Summary
Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.
Abstract
Dolaşımdaki ve dokuda yerleşik hücre dışı veziküller (EV'ler) yeni teranostik biyobelirteçler olarak umut verici hedefleri temsil eder ve organizma homeostazının korunmasında ve geniş bir hastalık spektrumunun ilerlemesinde önemli oyuncular olarak ortaya çıkarlar. Mevcut araştırma, endozomal kökenli endojen eksozomların karakterizasyonuna odaklanırken, plazma zarından dökülen mikro-parçacıklar, ana hücrelerin zar imzasını özetleyen yüzey moleküllerinin bolluğu ile öne çıkan sağlık ve hastalıkta artan bir dikkat kazanmıştır. Burada, EV'leri plazmadan ve kemik gibi katı dokulardan çıkarmak ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeye dayanan tekrarlanabilir bir prosedür sunulmaktadır. Protokol ayrıca, yüzey antijenlerinin ve EV'lerin protein yüklerinin daha sonraki profillemelerini açıklamaktadır, bu nedenle türevleri için izlenebilir ve potansiyel fonksiyonla ilgili bileşenlerle tanımlanmıştır. Bu yöntem, biyolojik, fizyolojik ve patolojik çalışmalarda EV'lerin korelasyonlu, fonksiyonel ve mekanik analizi için yararlı olacaktır.
Introduction
Hücre dışı veziküllerin (EV'ler), çeşitli fizyolojik ve patolojik olaylarda önemli rol oynayan hücre dışı yapılarıtanımlamak için hücre dışı veziküller (EV'ler) önerilmiştir2. Sağlıklı hücreler tarafından salınan EV'ler genel olarak iki ana kategoriye ayrılabilir: hücre içi endositik trafik yolu3 yoluyla oluşan eksozomlar (veya küçük EV'ler) ve hücre4'ün plazma zarının dışa doğru tomurcuklanmasıyla gelişen mikro-parçacıklar (veya büyük EV'ler). Birçok çalışma, in vitro5 kültürlü hücrelerden toplanan EV'lerin işlevine odaklanırken, dolaşımdan veya dokulardan türetilen EV'ler, organizmanın gerçek durumunu in vivo6'da yansıtma avantajına sahip olan daha karmaşık ve heterojendir. Ayrıca, hemen hemen her türlü doku in vivo EV'ler üretebilir ve bu EV'ler doku içinde haberci olarak hareket edebilir veya sistemik iletişimi kolaylaştırmak için çeşitli vücut sıvıları, özellikle periferik kan tarafından aktarılabilir7. Dolaşımdaki EV'ler ve dokular da hastalık tanı ve tedavisi için hedeflerdir8.
Eksozomlar son yıllarda yoğun bir şekilde çalışılırken, mikro-parçacıklar ayrıca ultrasantrifüjleme olmadan kolayca ekstrakte edilebilen önemli biyolojik fonksiyonlara sahiptir, böylece temel ve klinik araştırmaları teşvik eder9. Özellikle, dolaşımdan ve dokulardan izole edilen EV'lerle ilgili kritik bir konu, farklı hücre tiplerinden türetilmiş olmalarıdır10. Mikro-parçacıklar plazma zarından kesildiğinden ve bol miktarda hücre yüzey molekülü9 ile öne çıktığından, bu EV'lerin hücresel kökenini tanımlamak için ana hücre zarı belirteçlerinin kullanılması mümkündür. Spesifik olarak, membran belirteçlerini tespit etmek için akış sitometrisi (FC) tekniği uygulanabilir. Dahası, araştırmacılar EV'leri izole edebilir ve fonksiyonel kargolara dayanarak daha fazla analiz yapabilirler.
Mevcut protokol, EV'leri in vivo örneklerden çıkarmak ve karakterize etmek için kapsamlı bir prosedür sunmaktadır. EV'ler diferansiyel santrifüjleme yoluyla izole edilir ve EV'lerin karakterizasyonu, nanopartikül izleme analizi (NTA) ve iletim elektron mikroskobu (TEM) yoluyla morfolojik tanımlamayı, FC yoluyla orijin analizini ve batı lekesi yoluyla protein kargo analizini içerir. Farelerin kan plazması ve maksiller kemiği temsilci olarak kullanılır. Araştırmacılar, diğer kaynaklardan EV'ler için bu protokole başvurabilir ve ilgili değişiklikleri yapabilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Kılavuzları ve ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için 8 haftalık C57Bl / 6 fareleri (dişi veya erkek tercihi olmadan) kullanılmıştır. Plazma ve doku EV'lerinin izole edilmesinde yer alan adımlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Plazma, vücut sıvılarından EV izolasyon prosedürünü tanımlamak için bir temsilci olarak alınır. Maksiller kemik, katı dokulardan EV izolasyon prosedürünü açıklamak için bir temsilci olarak alınır.
1. Plazma ve maksiller kemik örneklerinin hazırlanması
- Aşağıdaki adımları izleyerek plazma numunelerini hazırlayın.
- Standart bir laboratuvar terazisi kullanarak farenin vücut ağırlığını belirleyin.
- 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 20 μL, 2 mg/mL heparin ekleyin ve heparinin tüpün duvarına yapışmasını sağlamak için karıştırıcı cihazı kullanın ( bkz.
NOT: Antikoagülasyon tüpleri doğrudan kan toplamak için de kullanılabilir. - 50 mg/kg pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonu ile fareyi uyuşturun (bkz. Farenin boynunu başparmak ve işaret parmağınızla tutun, ardından kuyruğu ve sol arka bacağı küçük parmağınızla sabitleyin ve göbeği açığa çıkardıktan sonra pentobarbital sodyumu 1 mL'lik bir enjeksiyon şırıngasıyla enjekte edin.
- Ayak yastığı sıkıştığında kornea refleksinin yokluğuna ve uzuv reaksiyonuna bağlı olarak farenin uygun şekilde uyuşturulduğunu onaylayın.
- Yüzdeki saçları ve gözlerin kirpiklerini kavisli makasla tıraş edin.
- Farenin boyun derisini tutun ve göz küresinin çıkıntı yapması için gözlerin etrafındaki cildi boynun arkasına bastırın. Göz küresini hızlı bir şekilde sıkıştırmak için oftalmik cımbız kullanın ve adım 1.1.2'de hazırlanan 1.5 mL santrifüj tüpleri ile kan çıkışını toplayın. Servikal omurları yerinden oynatarak fareyi feda edin.
DİKKAT: Tüylere ve kirpiklere dikkat edin, çünkü hemolize neden olabilirler. - Kanın pıhtılaşmasını önlemek için tüpü birkaç kez yavaşça baş aşağı çevirin.
DİKKAT: Tüpü mümkün olan en kısa sürede baş aşağı çevirin. - Kan örneğini 4 ° C'de 1.200 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı yeni ve temiz 1,5 mL santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın ve plazma numunesini hemen kullanın veya birkaç saat boyunca 4 ° C'de saklayın.
- Süpernatantı eşit miktarda 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin ve iyice karıştırın.
NOT: Plazmayı toplamak için yukarıda verilen protokol ölümcüldür. Kan, fareyi feda etmeden subklaviyen ven delinmesi11 yoluyla da toplanabilir.
- Aşağıdaki adımları izleyerek maksiller kemik örneklerini hazırlayın.
- Maksiller kemiği oftalmik cımbız ve makasla izole edin ve cımbızla yumuşak dokulardan kurtulmak için PBS ile yıkayın.
- Maksiller kemiği 1,5 mL santrifüj tüplerine koyun ve kemiği makasla küçük parçalara ayırın (boyut çapı 1 mm'den az olmalıdır). Dokuyu örtmek için belirli miktarda Liberaz (5 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin (8 haftalık bir fareden alınan kemik örnekleri için genellikle 1 mL) ve ardından 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Numuneyi 800 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı bir pipetle dikkatlice yeni ve temiz 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın.
2. EV'lerin çıkarılması
- Büyük hücre kalıntılarını ve kalan trombositleri çıkarmak için numuneleri (adım 1.1.10 ve adım 1.2.4'te hazırlanan) 2.500 x g'de (4 ° C) 15 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantları yeni ve temiz 1,5 mL santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın ve 16.800 x g'de (4 ° C) 30 dakika boyunca santrifüj yapın.
NOT: EV'leri çıkarmak için santrifüjleme hızı 10.000 x g'nin üzerine ayarlanabilir12. Santrifüjün hızı ne kadar yüksek olursa, o kadar fazla sayıda EV elde edilebilir. Kullandığımız santrifüjün hız sınırı 16.800 x g olduğu için ( Malzeme Tablosuna bakınız), bu protokolünde bu hızı seçtik. - Süpernatantı atın ve her tüpteki peletleri 1 mL PBS ile yeniden askıya alın. 16.800 x g'de (4 °C) 30 dakika boyunca santrifüj.
- Süpernatantı atın ve her tüpteki peletleri 50 μL PBS ile yeniden askıya alın. Bu numuneleri 4 °C'de sadece 24 saatten daha kısa bir süre için saklayın veya tercihen aşağıdaki analizler için hemen kullanın (adım 3-5).
DİKKAT: -80 ° C'de depolama kabul edilemez, çünkü bu, EV'lerin konsantrasyonunu azaltacak ve EV'lerin13'ünün partikül boyutlarını artıracak, böylece EV'lerin aşağıdaki analizini etkileyecektir.
3. EV'lerin morfolojik olarak tanımlanması
- NTA analizi gerçekleştirin.
- EV'lerin miktarına göre (kabaca peletlerin boyutuna göre değerlendirilir, 50 μL plazma parçacıkları minimumdur), 5-50 μL resuspension aktarın (adım 2.4), 10 mL tampon çözeltisinde seyreltin (PBS 0.22 μm filtre ile filtrelenmiştir) ve 1 mL mikro pipetleyici uçlarıyla yeterince karıştırın. Partikül ölçümü için bu son süspansiyonu kullanın.
- Algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısı beşten az olana kadar orta ve sabit bir hızda en az 5 mL damıtılmış su enjekte etmek için steril bir 1 mL şırınga kullanın.
NOT: Tüm kanaldan 1 mL damıtılmış su enjekte edildikten sonra, partikül sayısı doğrudan algılama arayüzünde gösterilir. Sayı hala beşin üzerindeyse, kriterler karşılanana kadar 1 mL damıtılmış su enjekte etmeye devam edin. - Birincil çözelti oluşturmak için 1 mL damıtılmış suda 1 μL kalibrasyon çözeltisini yeniden oluşturun ve daha sonra standart bir stok çözeltisi hazırlamak için birincil çözeltinin 100 μL'sini 25 mL damıtılmış suya alın (1:250.000). Bu çalışan reaktifi 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın.
- NTA cihazını standart stok çözeltisi ile kalibre edin (adım 3.1.3). Algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısı 50-400 arasında (tercihen 300 civarında) olana kadar makine kanalını yıkamak için 1-5 mL steril şırınga ile 1-5 mL çalışma kalibrasyon çözeltisi enjekte edin. Kalibrasyon programını çalıştırın.
- Her numune ölçümünden önce makine kanalını yıkamak için adım 3.1.2'yi tekrarlayın.
- Algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısı 10'dan az olana kadar makine kanalını sabit bir hızda yıkamak üzere en az 2 mL tampon çözeltisi enjekte etmek için steril bir 1 mL şırınga kullanın.
- Adım 3.1.1'de hazırlanan EV numunesinin 1 mL'sini orta ve sabit bir hızla enjekte edin (önerilen hız 0,5-1 mL / s'dir).
NOT: Optimum partikül konsantrasyonu, algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısını 50-400 arasında, tercihen 300 civarında yapmaktır. Partikül sayısı çok yüksekse, kanal duvarında partikül tutulmasını önlemek için makine kanalını hemen yıkamak için adım 3.1.2'yi tekrarlayın ve adım 3.1.1 ile EV numunesinin konsantrasyonunu ayarlayın, ardından adım 3.1.5'ten itibaren tekrarlayın. - Partikül analizini yapın ve analiz raporlarını üreticinin talimatlarına göre oluşturun (bakınız Malzeme Tablosu).
- Numune değerliyse, EV numunesini 1 mL şırınga ile geri pompalayın ve bunları 1,5 mL santrifüj tüplerinde toplayın. EV'leri çıkarmak için adım 2.2'yi tekrarlayın.
- Tüm numuneleri tespit ettikten sonra, makine kanalına en az 2 mL tampon çözeltisi enjekte edin ve ardından algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısı beşten az olana kadar en az 5 mL damıtılmış su enjekte edin.
- Kanaldaki suyu çıkarmak için sabit bir hızda (önerilen hız 1 mL / s'dir) en az 10 mL hava enjekte etmek için steril bir 5 mL şırınga kullanın.
- TEM analizi yapın.
NOT: Yeni EV süspansiyonlarıyla aşağıdaki adımları uygulayın. Formvar-karbon kaplı elektron mikroskobu ızgarasının iki tarafı vardır, çalışma tarafı merkez ızgaralarda aydınlıktır. Aşağıdaki prosedür için EV'leri çıkarmak için minimum plazma hacmi 50 μL'dir.- EV numunesini (adım 2.4) eşit hacimde% 4 paraformaldehit (PFA) ile karıştırın. EV'lerin 4 μL'sini bir ızgaraya koyun ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Bir polietilen film tabakasına dört damla PBS (bir damla 50 μL'ye eşittir) koyun (bkz. Izgaraları temiz mikroskobik cımbızla aktarın ve ızgaranın çalışma tarafını PBS'de bir damladan diğerine yıkayın.
- Izgaralarda kalan fazladan PBS'yi kaldırmak için filtre kağıtları kullanın.
- Izgaranın çalışma tarafını 2 dakika boyunca% 1 fosfotungstik aside ( Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin ve ardından adım 3.2.2'yi tekrarlayın.
DİKKAT: Fosfotungstik asit zehirli olduğundan, bu prosedürün duman davlumbazında çalıştırılması gerekir ve gereksiz fosfotungstik asidin doğrudan atılmak yerine özel olarak geri dönüştürülmesi gerekir. - Izgaraları yüzü yukarı bakacak şekilde filtre kağıtlarıyla kaplı 10 cm'lik bir kaba koyun. Şebekeler RT'de birkaç yıl saklanabilir.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek elektron mikroskobu altında ızgaraları gözlemleyin (bkz.
NOT: Tek parçacıkların gözlemlenmesini sağlamak için, EV'lerin konsantrasyonu ayarlanmalı ve süspansiyonun belirgin bulanıklık olmadan net olması gerekir. Düşürmeden önce, numune iyice karıştırılmalıdır. Temsili TEM ve NTA analizleri Şekil 2'de gösterilmiştir.
4. EV'lerin menşe analizi
NOT: EV'lerin hücresel kökeninin tanımlanması, tipik hücre zarı belirteçleri için antikorların uygulanmasını gerektirir. Aşağıdaki prosedür için EV'leri çıkarmak için minimum plazma hacmi 300 μL'dir. EV'lerin lipit çift katmanlı yapılarına dayanarak, bunları işaretlemek için membran boyası kullanılabilir. Kan plazması örnekleri için, lenfositler14 için CD18 temsil için seçilir. Maksiller kemik örnekleri için, osteoklastlar15 için osteoklastla ilişkili reseptör (OSCAR) örnek olarak seçilmiştir. FC'den önce, akış sitometresinin EVs16'nın ölçümüne uyarlandığından emin olun, çünkü alt boyut sınırı farklı akış sitometreleri arasında büyük ölçüde farklıdır.
- Numuneleri 500 μL PBS ile yeniden askıya alın (adım 2.4) ve 50 μL'yi boş bir kontrol (tüp A) olarak yeni ve temiz bir 1,5 mL santrifüj tüpüne ve başka bir 50 μL'yi FITC için basit bir boyama tüpü olarak yeni ve temiz bir 1,5 mL santrifüj tüpüne (tüp B) aktarın. Membran boyama için birincil tüpe 0,5 μL membran boyası ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Birincil tüpü 16.800 x g'de (4 ° C) 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve topakları 200 μL PBS ile yeniden askıya alın.
- Her 50 μL numuneyi, PE (tüp C), yüzey işaretleyici boyama (tüp D) ve yalnızca ikincil antikor kontrolleri (tüp E) için basit boyama tüpleri için dört adet 1,5 mL santrifüj tüpüne bölün.
- Kemik EV örneklerinde OSCAR'ın birincil antikorunu ve plazma EV örneklerinde CD18 antikorunu (bakınız Malzeme Tablosu) tüp B'ye (adım 4.1) ve tüp D'ye (adım 4.3) ayrı ayrı (1:100'de seyreltilmiş) ekleyin. 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Tüpleri 16.800 x g'de (4 ° C) 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın, topakları 500 μL PBS ile yeniden askıya alın ve daha sonra ekstra birincil antikorları çıkarmak için 16.800 x g'de (4 ° C) 30 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın.
- Süpernatantı atın ve peletleri 50 μL PBS ile yeniden askıya alın, ardından sırasıyla FITC-konjuge ikincil antikorlar ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) (1:200'de seyreltilmiş) (tüp E). Aynı ikincil antikorları tüp B'ye (adım 4.1) ve tüp D'ye (adım 4.3) ekleyin. Tüm tüpleri karanlıkta 4 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Doğrudan floresan konjuge etiketleme antikorları, FC tespitini uygun izotip kontrolleri ile işlemek için de kullanılabilir. - Sırasıyla 0,2, 0,5 ve 1 μm boyutunda boncuk süspansiyonunun bir damlasını ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 mL PBS'ye seyreltin ve EV'ler için seçilen kapıdan emin olmak için önce her boyuttaki boncukları çalıştırın. Uygun bir ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) kullanarak boncukları ve EV popülasyonunu aramak için akış sitometresinin eşiğini ayarlayın.
- Terminal koşulunu 100.000 membran boyalı parçacık hesaplamak olarak ayarlayın. Numuneyi, üreticinin talimatları altında bir akış sitometresi ile analiz edin (bkz. Temsili sonuçlar Şekil 3'te gösterilmiştir.
NOT: Floresan kanallı NTA ekipmanı da menşe analizi için kullanılabilir ve numune hazırlama işlemi FC ile aynıdır.
- Terminal koşulunu 100.000 membran boyalı parçacık hesaplamak olarak ayarlayın. Numuneyi, üreticinin talimatları altında bir akış sitometresi ile analiz edin (bkz. Temsili sonuçlar Şekil 3'te gösterilmiştir.
5. EV'lerin protein içeriği analizi
NOT: EV'ler içindeki protein içeriğinin analizi, batı lekesi yoluyla gerçekleştirilir. Örneğin, plazma ve kemik EV'leri, metabolik durum için 6-fosfoglukonat dehidrogenaz (PGD) ve piruvat kinaz M2'yi (PKM2) analiz etmek için seçildi. Golgin84 (Golgi organeli) negatif kontrol olarak kullanıldı ve Flotillin (membran proteini), Caveolin (caveolae'nin integral proteini) ve β-aktin (hücre iskeleti)17 , hücre örneklerine kıyasla EV'lerde pozitif bir kontrol olarak kullanıldı. Mitofilin ve α-Actinin-4 büyük EV belirteçleri olarak seçilirken, CD9 ve CD81, EV alt popülasyonlarını göstermek için küçük EV belirteçleri olarak seçildi18. Apoa1, plazma lipoppartikül belirteci19 olarak seçildi. İlgili reaktif detayları için Malzeme Tablosu'na bakınız.
- Peletleri (adım 2.4) 50 μL RIPA lizis tamponunda tekrar askıya alın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
- 96 delikli mikroplakadaki tüm numunelerin protein konsantrasyonlarını, üreticinin talimatlarını izleyerek BCA protein testi ile ölçün (bkz.
- 2 mg/mL sığır serum albüminini (BSA) %0,9 normal salin (NS) ile (%0,9 (w/v) sodyum klorür içeren) 0,5 mg/mL'ye seyreltin. 0.5 mg / mL BSA ve% 0.9 NS'yi, Tablo 1'de gösterildiği gibi, belirli hacimlere sahip üç çoğaltılmış kuyucuğa ekleyin.
- Numunelerin 2 μL'sini bırakın (adım 5.1) ve ayrı ayrı çoğaltılmış üç kuyucuğa 18 μL NS ekleyin.
- BCA Reaktif A'yı Reaktif B (50:1 Reaktif A:B) ile karıştırarak bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Her bir oyuğa 200 μL çalışma çözeltisi ekleyin ve 30 s boyunca hafifçe çalkalayın.
- 96 delikli mikroplakayı 37 ° C'de 20-25 dakika inkübe edin.
- OD'yi spektrofotometre ile 596 nm'de ölçün (bkz.
- Verileri dışa aktarın.
- Standart bir eğri çizin ve numunelerin protein konsantrasyonunu hesaplayın.
- Sonuçlara göre, numuneleri %0,9 NS ve 5x SDS-PAGE yükleme tamponu (250 mM Tris· HCl, pH 6.8, %10 SDS, %30 (v/v) Gliserol, 10 mM DTT, %0.05 (w/v) Bromofenol mavisi, bakınız Malzeme Tablosu). Tüpleri filmle sıkıca kapatın ve 100 ° C'de 5 dakika ısıtın.
- Numuneleri ve protein merdivenini% 4 -% 20 Hepes-Tris jelinin gradyan konsantrasyonuna yükleyin (bakınız Malzeme Tablosu).
NOT: İlgili proteinlerin moleküler ağırlığına göre jel yüzdesini seçin. - Jeli, proteinler bir çizgi oluşturana kadar 80 V'ta çalışan tamponda çalıştırın ve ardından yükleme boyası jelin dibinde olana kadar 1 saat boyunca 120 V'a geçin.
NOT: Çalışma süresi, kullanılan ekipmana veya jelin türüne ve konsantrasyonuna göre değişebilir. - Jeli, 20 s boyunca metil alkolde önceden inkübe edilmiş poliviniliden florür (PVDF) membranına (bakınız Malzeme Tablosuna bakınız) aktarın. 200 mA'da 1 saat boyunca aktarmak için ıslak bir transfer sistemi kullanın.
DİKKAT: Transfer sisteminin içinde kabarcık olmadığından emin olun ve PVDF membranını ıslak tutun.
NOT: Transfer süresi, hedef proteinin moleküler ağırlığına göre değişebilir; 1 KD genellikle 1 dakikaya ihtiyaç duyar. - 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 50 mL Tris tamponlu salin-Ara'ya (TBST) (2 L PBS çözeltisine 2 mL Tween eklenmiş) 2,5 g BSA ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek %5 BSA bloke edici tampon hazırlayın. Toz çözülene kadar çalkalayın. Bu tampondaki membranları RT'de 2 saat boyunca ajitasyonla bloke edin.
- Membranları, TBST ile seyreltilmiş spesifik primer antikorlarla uygun konsantrasyonda inkübe edin (Mitofilin, 1:1000; α-Aktin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotillin-1, 1:1000; Kaveolin-1, 1:1000; PGT, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-aktin, 1:3000) gece boyunca 4 °C'de.
- Membranları yıkama tamponunda (2 L PBS çözeltisine eklenen 2 mL Ara) dört kez (her seferinde 15 dakika) yıkayın ve membranları uygun ikincil antikorlarla 1:4000'de RT'de 1 saat boyunca çalkalama ile inkübe edin.
- Membranları yıkama tamponunda dört kez yıkayın (her seferinde 15 dakika) ve Kemilüminesans Kiti ve bir jel görüntüleme sistemi kullanarak membranları görüntüleyin (bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel iş akışına göre, EV'ler periferik kan ve katı dokulardan çıkarılabilir (Şekil 1). 8 haftalık bir farenin maksiller kemiği yaklaşık 0.1 ± 0.05 g'dır ve fareden yaklaşık 300 μL plazma toplanabilir. Protokol adımlarını takiben, sırasıyla 0.3 mg ve 3 μg EV toplanabilir. TEM ve NTA ile analiz edildiği gibi, EV'lerin tipik morfolojik özellikleri, çapı 50-300 nm arasında değişen yuvarlak fincan şeklindeki membran vezikülleridir (Şekil 2). FC, membran boyası etiketli EV'leri yararlı kontroller altında tespit edebilir ve FC analizi, EV'lerde ifade edilen ve ana hücrelerden kökenlerini ima eden spesifik membran belirteçlerinin yüzdelerini gösterir (Şekil 3). Western blot analizi, plazma EV'lerinde ve kemik EV'lerinde protein içeriğinin bir temsilcisi olarak sırasıyla PGD ve PKM2'nin ekspresyonunu gösterir ve metabolik durumu gösterir (Şekil 4). EV'lerde Golgin84'ün negatif ekspresyonu, genellikle plazma zarı kaynaklı büyük EV'lerde (mikro-parçacıklar) zenginleştirilmiş Mitofilin, α-Aktin-4, Flotillin-1, Kaveolin-1 ve β-aktin'in varlığı ile de tespit edilir. CD81 ekspresyonu düşük veya hiç yokken, plazma EV'lerinde Apoa1 varlığı eksikliği ile küçük EV belirteci CD9 da tespit edilebilir (Şekil 4).
Şekil 1: EV'leri çıkarma protokolünün çizimi . (A) Diferansiyel santrifüjleme ile periferik kan plazması EV'lerini çıkarma adımları. (B) Diferansiyel santrifüjleme ile doku EV'lerini çıkarma adımları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: EV'lerin morfolojik tanımlanması . (A) EV'lerin morfolojisini gösteren temsili iletim elektron mikroskobu (TEM) görüntüsü. Ölçek çubuğu = 200 nm. (B) Temsili nanopartikül izleme analizi (NTA) görüntüleri ve niceleme sonuçları, EV'lerin boyut dağılımını ve parçacık sayısını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: EV'lerin köken analizi . (A) Deneyin farklı kontrollerine sahip farklı tüp setleri. (B) Kesilmiş grafikte gösterilen 1 μm, 0,5 μm ve 0,2 μm boyutlu boncukların dağılımı. (C) PBS'yi (tüp A), EV'lerin basit boyanmasını (tüp B), membran boyasının basit boyanmasını (tüp C) ve EV numunelerinin çift boyanmasını (tüp D) gösteren temsili yoğunluk grafikleri. (D) Kan plazması EV'lerindeki CD18 pozitif EV'lerin yüzdesinin kırmızı renkte akış sitometrik analizi, sadece siyah renkte sekonder antikor kontrolü ile karşılaştırıldığında. (E) Kırmızı renkteki kemik örneklerinden OSCAR pozitif EV'lerin yüzdesinin akış sitometrik analizi, sadece siyah renkteki sekonder antikor kontrolü ile karşılaştırıldığında. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: EV'lerin protein içeriği analizi. (A) Plazma EV'lerinde 6-fosfoglukonat dehidrogenaz (PGD) ve Mitofilin, α-Aktinin-4, CD9, Flotillin-1, Kaveolin-1 ve β-aktinin varlığını ve CD81, Golgin84 ve Apoa1'in negatif ekspresyonunu gösteren plazma EV görüntülerinin temsili batı lekesi. (B) Kemik EV'lerinde piruvat kinaz M2 (PKM2) ve Mitofilin, α-Aktin-4, CD9, CD81, Flotillin-1, Kaveolin-1 ve β-aktinin varlığını ve Golgin84'ün negatif ekspresyonunu gösteren temsili batı kemik EV lekeleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Sayı | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| BSA (μL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| NS (μL) | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
Tablo 1: BCA testinin standart çalışma çözeltisi. 0.5 mg / mL BSA ve% 0.9 NS'yi, tabloda gösterildiği gibi üç çoğaltılmış kuyucuğa ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV'lerin özelliklerini, kaderini ve işlevini incelerken, EV'leri yüksek verim ve düşük kontaminasyonla izole etmek çok önemlidir. EV'leri çıkarmak için yoğunluk gradyanı santrifüjleme (DGC), boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve immünoyakalama testleri 4,20 gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Burada en sık kullanılan yöntemlerden biri olan diferansiyel santrifüjleme kullanılmıştır; Bunun avantajları, zaman alıcı olmaması, sınırlı numunelerden kolay izolasyon ile yüksek miktarda EV verimi üretmesi ve kullanılan numune kaynağına göre yöntemi değiştirme yeteneğidir. Dolaşımdaki EV'lerin işlevini analiz etmek için, serumdan ziyade EV'lerin gerçek durumunu in vivo olarak daha iyi yansıtabilen kan plazmasını seçmek daha iyidir. Bunun nedeni, serum21'in toplanması için pıhtı oluşumu sürecinde birçok trombosit türevi EV'nin salınması, trombositlerin ise EV'lerin plazma22'den izolasyonundan önce santrifüjleme yoluyla çıkarılmasıdır. Plazma EV izolasyonu için antikoagülasyon seçiminin hala tartışmalı olduğu belirtilmelidir. Heparinin antikoagülan mekanizması fizyoloji ile daha yakından ilişkilidir; Bu nedenle izole edilen EV'ler in vivo durumu daha fazla yansıtabilir. Heparinin yanlış negatif PCR okumalarına neden olacağı ve23,24 hücre tarafından EV alımını bloke edeceği belirtilmelidir. EDTA veya sodyum sitrat gibi diğer antikoagülasyon reaktifleri de, plazma ve trombositlerin kimyasal özelliklerini etkileyen biyotoksisite de dahil olmak üzere eksikliklerine sahiptir. Toplu olarak, yukarıdaki bilgiler göz önüne alındığında, bu çalışmada heparin seçilmiştir. Trombositleri çıkarmak için, numuneler 16.800 x g'den önce 2.500 x g hızında santrifüj edildi, bu da bazı büyük EV'leri kaldırabilir. Ek olarak, viskoz plazma içindeki birçok EV'nin trombositlere yapışacağı ve çıkarılacağı göz önüne alındığında, EV'lerin verimini artırmak için trombositleri santrifüjleme yoluyla çıkarmadan önce plazmanın eşit miktarda PBS ile seyreltilmesi önerilmektedir. Not olarak, protein polimerleri21 gibi çözünür protein kontaminasyonlarını gidermek için EV'leri saflaştırmak için ultra santrifüjleme ile bir sakkaroz gradyanı kullanmak daha iyidir.
Bugüne kadar, EV'leri karakterize etmenin yaygın yöntemleri arasında NTA, TEM, FC16 ve western blot, diğerleri arasında25 bulunmaktadır. Ek olarak, farklı koşullarda restore edildikten sonra morfolojinin ve EV'lerin miktarının değişmesi nedeniyle13, EV'lerin çıkarılmasından sonra tespitin mümkün olan en kısa sürede işlenmesini öneriyoruz. Ayrıca, Görgens ve ark., saf PBS26'dan daha iyi koruma için insan albümini ve trehaloz (PBS-HAT) ile desteklenmiş PBS'nin kullanılmasını önermişlerdir. EV'lerin NTA ve TEM ile morfolojik olarak tanımlanması ekstraksiyon işleminden hemen sonra yapılmalıdır, aksi takdirde EV'lerin şekli değişebilir27. Ayrıca, Cryo-EM, EV'lerin gelişmiş morfolojik gözlemi için28 kullanılabilir, bu da şekli daha yüksek çözünürlükte daha iyi korumanın faydalarına sahiptir. NTA'nın yanı sıra, parçacıkların konsantrasyonu, bilinen miktarda sayma boncuğu29 yardımıyla FC tarafından da ölçülebilir, ancak bu yöntem çok kararlı değildir ve küçük parçacıklara duyarlılık FC için düşüktür. Dahası, FC30 ile küçük parçacıkların sürü algılaması nedeniyle, boyut belirleme için NTA kullanmak daha iyidir. Benzer şekilde, EV'lerin kökeni de floresan filtrelerle NTA tarafından analiz edilebilir. FC ile karşılaştırıldığında, NTA daha küçük parçacıklara karşı daha hassastır ve numuneyi diğer deneyler için geri dönüştürmenin potansiyel avantajına sahiptir. FC kullanmanın bir avantajı, EV'lerin spesifik alt tiplerinin florokrom konjuge membran antikorları28 ile zenginleştirilebilmesidir. Ayrıca, spesifik yüzey antijenlerinin işlevi, nötralize edici antikorların kullanılması gibi fonksiyon kaybı deneyleri yoluyla incelenebilir28. Alternatif olarak,% 1 Triton X-100, EVs membranının lipit salını yok etmek için kullanılabilir, böylece membran sinyallerini tespit etmek için bir kontrol olarakkullanılabilir 31. Ayrıca, araştırmacılar hedeflenen ilaç taşıyıcılarını oluşturmak için spesifik membran özelliklerini kullanabilirler32.
Western blot, EV'lerdeki protein içeriğini analiz etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Son çalışmalarda Mitofilin, kaveolin ve α-Actinin-418 gibi çeşitli belirteçler büyük EV'leri tanımlamak için aday olarak önerilmiştir; CD9, büyük EV'lerden ziyade küçük EV'lerde zenginleştirilmiştir ve CD81, CD63 ve Syntenin-1, küçük EV'lerde18'de yaygın olarak bulunur. Western lekesinin sonuçlarına gelince, Mitofilin ve CD9 gibi belirteçler farklı hayvan koşullarında değişkendir. İzole EV'lerin, büyük EV'lerin büyük bir alt popülasyon olduğu karışık bir popülasyonu temsil ettiği varsayılabilir. EV'lerin saflığını doğrulamak için, Lamin B veya Golgin84 gibi organel / nükleer proteinlerin tespitinin negatif kontrol olarak eklenmesi önerilmektedir. Plazma EV'lerine gelince, sonuçlarımıza göre, lipoppartikülleri temsil eden Apoa1, toplanan EV'lerde zenginleştirilmemiştir. Bu yöntemin bir sınırlaması, yüzeydeki proteinleri vezikül içindekilerden ayırt etmenin zor olmasıdır. Bu nedenle, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA), membran protein analizi için tamamlayıcı deneyler olarak uygulanabilir. Dahası, yüksek verimli dizilemenin geliştirilmesiyle, araştırmacılar EV'lerin protein bileşimini analiz etmek için proteomik haritalama33'ten yararlanabilirler, hedef proteinlerin de batı lekesi tarafından doğrulanması gerekir.
Özetle, bu çalışma, dolaşım ve doku EV'lerini izole etmek ve karakterize etmek için, hücre kaynaklarının ve protein içeriklerinin analizi de dahil olmak üzere, daha ileri fonksiyonel deneyler için bir temel oluşturmaya yardımcı olan uygulanabilir bir protokol sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32000974, 81870796, 82170988 ve 81930025) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M663986 ve BX20190380) tarafından desteklenmiştir. Temel Tıp Ulusal Deneysel Öğretim Gösteri Merkezi'nin (AMFU) yardımı için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
- Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
- Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
- In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T.
- Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
- Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
- Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
- Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
- Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
- Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
- Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
- Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
- Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
- Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
