000). Conservar este reactivo de trabajo a 4 °C durante 1 semana.
- Calibre el instrumento NTA con la solución madre estándar (paso 3.1.3). Inyecte 1-5 ml de la solución de calibración de trabajo con una jeringa estéril de 1 ml para enjuagar el canal de la máquina hasta que el número de partículas que se muestran en la interfaz de detección esté entre 50-400 (preferiblemente alrededor de 300). Ejecute el programa de calibración.
- Repita el paso 3.1.2 para vaciar el canal de la máquina antes de cada medición de muestra.
- Utilice una jeringa estéril de 1 ml para inyectar al menos 2 ml de solución tampón para enjuagar el canal de la máquina a una velocidad constante hasta que el número de partículas que se muestran en la interfaz de detección sea inferior a 10.
- Inyectar 1 ml de la muestra EV preparada en el paso 3.1.1 con una velocidad moderada y constante (la velocidad recomendada es de 0,5-1 ml/s).
NOTA: La concentración óptima de partículas es hacer que el número de partículas que se muestran en la interfaz de detección oscile entre 50 y 400, preferiblemente alrededor de 300. Si el número de partículas es demasiado alto, repita el paso 3.1.2 para enjuagar inmediatamente el canal de la máquina para evitar la retención de partículas en la pared del canal y ajuste la concentración de la muestra EV con el paso 3.1.1, luego repita desde el paso 3.1.5. - Realice el análisis de partículas y genere los informes de análisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
- Si la muestra es preciosa, bombee la muestra EV con la jeringa de 1 ml y recójala en tubos de centrífuga de 1,5 ml. Repita el paso 2.2 para extraer los vehículos eléctricos.
- Después de detectar todas las muestras, inyecte al menos 2 ml de solución tampón en el canal de la máquina y luego inyecte al menos 5 ml de agua destilada hasta que el número de partículas que se muestran en la interfaz de detección sea inferior a cinco.
- Use una jeringa estéril de 5 ml para inyectar al menos 10 ml de aire a una velocidad constante (la velocidad recomendada es de 1 ml / s) para eliminar el agua en el canal.
- Realizar análisis TEM.
NOTA: Realice los siguientes pasos con nuevas resuspensiones de EV. La rejilla del microscopio electrónico recubierta de formvar-carbono tiene dos lados, con el lado de trabajo luminoso en las rejillas centrales. El volumen mínimo de plasma para extraer los EV para el siguiente procedimiento es de 50 μL.- Mezclar la muestra EV (paso 2.4) con un volumen igual de paraformaldehído (PFA) al 4%. Depositar 4 μL de los EV en una rejilla e incubar durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
- Ponga cuatro gotas de PBS (una gota es igual a 50 μL) en una lámina de película de polietileno (consulte la Tabla de materiales). Transfiera las rejillas con pinzas microscópicas limpias y lave el lado de trabajo de la rejilla en PBS de una gota a otra.
- Use papeles de filtro para eliminar PBS adicionales que permanecieron en las cuadrículas.
- Incubar el lado de trabajo de la rejilla en ácido fosfotúngstico al 1% (ver Tabla de materiales) durante 2 min y luego repetir el paso 3.2.2.
PRECAUCIÓN: Dado que el ácido fosfotúngstico es venenoso, este procedimiento debe operarse en la campana extractora, y el ácido fosfotúngstico redundante debe reciclarse específicamente en lugar de desecharse directamente. - Coloque las rejillas boca arriba en un plato de 10 cm cubierto con papeles de filtro. Las rejillas se pueden almacenar en RT durante varios años.
- Observe las rejillas bajo un microscopio electrónico siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Para garantizar que se observen las partículas individuales, se debe ajustar la concentración de los vehículos eléctricos y la suspensión debe ser clara sin turbidez obvia. Antes de caer, la muestra debe estar bien mezclada. Los análisis representativos de TEM y NTA se muestran en la Figura 2.
4. Análisis de origen de los vehículos eléctricos
NOTA: La identificación del origen celular de los EV requiere la aplicación de anticuerpos para los marcadores típicos de la membrana celular. El volumen plasmático mínimo para extraer los EV para el siguiente procedimiento es de 300 μL. Sobre la base de las estructuras de bicapa lipídica de los EV, se puede usar un colorante de membrana para marcarlas. Para muestras de plasma sanguíneo, se elige CD18 para linfocitos14 para la representación. Para muestras de hueso maxilar, se selecciona como ejemplo el receptor asociado a osteoclastos (OSCAR) para osteoclastos15 . Antes del FC, asegúrese de que el citómetro de flujo esté adaptado a la medición de EV16, ya que el límite de tamaño inferior es muy diferente entre los distintos citómetros de flujo.
- Resuspender muestras (paso 2.4) con 500 μL de PBS y transferir 50 μL a un tubo centrífugo nuevo y limpio de 1,5 ml como control en blanco (tubo A) y otros 50 μL a un tubo centrífugo nuevo y limpio de 1,5 ml como tubo de tinción simple para FITC (tubo B). Agregue 0,5 μL de colorante de membrana al tubo primario para la tinción de membrana. Incubar durante 5 min en RT.
- Centrifugar el tubo primario durante 30 min a 16.800 x g (4 °C). Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets con 200 μL de PBS.
- Divida cada muestra de 50 μL en cuatro tubos centrífugos de 1,5 ml para tubos de tinción simples para PE (tubo C), tinción de marcadores de superficie (tubo D) y controles secundarios de anticuerpos solamente (tubo E).
- Añadir el anticuerpo primario de OSCAR en muestras de EV ósea, así como el anticuerpo CD18 en muestras de EV plasmáticas (ver Tabla de materiales) al tubo B (paso 4.1) y al tubo D (paso 4.3) por separado (diluido a 1:100). Incubar durante 1 h a 4 °C.
- Centrifugar los tubos durante 30 min a 16.800 x g (4 °C). Desechar el sobrenadante, resuspender los gránulos con 500 μL de PBS y luego centrifugar de nuevo durante 30 min a 16.800 x g (4 °C) para eliminar los anticuerpos primarios adicionales.
- Desechar el sobrenadante y resuspender los gránulos con 50 μL de PBS, seguido de añadir anticuerpos secundarios conjugados con FITC (ver Tabla de materiales), respectivamente (diluidos a 1:200) (tubo E). Añadir los mismos anticuerpos secundarios al tubo B (paso 4.1) y al tubo D (paso 4.3). Incubar todos los tubos durante 1 h, a 4 °C en la oscuridad.
NOTA: Los anticuerpos de marcado conjugado con fluorescencia directa también se pueden usar para procesar la detección de FC con controles de isotipo adecuados. - Diluya una gota de suspensión de perlas de 0.2, 0.5 y 1 μm (consulte la Tabla de materiales) respectivamente en 1 ml de PBS, y ejecute primero cada cuenta de tamaño para asegurarse de la puerta elegida para los vehículos eléctricos. Establezca el umbral del citómetro de flujo para buscar las perlas y la población de EV utilizando una dispersión directa (FSC) y una dispersión lateral (SSC) adecuadas.
- Establezca la condición terminal como cálculo de 100.000 partículas teñidas por membrana. Analice la muestra a través de un citómetro de flujo siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Los resultados representativos se muestran en la Figura 3.
NOTA: El equipo NTA con canales de fluorescencia también se puede utilizar para el análisis de origen, y la preparación de la muestra es la misma que la FC.
- Establezca la condición terminal como cálculo de 100.000 partículas teñidas por membrana. Analice la muestra a través de un citómetro de flujo siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Los resultados representativos se muestran en la Figura 3.
5. Análisis del contenido proteico de los EV
NOTA: El análisis del contenido de proteína dentro de los EV se realiza a través de Western blot. Por ejemplo, los EV plasmáticos y óseos se seleccionaron para analizar la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (DGP) y la piruvato quinasa M2 (PKM2) para determinar el estado metabólico. Golgin84 (el orgánulo de Golgi) se utilizó como control negativo, y Flotillin (proteína de membrana), Caveolin (proteína integral de caveolas) y β-actina (el citoesqueleto)17 se utilizaron como control positivo en EVs en comparación con muestras celulares. La mitofilina y la α-actinina-4 fueron elegidas como marcadores EV grandes, mientras que CD9 y CD81 fueron elegidas como marcadores EV pequeños para demostrar las subpoblaciones de EV18. Apoa1 fue seleccionado como marcador de lipopartículas plasmáticas19. Para obtener los detalles del reactivo respectivo, consulte Tabla de materiales.
- Resuspender los gránulos (paso 2.4) en 50 μL de tampón de lisis RIPA e incubar durante 30 min en hielo.
- Cuantificar las concentraciones de proteínas de todas las muestras en la microplaca de 96 pocillos mediante el ensayo de proteína BCA siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).
- Diluir los 2 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) con 0,9% de solución salina normal (NS) (que contiene 0,9% (p/v) de cloruro de sodio) en 0,5 mg/ml. Agregue los 0.5 mg / ml de BSA y 0.9% de NS en tres pozos duplicados con ciertos volúmenes, como se muestra en la Tabla 1.
- Dejar caer 2 μL de las muestras (paso 5.1) y añadir 18 μL de NS en tres pocillos duplicados por separado.
- Prepare una solución de trabajo mezclando BCA Reactivo A con Reactivo B (50:1 Reactivo A:B). Añadir 200 μL de la solución de trabajo a cada pocillo y agitar suavemente durante 30 s.
- Incubar la microplaca de 96 pocillos durante 20-25 min a 37 °C.
- Mida el OD a 596 nm con el espectrofotómetro (consulte la Tabla de materiales).
- Exporte los datos.
- Dibuje una curva estándar y calcule la concentración de proteínas de las muestras.
- De acuerdo con los resultados, diluir las muestras a 1 μg/μL con 0,9% de NS y 5x SDS-PAGE buffer de carga (250 mM Tris· HCl, pH 6.8, 10% SDS, 30% (v/v) glicerol, 10 mM DTT, 0.05% (p/v) azul de bromofenol, ver Tabla de materiales). Sellar herméticamente los tubos con film y calentar durante 5 min a 100 °C.
- Cargue las muestras y la escalera de proteínas en una concentración de gradiente de 4% -20% de gel Hepes-Tris (ver Tabla de materiales).
NOTA: Elija el porcentaje de gel según el peso molecular de las proteínas de interés. - Ejecute el gel en el tampón de funcionamiento a 80 V hasta que las proteínas formen una línea, y luego cambie a 120 V durante 1 h hasta que el tinte de carga esté en la parte inferior del gel.
NOTA: El tiempo de funcionamiento puede variar según el equipo utilizado o el tipo y concentración del gel. - Transfiera el gel a la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (consulte la Tabla de materiales), preincubado en alcohol metílico durante 20 s. Utilice un sistema de transferencia húmeda para transferir durante 1 h a 200 mA.
PRECAUCIÓN: Asegúrese de que no haya burbujas dentro del sistema de transferencia y mantenga húmeda la membrana de PVDF.
NOTA: El tiempo de transferencia puede variar según el peso molecular de la proteína diana; 1 KD generalmente necesita 1 min. - Prepare el tampón de bloqueo de BSA al 5% agregando 2.5 g de BSA (ver Tabla de materiales) en 50 ml de Tween solución salina tamponada con Tris (TBST) (2 ml de Tween agregada en 2 L de solución de PBS) en un tubo de centrífuga de 50 ml. Agitar hasta que el polvo se disuelva. Bloquear las membranas en este tampón durante 2 h en RT con agitación.
- Incubar las membranas con anticuerpos primarios específicos diluidos con TBST en la concentración adecuada (Mitofilin, 1:1000; α-Actinina-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotillin-1, 1:1000; Caveolina-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-actina, 1:3000) durante la noche a 4 °C.
- Lave las membranas en el tampón de lavado (2 ml de Tween añadido en 2 L de solución de PBS) cuatro veces (15 min cada vez) e incube las membranas con los anticuerpos secundarios adecuados a 1:4000 durante 1 h en RT con agitación.
- Lave las membranas en el tampón de lavado cuatro veces (15 minutos cada vez) y obtenga una imagen de las membranas utilizando el kit de quimioluminiscencia y un sistema de imágenes en gel (consulte la Tabla de materiales).
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Representative Results
De acuerdo con el flujo de trabajo experimental, los EV se pueden extraer de la sangre periférica y los tejidos sólidos (Figura 1). El hueso maxilar de un ratón de 8 semanas es de aproximadamente 0,1 ± 0,05 g, y se pueden recolectar aproximadamente 300 μL de plasma del ratón. Siguiendo los pasos del protocolo, se pueden recolectar 0,3 mg y 3 μg de EV, respectivamente. Según lo analizado por TEM y NTA, las características morfológicas típicas de los EV son vesículas de membrana redondas en forma de copa con un diámetro que oscila entre 50-300 nm (Figura 2). FC puede detectar los EV marcados con colorante de membrana bajo controles útiles, y el análisis de FC muestra los porcentajes de marcadores de membrana específicos expresados en EV que implican su origen a partir de células parentales (Figura 3). El análisis Western blot muestra la expresión de DGP y PKM2, respectivamente, como representante del contenido proteico en EVs plasmáticas y EVs óseas, indicando el estado metabólico (Figura 4). La expresión negativa de Golgin84 en EV también se detecta con la presencia de mitofilina, α-actinina-4, flotillina-1, caveolina-1 y β-actina, que comúnmente se enriquece en EV grandes derivadas de la membrana plasmática (microvesículas). También se puede detectar el pequeño marcador EV CD9, mientras que la expresión de CD81 es baja o está ausente, con una falta de existencia de Apoa1 en los EV plasmáticos (Figura 4).
Figura 1: Ilustración del protocolo para extraer EVs . (A) Los pasos para extraer EVs de plasma sanguíneo periférico con centrifugación diferencial. (B) Los pasos para extraer EVs tisulares con centrifugación diferencial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Identificación morfológica de EVs . (A) Imagen representativa del microscopio electrónico de transmisión (TEM) que muestra la morfología de los EVs. Barra de escala = 200 nm. (B) Las imágenes representativas del análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y los resultados de cuantificación muestran la distribución del tamaño y el número de partículas de los EV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de origen de los vehículos eléctricos . (A) Los diferentes conjuntos de tubos con diferentes controles del experimento. (B) La distribución de cuentas de tamaño de 1 μm, 0.5 μm y 0.2 μm se mostró en el gráfico disperso. (C) Gráficos de densidad representativos que muestran PBS (tubo A), la tinción simple de EV (tubo B), la tinción simple de colorante de membrana (tubo C) y la tinción doble de las muestras de EV (tubo D). (D) Análisis citométrico de flujo del porcentaje de EV CD18 positivos en EV del plasma sanguíneo en rojo en comparación con el control secundario de anticuerpos solo en negro. (E) Análisis citométrico de flujo del porcentaje de EVs OSCAR positivos de muestras óseas en rojo en comparación con el control secundario de anticuerpos solo en negro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis del contenido proteico de EVs. (A) Imagen representativa de Western Blot de EV plasmática que muestra la presencia de 6-fosfogluconato deshidrogenasa (DGP) y mitofilina, α-actinina-4, CD9, Flotillin-1, caveolina-1 y β-actina en EV plasmáticas y la expresión negativa de CD81, Golgin84 y Apoa1. (B) Imágenes representativas de EV de Western Blot of bone que muestran la presencia de piruvato quinasa M2 (PKM2) y mitofilina, α-actinina-4, CD9, CD81, flotillina-1, caveolina-1 y β-actina en EVs óseos y la expresión negativa de Golgin84. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Número | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| BSA (μL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| NS (μL) | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
Tabla 1: Solución de trabajo estándar del ensayo BCA. Agregue los 0.5 mg / ml de BSA y 0.9% de NS en tres pocillos duplicados, como se muestra en la tabla.
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Discussion
Al estudiar las características, el destino y la función de los vehículos eléctricos, es crucial aislar los vehículos eléctricos con alto rendimiento y baja contaminación. Existen varios métodos para extraer EVs, como la centrifugación por gradiente de densidad (DGC), la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y los ensayos de inmunocaptura 4,20. Aquí, se utilizó uno de los métodos más utilizados, la centrifugación diferencial; las ventajas de esto son que no consume mucho tiempo, genera un alto rendimiento de EV con fácil aislamiento de muestras limitadas y la capacidad de modificar el método en función de la fuente de muestra utilizada. Para analizar la función de los EV circulantes, es mejor elegir el plasma sanguíneo, que puede reflejar mejor el estado real de los EV in vivo, en lugar del suero. Esto se debe a que muchas EV derivadas de plaquetas se liberarán durante el proceso de formación de coágulos para recolectar suero21, mientras que las plaquetas se eliminan por centrifugación antes del aislamiento de EV del plasma22. Cabe señalar que la elección de la anticoagulación para el aislamiento de EV en plasma sigue siendo controvertida. El mecanismo anticoagulante de la heparina está más estrechamente relacionado con la fisiología; por lo tanto, los vehículos eléctricos aislados podrían reflejar mejor el estado in vivo. Debe mencionarse que la heparina causará lecturas de PCR falsas negativas y bloqueará la captación de EV por las células23,24. Otros reactivos anticoagulantes, como el EDTA o el citrato de sodio, también tienen su escasez, incluida la biotoxicidad, que afecta las propiedades químicas del plasma y las plaquetas. Colectivamente, dada la información anterior, la heparina se selecciona en este estudio. Para eliminar las plaquetas, las muestras se centrifugaron a la velocidad de 2.500 x g antes de 16.800 x g, lo que puede eliminar algunos EV grandes. Además, teniendo en cuenta que muchos EV dentro del plasma viscoso se adherirán a las plaquetas y se eliminarán, se sugiere diluir el plasma con un volumen igual de PBS antes de eliminar las plaquetas a través de la centrifugación para mejorar el rendimiento de EV. Cabe destacar que es mejor usar un gradiente de sacarosa con ultracentrifugación para purificar los EV para eliminar las contaminaciones de proteínas solubles, como los polímeros de proteínas21.
Hasta la fecha, los métodos comunes para caracterizar los EV incluyen NTA, TEM, FC16 y Western blot, entre otros25. Además, debido a la alteración de la morfología y cantidad de EVs después de ser restaurados en diferentes condiciones13, sugerimos procesar la detección tan pronto como sea posible después de la extracción de los EVs. Además, Görgens et al. han recomendado el uso de PBS suplementado con albúmina humana y trehalosa (PBS-HAT) para una mejor conservación que el PBS puro26. La identificación morfológica de los EV a través de NTA y TEM debe realizarse inmediatamente después del procedimiento de extracción, de lo contrario la forma de los EV puede cambiar27. Además, Cryo-EM se puede utilizar28 para la observación morfológica avanzada de EV, lo que tiene los beneficios de preservar mejor la forma con una resolución más alta. Además de NTA, la concentración de partículas también puede ser cuantificada por FC con la ayuda de una cantidad conocida de perlas de conteo29, pero este método no es muy estable y la sensibilidad a partículas pequeñas es baja para FC. Además, debido a la detección de enjambres de partículas pequeñas con FC30, es mejor usar NTA para las determinaciones de tamaño. Del mismo modo, el origen de los EV también puede ser analizado por NTA con filtros de fluorescencia. En comparación con FC, NTA es más sensible a partículas más pequeñas y tiene la ventaja potencial de reciclar la muestra para otros experimentos. Una ventaja del uso de FC es que los subtipos específicos de EV pueden enriquecerse con anticuerpos de membrana conjugados con fluorocromo28. Además, la función de antígenos de superficie específicos puede ser estudiada a través de experimentos de pérdida de función, como el uso de anticuerpos neutralizantes28. Alternativamente, Triton X-100 al 1% puede usarse para destruir la balsa lipídica de la membrana de EVs, por lo tanto, como un control para detectar señales de membrana31. Además, los investigadores pueden utilizar las características específicas de la membrana para crear portadores de fármacos dirigidos32.
Western blot se utiliza ampliamente para analizar el contenido de proteínas en las EV. Varios marcadores como la mitofilina, la caveolina y la α-actinina-418 se han recomendado como candidatos para identificar EV grandes en estudios recientes; El CD9 está enriquecido en EV pequeños en lugar de en EV grandes, y CD81, CD63 y Syntenin-1 son ampliamente abundantes en EV pequeños18. En cuanto a los resultados del Western blot, marcadores como la mitofilina y CD9 son variables en diferentes condiciones animales. Se puede suponer que los EV aislados representan una población mixta, en la que los EV grandes son una subpoblación importante. Para verificar la pureza de los EV, se sugiere que la detección de orgánulos/proteínas nucleares, como Lamin B o Golgin84, se agregue como control negativo. En cuanto a los EV plasmáticos, según nuestros resultados, Apoa1 que representa las lipopartículas no está enriquecido en los EV recolectados. Una limitación de este método es que es difícil distinguir las proteínas en la superficie de las que están dentro de la vesícula. Por lo tanto, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se puede aplicar para el análisis de proteínas de membrana como experimentos complementarios. Además, con el desarrollo de la secuenciación de alto rendimiento, los investigadores pueden aprovechar el mapeo proteómico33 para analizar la composición proteica de las EV, y las proteínas objetivo también deben verificarse mediante Western blot.
En resumen, este estudio proporciona un protocolo factible para aislar y caracterizar las EV circulatorias y tisulares, incluido un análisis de sus fuentes celulares y contenidos de proteínas, lo que ayuda a establecer una base para futuros experimentos funcionales.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32000974, 81870796, 82170988 y 81930025) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2019M663986 y BX20190380). Estamos agradecidos por la asistencia del Centro Nacional de Demostración de Enseñanza Experimental para Medicina Básica (AMFU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
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