Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

חבילה של כלים אנליטיים מבוססים כדי לחקור את השינוי במצב מוצק של חומרים פעילים מבוססי ליפידים

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/63993
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Research Center Pharmaceutical Engineering, GmbH, 2Institute of Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmaceutical Technology and Biopharmacy, University of Graz

Summary

פרסום זה מציג את היישום של עקיפת קרני רנטגן וקלורימטריה של סריקה דיפרנציאלית כתקני זהב לחקר המצב המוצק של חומרים פעילים מבוססי שומנים (LBEs). הבנת השינוי במצב מוצק ב-LBEs והשפעתו על הביצועים של מוצרים פרמצבטיים הם גורם המפתח לייצור צורות מינון חזקות המבוססות על שומנים.

Abstract

חומרים פעילים מבוססי שומנים (LBEs) הם רעילים נמוכים, תואמים ביולוגית ומבוססים על טבעי, ויישומן תומך בקיימות של ייצור תרופות. עם זאת, האתגר העיקרי הוא מצבם המוצק הלא יציב, המשפיע על יציבות המוצר התרופתי. תכונות פיזיקליות קריטיות של שומנים לעיבודם - כגון טמפרטורת התכה וצמיגות, ריאולוגיה וכו ' - קשורות למבנה המולקולרי שלהם ולגבישיותם. תוספים, כמו גם מתח תרמי ומכני המעורב בתהליך הייצור, משפיעים על מצב מוצק של שומנים ובכך על הביצועים של מוצרים פרמצבטיים שלהם. לכן, הבנת השינוי במצב המוצק היא קריטית. בעבודה זו, השילוב של עקיפת קרני רנטגן אבקה וקלורימטריה של סריקה דיפרנציאלית (DSC) מוצג כתקן הזהב לאפיון המצב המוצק של השומנים. עקיפת קרני רנטגן היא השיטה היעילה ביותר לסינון פולימורפיזם וצמיחת גבישים. הסידור הפולימורפי ואורך הלמלה מאופיינים באזורים הרחבים והקטנים-זוויתיים של עקיפת קרני רנטגן, בהתאמה. ניתן להשתמש באזור פיזור קרני הרנטגן בזווית קטנה (SAXS) כדי לחקור את צמיחת הגבישים. ניתן להצביע על מעבר פאזה והפרדה. DSC משמש לסינון ההתנהגות התרמית של שומנים, להערכת הטעות של תוספים ו/או חומרים פרמצבטיים פעילים (API) במטריצת השומנים, ולספק דיאגרמות פאזה. מוצגים ארבעה מקרי בוחן שבהם LBEs משמשים כחומר ציפוי או כמטריצת אנקפסולציה כדי לספק מערכות מולטי-חלקיקים מצופות שומנים וננו-חלקיקים של שומנים, בהתאמה. מצב מוצק השומנים והשינוי הפוטנציאלי שלו במהלך האחסון נחקרים ומתואמים לשינוי במהדורת ה- API. שיטות מיקרוסקופיות איכותיות כגון מיקרוסקופיית אור מקוטבת ומיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת הן כלים משלימים לחקר התגבשות ברמת המיקרו. יש להוסיף שיטות אנליטיות נוספות המבוססות על תהליך הייצור שנבחר. יש להבין היטב את יחסי המבנה-פונקציה-יכולת העיבוד כדי לתכנן מוצרים פרמצבטיים חזקים ויציבים מבוססי שומנים.

Introduction

ליפידים הם סוג של חומרים המכילים פחמימנים אליפטיים ארוכי שרשרת ונגזרותיהם. הם מכסים מגוון רחב של מבנים כימיים, כולל חומצות שומן, אצילגליצרולים, סטרולים ואסטרים של סטרול, שעווה, פוספוליפידים וספינגוליפידים1. השימוש בליפידים כחומרים פעילים פרמצבטיים החל בשנת 1960 להטמעת תרופות במטריצת שעווה כדי לספק פורמולציות בשחרור מושהה2. מאז, חומרים פעילים מבוססי שומנים (LBEs) זכו לתשומת לב רבה עבור יישומים מגוונים, כגון שחרור תרופות מותאמות, מיסוך טעם, אנקפסולציה של תרופות וזמינות ביולוגית משופרת של תרופות. ניתן ליישם LBEs במגוון רחב של צורות מינון פרמצבטיות באמצעות תהליכי ייצור רב-תכליתיים, כלומר, ציפוי נמס חם, ייבוש בהתזה, שחול שומנים מוצקים, הדפסה תלת-ממדית, טאבלטים והומוגניות בלחץ גבוה, בין היתר. צורות מינון כגון טבליות, יריעות מתפרקות דרך הפה, מערכות מולטי-חלקיקי, ננו-חלקיקים, כדורים וצורות מודפסות בתלת-ממד הן התוצאה 2,3,4.

LBEs הם בעלי מעמד "כללי מוכר כבטוח", רעילות נמוכה, תאימות ביולוגית טובה וסובלנות משופרת של המטופלים. מקורם הטבעי וזמינותם הרחבה מאפשרים להם להעצים ייצור תרופות ירוק ובר קיימא. עם זאת, השימוש ב- LBEs נקשר לצורות מינון לא יציבות. שינויים בתכונות של מוצרים מבוססי שומנים לאחר אחסון דווחו באופן נרחב. המצב המוצק של LBEs וקיומו של פולימורפיזם שומנים נחשבים לסיבות העיקריות לחוסר היציבות של צורות מינון מבוססות שומנים 5,6,7,8.

התכונות המכניות והפיזיקליות של השומנים קשורות קשר הדוק לתכונות ההתגבשות שלהם ולמבנה רשת הגבישים שלהם, המציגה היררכיות מובחנות של ארגון מבני. כאשר שומנים משמשים בייצור מוצרים פרמצבטיים, המבנה הגבישי מושפע מפרמטרים של תהליך המיושם, כגון טמפרטורה, ממיסים אורגניים, גזירה וכוחות מכניים, אשר בתורם משפיעים על הביצועים של המוצר התרופתי 5,7,9,10,11,12 . כדי להבין את הקשר הזה בין מבנה לתפקוד, חשוב לדעת את המימון של התגבשות שומנים ומבנה גבישי ושיטות אנליטיות לסנן אותם.

ברמה המולקולרית, היחידה הקטנה ביותר של גביש שומנים נקראת "תא יחידה". חזרה תלת-ממדית קבועה על תאי יחידה בונה את הסריגים הגבישיים, עם אינטראקציות מולקולריות חזקות יותר לצד הכיוונים הלטרליים שלהם מאשר אלה האורכיים, ומסבירה את הבנייה הרב-שכבתית של גבישי שומנים. האריזה החוזרת ונשנית של שרשראות פחמימנים נקראת תת-תא 1,12,13 (איור 1). Lamellae הם אריזה צידית של מולקולות שומנים. בחבילת הגבישים, הממשקים בין lamellae שונים עשויים מקבוצות קצה מתיל, בעוד שקבוצות הגליצרול הקוטבי ממוקמות בחלקים הפנימיים של lamella14. כדי להבדיל בין כל שרשרת של חומצות שומן בלמלה, נעשה שימוש במונח עלון, המייצג תת-שכבה המורכבת משרשראות בודדות של חומצות שומן. ניתן לסדר אצילגליצרולים באורך שרשרת עלונים כפול (2L) או משולש (3L)14. אנרגיית פני השטח של הלמלה מניעה אותם להיערם זה לזה באופן אפיטקסי, כדי לספק ננו-גבישיות. גורמי עיבוד שונים כגון טמפרטורת הקירור וקצב הקירור משפיעים על מספר הלמלות הערומות ובכך על עובי הגבישיות (~10-100 ננומטר). צבירה של גבישים מובילה להיווצרות של כדורוליטים בקנה מידה זעיר, וצבירה של כדורוליטים מספקת לרשת הגבישים של LBEs התנהגות מקרוסקופית מוגדרת13.

מעברי מצב מוצק מתחילים ברמה המולקולרית. המעבר הגיאומטרי מתת-תא אחד למשנהו נקרא פולימורפיזם. שלושה פולימורפים עיקריים של צורות α, β'-, ו-β נמצאים בדרך כלל באצילגליקרולים, מסודרים על פי יציבות מוגברת. הטיה של הלמלה ביחס לחבורות קצה מתרחשת במהלך מעברים פולימורפיים 1,13. מעברים פולימורפיים בתיווך אחסון ונמסים נחווים על ידי LBEs. מעברי אחסון מתרחשים כאשר הצורה המטא-יציבה מאוחסנת מתחת לטמפרטורת ההיתוך שלה, ואילו מעברים בתיווך נמס מתרחשים כאשר הטמפרטורה עולה מעל נקודת ההיתוך של צורה מטא-יציבה המעוררת התכה והתגבשות רצופה של הצורה היציבה יותר.

יתר על כן, הפרדת פאזות וצמיחת גבישים יכולה להתרחש גם כן. הפרדת פאזות מונעת על ידי התגבשות רב-פאזית ראשונית וצמיחה של שלב אחד או יותר. אינטראקציות בין חלקיקים לחלקיקים, כולל סינטר, אינטראקציות מולקולריות, תכונות מיקרו-מבניות ורכיבים זרים, יכולות גם הן לגרום לצמיחת גביש 1,5.

לניטור מעברי המצב המוצק של LBEs והשפעתם על הביצועים של צורות מינון יש חשיבות משמעותית. בין היתר, קלורימטריה של סריקה דיפרנציאלית (DSC) ודיפרקציה של קרני רנטגן, במיוחד פיזור קרני רנטגן קטן ורחב זווית בו זמנית (SWAXS), הם שני תקני זהב להערכת מצב מוצק שומנים.

DSC משמש בדרך כלל למדידת השינויים האנתלפיים של החומר המעניין הקשור לזרימת החום כפונקציה של זמן וטמפרטורה. השיטה נמצאת בשימוש נרחב לסינון התנהגות תרמית של שומנים, כגון מסלולים אפשריים של התכה והתגבשות, טמפרטורה מתאימה ואנתלפיה של צורות פולימורפיות שונות, כמו גם שברים קלים ועיקריים של הרכבי שומנים. ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי לתאר את ההטרוגניות, שלבים מרובים ופולימורפיזם שומנים 5,7,13.

טכניקות עקיפה של קרני רנטגן הן השיטות החזקות ביותר לקביעת מבנה במצב מוצק. בעל ננו-מבנה מסודר עם למלה חוזרת ונשנית, ניתן לחקור את השתקפות קרן הרנטגן מגבישי שומנים באמצעות חוק בראג:

d = λ/2sinθ (משוואה 1)

כאשר λ הוא אורך גל קרני הרנטגן של 1.542 Å, θ הוא זווית הדיפרקציה של הקרן המפוזרת, ו-d הוא הריווח הבין-מישורי של שכבות חוזרות, המוגדר כאורך למלה בליפידים. האזור בעל הזווית הקטנה של הרנטגן יכול לשמש באופן מושלם כדי לזהות את תבנית הריווח הארוך ולחשב את אורך הלמלה (d). ככל שהמרחק החוזר d גדול יותר, כך זווית הפיזור קטנה יותר (1-15°, אזור בעל זווית קטנה) מכיוון ש-d הוא ביחס הפוך לחטא θ. ניתן לאפיין את סידור תת-התא של השומנים כתבנית הריווח הקצר באזור רחב הזווית של עקיפת קרני הרנטגן. ניתן להשתמש הן בתבניות הריווח הארוכות והן בתבניות הריווח הקצרות של השומנים (אורך למלה וסידור תת-התא) כדי לציין את הטרנספורמציה הפולימורפית המונוטרופית. לדוגמה, ניתן לשנות את צורת α (משושה) לצורת β (טריקליניקה) עקב שינוי בזווית ההטיה של השרשראות, עם שינויים באורך הלמלה (תבנית ריווח ארוך, באזור הזווית הקטנה, 1-15°) ובמצב אריזת החתך (תבנית ריווח קצר, באזור הזווית הרחבה, 16-25°) (איור 2).

המידע המתקבל מאזור SAXS יכול לשמש גם כדי לחקור את גדילת הגביש על ידי מדידת עוביו (D) באמצעות משוואת שרר15:

D = Kλ/FWHMcosθ (משוואה 2)

כאשר, FWHM הוא הרוחב ברדיאנים של מקסימום עקיפה הנמדד בגובה של חצי כיוון בין הרקע לשיא, הידוע בדרך כלל כרוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM); θ היא זווית עקיפה; λ הוא אורך הגל של קרני הרנטגן (1.542 Å) ו- K (קבוע שרר) הוא מספר חסר ממדים המספק מידע על צורת הגביש (במקרה של היעדר מידע צורה מפורט K = 0.9 הוא קירוב טוב). שים לב שניתן להשתמש במשוואת שרר כדי להעריך גדלים גבישיים ממוצעים של עד כ-100 ננומטר מכיוון שהרחבת השיא היא ביחס הפוך לגודל הגבישי. לכן, היישום שלה שימושי לקביעת עובי של ננו-טסיות, ובעקיפין, את מספר lamellae מצטבר. דוגמאות לשימוש בגישה ידועה זו לסינון התכונות הגבישיות של שומנים בפיתוח פורמולציה פרמצבטית וחוסר היציבות המקביל בביצועי המוצר ניתן למצוא ב- 5,12,16,17,18.

ניטור המצב המוצק של LBEs בכל שלב התפתחותי באמצעות טכניקות אנליטיות מבוססות היטב מספק אסטרטגיה יעילה לתכנון תהליכי ייצור בעלי ביצועים גבוהים ומוצרים פרמצבטיים יציבים מבוססי שומנים.

פרסום זה מציג את היישום הקריטי של ניתוח מקיף של מצב מוצק של LBEs לניטור השינויים במצב מוצק והמתאם שלו לשינוי בפרופיל השחרור של חומר תרופתי פעיל (API) מצורת המינון הפרמצבטי. מערכות מולטי-חלקיקים המבוססות על גבישי API מצופים שומנים באמצעות ציפוי נמס חם, ותרחיפים ננו-ליפידים המיוצרים באמצעות הומוגניזציה בלחץ גבוה נלקחים כמקרי בוחן. המוקד של פרסום זה הוא היישום של עקיפת רנטגן אבקה ו- DSC ככלים אנליטיים. שתי הדוגמאות הראשונות מראות את ההשפעה של טרנספורמציה פולימורפית וצמיחת גבישים, בהתאמה, על השינוי בשחרור API מדגימות מצופות. הדוגמה האחרונה חושפת את המתאם בין המצב המוצק היציב של השומנים לבין הביצועים היציבים של המוצר התרופתי במערכות מולטי-חלקיקים מצופות ליפידים ובמתלי ננו-ליפידים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קלורימטריה לסריקה דיפרנציאלית (DSC)

  1. הכנת כלי נגינה
    1. השתמש בקלורימטר סריקה דיפרנציאלי המצויד באינטרקולר, דוגם אוטומטי ובתוכנה לבקרת מכשירים וניתוח נתונים.
    2. הפעל את אספקת גז החנקן והגדר את הלחץ בין 0.2-0.5 בר והפעל את מכשיר ה- DSC ואת מחליף הדגימה האוטומטי.
    3. פתח את התוכנה והפעל את מצב ההמתנה על ידי לחיצה על כפתור כן . אפשר שיווי משקל של המכשיר למשך שעה אחת לפחות
    4. נקה את הכבשן עם חנקן, לחץ על הסמל שיטה חדשה ועבור אל הגדרת שיטה. הפעל את האפשרות אפנון טמפרטורה בחלון הסקירה.  עבור אל הכרטיסייה כותרת ובחר את השיטה על ידי לחיצה על "מדגם".
    5. עבור אל הכרטיסייה תוכנית טמפרטורה, בחר טיהור 2 MFC ועל מגן MFC, שניהם ב 50 מ"ל / דקה.
    6. הוסף את שיטת המדידה הבאה: המתנה ב- 20 ° C, מחזור חימום ב- 5 K / min מ- 20 ° C עד מעל טמפרטורת ההמסה של השומנים, החזקה איזותרמית בטמפרטורה זו למשך 5 דקות, מחזור קירור ל- 0 ° C ב- 5 K / min עד - 20 ° C, טמפרטורת איפוס חירום סופית בטמפרטורה של 10 מעלות צלזיוס מעל הטמפרטורה הגבוהה ביותר של התוכנית, וטמפרטורת המתנה סופית ב-20 מעלות צלזיוס.
    7. עבור אל הכרטיסייה כיול ובחר את קובץ הטמפרטורה והרגישות המתאים. שמור את השיטה
  2. הכנה ומדידה של דגימות
    1. שוקלים 3-4 מ"ג מכל דגימה לכור היתוך מאלומיניום. רשמו את המשקל המדויק המועמס על כל כור היתוך ואטמו את כור ההיתוך מאלומיניום באמצעות מכסה מנוקב.
    2. הנח את כור ההיתוך במגש הדגימה האוטומטית והפעל את מצב הדגימה האוטומטית בתוכנה ובשיטה הקשורה לטעינה עבור כל דגימה.
    3. מלא את מיקום המדגם, שם הדגימה והמשקל של כל דגימה, ואת מיקום כור ההיתוך בחלון תצוגת מגש הדגימה והתחל את המדידות.
  3. ניתוח נתונים
    1. פתח את הנתונים הגולמיים באמצעות התוכנה לניתוח נתונים והתווה את הטמפרטורה לעומת זרימת החום, על ידי לחיצה על הכפתור "X-time / X-temperature"
    2. בחלון המקפץ, לחץ על "הסתר מקטעים איזותרמיים". בצד שמאל של המסך, בחר רק את העקומות שיש לנתח (לדוגמה, בטל את הלחיצה על הנתונים "נוספים").
    3. בדוק את ההתנהגות התרמית של שומנים כאירועים אנדותרמיים ואקסותרמיים של אנרגיה נספגת או משוחררת בצורה של חום, בהתאמה, כפונקציה של טמפרטורה.
    4. לחץ על העקומה, ואחריה הערכה ושטח, כדי לחשב את האנתלפיה של היתוך כשטח שמתחת לעקומת האנדותרמיות.
    5. בחר את גבולות האינטגרציה על-ידי הזזת הקווים האנכיים סביב 2 עד 3 מעלות צלזיוס לפני ואחרי תחילת ונקודת הקצה של השיא.
    6. בחר קו בסיס ליניארי לשילוב השיא. השטח שבין העקומה לקו הבסיס פרופורציונלי לשינוי באנתלפיה. לחץ על החל כדי לסיים את החישוב. באופן דומה, חשב את האנתלפיה של ההתגבשות כשטח שמתחת לעקומת האקסותרמיות
    7. קבע את תחילת טמפרטורת ההיתוך (אל) על ידי לחיצה על העקומה שיש לנתח ולאחר מכן על הערכה ותחילה.
    8. בחר את גבולות הכימות על-ידי הזזת הקווים האנכיים לחלק הישר ביותר של העקומה. זה בדרך כלל סביב 5-10 מעלות צלזיוס לפני ואחרי השיא. לאחר מכן, קבע את טמפרטורת ההיתוך על ידי לחיצה על העקומה שיש לנתח, ואחריה הערכה ושיא. הערך המתקבל הוא מקסימום השיא.

2. פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה ורחבה (SWAXS)

  1. הכנת כלי נגינה
    1. השתמש במערכת פיזור רנטגן, המחברת מצלמה ממוקדת נקודה המקובעת למחולל רנטגן עם צינור אטום ומצוידת ביחידת בקרה ובתוכנות נלוות.
    2. השתמש בקופר (λ = 1.54 Å) ב- 50 kV ו- 1 mA כמקור קרני רנטגן ושני גלאים רגישים הממוקמים ליניארית כדי לכסות אזורי פיזור קרני רנטגן קטנים ורחבים.
    3. ודא דרישות בטיחות כדי להגן מפני חשיפה לקרני רנטגן.
    4. הפעל את מערכת מי הקירור ביחידת הבקרה, במשאבת הוואקום, בשסתומי הגז ובמערכת בקרת החשמל והבטיחות.
    5. הפעל את בקרת המתח ושסתומי הטיהור של הגלאים בזרימת גז בין 10-20 מ"ל/דקה.
    6. הפעל את צינור הרנטגן ואת אפשרות ההמתנה והמתן כ-10 דקות. כבה את מצב ההמתנה והפעל את צינור הרנטגן בעוצמה מלאה (>50kV) והמתן לפחות 30 דקות.
    7. הפעל את תוכנת הבקרה ולחץ על איפוס TPF. בחר מסנן Tugsten והגדר מיקום. עבור אל מיקום כדי לתקן את המיקום של מסנן טונגסטן
  2. הכנה ומדידה של דגימות
    1. ודא שהדגימות זמינות כאבקה עדינה. במידת הצורך, טחנו את הדגימות בעדינות בטמפרטורות נמוכות כדי לספק אבקה דקה.
    2. ממלאים את הדגימות בנימי זכוכית מיוחדים בקוטר חיצוני של כ-2 מ"מ, ונמנעים מכל לכידת אוויר בנימים. אטמו את נימי הזכוכית בשעווה והניחו אותה בזהירות לתוך מחזיק הנימים.
    3. הפעל את המנוע לסיבוב דגימה וסגור את שסתום הוואקום עד שהלחץ יהיה מתחת ל -5 mbar.
    4. בתוכנה, תקן את הגדרת המדידות על ידי בחירת רזולוציית מיקום של 1024. תקן את זמן החשיפה ל- 1200 שניות.
    5. הגדר את מגבלות האנרגיה על ידי לחיצה על הקשה על כלים, לאחר מכן לחץ על אנרגיה ורזולוציה, ולחץ על הפעלה מחדש. הגדר את מגבלות האנרגיה לטווח מתאים בין 400-900.
    6. פתחו את תריס הבטיחות והתחילו במדידות. ודא שחלון המדידה מציג מקסימום של 80 ספירות לשנייה. אם זה לא ניתן, התאם את מיקום המסנן.
  3. ניתוח נתונים
    1. ייצא את הנתונים כקבצי p00. הנתונים מורכבים מעוצמת השידור והקליטה לעומת מספר הערוץ וזווית הדיפרקציה.
    2. העבר את הנתונים להערכה לתוכנה סטטיסטית ותקן את הנתונים על ידי נרמול העוצמות באמצעות מסת הפיזור שנמדדה באמצעות מסנן טונגסטן.
    3. צור עלילה בעוצמה מנורמלת לעומת זווית עקיפה של פי שניים [(2Θ) 2xtheta].
    4. השתמש בפונקציה של "קורא מסך" כדי למצוא פסגות עקיפה באזורי SAXS ו- WAXS.
    5. החל את משוואת בראג כדי לחשב את שיאי הדיפרקציה בעוצמה מרבית לריווח d קצר וארוך עבור אזורי WAXS ו- SAXS, בהתאמה.
    6. חשב את היחסים של מיקום השיא של אזור SAXS כדי לגלות את הסימטריה הגבישית של השומנים (למשל, למלר, משושה, מעוקב).
    7. השתמש בשיא הדיפרקציה הראשי של אזור SAXS כדי לכמת את עובי הגבישיות (D). התאם את הפסגה לפונקציה של גאוס באמצעות ריבועים קלאסיים וקבל את ה- FWHM על ידי לחיצה על אנליזה, פסגות וקווי בסיס, מנתח שיא, תיבת דו-שיח פתוחה.
    8. בחלון המקפץ, בחר באפשרות "התאם פסגות פרו". בחר קו בסיס קבוע עם y = 0, ובחר את שיא הדיפרקציה הראשי של אזור SAXS ולחץ על "התאם שליטה" כדי לבחור את הפרמטרים של התאמת שיא.
    9. בחר את הפונקציה GaussAmp. הגדר את הפרמטרים y_0, xc_1 ו- A_1 כקבועים וקבל את ה- FWHM מההתאמה. השתמש במשוואת שרר כדי לחשב את עובי הגבישיות.

3. בדיקות פירוק

  1. שחרור API ממערכות מולטי-חלקיקים מצופות
    1. השתמש במנגנון USP 2 (משוט) למחקרי פירוק.
    2. ממלאים את כלי בדיקת הפירוק בחיץ פוספט pH 6.8, ומחממים ל 37 מעלות צלזיוס.
    3. שקלו משולשים של דגימות של חלקיקים מצופים המקבילים למנה אחת של API, והכניסו את הדגימות לכלי בדיקה לפירוק.
    4. הפעל את ההנעה במהירות של 100 סל"ד.
    5. הגדר את הדוגם האוטומטי לקחת דגימות של 1 מ"ל בנקודות הדגימה הבאות: 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות, 2 שעות, 4 שעות, 6 שעות, 8 שעות, 10 שעות, 12 שעות, 18 שעות ו- 24 שעות.
    6. נתח את הדגימות בשיטת HPLC מתאימה 5,7,17.
    7. נתח את הנתונים על-ידי התוויית מהדורת ה- API המצטברת לעומת הזמן.
    8. בצע את הניסויים עבור דגימות מאוחסנות לטווח ארוך (25 ° C, 60% לחות יחסית) ומואצת (40 ° C ו 70% לחות יחסית).
  2. שחרור API מננו-חלקיקי ליפידים מוצקים (SLN)
    1. הכינו נוזל ריאות מדומה (SLF) על ידי ערבוב של 0.02% (w/w) של דיפלמיטואילפוספטידילכולין במלח הפוספט של דולבקו (D-PBS), עם ההרכב הבא: KCl (2.683 mM), KH 2 PO 4 (1.47 mM), NaCl (136.893 mM), Na2HPO4· 2H2 O (8.058 mM), CaCl2· 2H2 O (0.884 mM), ו- MgCl2· 6H2O (0.492 mM). מחממים אותו מראש ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. השתמש בקלטות דיאליזה עם שקית קרום תאית של חתך מבוקר של 7,000 Da במשולש עבור כל דגימה.
    3. הקצה קלטת דיאליזה אחת לכל זמן דגימה: 0.5 שעות, 1.5 שעות, 3 שעות, 5 שעות, 7 שעות ו-24 שעות. הרטיבו את קלטות הדיאליזה למשך 2 דקות על ידי טבילתן ב-SLF. לאחר מכן, ייבשו בזהירות את פני השטח שלהם עם מגבות נייר רכות.
    4. להזריק 3 מ"ל של הדגימה (ליפיד-ננו-מוסט), שווה ערך ל-600 מיקרוגרם דקסמתזון, לכל קלטת.
    5. לטבול כל קלטת ב-200 מ"ל של SLF ב-37°C (תנאי כיור) ולהתסיס את המערכת ב-125 סל"ד.
    6. קח דגימות של 200 מ"ג מתוך הקלטת באמצעות מזרק בכל זמן דגימה שנקבע.
    7. קבע את תוכן ה- API באמצעות שיטת HPLC-MSשפותחה 18.
    8. חשב את ה- API ששוחרר מ- SLN לפי איזון מסה, לפי18, בקצרה כהפרש בין הסכום הכולל של API ב- SLN לבין הסכום הנותר של API לאחר הדגימה.
    9. חזור על התהליך עבור דוגמאות מאוחסנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מתאם בין מעבר פולימורפי של שחרור שומנים ו-API בגבישי API מצופים שומנים:
גבישי API המצופים בגליצרול מונוסטארט נמדדים באמצעות DSC ורנטגן מיד לאחר הציפוי ולאחר 3 חודשי אחסון בתנאים מואצים (40 °C, לחות יחסית של 75%)7. גליצריל מונוסטארט היא מערכת רב-פאזית המכילה 40%-55% מונוגליצרידים, 30%-45% דיגליצרידים, ו-5%-15% גליצרידים, בעיקר טריסטארין19. הצורות הפולימורפיות של תת-α, α, β-ראשוניים ו-β מדווחות עבור מונוסטארין20. טריסטארין ו-1, 2-דיסטארין מראים צורות פולימורפיות α, β-ראשוניים ו-β14.

נתוני DSC של דגימות T0 ודגימות המאוחסנות בתנאים מואצים מוצגים באיור 3A. מחזור החימום במדגם T0 הראה אירוע אנדותרם רחב עד 10 מעלות צלזיוס, אשר יכול להיות מתואם למעבר תת-α / α הפיך המתואר עבור 1-מונוסטארין ו-1-מונופלמיטין21. שני אירועים אנדותרמיים ב- To = 54.0 °C ו- 46.7 מתואמים לצורת β ולשלב דו-קיום של נקודת התכה נמוכה יותר. ניתן לראות פאזת דו-קיום בנתוני הרנטגן כמרווח d קצר של 4.16 Å המתאים לצורת α הפולימורפית, המאורגנת בפאזה למלרית של 57.3 Å ומתאימה למרכיבים שונים של התערובת. הסידור הלמלרי של ציפוי השומנים של דגימת T0 ניתן עקב השיא ההרמוני הזמין ב-18.7 Å המתאים להשתקפות מסדר שלישי ב-SAXS diffractogram7 (איור 3B).

נתוני DSC של דגימות לאחר 3 חודשי אחסון בתנאים מואצים מראים אנדותרם ב- To = 55.7 °C, עם שני אירועים חופפים ב- Tm = 60.2 °C עבור צורת α הנותרת וב- Tm = 63.8 °C כאירוע העיקרי להתכה של צורת β. המעבר הפולימורפי מאושר עם נתוני קרני הרנטגן על ידי זיהוי ריווח d קצר של 4.66 Å, 4.58 Å, 4.37 Å, 3.92 Å ו- 3.83 Å, אופייני לצורת β, בשילוב עם הפחתת עובי הלמלה מ- 57.3 Å ל- 50.4 Å, עקב ההטיה המולקולרית7.

השוואת פרופיל השחרור של API מציפוי ב-T0 ולאחר 3 חודשי אחסון בתנאים מואצים (איור 3C) מראה שינוי משמעותי בפרופילי השחרור, אשר ניתן להסבירו על ידי הטרנספורמציה הפולימורפית הניכרת של צורת α לצורת β עם סידור תת-תאי צפוף יותר, וכתוצאה מכך משטח דוחה מים 7,21.

מתאם בין צמיחת גבישים של ציפוי שומנים, הפרדת פאזות פוטנציאלית ושינוי שחרור בגבישי API מצופים שומנים: גבישי API מצופים בתערובת של טריפלמיטין ופוליסורבט 65 ביחס של 90:10 % w/w. טריפלמיטין הוא טריגליצרידים עם טוהר של 99%5. טריגליצרידים מראים בדרך כלל את הצורות הפולימורפיות α, β-פריים ו-β, המסודרות על ידי צפיפות מוגברת של חבילת גבישים ויציבות מוגברת.

Polysorbate 65 הוא מתחלב עם איזון הידרופילי-ליפופילי (HLB) ערך של 10.5 וטמפרטורת התכה של 32 מעלות צלזיוס. טריגליצרידים מתגבשים בדרך כלל בפולימורף α שלהם מהמסה. תוספים מסוימים גורמים לטרנספורמציה של α β של TAGs, ביניהם polysorbate 65. יתר על כן, פוליסורבט 65 פועל כטומאה במערכת, גורם להתגבשות הטרוגנית של טריפלמיטין בכוחות מניעים נמוכים יותר ומעורר צמיחת גבישים.

נתוני ה-DSC וקרני הרנטגן של דגימות T0 ודגימות המאוחסנות בתנאים מואצים מוצגים באיור 4A,B. מחזור החימום של מדידות DSC בדגימת T0 מראה אירוע אנדותרמי חד עם שיא של 64.8 מעלות צלזיוס, המתאים לצורת β הפולימופית של טריפלמיטין5. ניתן לזהות זאת גם באזור WAXS, ולהראות את הריווח הקצר ב-4.6 Å, המאפיין את תת-התא של צורת β (איור 4A,B). הנתונים מראים, בבירור, את צורת β הפולימורפית המושרה של טריפלמיטין בנוכחות פוליסורבט 65 בדגימות T0 וכמובן בדגימות מאוחסנות. עובי הלמלר המתאים מחושב באמצעות משוואת בראג כ- d = 2π/q001 = 42 Å5.

ניתן למדוד את עובי הגביש (D) של דגימות T0 ודגימות מאוחסנות באמצעות משוואת שרר שתוארה לעיל. החישובים מראים עובי גביש של 24 ננומטר בדגימות T0 ועובי מוגבר של 37 ננומטר בדגימות מאוחסנות, המקביל ל-5.7 ו-8.8 למלה, בהתאמה.

השוואת פרופיל השחרור של API מציפוי ב-T0 ולאחר 3 חודשי אחסון בתנאים מואצים מראה שוב שינוי משמעותי בפרופילי השחרור לאחר האחסון (איור 4C).

בשל העובדה כי תערובת של tripalmitin ו polysorbate 65 היא מערכת דו פאזית, הצמיחה הגבישית של tripalmitin מופעלת על ידי קיומו של שלב polysorbate, במיוחד תחת מצב מואץ (40 °C, 75% לחות יחסית) שבו polysorbate 65 הוא בצורתו מותכת נוזלית. מעבר הפאזה וצמיחת פאזה פוליסורבט במצב מואץ נובעים ככל הנראה מתנועה של חומר נוזלי בשל כוחות הקפילריות והכבידה 5,22. התוצאה היא השינוי בשחרור ה-API מציפוי5.

מתאם בין מצב מוצק יציב של שומנים לבין ביצועים יציבים של מוצרים פרמצבטיים מבוססי שומנים: שני מוצרים פרמצבטיים שונים המבוססים על שומנים מוערכים: (א) צורת מינון מוצקה המורכבת מגבישי API המצופים בחומרים פעילים מבוססי שומנים17 ו-(ב) צורת מינון נוזלית המורכבת מננו-חלקיקים תלויים של שומנים-מוצקים הטעונים ב-API18 . ה-LBEs המשמשים לשני המוצרים הם אסטרים פוליגליצרוליים של חומצות שומן (PGFAs), קבוצה של מולקולות שומנים המורכבת מהידרוקסייתרים אוליגומריים של גליצרול שעברו אסטר מלא או חלקי עם חומצות שומן. PGFAs מאופיינים על ידי התגבשות מונופאזית לצורת α, היעדר מעברים פולימורפיים, ויציבות כוללת של המולקולרי, הננו והמיקרו-מבנהשלהם 23.

במוצר הראשון, גבישי API היו מצופים ב-PG3-C16/C18p, PGFA המורכב מ-3 יחידות גליצרול שעברו אסטרציה חלקית עם חומצה פלמיטית וסטארית. נתוני ה-DSC וקרני הרנטגן של דגימות T0 ו-3 חודשים מאוחסנות בתנאים מואצים מוצגים באיור 5. ניתוח DSC (איור 5A) מראה שיא התכה יחיד במחזור החימום הראשון המתאים לקיומה של צורה פולימורפית אחת בלבד של PG3-C16/C18p עם To = 54.2 °C. מחזור הקירור חושף את ההתגבשות המונפזית של השומנים באמצעות קיומה של פסגה אחת בודדת עם Tc = 45.4 מעלות צלזיוס. דגימות מאוחסנות חושפות גם תרמוגרמות ללא שינוי, שאינן מתארות פולימורפיזם וללא הפרדת פאזות. המצב המוצק היציב של PG3-C16/C18p מאושר על-ידי תבניות SWAXS (איור 5B). אזור WAXS מראה שיא המתאים לריווח קצר של d = 4.15 Å ב- T0 ודגימות מאוחסנות17. ריווח d קצר כזה משויך לצורת α של TAGs 1,13. אות ה-WAXS ללא שינוי לאחר האחסון מאשר את היעדר הפולימורפיזם של PG3-C16/C18p. אזור SAXS חושף שיא ראשי בריווח d ארוך של d = 63.7 Å, המתאים למבנה למלרי עם תצורת 2L. גודל הגביש (D) של דגימות T0 המתקבלות באמצעות ניתוח שרר מתאר 23 ננומטר, המקביל לארבע לאמליות מוערמות. לא מוצגים שינויים בעובי הלמלה (63.5 Å) או בצמיחת הגביש (ארבעה lamellae) לאחר האחסון. השוואה של פרופיל השחרור של דגימות T0 ולאחר אחסון (איור 5C) מראה את היציבות יוצאת הדופן של המוצר המפותח. המצב המוצק היציב של מטריצת השומנים המסופק על ידי PG3-C16/C18p מביא לביצועים היציבים של פרופיל השחרור של המוצר17.

עבור המוצר השני, ננו-חלקיקי ליפידים מוצקים טעונים API (SLN) בצורה של ננו-השעיה מימית הוכנו באמצעות PG2-C18f כמטריצת שומנים ופולוקסמר 188 כמתחלב18. PG2-C18f היא מולקולת PGFA המורכבת מ-2 יחידות גליצרול המאוסטרות באופן מלא עם חומצה סטארית. Poloxamer 188 הוא פולימר בלוק לא יוני עם HLB גבוה של 29. המבנה הכימי מורכב מחלקי פוליאוקסיפרופילן ופוליאוקסיאתילן. ה-API עטוף לתוך מטריצת השומנים. בתוך מוצר זה, המצב המוצק של השומנים יכול להיות מושפע לא רק על ידי תנאי העיבוד אלא גם על ידי אינטראקציות מים-ננו-חלקיקים ואינטראקציות מתחלב-שומנים. נתוני ה-DSC והרנטגן של ננו-לוויינים ב-T0 ולאחר 3 חודשי אחסון בתנאים מואצים מוצגים באיור 6. ניתוח DSC מראה אירוע אנדותרמי ב- To = 55.3 °C ואחריו אנדותרם רחב המשתרע עד 100 °C. האירוע הראשון המיוחס להמסת SLN של PG2-C18f והאנדותרם הרחב נובע מאידוי מים. מאחר שפולוקסמר 188 מומס בשלב המים, לא מתואר אנדותרם במחזור הראשון. התנהגות תרמית יציבה מתוארת בניתוח DSC של דגימות מאוחסנות, אשר אינן מראות שינויים. למרות שפולימורפיזם השומנים מואץ בדרך כלל במערכות ננומטריאליות, ניתוח SWAXS מאשר את ההתנהגות היציבה של מטריצת השומנים. ריווח ה-d הקצר שנמדד של 4.15 Å עבור PG2-C18f לאחר התגבשותו ב-SLN שזה עתה יוצר ולאחר 6 חודשים אחסון של דגימות במצב מואץ (6m/AC) מצביע על נוכחות של צורת ה-stableα. עובי הלמלה של PG2-C18f בתוך SLN ב- T0 (56.5 Å) ולאחר האחסון (56.3 Å) אינו מראה שינויים. המבנה הלמלרי של השומנים מעיד על אות הרמוני ב-18.7 Å. גודל הגבישיות (D) של PG2-C18f על ידי ניתוח שרר נמצא כ-10.8 ננומטר (שני לאמלה), ואינו מראה צמיחה גבישית לאחר אחסון הננו-משענים (11.7 ננומטר, שני לאמלה)18. השימוש ב-SLN בתעשיית התרופות הופרע עקב בעיות יציבות שדווחו היטב לאחר אחסון, כגון אגרגציה וג'לציה של חלקיקים, אובדן אנקפסולציה (גירוש API) ופרופיל שחרור לא יציב. במקום זאת, היישום של מטריצת שומנים יציבה, PG2-C18f, כפי שמוצג כאן, מביא לביצועי המוצר המוצגים באיור 7. לא מתוארים אגרגציה של חלקיקים, פרופיל שחרור יציב ויעילות אנקפסולציה יציבה. חוסר היציבות הכללי של SLN מיוחס לפולימורפיזם של שומנים ולמעברי מצב מוצקאחרים 24. שומנים פולימורפיים סובלים ממעברים במהלך האחסון מצורות גבישיות פחות צפופות (צורת α) לצפופות יותר (β-פריים ו-β). מעבר פולימורפי זה יכול להשפיע על שטח הפנים של ננו-חלקיקים מיוצרים, במיוחד אם שטח הפנים אינו מיוצב מספיק על ידי מתחלב. כתוצאה מכך יכול להיות instabilites כגון agglomeration או gelation. כמו כן, השינוי בצפיפות הגביש מ- α ל- β גורם לאובדן שטח מספיק עבור ה- API בתוך מטריצת השומנים, מה שמוביל לסילוק API, שינויים ביעילות האנקפסולציה ופרופיל השחרור. בהתחשב בגודל הקטן של SLN (במחקר זה x50 = 234.3 ננומטר), ההשפעות של גידול גבישים על ביצועי המוצר הופכות להיות קריטיות מדי. השימוש במטריצת שומנים עם מצב מוצק יציב הביא לביצועי מוצר יציבים18.

Figure 1
איור 1: תצורות מזלג המנגינה והכיסא של מולקולת TAG, תת-התא, הלמלה והטסיות הגבישיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תבניות ריווח קצרות (יד שמאל) וריווח ארוך (יד ימין) של טריפלמיטין באזורים בעלי זווית רחבה וזווית קטנה של דיפרקטוגרמות קרני רנטגן, בהתאמה. (A) צורת האלפא, ו-(B) צורת הבטא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: גבישי API מצופים בגליצרול מונוסטארט: ניתוח מצב מוצק של שומנים כחומר ציפוי ופרופיל שחרור API של דגימות טריות (T0) ולאחר אחסון של 3 חודשים בתנאים מואצים (AC). (A) DSC, (B) SWAXS ו-(C) פרופיל שחרור. נתון זה שונהמ-7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: גבישי API מצופים בטריפלמיטין ופוליסורבט 65 (90:10% w/w): ניתוח מצב מוצק של חומר ציפוי ושחרור API של דגימות מוכנות טריות (T0) ולאחר אחסון של 3 חודשים בתנאים מואצים (AC). (A) DSC, (B) SWAXS, (C) פרופיל שחרור API. נתון זה שונהמ-5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: גבישי API מצופים ב-PG3-C16/C18p: ניתוח מצב מוצק של PG3-C16/C18p כחומר ציפוי ופרופיל שחרור API של דגימות מוכנות טריות (T0) ולאחר אחסון של 3 חודשים בתנאים מואצים (AC). (A) DSC, (B) SWAXS, (C) פרופיל שחרור API. נתון זה שונהמ-17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: ניתוח מצב מוצק של דגימות SLN טריות (T0), לאחר אחסון של 3 חודשים בתנאים מואצים (AC), וחומרי ליפידים גולמיים . (A) DSC ו-(B) SWAXS. נתון זה שונהמ-18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: ביצועי מוצר של רשתות SLN טריות (T0) ולאחר אחסון של 3 ו-6 חודשים בתנאים מואצים (3 מ'/AC, 6 מ'/AC). (A) התפלגות גודל החלקיקים, (B) פרופיל שחרור, (C) יעילות אנקפסולציה. נתון זה שונהמ-18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עקיפת קרני רנטגן אבקה ו- DSC תוארו בכתב יד זה כתקני זהב לניתוח מצב מוצק של LBEs. עקיפת קרני רנטגן אבקה יש את היתרון יוצא מן הכלל של עיבוד המדידות באתרו, עם מניפולציה מינימלית של מצב מוצק של דגימות במהלך המדידות. יתר על כן, נימים מלאים זהים ניתן לאחסן בתנאים שונים לאחר מדידות ראשוניות כדי לחקור את השינוי במצב מוצק במהלך האחסון. בעבודה זו התמקדנו באזורים הרחבים והקטנים-זוויתיים של קרני הרנטגן, מה שאפשר לנו לספק נתונים מבניים בממדים של עד כ-100 ננומטר.

ניתן להשתמש באולטרה SAXS (USAXS) למעקב אחר צבירת ננו-טסיות קריסטליות (CNP) וגידול גבישי בממדים גדולים יותר. השיטה יושמה בהצלחה במערכות מסוימות לניתוח גדלי CNP באזור של כ-100 עד 1,000 ננומטר 15,26,27. אפיון גבישי שומנים במערכות נוזליות דורש רזולוציה גבוהה יותר. קרינת סינכרוטרון ומתן שטף רנטגן בעוצמה גבוהה יותר משמשים בדרך כלל לאפיון כזה28. עקיפת קרני רנטגן סינכרוטרון ופיזור נויטרונים בזווית קטנה (SANS) הם כלים רבי עוצמה לאפיון גבישים נוזליים ומערכות תחליב עצמי רב-שכבתיות כגון ליפוזומים, שאינם בהיקפם של מאמר זה25,28,29. ניתן לאפיין את המערכות הנוזליות גם באמצעות מערך קרני הרנטגן המתואר בפרוטוקול על ידי התאמת זמן הקרינה לתקופה ארוכה יותר.

יש לציין את הנקודות הבאות ליישום הרנטגן לסינון המצב המוצק של השומנים והרכבם: (i) באופן כללי, יש לבחור את זמן הקרינה בנפרד, בהתבסס על אופי הדגימות והגדרות הציוד. (ii) עוצמת האותות עומדת ביחס ישר לריכוז החומר בתערובת. לכן, חשוב לסנן, בהתחלה, את התערובת הפיזית של הרכב multiphasic. זה ימנע פרשנות שגויה של נתונים בפיזורים מוצקים אמורפיים (ASDs), אם recrystallization של API אמורפי בהרכב המעובד שלה עם LBE נחקר. כדי לזהות שברים קטנים של גבישים בקומפוזיציות כאלה, חשוב להתקרב לאזורים שבהם צפויים האותות. (iii) טחינת הדגימות כדי לספק אבקה עדינה למילוי נימים צריכה להתבצע בטמפרטורה נמוכה כדי למנוע חום חיצוני ומתח. זה עלול לגרום לשינוי במצב המוצק של השומנים בדגימה. המילוי הצפוף של נימים חשוב כדי למנוע לכידת אוויר בין חלקיקים ולהבטיח פיזור ללא רבב של קרני רנטגן על ידי חלקיקים.

DSC הוא כלי רב עוצמה לסינון ההתנהגות התרמית של שומנים, הערכת הטעות של תוספים ו/או API במטריצת השומנים, ומתן דיאגרמות פאזה. האירוע התרמודינמי, כולל התפרצויות ופסגות ההתכה וההתגבשות, כמו גם האנתלפיה של כל אירוע, מספק מידע שימושי על הצורות הפולימורפיות הזמינות, מעברים פולימורפיים אפשריים ומעברי פאזה שונים. עם זאת, בניגוד לעקיפת קרני רנטגן, החום המופעל במדידות DSC יכול לתמרן את התנהגות המצב המוצק של שומנים ולגרום לפולימורפי ולמעבר פאזה במהלך המדידות. לכן, מומלץ מאוד להימנע משימוש בלעדי בטכניקה זו לניתוח מצב מוצק שומנים. יש להשתמש בשיטה זו כטכניקה משלימה לעקיפת קרני רנטגן. DSC מצומד ודיפרקציה של קרני רנטגן נמצא בשימוש נרחב בתעשיית המזון לניתוח מצב מוצק שומנים 30,31,32,33,34. היישום שלה בתעשיית התרופות מוגבל למדי לזיהוי של שינויים פולימורפיים בממשקי API35,36,37. החיסרון הנוסף של השימוש היחיד ב- DSC הוא אפיון של מערכות שומנים רב-פאזיות, מכיוון שעוצמת האירועים התרמיים תלויה בריכוז. יתר על כן, אירועים תרמיים חופפים יכולים להתרחש. ניתן להשתמש בטמפרטורה-אפנון-DSC לאפיון מערכות רב-פאזיות, המאפשרות הפרדה בין אירועים קינטיים ומעברים חופפים38,39.

יש לציין את הנקודות הבאות ליישום ניסויי DSC המתוארים בפרוטוקול: (i) בהתבסס על הניסויים, ניתן ליישם מחזור חימום שני במידת הצורך. (ii) בשל ההתנהגות המתמדת של קיבולת החום הספציפית (Cp) של שומנים במהלך האנליזה, הבחירה של קו בסיס ליניארי מתאימה. (iii) כדי לקבל את תחילת ההיתוך (To), יש להגדיר את גבולות החישוב. גבולות המינימום והמקסימום צריכים לכלול את הנקודה הקיצונית של עקומת הנגזרת ואת הטווח הליניארי ביותר של קו הבסיס. נקודת ההצטלבות בין המשיק האינפלקטיווי לבין קו הבסיס נקבעת כ- To.

במקרה של תרמוגרמות עם פסגות מופרדות היטב, מומלץ לשקול את האנתלפיה של כל אירוע על ידי חישוב השטח מתחת לעקומה. הנתונים שימושיים כדי להסביר את מידת המעבר הפולימורפי או הפאזה במערכת, בשילוב עם נתוני עקיפת קרני הרנטגן.

כתב יד זה עוסק בתקני הזהב לניתוח LBEs ומוצריהם הפרמצבטיים. שיטות אנליטיות אחרות יכולות לשמש כשיטות משלימות. דוגמאות לכך הן שיטות מיקרוסקופיות איכותיות כגון מיקרוסקופיית אור מקוטבת ומיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת, כדי לחקור את ההשפעה של לחץ תהליכי על קצב ההתגבשות, וכתוצאה מכך על הצורה והמורפולוגיה של גבישים. הגישה של פיתוח מוצרים פרמצבטיים מבוססי שומנים צריכה להתבסס על אפיון של LBEs פיזיקוכימיים, להגדיר את התכונות הקריטיות שלהם הרלוונטיות לתהליכי ייצור נבחרים, ולחזות את יכולת העיבוד שלהם. כמו כן, יש לסנן בקפידה את האינטראקציות excipient-API עבור כל API40 בנפרד. יש להוסיף שיטות אנליטיות נוספות המבוססות על תהליך הייצור שנבחר. יש להבין היטב את יחסי המבנה-פונקציה-יכולת העיבוד כדי לתכנן מוצרים פרמצבטיים חזקים ויציבים מבוססי שומנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים חושפים כל ניגוד עניינים.

Acknowledgments

מרכז המחקר להנדסת תרופות (RCPE) ממומן במסגרת COMET - מרכזי כשירות לטכנולוגיות מצוינות על ידי BMK, BMDW, לנד שטיירמארק ו- SFG. תוכנית השביט מנוהלת על ידי FFG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2·2H2O Sigma-Aldrich 223506
Cassettes with a cellulose membrane bag with a cut-off of 7000 Da, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer 7K Fisher Scientific Inco, USA
Control software of x-ray system HECUS dedicated house equipment
Control unit of x-ray system HECUS dedicated house equipment
Differential scanning calorimeter (DSC) aluminum crucibles and lids Netzsch, Germany
Differential scanning calorimeter DSC 204 F1 Phoenix (NETZSCH, Germany). Netzsch, Germany
Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) Sigma-Aldrich 850355P
Dissolution paddle apparatus II, Erweka DT 828 LH Erweka GmbH, Langen, Germany
Dynasan 116 IOI OLEO Tripalmitin
Geleol Gattefosse Glyceryl monosterarate 
KCl  Sigma-Aldrich 529552
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662
Kolliphor P 188 BASF Chem Trade Poloxamer 188 
MgCl2·6H2O Sigma-Aldrich M2670
Na2HPO4·2H2O Sigma-Aldrich S9763
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Netzsch DSC 204F1 Software Version 8.0.1 Netzsch, Germany 6.239.2-64.51.00
Origin Pro (OriginLab, Northampton, MA) (statistical software OriginLab, Northampton, MA
Proteous Analysis Software Netzsch, Germany
Tween 65 Polysorbate 65
Witepsol PMF 1683 IOI OLEO Triglycerol ester of stearatic/palmitic acid (partially esterified)
Witepsol PMF 282 IOI OLEO Diglycerol ester of stearic acid 
X-ray HECUS system composed of a point-focusing camera and two linearly positioned sensitive detectors HECUS dedicated house equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, K. Crystallization behaviour of fats and lipids a review. Chemical Engineering Science. 56 (7), 2255-2265 (2001).
  2. Becker, K., Salar-Behzadi, S., Zimmer, A. Solvent-free melting techniques for the preparation of lipid-based solid oral formulations. Pharmaceutical Research. 32 (5), 1519-1545 (2015).
  3. Rosiaux, Y., Jannin, V., Hughes, S., Marchaud, D. Solid lipid excipients - Matrix agents for sustained drug delivery. Journal of Controlled Release. 188, 18-30 (2014).
  4. Siepmann, J., et al. Lipids and polymers in pharmaceutical technology: lifelong companions. International Journal of Pharmaceutics. 558, 128-142 (2019).
  5. Lopes, D., et al. Microphase separation in solid lipid dosage forms as the cause of drug release instability. International Journal of Pharmaceutics. 517 (1-2), 403-412 (2017).
  6. Reitz, C., Kleinebudde, P. Solid lipid extrusion of sustained release dosage forms. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 67 (2), 440-448 (2007).
  7. Salar-Behzadi, S., Corzo, C., Schaden, L., Laggner, P., Zimmer, A. Correlation between the solid state of lipid coating and release profile of API from hot melt coated microcapsules. International Journal of Pharmaceutics. 565, 569-578 (2019).
  8. Windbergs, M., Gueres, S., Strachan, C. J., Kleinebudde, P. Two-step solid lipid extrusion as a process to modify dissolution behavior. AAPS PharmSciTech. 11 (1), 2-8 (2010).
  9. Schertel, S., Salar-Behzadi, S., Zimmer, A. Impact of surface properties of core material on the stability of hot melt-coated multiparticulate systems. Pharmaceutics. 13 (3), 366 (2021).
  10. Tang, D., Marangoni, A. G. Microstructure and fractal analysis of fat crystal networks. Journal of the American Oil Chemists' Society. 83, 377-388 (2006).
  11. Corzo, C., et al. Lipid-microparticles for pulmonary delivery of active pharmaceutical ingredients: Impact of lipid crystallization on spray-drying processability. International Journal of Pharmaceutics. 610, 121259 (2021).
  12. Acevedo, N. C. Characterization of the nanostructure of triacylglycerol crystal networks. Structure-Function Analysis of Edible Fats. Marangoni, A. G. , AOCS Press. Urbana, USA. (2012).
  13. Marangoni, A. G. Structure-function analysis of edible fats. Structure-Function Analysis of Edible Fats. , (2018).
  14. Sato, K. Crystallization of lipids. Fundamentals and Applications in Food, Cosmetics, and Pharmaceuticals. Sato, K. , Wiley. Blackwell, NJ, USA. (2018).
  15. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Toward nanoscale engineering of triacylglycerol crystal networks. Crystal Growth and Design. 10 (8), 3334-3339 (2010).
  16. Lopes, D. G., et al. Role of lipid blooming and crystallite size in the performance of highly soluble drug-loaded microcapsules. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (12), 4257-4265 (2015).
  17. Salar-Behzadi, S., et al. Novel approach for overcoming the stability challenges of lipid-based excipients. Part 2: Application of polyglycerol esters of fatty acids as hot melt coating excipients. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 148, 107-117 (2020).
  18. Corzo, C., Meindl, C., Lochmann, D., Reyer, S., Salar-Behzadi, S. Novel approach for overcoming the stability challenges of lipid-based excipients. Part 3: Application of polyglycerol esters of fatty acids for the next generation of solid lipid nanoparticles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 152, 44-55 (2020).
  19. Tylor, A. K. Glyceryl monostearate. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Quinn, M. E. , Pharmaceutical Press and American Pharmacists Association. UK, USA. 290-293 (2009).
  20. Lutton, R. S., Jackson, F. L. The polymorphism of 1- monostearin and 1-monopalmitin. Journal of the American Chemical Society. 70 (7), 2445-2449 (1948).
  21. Fang, W., Mayama, H., Tsujii, K. Spontaneous formation of fractal structures on triglyceride surfaces with reference to their super water-repellent properties. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (3), 564-571 (2007).
  22. Maleky, F., Marangoni, A. Nanoscale effects on oil migration through triacylglycerol polycrystalline colloidal networks. Soft Matter. 7, 6012-6024 (2011).
  23. Corzo, C., et al. Novel approach for overcoming the stability challenges of lipid-based excipients. Part 1: Screening of solid-state and physical properties of polyglycerol esters of fatty acids as advanced pharmaceutical excipients. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 148, 134-147 (2020).
  24. Gordillo-Galeano, A., Mora-Huertas, C. E. Solid lipid nanoparticles and nanostructured lipid carriers: A review emphasizing on particle structure and drug release. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 133, 285-308 (2018).
  25. Fan, Y., Marioli, M., Zhang, K. Analytical characterization of liposomes and other lipid nanoparticles for drug delivery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 192, 113642 (2021).
  26. Peyronel, F., Pink, D. A., Marangoni, A. G. Triglyceride nanocrystal aggregation into polycrystalline colloidal networks: Ultra-small angle X-ray scattering, models and computer simulation. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 19 (5), 459-470 (2014).
  27. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Functionalization of non-interesterified mixtures of fully hydrogenated fats using shear processing. Food and Bioprocess Technology. 7 (2), 575-587 (2014).
  28. Dong, Y. D., Boyd, B. J. Applications of X-ray scattering in pharmaceutical science. International Journal of Pharmaceutics. 417 (1-2), 101-111 (2011).
  29. Di Cola, E., Grillo, I., Ristori, S. Small angle X-ray and neutron scattering: Powerful tools for studying the structure of drug-loaded liposomes. Pharmaceutics. 8 (2), 10 (2016).
  30. Lopez, C., Lesieur, P., Bourgaux, C., Ollivin, M. Thermal and structural behavior of anhydrous milk fat. 3. Influence of cooling rate. Journal of Dairy Science. 88 (2), 511-526 (2005).
  31. Kalnin, D., Garnaud, G., Amenitsch, H. Ollivon. Monitoring fat crystallization in aerated food emulsions by combined DSC and time-resolved synchrotron X-ray diffraction. Food Research International. 35 (10), 927-934 (2002).
  32. Bugeat, S., et al. Unsaturated fatty acid enriched vs. control milk triacylglycerols: Solid and liquid TAG phases examined by Synchrotron radian X-ray diffraction coupled with DSC. Food Research International. 67, 91-101 (2015).
  33. Brubach, J. B., et al. Structural and thermal characterization of glyceryl behenate by X-ray diffraction coupled to differential calorimetry and infrared spectroscopy. International Journal of Pharmaceutics. 336 (2), 248-256 (2007).
  34. Chong, C. L., et al. Thermal and structural behaviour of crude palm oil: Crystallisation at very low cooling rate. European Journal of Lipid Science and Technology. 109 (4), 410-421 (2007).
  35. Askin, S., et al. A simultaneous differential scanning calorimetry-X-ray diffraction study of olanzapine crystallization from amorphous solid dispersions. Molecular Pharmaceutics. 17 (11), 4364-4374 (2020).
  36. Clout, A., et al. Simultaneous differential scanning calorimetry - synchrotron X-ray powder diffraction: A powerful technique for physical form characterization in pharmaceutical materials. Analytical Chemistry. 88 (20), 10111-10117 (2016).
  37. Jendrzejewska, I., Goryczka, T., Pietrasik, E., Klimontko, J., Jampilek, J. X-ray and thermal analysis of selected drugs containing acetaminophen. Molecules. 25 (24), 5909 (2020).
  38. Righetti, M. C. Crystallization of Polymers Investigated by Temperature-Modulated DSC. Materials. 10 (4), 442 (2017).
  39. Sauer, B. B., Kampert, W. G., Neal Blanchard, E., Threefoot, S. A., Hsiao, B. S. Temperature modulated DSC studies of melting and crystallization in polymers exhibiting multiple endotherms. Polymer. 41 (3), 1099-1108 (2000).
  40. Ali, F., Kumar, R., Lal Sahu, P., Singh, G. N. Physicochemical characterization and compatibility study of roflumilast with various pharmaceutical excipients. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 130, 1627-1641 (2017).

Tags

כימיה גיליון 186
חבילה של כלים אנליטיים מבוססים כדי לחקור את השינוי במצב מוצק של חומרים פעילים מבוססי ליפידים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salar-Behzadi, S., Corzo, C.,… More

Salar-Behzadi, S., Corzo, C., Laggner, P. A Package of Established Analytical Tools to Investigate the Solid-State Alteration of Lipid-Based Excipients. J. Vis. Exp. (186), e63993, doi:10.3791/63993 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter