Summary
O presente protocolo descreve um método para extração de vesículas extracelulares do sangue periférico e tecidos sólidos com posterior perfilamento de antígenos de superfície e cargas proteicas.
Abstract
As vesículas extracelulares (EVs) circulantes e residentes nos tecidos representam alvos promissores como novos biomarcadores teranósticos, e emergem como importantes atores na manutenção da homeostase do organismo e na progressão de um amplo espectro de doenças. Enquanto a pesquisa atual se concentra na caracterização de exossomos endógenos com origem endossomal, microvesículas que sopram da membrana plasmática têm ganhado atenção crescente na saúde e na doença, que são caracterizadas por uma abundância de moléculas de superfície recapitulando a assinatura da membrana das células parentais. Aqui, um procedimento reprodutível é apresentado baseado na centrifugação diferencial para extrair e caracterizar EVs do plasma e tecidos sólidos, como o osso. O protocolo descreve ainda o perfil subsequente de antígenos de superfície e cargas proteicas de EVs, que são rastreáveis por suas derivações e identificados com componentes relacionados à função potencial. Este método será útil para análise correlacional, funcional e mecanística de EVs em estudos biológicos, fisiológicos e patológicos.
Introduction
Vesículas extracelulares (EVs) têm sido propostas para definir estruturas extracelulares liberadas de lipídios e fechadas por bicamadas1, que desempenham papéis importantes em vários eventos fisiológicos e patológicos2. Os EVs liberados por células saudáveis podem ser amplamente divididos em duas categorias principais, a saber, exossomos (ou pequenos EVs) formados através de uma via de tráfego endocítico intracelular3 e microvesículas (ou grandes EVs) desenvolvidas pelo brotamento externo da membrana plasmática da célula4. Enquanto muitos estudos enfocam a função dos EVs coletados de células cultivadas in vitro5, os EVs derivados da circulação ou tecidos são mais complexos e heterogêneos, o que tem a vantagem de refletir o verdadeiro estado do organismo in vivo6. Além disso, quase todos os tipos de tecidos podem produzir EVs in vivo, e esses EVs podem atuar como mensageiros dentro do tecido ou ser transferidos por vários fluidos corporais, especialmente o sangue periférico, para facilitar a comunicação sistêmica7. Os EVs na circulação e nos tecidos também são alvos para o diagnóstico e tratamento da doença8.
Enquanto os exossomos têm sido intensamente estudados nos últimos anos, as microvesículas também têm funções biológicas importantes, que podem ser facilmente extraídas sem ultracentrifugação, promovendo pesquisas básicas eclínicas9. Notadamente, uma questão crítica em relação aos EVs isolados da circulação e dos tecidos é que eles são derivados de diferentes tipos celulares10. Uma vez que as microvesículas são sopradas da membrana plasmática e caracterizadas por uma abundância de moléculas de superfície celular9, o uso de marcadores da membrana da célula de origem para identificar a origem celular desses EVs é viável. Especificamente, a técnica de citometria de fluxo (FC) pode ser aplicada para detectar marcadores de membrana. Além disso, os pesquisadores podem isolar os EVs e fazer análises adicionais com base nas cargas funcionais.
O presente protocolo fornece um procedimento minucioso para extração e caracterização de EVs de amostras in vivo. Os EVs são isolados via centrifugação diferencial, e a caracterização dos EVs inclui identificação morfológica via análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e microscopia eletrônica de transmissão (MET), análise de origem via FC e análise de carga proteica via western blot. O plasma sanguíneo e o osso maxilar de camundongos são usados como representantes. Os pesquisadores podem consultar este protocolo para EVs de outras fontes e fazer as modificações correspondentes.
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Protocol
Os experimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Quarta Universidade Médica Militar e as diretrizes do ARRIVE. Para o presente estudo, camundongos C57Bl/6 com 8 semanas de idade (sem preferência por fêmeas ou machos) foram utilizados. As etapas envolvidas no isolamento dos EVs plasmáticos e teciduais estão ilustradas na Figura 1. O plasma é tomado como um representante para descrever o procedimento de isolamento EV de fluidos corporais. O osso maxilar é tomado como um representante para explicar o procedimento de isolamento EV dos tecidos sólidos.
1. Preparo das amostras de plasma e osso maxilar
- Prepare as amostras de plasma seguindo os passos abaixo.
- Determine o peso corporal do rato utilizando uma balança de laboratório padrão.
- Adicionar 20 μL, 2 mg/mL de heparina a um tubo de centrífuga de 1,5 mL e usar o dispositivo misturador (ver Tabela de Materiais) para deixar a heparina se fixar à parede do tubo.
NOTA: Os tubos de anticoagulação também podem ser usados diretamente para coletar o sangue. - Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico (ver Tabela de Materiais). Agarre o pescoço do rato com o polegar e o indicador, depois fixe a cauda e a perna traseira esquerda com o dedo mínimo e injete o pentobarbital sódico com uma seringa de injeção de 1 ml depois de expor a barriga.
- Confirme se o rato está adequadamente anestesiado com base na ausência de reflexo corneano e reação dos membros quando o coxim plantar é comprimido.
- Faça a barba dos pelos do rosto e dos cílios dos olhos com uma tesoura curva.
- Pegue a pele do pescoço do rato e pressione a pele ao redor dos olhos para a parte de trás do pescoço para que o globo ocular se projete. Use uma pinça oftálmica para prender rapidamente o globo ocular e colete a saída de sangue com os tubos centrífugos de 1,5 mL preparados na etapa 1.1.2. Sacrifique o rato deslocando a vértebra cervical.
CUIDADO: Cuidado com os pelos e cílios, pois eles podem causar hemólise. - Vire suavemente o tubo de cabeça para baixo várias vezes para evitar a coagulação do sangue.
CUIDADO: Vire o tubo de cabeça para baixo o mais rápido possível. - Centrifugar a amostra de sangue durante 15 minutos a 1.200 x g a 4 °C.
- Transfira cuidadosamente o sobrenadante para tubos de centrífuga novos e limpos de 1,5 ml e utilize a amostra de plasma imediatamente ou armazene-a a 4 °C durante algumas horas.
- Diluir o sobrenadante com um volume igual de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e misturar bem.
NOTA: O protocolo fornecido acima para coletar o plasma é fatal. O sangue também pode ser coletado por punção da veia subclávia11 sem sacrifício do camundongo.
- Prepare as amostras de osso maxilar seguindo os passos abaixo.
- Isole o osso maxilar com pinça oftálmica e tesoura e lave-os com PBS para se livrar dos tecidos moles com pinça.
- Coloque o osso maxilar em tubos de centrífuga de 1,5 mL e corte o osso em pequenos pedaços (o tamanho deve ser inferior a 1 mm de diâmetro) com uma tesoura. Adicionar uma certa quantidade de Liberase (5 μg/ml, ver Tabela de Materiais) para cobrir o tecido (geralmente 1 ml para amostras ósseas de um rato com 8 semanas de idade) e, em seguida, incubar durante 30 minutos a 37 °C.
- Centrifugar a amostra a 800 x g durante 10 min a 4 °C.
- Transfira cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta para tubos de centrífuga novos e limpos de 1,5 mL.
2. Extração de EVs
- Centrifugar as amostras (preparadas nos passos 1.1.10 e 1.2.4) durante 15 minutos a 2.500 x g (4 °C) para remover os restos de grandes células e as plaquetas remanescentes.
- Transfira cuidadosamente os sobrenadantes para tubos de centrífuga novos e limpos de 1,5 ml e centrifuga durante 30 minutos a 16.800 x g (4 °C).
NOTA: A velocidade de centrifugação pode ser ajustada para mais de 10.000 x g para extrair EVs12. Quanto maior a velocidade da centrífuga, mais quantidade de EVs pode ser obtida. Como o limite de velocidade da centrífuga que utilizamos é de 16.800 x g (ver Tabela de Materiais), optamos por essa velocidade neste protocolo. - Descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets em cada tubo com 1 mL de PBS. Centrifugar durante 30 minutos a 16.800 x g (4 °C).
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets em cada tubo com 50 μL de PBS. Conservar estas amostras a 4 °C durante menos de 24 horas ou, de preferência, utilizar imediatamente para as seguintes análises (passos 3-5).
CUIDADO: O armazenamento a -80 °C é inaceitável, pois isso reduzirá a concentração de EVs e aumentará o tamanho das partículas de EVs13, influenciando assim a análise seguinte de EVs.
3. Identificação morfológica dos EVs
- Realizar análise NTA.
- De acordo com a quantidade de EVs (aproximadamente julgada pelo tamanho dos pellets, as partículas de 50 μL de plasma são o mínimo), transferir 5-50 μL de ressuspensão (passo 2.4), diluir em 10 mL de solução tampão (PBS filtrado com filtro de 0,22 μm) e misturar com 1 mL de micropipetadores suficientemente. Use esta suspensão final para medição de partículas.
- Use uma seringa estéril de 1 mL para injetar pelo menos 5 mL de água destilada com uma velocidade moderada e constante até que o número de partículas exibidas na interface de detecção seja inferior a cinco.
NOTA: Depois de injetar 1 mL de água destilada através de todo o canal, o número de partículas é mostrado diretamente na interface de detecção. Se o número ainda for superior a cinco, continuar injetando 1 mL de água destilada até que os critérios sejam atendidos. - Reconstituir 1 μL de solução de calibração em 1 mL de água destilada para gerar uma solução primária e, em seguida, tomar 100 μL da solução primária para 25 mL de água destilada para preparar uma solução-mãe padrão (1:250.000). Conservar este reagente de trabalho a 4 °C durante 1 semana.
- Calibrar o instrumento NTA com a solução-mãe padrão (passo 3.1.3). Injetar 1-5 mL da solução de calibração de trabalho com uma seringa estéril de 1 mL para lavar o canal da máquina até que o número de partículas exibidas na interface de detecção esteja entre 50-400 (de preferência em torno de 300). Execute o programa de calibração.
- Repita o passo 3.1.2 para limpar o canal da máquina antes de cada medição da amostra.
- Use uma seringa estéril de 1 mL para injetar pelo menos 2 mL de solução tampão para lavar o canal da máquina a uma velocidade constante até que o número de partículas exibidas na interface de detecção seja inferior a 10.
- Injectar 1 ml da amostra de EV preparada no passo 3.1.1 com uma velocidade moderada e constante (a velocidade recomendada é de 0,5-1 ml/s).
NOTA: A concentração ideal de partículas está fazendo com que o número de partículas exibidas na interface de detecção varie de 50 a 400, de preferência em torno de 300. Se o número de partículas for demasiado elevado, repetir o passo 3.1.2 para lavar imediatamente o canal da máquina para evitar a retenção de partículas na parede do canal e ajustar a concentração da amostra de EV com o passo 3.1.1 e, em seguida, repetir o passo 3.1.5. - Realizar a análise de partículas e gerar os relatórios de análise de acordo com as instruções do fabricante (consulte Tabela de Materiais).
- Se a amostra for preciosa, bombeie de volta a amostra de EV com a seringa de 1 mL e colete-a em tubos de centrífuga de 1,5 mL. Repita a etapa 2.2 para extrair os EVs.
- Depois de detectar todas as amostras, injetar pelo menos 2 mL de solução tampão no canal da máquina e, em seguida, injetar pelo menos 5 mL de água destilada até que o número de partículas exibidas na interface de detecção seja inferior a cinco.
- Use uma seringa estéril de 5 mL para injetar pelo menos 10 mL de ar a uma velocidade constante (a velocidade recomendada é de 1 mL/s) para remover a água no canal.
- Realizar análise de TEM.
Observação : execute as seguintes etapas com novas resuspensões EV. A grade do microscópio eletrônico revestido com formvar-carbono tem dois lados, com o lado de trabalho sendo luminoso nas grades centrais. O volume mínimo de plasma para extrair os EVs para o procedimento abaixo é de 50 μL.- Misturar a amostra de EV (passo 2.4) com um volume igual de paraformaldeído a 4% (PFA). Depositar 4 μL dos EVs em uma grade e incubar por 15 min à temperatura ambiente (TR).
- Coloque quatro gotas de PBS (uma gota é igual a 50 μL) em uma folha de filme de polietileno (ver Tabela de Materiais). Transfira as grades com pinças microscópicas limpas e lave o lado de trabalho da grade em PBS de uma gota para outra.
- Use papéis de filtro para remover PBS extras que permaneceram nas grades.
- Incubar o lado de trabalho da grelha em ácido fosfotúngstico a 1% (ver Tabela de Materiais) durante 2 minutos e, em seguida, repetir o passo 3.2.2.
CUIDADO: Como o ácido fosfotúngstico é venenoso, esse procedimento precisa ser operado no exaustor de fumaça, e o ácido fosfotúngstico redundante precisa ser especificamente reciclado em vez de descartado diretamente. - Coloque as grades viradas para cima em um prato de 10 cm coberto com papéis de filtro. As grades podem ser armazenadas em RT por vários anos.
- Observe as grades sob um microscópio eletrônico seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Para garantir que as partículas individuais sejam observadas, a concentração dos EVs deve ser ajustada e a suspensão precisa ser clara sem turbidez óbvia. Antes de cair, a amostra deve ser bem misturada. As análises representativas do ETM e NTA são mostradas na Figura 2.
4. Análise de origem dos EVs
NOTA: A identificação da origem celular dos EVs requer a aplicação de anticorpos para marcadores típicos da membrana celular. O volume plasmático mínimo para extrair os EVs para o procedimento abaixo é de 300 μL. Com base nas estruturas da bicamada lipídica dos EVs, o corante de membrana pode ser usado para marcá-los. Para amostras de plasma sanguíneo, o CD18 para linfócitos14 é escolhido para representação. Para amostras de osso maxilar, o receptor associado aos osteoclastos (OSCAR) para osteoclastos15 é selecionado como exemplo. Antes da CF, certifique-se de que o citômetro de fluxo esteja adaptado para a medição de EVs16, pois o limite inferior de tamanho é amplamente diferente entre citômetros de fluxo distintos.
- Ressuspender as amostras (passo 2.4) com 500 μL de PBS e transferir 50 μL para um tubo de centrífuga novo e limpo de 1,5 ml como controlo em branco (tubo A) e outros 50 μL para um tubo de centrifugação novo e limpo de 1,5 ml como um tubo de coloração simples para FITC (tubo B). Adicionar 0,5 μL de corante de membrana ao tubo primário para coloração da membrana. Incubar por 5 min no TR.
- Centrifugar o tubo primário durante 30 minutos a 16.800 x g (4 °C). Descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets com 200 μL de PBS.
- Divida cada amostra de 50 μL em quatro tubos de centrífuga de 1,5 mL para tubos de coloração simples para PE (tubo C), coloração de marcador de superfície (tubo D) e controles somente com anticorpos secundários (tubo E).
- Adicionar o anticorpo primário de OSCAR em amostras de EV ósseo, bem como o anticorpo CD18 em amostras de EV plasmático (ver Tabela de Materiais) ao tubo B (passo 4.1) e ao tubo D (passo 4.3) separadamente (diluído a 1:100). Incubar durante 1 h a 4 °C.
- Centrifugar os tubos durante 30 minutos a 16.800 x g (4 °C). Descarte o sobrenadante, ressuspenda os pellets com 500 μL de PBS e, em seguida, centrifugue novamente por 30 min a 16.800 x g (4 °C) para remover os anticorpos primários extras.
- Eliminar o sobrenadante e ressuspender os pellets com 50 μL de PBS, seguindo-se a adição de anticorpos secundários conjugados com FITC (ver Tabela de Materiais), respetivamente (diluídos a 1:200) (tubo E). Adicionar os mesmos anticorpos secundários ao tubo B (passo 4.1) e ao tubo D (passo 4.3). Incubar todos os tubos durante 1 h, a 4 °C no escuro.
NOTA: Os anticorpos de marcação conjugados por fluorescência direta também podem ser usados para processar a detecção de FC com controles de isotipo adequados. - Dilua uma gota de esferas de 0,2, 0,5 e 1 μm (ver Tabela de Materiais) respectivamente em 1 mL de PBS e execute primeiro as contas de cada tamanho para se certificar do portão escolhido para EVs. Defina o limiar do citômetro de fluxo para procurar as contas e a população de EV usando uma dispersão direta adequada (FSC) e uma dispersão lateral (SSC).
- Defina a condição terminal como calculando 100.000 partículas tingidas por membrana. Analise a amostra através de um citômetro de fluxo de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Os resultados representativos são apresentados na Figura 3.
NOTA: Equipamentos NTA com canais de fluorescência também podem ser usados para análise de origem, e a preparação da amostra é a mesma que FC.
- Defina a condição terminal como calculando 100.000 partículas tingidas por membrana. Analise a amostra através de um citômetro de fluxo de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Os resultados representativos são apresentados na Figura 3.
5. Análise do teor de proteínas de EVs
NOTA: A análise do teor de proteínas dentro dos EVs é realizada via western blot. Por exemplo, os EVs plasmáticos e ósseos foram selecionados para analisar a 6-fosfogluconato desidrogenase (PGD) e a piruvato quinase M2 (PKM2) quanto ao estado metabólico. Golgin84 (organela de Golgi) foi usado como controle negativo, e Flotillina (proteína de membrana), Caveolina (proteína integral das cavéolas) e β-actina (citoesqueleto)17 foram usadas como controle positivo em EVs em comparação com amostras celulares. Mitofilina e α-Actinina-4 foram escolhidas como grandes marcadores de EV, enquanto CD9 e CD81 foram escolhidos como pequenos marcadores de EV para demonstrar as subpopulações de EV18. A apoa1 foi selecionada como marcador de lipopartículas plasmáticas19. Para obter os respectivos detalhes do reagente, consulte Tabela de materiais.
- Ressuspender os pellets (passo 2.4) em 50 μL de tampão de lise RIPA e incubar durante 30 min sobre gelo.
- Quantificar as concentrações de proteínas de todas as amostras na microplaca de 96 poços através do ensaio de proteína BCA seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
- Diluir os 2 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) com 0,9% de solução salina normal (NS) (contendo 0,9% (p/v) de cloreto de sódio) em 0,5 mg/mL. Acrescentar 0,5 mg/mL de SC e 0,9% de SN em três poços duplicados com determinados volumes, como mostra a Tabela 1.
- Soltar 2 μL das amostras (passo 5.1) e adicionar 18 μL de SN em três poços duplicados separadamente.
- Prepare uma solução de trabalho misturando o Reagente A de BCA com o Reagente B (Reagente A:B 50:1). Adicionar 200 μL da solução de trabalho a cada poço e agitar suavemente durante 30 s.
- Incubar a microplaca de 96 poços durante 20-25 min a 37 °C.
- Medir o DO a 596 nm pelo espectrofotômetro (ver Tabela de Materiais).
- Exporte os dados.
- Desenhar uma curva padrão e calcular a concentração de proteína das amostras.
- De acordo com os resultados, diluir as amostras a 1 μg/μL com 0,9% de NS e tampão de carregamento SDS-PAGE 5x (Tris· 250 mM HCl, pH 6,8, 10% SDS, 30% (v/v) Glicerol, 10 mM TDT, 0,05% (p/v) Azul de bromofenol, ver Tabela de Materiais). Sele bem os tubos com filme e aqueça por 5 min a 100 °C.
- Coloque as amostras e a escada de proteína em uma concentração gradiente de 4%-20% de gel Hepes-Tris (ver Tabela de Materiais).
OBS: Escolha a porcentagem do gel de acordo com o peso molecular das proteínas de interesse. - Passe o gel no tampão de corrida a 80 V até que as proteínas formem uma linha e, em seguida, mude para 120 V por 1 h até que o corante de carga esteja na parte inferior do gel.
OBS: O tempo de execução pode variar de acordo com o equipamento utilizado ou com o tipo e concentração do gel. - Transfira o gel para a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (ver Tabela de Materiais), pré-incubada em álcool metílico por 20 s. Use um sistema de transferência úmida para transferir por 1 h a 200 mA.
CUIDADO: Certifique-se de que não haja nenhuma bolha dentro do sistema de transferência e mantenha a membrana PVDF molhada.
NOTA: O tempo de transferência pode variar de acordo com o peso molecular da proteína alvo; 1 KD geralmente precisa de 1 min. - Preparar tampão de bloqueio de BSA a 5% adicionando 2,5 g de BSA (ver Tabela de Materiais) em 50 mL de solução salina-Tween tamponada com Tris (TBST) (2 mL de Tween adicionados em 2 L de solução PBS) em um tubo de centrífuga de 50 mL. Agitar até dissolver o pó. Bloquear as membranas neste tampão por 2 h na RT com agitação.
- Incubar as membranas com anticorpos primários específicos diluídos com TBST em concentração adequada (Mitofilin, 1:1000; α-Actinina-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotina 1, 1:1000; Caveolina-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-actina, 1:3000) durante a noite a 4 °C.
- Lavar as membranas no tampão de lavagem (2 mL de Tween adicionados em 2 L de solução de PBS) quatro vezes (15 min cada vez) e incubar as membranas com os anticorpos secundários adequados a 1:4000 por 1 h na RT com agitação.
- Lave as membranas no tampão de lavagem quatro vezes (15 min cada vez) e obtenha imagens das membranas usando o Kit de quimioluminescência e um sistema de imagem em gel (consulte a Tabela de Materiais).
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Representative Results
De acordo com o fluxo de trabalho experimental, os VE podem ser extraídos do sangue periférico e dos tecidos sólidos (Figura 1). O osso maxilar de um camundongo com 8 semanas de idade é de aproximadamente 0,1 ± 0,05 g, e cerca de 300 μL de plasma podem ser coletados do camundongo. Seguindo as etapas do protocolo, 0,3 mg e 3 μg de VE podem ser coletados, respectivamente. Conforme analisado por MET e NTA, as características morfológicas típicas dos EVs são vesículas redondas de membrana em forma de taça com diâmetro variando de 50-300 nm (Figura 2). A FC pode detectar os EVs marcados com corante de membrana sob controles úteis, e a análise de FC mostra as porcentagens de marcadores de membrana específicos expressos em EVs que implicam sua origem a partir de células parentais (Figura 3). A análise de Western blot mostra a expressão de PGD e PKM2, respectivamente, como representativa do conteúdo proteico em EVs plasmáticos e ósseos, indicando o estado metabólico (Figura 4). A expressão negativa de Golgin84 em EVs também é detectada com a presença de Mitofilina, α-Actinina-4, Flotillina-1, Caveolina-1 e β-actina, que é comumente enriquecida em grandes EVs (microvesículas) derivadas da membrana plasmática. O pequeno marcador EV CD9 também pode ser detectado, enquanto a expressão de CD81 é baixa ou ausente, com ausência de existência de Apoa1 nas EVs plasmáticas (Figura 4).
Figura 1: Ilustração do protocolo de extração de EVs. (A) Os passos para extrair EVs de plasma de sangue periférico com centrifugação diferencial. (B) Os passos para extrair EVs teciduais com centrifugação diferencial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Identificação morfológica dos EVs. (A) Imagem representativa do microscópio eletrônico de transmissão (MET) mostrando a morfologia dos EVs. Barra de escala = 200 nm. (B) Imagens representativas de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e resultados de quantificação mostram a distribuição de tamanho e o número de partículas de EVs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise da origem dos EVs . (A) Os diferentes conjuntos de tubos com diferentes controles do experimento. (B) A distribuição das esferas de tamanho de 1 μm, 0,5 μm e 0,2 μm mostrada no gráfico disperso. (C) Gráficos de densidade representativa mostrando PBS (tubo A), coloração simples de EVs (tubo B), coloração simples de corante de membrana (tubo C) e dupla coloração de amostras de EV (tubo D). (D) Análise por citometria de fluxo da porcentagem de EVs CD18 positivos em EVs de plasma sanguíneo em vermelho em comparação com o controle de anticorpos secundários apenas em preto. (E) Análise por citometria de fluxo da porcentagem de EVs OSCAR positivos de amostras ósseas em vermelho em comparação com o controle de anticorpos secundários apenas em preto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise do conteúdo proteico de EVs. (A) Imagens representativas de Western blot de EV plasmáticas mostrando a presença de 6-fosfogluconato desidrogenase (PGD) e Mitofilina, α-Actinina-4, CD9, Flotin-1, Caveolina-1 e β-actina em EVs plasmáticos e a expressão negativa de CD81, Golgin84 e Apoa1. (B) Western blot representativo de imagens EV ósseas mostrando a presença de piruvato quinase M2 (PKM2) e mitofilina, α-Actinina-4, CD9, CD81, Flotin-1, Caveolina-1 e β-actina em EVs ósseos e a expressão negativa de Golgin84. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Número | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| BSA (μL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| NS (μL) | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
Tabela 1: Solução de trabalho padrão do ensaio de BCA. Adicionar 0,5 mg/mL de SC e 0,9% de SF em três poços duplicados, conforme mostrado na tabela.
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Discussion
Ao estudar as características, o destino e a função dos EVs, é crucial isolar EVs com alto rendimento e baixa contaminação. Existem vários métodos para extrair EVs, como centrifugação por gradiente de densidade (DGC), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e ensaios de imunocaptura 4,20. Aqui, um dos métodos mais comumente utilizados, a centrifugação diferencial, foi usado; as vantagens disso são que não é demorado, gera um alto rendimento de EVs com fácil isolamento de amostras limitadas, e a capacidade de modificar o método com base na fonte de amostra utilizada. Para analisar a função dos EVs circulantes, é melhor escolher o plasma sanguíneo, que pode refletir melhor o estado real dos EVs in vivo, em vez do soro. Isso ocorre porque muitos EVs derivados de plaquetas serão liberados durante o processo de formação de coágulos para coleta do soro21, enquanto as plaquetas são removidas por centrifugação antes do isolamento dos EVs do plasma22. Deve-se notar que a escolha da anticoagulação para o isolamento da EV plasmática ainda é controversa. O mecanismo anticoagulante da heparina está mais relacionado à fisiologia; os EVs isolados, portanto, podem ser mais reflexos do status in vivo. Deve-se mencionar que a heparina causará leituras de PCR falso-negativas e bloqueará a captação da EV pelas células23,24. Outros reagentes anticoagulantes, como EDTA ou citrato de sódio, também têm sua escassez, incluindo a biotoxicidade, afetando as propriedades químicas do plasma e das plaquetas. Coletivamente, diante das informações acima, a heparina é selecionada neste estudo. Para a retirada das plaquetas, as amostras foram centrifugadas na velocidade de 2.500 x g antes de 16.800 x g, o que pode remover alguns EVs grandes. Além disso, considerando que muitos EVs dentro do plasma viscoso se fixarão às plaquetas e serão removidos, sugere-se diluir o plasma com um volume igual de PBS antes de remover as plaquetas por centrifugação para melhorar o rendimento dos EVs. É importante ressaltar que é melhor usar um gradiente de sacarose com ultracentrifugação para purificar os EVs para remover as contaminações de proteínas solúveis, como polímeros proteicos21.
Até o momento, os métodos comuns de caracterização de EVs incluem NTA, TEM, FC16 e western blot, entre outros25. Além disso, devido à alteração da morfologia e quantidade de VE após serem restaurados em diferentes condições13, sugerimos processar a detecção o mais rápido possível após a extração dos EVs. Além disso, Görgens e col. recomendaram o uso de PBS suplementado com albumina e trealose humana (PBS-HAT) para melhor preservação do que PBS puro26. A identificação morfológica dos EVs via NTA e MET deve ser realizada imediatamente após o procedimento de extração, caso contrário a forma dos EVs pode mudar27. Além disso, o Cryo-EM pode ser utilizado28 para observação morfológica avançada de EVs, o que tem os benefícios de preservar melhor a forma com maior resolução. Além do NTA, a concentração de partículas também pode ser quantificada por CF com o auxílio de uma quantidade conhecida de esferas de contagem29, mas esse método não é muito estável, e a sensibilidade a partículas pequenas é baixa para FC. Além disso, devido à detecção por enxame de partículas pequenas com FC30, é melhor usar NTA para determinações de tamanho. Da mesma forma, a origem dos EVs também pode ser analisada por NTA com filtros de fluorescência. Comparado com FC, o NTA é mais sensível a partículas menores e tem a vantagem potencial de reciclar a amostra para outros experimentos. Uma vantagem do uso da CF é que os subtipos específicos de EVs podem ser enriquecidos com anticorpos de membrana conjugados com fluorocromo28. Além disso, a função de antígenos de superfície específicos pode ser estudada por meio de experimentos de perda de função, como o uso de anticorpos neutralizantes28. Alternativamente, o Triton X-100 a 1% pode ser usado para destruir a jangada lipídica da membrana dos EVs, como um controle para detectar sinais de membrana31. Além disso, os pesquisadores podem usar as características específicas da membrana para criar carreadores de drogas alvo32.
Western blot é amplamente utilizado para analisar o conteúdo de proteínas em EVs. Vários marcadores como mitofilina, caveolina e α-Actinina-418 têm sido recomendados como candidatos para identificar grandes EVs em estudos recentes; CD9 é enriquecido em pequenos EVs em vez de em grandes EVs, e CD81, CD63 e Sintenina-1 são extensivamente abundantes em pequenos EVs18. Quanto aos resultados do Western blot, marcadores como Mitofilin e CD9 são variáveis em diferentes condições animais. Pode-se supor que os EVs isolados representem uma população mista, na qual os grandes EVs são uma das principais subpopulações. Para verificar a pureza dos EVs, sugere-se que a detecção de organelas/proteínas nucleares, como Lamin B ou Golgin84, seja adicionada como controle negativo. Quanto aos EVs plasmáticos, de acordo com nossos resultados, a Apoa1 representando lipopartículas não é enriquecida nos EVs coletados. Uma limitação deste método é que é difícil distinguir as proteínas na superfície daquelas dentro da vesícula. Portanto, o ensaio imunoenzimático (ELISA) pode ser aplicado para análise de proteínas de membrana como experimentos complementares. Além disso, com o desenvolvimento do sequenciamento de alto rendimento, os pesquisadores podem aproveitar o mapeamento proteômico33 para analisar a composição proteica de EVs, com as proteínas-alvo também precisando ser verificadas por western blot.
Em resumo, este estudo fornece um protocolo viável para isolar e caracterizar EVs circulatórios e teciduais, incluindo uma análise de suas fontes celulares e conteúdo proteico, o que ajuda a estabelecer uma base para futuros experimentos funcionais.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32000974, 81870796, 82170988 e 81930025) e da Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2019M663986 e BX20190380). Somos gratos pela assistência do National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
References
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