Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode om extracellulaire blaasjes uit het perifere bloed en vaste weefsels te extraheren met daaropvolgende profilering van oppervlakteantigenen en eiwitladingen.
Abstract
Circulerende en weefsel-residente extracellulaire blaasjes (EV's) vertegenwoordigen veelbelovende doelen als nieuwe theranostische biomarkers, en ze komen naar voren als belangrijke spelers in het onderhoud van organismale homeostase en de progressie van een breed spectrum van ziekten. Terwijl het huidige onderzoek zich richt op de karakterisering van endogene exosomen met de endosomale oorsprong, hebben microvesicles die uit het plasmamembraan blossen steeds meer aandacht gekregen in gezondheid en ziekte, die worden gekenmerkt door een overvloed aan oppervlaktemoleculen die de membraansignatuur van oudercellen samenvatten. Hier wordt een reproduceerbare procedure gepresenteerd op basis van differentiële centrifugatie voor het extraheren en karakteriseren van EV's uit het plasma en vaste weefsels, zoals het bot. Het protocol beschrijft verder de daaropvolgende profilering van oppervlakteantigenen en eiwitladingen van EV's, die dus traceerbaar zijn voor hun afleidingen en geïdentificeerd met componenten die verband houden met de potentiële functie. Deze methode zal nuttig zijn voor correlatieve, functionele en mechanistische analyse van EV's in biologische, fysiologische en pathologische studies.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn voorgesteld om cel-vrijgegeven lipide bilayer-omsloten extracellulaire structuren1 te definiëren, die een belangrijke rol spelen bij verschillende fysiologische en pathologische gebeurtenissen2. EV's die door gezonde cellen worden vrijgegeven, kunnen grofweg worden onderverdeeld in twee hoofdcategorieën, namelijk exosomen (of kleine EV's) gevormd door een intracellulaire endocytische handelsroute3 en microvesicles (of grote EV's) ontwikkeld door de uitwendige ontluiking van het plasmamembraan van de cel4. Hoewel veel studies zich richten op de functie van EV's verzameld uit gekweekte cellen in vitro5, zijn EV's afgeleid van de circulatie of weefsels complexer en heterogener, die het voordeel hebben dat ze de ware toestand van het organisme in vivoweerspiegelen 6. Bovendien kunnen bijna alle soorten weefsels EV's in vivo produceren, en deze EV's kunnen fungeren als boodschappers in het weefsel of worden overgedragen door verschillende lichaamsvloeistoffen, vooral het perifere bloed, om systemische communicatie te vergemakkelijken7. EV's in de bloedsomloop en weefsels zijn ook doelwitten voor ziektediagnose en -behandeling8.
Terwijl exosomen de afgelopen jaren intensief zijn bestudeerd, hebben microvesicles ook belangrijke biologische functies, die gemakkelijk kunnen worden geëxtraheerd zonder ultracentrifugatie, waardoor fundamenteel en klinisch onderzoek wordt bevorderd9. Met name een kritiek probleem met betrekking tot EV's geïsoleerd uit de bloedsomloop en weefsels is dat ze zijn afgeleid van verschillende celtypen10. Aangezien microvesicles uit het plasmamembraan worden gespoeld en worden gekenmerkt door een overvloed aan celoppervlakmoleculen9, is het gebruik van oudercelmembraanmarkers om de cellulaire oorsprong van deze EV's te identificeren haalbaar. Concreet kan de flowcytometrie (FC) techniek worden toegepast om membraanmarkers te detecteren. Bovendien kunnen onderzoekers de EV's isoleren en verdere analyses maken op basis van de functionele ladingen.
Het huidige protocol voorziet in een grondige procedure voor het extraheren en karakteriseren van EV's uit in vivo monsters. De EV's worden geïsoleerd via differentiële centrifugatie en de karakterisering van EV's omvat morfologische identificatie via nanodeeltjesvolganalyse (NTA) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), oorsprongsanalyse via FC en eiwitladinganalyse via western blot. Het bloedplasma en het maxillaire bot van muizen worden gebruikt als vertegenwoordigers. Onderzoekers kunnen dit protocol raadplegen voor EV's uit andere bronnen en overeenkomstige wijzigingen aanbrengen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Guidelines of Institutional Animal Care and Use Committee van de Fourth Military Medical University en de ARRIVE-richtlijnen. Voor de huidige studie werden 8 weken oude C57Bl/6-muizen (geen voorkeur voor vrouwtjes of mannetjes) gebruikt. De stappen die betrokken zijn bij het isoleren van plasma- en weefsel-EV's worden geïllustreerd in figuur 1. Het plasma wordt als een vertegenwoordiger genomen om de EV-isolatieprocedure van lichaamsvloeistoffen te beschrijven. Het maxillaire bot wordt als een vertegenwoordiger genomen om de EV-isolatieprocedure van de vaste weefsels uit te leggen.
1. Bereiding van het plasma en de maxillaire botmonsters
- Bereid de plasmamonsters voor volgens de onderstaande stappen.
- Bepaal het lichaamsgewicht van de muis met behulp van een standaard laboratoriumbalans.
- Voeg 20 μL, 2 mg/ml heparine toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml en gebruik het mixerapparaat (zie materiaaltabel) om de heparine aan de wand van de buis te laten hechten.
OPMERKING: Antistollingsbuizen kunnen ook direct worden gebruikt om het bloed te verzamelen. - Verdoof de muis door intraperitoneale injectie van 50 mg/kg pentobarbitalnatrium (zie tabel met materialen). Pak de nek van de muis met de duim en wijsvinger, bevestig vervolgens de staart en de linkerachterpoot met de pink en injecteer het pentobarbital-natrium met een injectiespuit van 1 ml na het blootleggen van de buik.
- Controleer of de muis goed is verdoofd op basis van de afwezigheid van hoornvliesreflex en ledemaatreactie wanneer de voetzool wordt geknepen.
- Scheer het haar op het gezicht en de wimpers van de ogen met een gebogen schaar.
- Pak de nekhuid van de muis en druk de huid rond de ogen tegen de achterkant van de nek zodat de oogbol uitsteekt. Gebruik een oogheelkundig pincet om de oogbol snel vast te klemmen en vang de uitstroom van bloed op met de 1,5 ml centrifugebuizen die in stap 1.1.2 zijn voorbereid. Offer de muis op door de halswervel te ontwrichten.
LET OP: Wees voorzichtig met de haren en wimpers omdat ze hemolyse kunnen veroorzaken. - Draai de buis een paar keer voorzichtig ondersteboven om bloedstolling te voorkomen.
LET OP: Draai de buis zo snel mogelijk ondersteboven. - Centrifugeer het bloedmonster gedurende 15 minuten bij 1.200 x g bij 4 °C.
- Breng het supernatant voorzichtig over in nieuwe en schone centrifugebuizen van 1,5 ml en gebruik het plasmamonster onmiddellijk of bewaar het gedurende enkele uren bij 4 °C.
- Verdun het supernatant met een gelijk volume van 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en meng goed.
OPMERKING: Het bovenstaande protocol om het plasma te verzamelen is fataal. Het bloed kan ook worden verzameld door middel van subclavia aderpunctie11 zonder de muis op te offeren.
- Bereid de maxillaire botmonsters voor volgens de onderstaande stappen.
- Isoleer het maxillaire bot met een oogheelkundig pincet en een schaar en was ze met PBS om zachte weefsels met een pincet te verwijderen.
- Doe het maxillaire bot in centrifugebuizen van 1,5 ml en snijd het bot in kleine stukjes (de grootte moet minder dan 1 mm in diameter zijn) met een schaar. Voeg een bepaalde hoeveelheid Liberase (5 μg/ml, zie materiaaltabel) toe om het weefsel te bedekken (meestal 1 ml voor botmonsters van een muis van 8 weken oud) en incubeer vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 800 x g .
- Breng het supernatant voorzichtig over met een pipet naar nieuwe en schone centrifugebuizen van 1,5 ml.
2. Extractie van EV's
- Centrifugeer de monsters (bereid in stap 1.1.10 en stap 1.2.4) gedurende 15 minuten bij 2.500 x g (4 °C) om grote celresten en resterende bloedplaatjes te verwijderen.
- Breng de supernatanten voorzichtig over in nieuwe en schone centrifugebuizen van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 16.800 x g (4 °C).
OPMERKING: De centrifugatiesnelheid kan worden ingesteld op meer dan 10.000 x g om EV's12 te extraheren. Hoe hoger de snelheid van de centrifuge, hoe meer EV's er kunnen worden verkregen. Omdat de snelheidslimiet van de centrifuge die we gebruikten 16.800 x g is (zie materiaaltabel), hebben we deze snelheid in dit protocol gekozen. - Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellets in elke buis met 1 ml PBS. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 16.800 x g (4 °C).
- Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellets in elke buis met 50 μL PBS. Bewaar deze monsters bij 4 °C gedurende minder dan 24 uur of gebruik deze bij voorkeur onmiddellijk voor de volgende analyses (stappen 3-5).
LET OP: Opslag bij -80 °C is onaanvaardbaar, omdat dit de concentratie van EV's zal verminderen en de deeltjesgrootte van EV's13 zal vergroten, waardoor de volgende analyse van EV's wordt beïnvloed.
3. Morfologische identificatie van EV's
- Voer NTA-analyse uit.
- Afhankelijk van de hoeveelheid EV's (ruwweg beoordeeld op basis van de grootte van pellets, zijn de deeltjes van 50 μL plasma het minimum), breng 5-50 μL resuspensie over (stap 2.4), verdun in 10 ml bufferoplossing (PBS gefilterd met 0,22 μm filter) en meng voldoende met 1 ml micro pipettortips. Gebruik deze laatste suspensie voor deeltjesmeting.
- Gebruik een steriele spuit van 1 ml om ten minste 5 ml gedestilleerd water met een matige en constante snelheid te injecteren totdat het aantal deeltjes dat op de detectie-interface wordt weergegeven minder dan vijf is.
OPMERKING: Na het injecteren van 1 ml gedestilleerd water door het hele kanaal, wordt het aantal deeltjes direct weergegeven op de detectie-interface. Als het aantal nog steeds meer dan vijf is, blijft u 1 ml gedestilleerd water injecteren totdat aan de criteria is voldaan. - Reconstitueer 1 μl ijkoplossing in 1 ml gedestilleerd water om een primaire oplossing te genereren en neem vervolgens 100 μl van de primaire oplossing tot 25 ml gedestilleerd water om een standaardstamoplossing (1:250.000) te bereiden. Bewaar dit werkende reagens bij 4 °C gedurende 1 week.
- Kalibreer het NTA-instrument met de standaardvoorraadoplossing (stap 3.1.3). Injecteer 1-5 ml van de werkende kalibratieoplossing met een steriele spuit van 1 ml om het machinekanaal te spoelen totdat het aantal deeltjes dat op de detectie-interface wordt weergegeven tussen 50-400 ligt (bij voorkeur ongeveer 300). Voer het kalibratieprogramma uit.
- Herhaal stap 3.1.2 om het machinekanaal vóór elke monstermeting te spoelen.
- Gebruik een steriele spuit van 1 ml om ten minste 2 ml bufferoplossing te injecteren om het machinekanaal met een constante snelheid te spoelen totdat het aantal deeltjes dat op de detectie-interface wordt weergegeven minder dan 10 is.
- Injecteer 1 ml van het in stap 3.1.1 bereide EV-monster met een matige en constante snelheid (de aanbevolen snelheid is 0,5-1 ml/s).
OPMERKING: De optimale deeltjesconcentratie is dat het aantal deeltjes dat op de detectie-interface wordt weergegeven, varieert van 50-400, bij voorkeur rond de 300. Als het aantal deeltjes te hoog is, herhaalt u stap 3.1.2 om het machinekanaal onmiddellijk te spoelen om deeltjesretentie aan de kanaalwand te voorkomen en past u de concentratie van het EV-monster aan met stap 3.1.1 en herhaalt u stap 3.1.5. - Voer de deeltjesanalyse uit en genereer de analyserapporten volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
- Als het monster kostbaar is, pompt u het EV-monster terug met de spuit van 1 ml en verzamelt u ze in centrifugebuizen van 1,5 ml. Herhaal stap 2.2 om de EV's uit te pakken.
- Injecteer na detectie van alle monsters ten minste 2 ml bufferoplossing in het machinekanaal en injecteer vervolgens ten minste 5 ml gedestilleerd water totdat het aantal deeltjes dat op de detectie-interface wordt weergegeven minder dan vijf is.
- Gebruik een steriele spuit van 5 ml om ten minste 10 ml lucht met een constante snelheid te injecteren (de aanbevolen snelheid is 1 ml / s) om het water in het kanaal te verwijderen.
- Voer TEM-analyse uit.
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit met nieuwe EV-resuspensies. Het met formvar-koolstof gecoate elektronenmicroscoopraster heeft twee zijden, waarbij de werkzijde lichtgevend is in de middelste rasters. Het minimale plasmavolume om de EV's voor de onderstaande procedure te extraheren is 50 μl.- Meng het EV-monster (stap 2.4) met een gelijk volume van 4% paraformaldehyde (PFA). Deponeer 4 μL van de EV's op één rooster en incuber gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Doe vier druppels PBS (één druppel is gelijk aan 50 μL) op een vel polyethyleenfilm (zie materiaaltabel). Breng de roosters over met een schoon microscopisch klein pincet en was de werkzijde van het rooster in PBS van de ene druppel naar de andere.
- Gebruik filterpapier om extra PBS te verwijderen die in de rasters zijn achtergebleven.
- Incubeer de werkzijde van het rooster gedurende 2 minuten tot 1% fosfotungstinezuur (zie materiaaltabel) en herhaal stap 3.2.2.
LET OP: Aangezien fosfotungstic acid giftig is, moet deze procedure in de zuurkast worden uitgevoerd en moet overtollig fosfotungstic acid specifiek worden gerecycled in plaats van direct te worden weggegooid. - Leg de roosters met de voorkant naar boven in een schaal van 10 cm bedekt met filterpapier. De netten kunnen meerdere jaren bij RT worden opgeslagen.
- Observeer de roosters onder een elektronenmicroscoop volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de afzonderlijke deeltjes worden waargenomen, moet de concentratie van de EV's worden aangepast en moet de ophanging helder zijn zonder duidelijke troebelheid. Voordat het valt, moet het monster goed worden gemengd. De representatieve TEM- en NTA-analyses zijn weergegeven in figuur 2.
4. Oorsprongsanalyse van EV's
OPMERKING: De identificatie van de cellulaire oorsprong van EV's vereist de toepassing van antilichamen voor typische celmembraanmarkers. Het minimale plasmavolume om de EV's te extraheren voor de onderstaande procedure is 300 μL. Op basis van de lipide dubbellaagse structuren van EV's kan membraankleurstof worden gebruikt om ze te markeren. Voor bloedplasmamonsters wordt CD18 voor lymfocyten14 gekozen voor representatie. Voor maxillaire botmonsters wordt osteoclast-geassocieerde receptor (OSCAR) voor osteoclasten15 als voorbeeld gekozen. Zorg ervoor dat de flowcytometer vóór de FC is aangepast aan de meting van EV's16, omdat de onderste groottelimiet grotendeels verschilt tussen verschillende flowcytometers.
- Resuspendie monsters (stap 2.4) met 500 μL PBS en breng 50 μL over in een nieuwe en schone 1,5 ml centrifugebuis als een blanco controle (buis A) en nog eens 50 μL in een nieuwe en schone 1,5 ml centrifugebuis als een eenvoudige kleuringsbuis voor FITC (buis B). Voeg 0,5 μL membraankleurstof toe aan de primaire buis voor membraankleuring. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
- Centrifugeer de primaire buis gedurende 30 minuten bij 16.800 x g (4 °C). Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellets met 200 μL PBS.
- Verdeel elk monster van 50 μL in vier centrifugebuizen van 1,5 ml voor eenvoudige kleuringsbuizen voor PE (buis C), oppervlaktemarkerkleuring (buis D) en alleen secundaire antilichaamcontroles (buis E).
- Voeg het primaire antilichaam van OSCAR in bot EV-monsters en CD18-antilichaam in plasma-EV-monsters (zie materiaaltabel) afzonderlijk toe aan buis B (stap 4.1) en buis D (stap 4.3) (verdund bij 1:100). Incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 16.800 x g (4 °C). Gooi het supernatant weg, resuspensie van de pellets met 500 μL PBS en centrifugeer vervolgens opnieuw gedurende 30 minuten bij 16.800 x g (4 °C) om de extra primaire antilichamen te verwijderen.
- Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellets met 50 μL PBS, gevolgd door toevoeging van FITC-geconjugeerde secundaire antilichamen (zie materiaaltabel), respectievelijk (verdund bij 1:200) (buis E). Voeg dezelfde secundaire antilichamen toe aan buis B (stap 4.1) en buis D (stap 4.3). Incubeer alle buizen gedurende 1 uur, bij 4 °C in het donker.
OPMERKING: Directe fluorescentie-geconjugeerde etiketteringsantistoffen kunnen ook worden gebruikt om de FC-detectie te verwerken met de juiste isotypecontroles. - Verdun een druppel van respectievelijk 0,2, 0,5 en 1 μm grote kralen (zie materiaaltabel) suspensie in 1 ml PBS en voer elke maat kralen eerst uit om er zeker van te zijn dat de poort is gekozen voor EV's. Stel de drempel van de flowcytometer in om te zoeken naar de kralen en EV-populatie met behulp van een geschikte forward scatter (FSC) en side scatter (SSC).
- Stel de terminale voorwaarde in als het berekenen van 100.000 membraangeverfde deeltjes. Analyseer het monster via een flowcytometer volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). De representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 3.
OPMERKING: NTA-apparatuur met fluorescentiekanalen kan ook worden gebruikt voor oorsprongsanalyse en de monstervoorbereiding is hetzelfde als FC.
- Stel de terminale voorwaarde in als het berekenen van 100.000 membraangeverfde deeltjes. Analyseer het monster via een flowcytometer volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). De representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 3.
5. Eiwitgehalteanalyse van EV's
OPMERKING: De analyse van het eiwitgehalte in EV's wordt uitgevoerd via western blot. De plasma- en bot-EV's werden bijvoorbeeld geselecteerd om 6-fosfogluconaatdehydrogenase (PGD) en pyruvaatkinase M2 (PKM2) te analyseren op metabole status. Golgin84 (het Golgi-organel) werd gebruikt als een negatieve controle en Flotillin (membraaneiwit), Caveolin (integraal eiwit van caveolae) en β-actine (het cytoskelet)17 werden gebruikt als een positieve controle in EV's in vergelijking met celmonsters. Mitofilin en α-Actinin-4 werden gekozen als grote EV-markers, terwijl CD9 en CD81 werden gekozen als kleine EV-markers om de EV-subpopulaties18 aan te tonen. Apoa1 werd geselecteerd als plasmalipopdeeltjesmarker19. Voor de respectieve reagensdetails, zie materiaaltabel.
- Resuspendeer de pellets (stap 2.4) in 50 μL RIPA-lysisbuffer en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Kwantificeer de eiwitconcentraties van alle monsters in de 96-well microplate door de BCA-eiwittest volgens de instructies van de fabrikant (zie tabel met materialen).
- Verdun de 2 mg/ml runderserumalbumine (BSA) met 0,9% normale zoutoplossing (NS) (met 0,9% (g/v) natriumchloride) tot 0,5 mg/ml. Voeg de 0,5 mg/ml BSA en 0,9% NS toe aan drie gedupliceerde putten met bepaalde volumes, zoals weergegeven in tabel 1.
- Laat 2 μL van de monsters vallen (stap 5.1) en voeg 18 μL NS toe aan drie gedupliceerde putjes afzonderlijk.
- Bereid een werkoplossing door BCA-reagens A te mengen met reagens B (50:1 reagens A:B). Voeg 200 μL van de werkoplossing toe aan elk putje en schud zachtjes gedurende 30 s.
- Incubeer de 96-well microplate gedurende 20-25 min bij 37 °C.
- Meet de OD bij 596 nm met de spectrofotometer (zie materiaaltabel).
- Exporteer de gegevens.
- Teken een standaardcurve en bereken de eiwitconcentratie van de monsters.
- Verdun volgens de resultaten de monsters tot 1 μg/μL met 0,9% NS en 5x SDS-PAGE laadbuffer (250 mM Tris· HCl, pH 6,8, 10% SDS, 30% (v/v) Glycerol, 10 mM DTT, 0,05% (w/v) Broomfenol blauw, zie Materiaaltabel). Sluit de buizen goed af met folie en verwarm gedurende 5 minuten bij 100 °C.
- Laad de monsters en de eiwitladder in een gradiëntconcentratie van 4% -20% Hepes-Tris-gel (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Kies het gelpercentage op basis van het molecuulgewicht van de eiwitten van belang. - Laat de gel in de lopende buffer op 80 V lopen totdat de eiwitten een lijn vormen en schakel vervolgens gedurende 1 uur over naar 120 V totdat de ladende kleurstof zich aan de onderkant van de gel bevindt.
OPMERKING: De looptijd kan variëren afhankelijk van de gebruikte apparatuur of het type en de concentratie van de gel. - Breng de gel over op het membraan polyvinylideenfluoride (PVDF) (zie materiaaltabel), voorgeïncubeerd in methylalcohol gedurende 20 s. Gebruik een nat transfersysteem om gedurende 1 uur bij 200 mA over te brengen.
LET OP: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het overdrachtssysteem zitten en houd het PVDF-membraan nat.
OPMERKING: De overdrachtstijd kan variëren afhankelijk van het molecuulgewicht van het doeleiwit; 1 KD heeft meestal 1 minuut nodig. - Bereid 5% BSA-blokkeringsbuffer voor door 2,5 g BSA (zie materiaaltabel) in 50 ml Tris-gebufferde zoutoplossing-Tween (TBST) (2 ml Tween toegevoegd in 2 l PBS-oplossing) toe te voegen aan een centrifugebuis van 50 ml. Roer tot het poeder is opgelost. Blokkeer de membranen in deze buffer gedurende 2 uur bij RT met roeren.
- Incubeer de membranen met specifieke primaire antilichamen verdund met TBST tot de juiste concentratie (Mitofilin, 1:1000; α-Actinine-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flottielje-1, 1:1000; Caveolin-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-actine, 1:3000) 's nachts bij 4 °C.
- Was de membranen in de wasbuffer (2 ml Tween toegevoegd in 2 L PBS-oplossing) vier keer (telkens 15 minuten) en incubeer de membranen met de geschikte secundaire antilichamen op 1:4000 gedurende 1 uur bij RT met roeren.
- Was de membranen in de wasbuffer vier keer (telkens 15 minuten) en beeld de membranen af met behulp van de Chemiluminescence Kit en een gelbeeldvormingssysteem (zie Materiaaltabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens de experimentele workflow kunnen EV's worden geëxtraheerd uit het perifere bloed en vaste weefsels (figuur 1). Het maxillaire bot van een muis van 8 weken oud is ongeveer 0,1 ± 0,05 g en ongeveer 300 μL plasma kan uit de muis worden verzameld. Volgens de protocolstappen kan respectievelijk 0,3 mg en 3 μg EV's worden verzameld. Zoals geanalyseerd door TEM en NTA, zijn de typische morfologische kenmerken van EV's ronde bekervormige membraanblaasjes met een diameter variërend van 50-300 nm (figuur 2). FC kan de ev's met membraankleurstoflabel detecteren onder nuttige controles, en FC-analyse toont de percentages specifieke membraanmarkers uitgedrukt op EV's die hun oorsprong uit oudercellen impliceren (figuur 3). Western blot-analyse toont de expressie van respectievelijk PGD en PKM2 als een representatief voor het eiwitgehalte in plasma-EV's en bot-EV's, wat de metabole status aangeeft (figuur 4). Negatieve expressie van Golgin84 in EV's wordt ook gedetecteerd met de aanwezigheid van mitofiline, α-actinine-4, flottielachtig-1, caveolin-1 en β-actine, dat gewoonlijk wordt verrijkt in plasmamembraan-afgeleide grote EV's (microvesicles). De kleine EV-marker CD9 kan ook worden gedetecteerd, terwijl de CD81-expressie laag of afwezig is, met een gebrek aan Apoa1-bestaan in de plasma-EV's (figuur 4).
Figuur 1: Illustratie van het protocol voor het extraheren van EV's. (A) De stappen om perifere bloedplasma-EV's te extraheren met differentiële centrifugatie. (B) De stappen voor het extraheren van weefsel-EV's met differentiële centrifugatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologische identificatie van EV's. (A) Representatief transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) beeld dat de morfologie van EV's weergeeft. Schaalbalk = 200 nm. (B) Representatieve beelden van nanoparticle tracking analysis (NTA) en kwantificeringsresultaten tonen de grootteverdeling en het deeltjesaantal EV's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Oorsprongsanalyse van EV's . (A) De verschillende sets buizen met verschillende bedieningselementen van het experiment. (B) De verdeling van 1 μm, 0,5 μm en 0,2 μm grote kralen weergegeven in de scatted grafiek. (C) Representatieve dichtheidsgrafieken met PBS (buis A), de eenvoudige kleuring van EV's (buis B), de eenvoudige kleuring van membraankleurstof (buis C) en dubbele kleuring van de EV-monsters (buis D). (D) Flowcytometrische analyse van het percentage CD18-positieve EV's in bloedplasma-EV's in rood in vergelijking met de controle van secundaire antilichamen alleen in zwart. (E) Flowcytometrische analyse van het percentage OSCAR-positieve EV's uit botmonsters in rood in vergelijking met de controle van secundaire antilichamen alleen in zwart. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Eiwitgehalteanalyse van EV's. (A) Representatieve western blot van plasma EV-beelden die de aanwezigheid van 6-fosfogluconaatdehydrogenase (PGD) en mitofiline, α-actinine-4, CD9, flottielachtig-1, caveolin-1 en β-actine in plasma-EV's en de negatieve expressie van CD81, Golgin84 en Apoa1 laten zien. (B) Representatieve westelijke vlek van bot EV-beelden die de aanwezigheid van pyruvaatkinase M2 (PKM2) en mitofiline, α-actinine-4, CD9, CD81, flottielachtig-1, caveolin-1 en β-actine in bot-EV's en de negatieve expressie van Golgin84 laten zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Getal | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| BSA (μL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| NS (μL) | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
Tabel 1: Standaard werkoplossing van de BMA-test. Voeg de 0,5 mg/ml BSA en 0,9% NS toe aan drie gedupliceerde putjes, zoals weergegeven in de tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij het bestuderen van de kenmerken, het lot en de functie van EV's is het cruciaal om EV's met een hoge opbrengst en lage vervuiling te isoleren. Er bestaan verschillende methoden om EV's te extraheren, zoals dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC), grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en immunocapture-assays 4,20. Hier werd een van de meest gebruikte methoden, differentiële centrifugatie, gebruikt; de voordelen hiervan zijn dat het niet tijdrovend is, het genereert een hoge opbrengst aan EV's met eenvoudige isolatie van beperkte monsters en de mogelijkheid om de methode aan te passen op basis van de gebruikte monsterbron. Voor het analyseren van de functie van circulerende EV's is het beter om het bloedplasma te kiezen, dat de werkelijke toestand van EV's in vivo beter kan weerspiegelen, in plaats van het serum. Dit komt omdat veel van bloedplaatjes afgeleide EV's vrijkomen tijdens het proces van stolselvorming voor het verzamelen van serum21, terwijl bloedplaatjes worden verwijderd via centrifugatie voordat EV's uit het plasma22 worden geïsoleerd. Opgemerkt moet worden dat de keuze van antistolling voor plasma EV-isolatie nog steeds controversieel is. Het antistollingsmechanisme van heparine is nauwer verwant aan de fysiologie; de geïsoleerde EV's zouden dus meer een afspiegeling kunnen zijn van de in vivo status. Er moet worden vermeld dat heparine vals-negatieve PCR-metingen veroorzaakt en de EV-opname door cellenblokkeert 23,24. Andere antistollingsreagentia, zoals EDTA of natriumcitraat, hebben ook hun tekorten, waaronder biotoxiciteit, die de chemische eigenschappen van plasma en de bloedplaatjes beïnvloeden. Gezamenlijk, gezien de bovenstaande informatie, wordt heparine geselecteerd in deze studie. Om de bloedplaatjes te verwijderen, werden de monsters gecentrifugeerd met een snelheid van 2.500 x g vóór 16.800 x g, waardoor sommige grote EV's kunnen worden verwijderd. Bovendien, gezien het feit dat veel EV's in het viskeuze plasma zich aan bloedplaatjes zullen hechten en worden verwijderd, wordt voorgesteld om het plasma te verdunnen met een gelijk volume PBS voordat bloedplaatjes worden verwijderd door centrifugatie om de opbrengst van EV's te verbeteren. Van belang is dat het beter is om een sucrosegradiënt met ultracentrifugatie te gebruiken om de EV's te zuiveren om de oplosbare eiwitverontreinigingen, zoals eiwitpolymeren21, te verwijderen.
Tot op heden zijn de gebruikelijke methoden voor het karakteriseren van EV's NTA, TEM, FC16 en western blot, onder andere25. Bovendien, vanwege de verandering van morfologie en hoeveelheid EV's na herstel in verschillende omstandigheden13, raden we aan om de detectie zo snel mogelijk na extractie van de EV's te verwerken. Bovendien hebben Görgens et al. aanbevolen om PBS aangevuld met humaan albumine en trehalose (PBS-HAT) te gebruiken voor een betere conservering dan pure PBS26. Morfologische identificatie van EV's via NTA en TEM moet onmiddellijk na de extractieprocedure worden uitgevoerd, anders kan de vorm van EV's veranderen27. Bovendien kan Cryo-EM28 worden gebruikt voor geavanceerde morfologische observatie van EV's, wat de voordelen heeft van een beter behoud van de vorm met een hogere resolutie. Naast NTA kan de concentratie van deeltjes ook door FC worden gekwantificeerd met behulp van een bekende hoeveelheid telparels29, maar deze methode is niet erg stabiel en de gevoeligheid voor kleine deeltjes is laag voor FC. Bovendien is het vanwege de zwermdetectie van kleine deeltjes met FC30 beter om NTA te gebruiken voor groottebepalingen. Op dezelfde manier kan de oorsprong van EV's ook worden geanalyseerd door NTA met fluorescentiefilters. In vergelijking met FC is NTA gevoeliger voor kleinere deeltjes en heeft het potentiële voordeel dat het monster wordt gerecycled voor andere experimenten. Een voordeel van het gebruik van FC is dat de specifieke subtypes van EV's kunnen worden verrijkt met fluorochroom-geconjugeerde membraanantistoffen28. Ook kan de functie van specifieke oppervlakte-antigenen worden bestudeerd via experimenten met functieverlies, zoals het gebruik van neutraliserende antilichamen28. Als alternatief kan 1% Triton X-100 worden gebruikt om het lipidenvlot van EV-membraan te vernietigen, dus als een controle voor het detecteren van membraansignalen31. Bovendien kunnen onderzoekers de specifieke membraankenmerken gebruiken om gerichte medicijndragerste creëren 32.
Western blot wordt veel gebruikt voor het analyseren van het eiwitgehalte in EV's. Verschillende markers zoals Mitofilin, caveolin en α-Actinin-418 zijn aanbevolen als kandidaten om grote EV's te identificeren in recente studies; CD9 is verrijkt in kleine EV's in plaats van in grote EV's, en CD81, CD63 en Syntenin-1 zijn uitgebreid overvloedig aanwezig in kleine EV's18. Wat betreft de resultaten van de Western blot, markers zoals Mitofilin en CD9 zijn variabel in verschillende dieromstandigheden. Aangenomen mag worden dat de geïsoleerde EV's een gemengde populatie vertegenwoordigen, waarbij grote EV's één grote subpopulatie vormen. Om de zuiverheid van EV's te verifiëren, wordt voorgesteld om de detectie van organel / nucleaire eiwitten, zoals Lamin B of Golgin84, toe te voegen als de negatieve controle. Wat betreft plasma-EV's, volgens onze resultaten is Apoa1 die lipodeeltjes vertegenwoordigt niet verrijkt in de verzamelde EV's. Een beperking van deze methode is dat het moeilijk is om de eiwitten op het oppervlak te onderscheiden van die in het blaasje. Daarom kan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) worden toegepast voor membraaneiwitanalyse als aanvullende experimenten. Bovendien kunnen onderzoekers met de ontwikkeling van high-throughput sequencing profiteren van proteomische mapping33 om de eiwitsamenstelling van EV's te analyseren, waarbij de doeleiwitten ook moeten worden geverifieerd door western blot.
Samenvattend biedt deze studie een haalbaar protocol om bloedsomloop- en weefsel-EV's te isoleren en te karakteriseren, inclusief een analyse van hun celbronnen en eiwitinhoud, wat helpt om een basis te leggen voor verdere functionele experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 en 81930025) en de China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 en BX20190380). We zijn dankbaar voor de hulp van het National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
- Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
- Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
- In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T.
- Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
- Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
- Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
- Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
- Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
- Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
- Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
- Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
- Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
- Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
