Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

一套成熟的分析工具，用于研究脂质赋形剂的固态变化

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/63993
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Research Center Pharmaceutical Engineering, GmbH, 2Institute of Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmaceutical Technology and Biopharmacy, University of Graz

Summary

该出版物展示了X射线衍射和差示扫描量热法作为研究脂质赋形剂（LBEs）固态的金标准的应用。了解LBEs的固态变化及其对医药产品性能的影响是生产稳健的脂质剂型的关键因素。

Abstract

脂质赋形剂 （LBE） 具有低毒、生物相容性和天然性，其应用支持制药生产的可持续性。然而，主要的挑战是它们的固态不稳定，影响了药品的稳定性。用于加工的脂质的关键物理性质（例如熔体温度和粘度，流变性等）与其分子结构和结晶度有关。添加剂以及制造过程中涉及的热应力和机械应力会影响脂质的固态，从而影响其药品的性能。因此，了解固态的变化至关重要。在这项工作中，引入了粉末X射线衍射和差示扫描量热法（DSC）的组合作为表征脂质固态的金标准。X射线衍射是筛选多晶型和晶体生长的最有效方法。X射线衍射的多晶型排列和薄片长度分别表征了广角和小角区域。小角X射线散射（SAXS）区域可以进一步用于研究晶体生长。可以指示相变和分离。DSC用于筛选脂质的热行为，估计脂质基质中添加剂和/或活性药物成分（API）的混溶性，并提供相图。介绍了四个案例研究，其中LBEs分别用作包衣材料或封装基质以提供脂质包覆的多颗粒系统和脂质纳米悬浮液。研究了脂质固态及其在储存过程中的潜在变化，并与API释放中的改变相关。定性显微镜方法，如偏振光显微镜和扫描电子显微镜是研究微观水平结晶的补充工具。应根据所选的制造工艺添加进一步的分析方法。应仔细了解结构-功能-加工性关系，以设计稳健稳定的脂质基药品。

Introduction

脂质是一类含有长链脂肪烃及其衍生物的材料。它们涵盖了广泛的化学结构，包括脂肪酸、酰基甘油、甾醇和甾醇酯、蜡、磷脂和鞘脂1。脂质作为药用赋形剂的使用始于1960年，用于将药物包埋在蜡基质中以提供缓释制剂2。此后，脂质赋形剂（LBEs）在改良药物释放、掩味、药物包封和提高药物生物利用度等各种应用中受到广泛关注。LBEs可以通过多功能制造工艺应用于各种药物剂型，即热熔包衣，喷雾干燥，固体脂质挤出，3D打印，压片和高压均质等。片剂、口腔崩解膜、多颗粒系统、纳米和微粒、颗粒和 3D 打印形式等剂型的结果是2，3，4。

LBE具有“一般公认的安全”状态，毒性低，生物相容性好，患者耐受性更高。它们的天然来源和广泛的可用性使它们能够为绿色和可持续的制药生产赋能。然而，LBE的使用与不稳定的剂型有关。储存后脂质基产品性质的改变已被广泛报道。LBEs的固态和脂质多态性的存在被认为是脂质基剂型5，6，7，8不稳定的主要原因。

脂质的力学和物理性质与其结晶性质及其晶体网络结构密切相关，表现出不同的结构组织层次。当脂质用于药品制造时，晶体结构受所施加的工艺参数的影响，例如温度、有机溶剂、剪切力和机械力，进而影响药品的性能5，7，9，10，11，12.要了解这种结构-功能关系，重要的是要了解脂质结晶的基础和晶体结构以及筛选它们的分析方法。

在分子水平上，脂质晶体的最小单位称为“晶胞”。晶胞的常规三维重复构建晶格，其横向比纵向具有更强的分子相互作用，这解释了脂质晶体的分层构造。烃链的重复横截面填料称为子电池1，12，13（图1）。薄片是脂质分子的横向堆积。在晶体封装中，不同薄片之间的界面由甲基端基组成，而极性甘油基团位于薄片14的内部部分。为了区分薄片中的每个脂肪酸链，使用了术语小叶，它表示由单个脂肪酸链组成的亚层。酰基甘油可以排列成双（2L）或三（3L）小叶链长度14。薄片的表面能驱使它们外延地相互堆叠，以提供纳米微晶。不同的加工因素，如冷却温度和速率，影响堆叠薄片的数量，从而影响微晶厚度（~10-100nm）。微晶的聚集导致微尺度上球晶的形成，球晶的聚集为LBEs的晶体网络提供了明确的宏观行为13。

固态跃迁始于分子水平。从一个子单元到另一个子单元的几何过渡称为多态性。α-、β'-和β-形式的三种主要多晶型通常在酰基甘油中发现，根据增加的稳定性排序。薄片相对于端基的倾斜发生在多态性转变1，13期间。LBE经历了存储和熔体介导的多态性转变。当亚稳形式储存在其熔融温度以下时，就会发生储存转变，而熔融介导的转变发生在温度上升到亚稳形式的熔点以上时，从而引发更稳定形式的熔化和连续结晶。

此外，还可能发生相分离和晶体生长。相分离由初始多相结晶和一相或多相生长驱动。颗粒-颗粒相互作用，包括烧结、分子相互作用、微观结构特征和外来成分，也可以触发晶体生长1，5。

监测LBE的固态转变及其对剂型性能的影响非常重要。其中，差示扫描量热法（DSC）和X射线衍射，特别是同步小角和广角X射线散射（SWAXS），是评估脂质固态的两个黄金标准。

DSC通常用于测量与热流相关的目标材料的焓变化，作为时间和温度的函数。该方法广泛用于筛选脂质的热行为，例如可能的熔融和结晶途径，不同多晶型的相应温度和焓，以及脂质组合物的次要和主要部分。这些数据可用于描述异质性、多相和脂质多态性5，7，13。

X射线衍射技术是测定固态结构的最有力方法。具有具有重复薄片的有序纳米结构，可以使用布拉格定律研究脂质晶体的X射线束反射：

d = λ/2sinθ （公式 1）

其中λ是1.542 Å的X射线波长，θ是散射光束的衍射角，d是重复层的平面间距，定义为脂质中的薄片长度。X射线的小角度区域可以完美地用于检测长间距图案并计算薄片长度（d）。重复距离d越大，散射角越小（1-15°，小角度区域），因为d与sin θ成反比。脂质的亚细胞排列可以表征为X射线衍射广角区域中的短间距图案。脂质的长间距和短间距模式（薄片长度和亚细胞排列）都可用于指示单向性多态性转化。例如，由于链条倾斜角度的变化，α形（六角形）可以更改为β（三斜线），薄片长度（长间距图案，在小角度区域，1-15°）和横截面堆积模式（短间距图案，在广角区域，16-25°）（图2）。

从SAXS区域获得的信息可以通过Scherrer方程15测量其厚度（D）来进一步用于研究晶体生长：

D = Kλ/FWHMcosθ（公式 2）

其中，FWHM是在背景和峰值之间的一半高度处测量的衍射最大值的弧度宽度，通常称为半峰全宽（FWHM）;θ 是衍射角;λ是X射线波长（1.542 Å），K（谢勒常数）是一个无量纲数，提供有关晶体形状的信息（在没有详细形状信息的情况下，K = 0.9是一个很好的近似值）。请注意，Scherrer方程可用于估计高达约100nm的平均晶体尺寸，因为峰展宽与微晶尺寸成反比。因此，其应用可用于确定纳米片的厚度，并间接确定聚集薄片的数量。在药物制剂开发中使用这种公知的方法筛选脂质的晶体性质以及产品性能的相应不稳定性的例子可以在5，12，16，17，18中找到。

通过成熟的分析技术监测每个发育阶段LBE的固态，为设计高性能制造工艺和稳定的脂质基药品提供了有效的策略。

本出版物介绍了LBEs的综合固态分析在监测固态变化及其与药物剂型中活性药物成分（API）释放曲线变化的相关性方面的关键应用。以基于热熔包覆脂质的API晶体的多颗粒体系和通过高压均质生产的纳米脂质悬浮液为例。本出版物的重点是粉末X射线衍射和DSC作为分析工具的应用。前两个示例分别显示了多晶型转变和晶体生长对包被样品API释放变化的影响。最后一个例子揭示了脂质的稳定固态与药物产品在脂质包被的多颗粒系统和纳米脂质悬浮液中的稳定性能之间的相关性。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 差示扫描量热法

  1. 仪器准备
    1. 使用配备内冷器、自动进样器和软件的差示扫描量热仪进行仪器控制和数据分析。
    2. 打开氮气供应并将压力设置在 0.2–0.5 bar 之间，然后打开 DSC 仪器和自动进样器的电源。
    3. 打开软件并通过单击激活待机模式 是 按钮。允许设备平衡至少一小时
    4. 用氮气吹扫炉子，单击“新方法”图标并转到“方法定义”。激活概览窗口中的温度调制选项。 转到 标题 选项卡，然后单击“示例”选择方法。
    5. 转到“温度程序”选项卡，选择“清除 2 MFC”和“保护性 MFC”，均以 50 mL/min 的速度进行。
    6. 插入以下测量方法：待机在20°C，从20°C以5K/min加热循环至脂质熔融温度以上，在此温度下等温保持5分钟，冷却循环至0°C，5K/min至-20°C，最终紧急复位温度高于程序最高温度10°C， 最终待机温度为20°C。
    7. 转到校准选项卡并选择适当的温度和灵敏度文件。保存方法
  2. 样品制备和测量
    1. 称取每个样品的3-4毫克到铝坩埚中。记录装入每个坩埚的确切重量，并用带孔的盖子密封铝制坩埚。
    2. 将坩埚放入自动进样器托盘中，并在软件中激活自动进样器模式，并为每个样品加载相关方法。
    3. 在样品盘视图窗口中填写每个样品的样品位置、样品名称和重量，以及参考坩埚的位置，然后开始测量。
  3. 数据分析
    1. 使用软件打开原始数据进行数据分析，并通过单击“X时间/ X温度”按钮绘制温度与热流的关系
    2. 在弹出的窗口中，单击“隐藏等温段”。在屏幕左侧，仅选择要分析的曲线（例如，取消单击“其他”数据）。
    3. 检查脂质的热行为，分别作为以热量形式吸收或释放能量的吸热和放热事件作为温度的函数。
    4. 单击曲线，然后单击评估和面积，将融合焓计算为吸热曲线下的面积。
    5. 通过在峰值的开始和终点前后移动垂直线大约 2 到 3 摄氏度来选择积分边界。
    6. 为峰积分选择线性基线。曲线和基线之间的面积与焓的变化成正比。单击“应用”以完成计算。同样，将结晶焓计算为放热曲线下的面积
    7. 通过单击要分析的曲线，然后单击评估和开始来确定熔化温度（To）的开始。
    8. 通过将垂直线移动到曲线的最直部分来选择量化边界。这通常在峰值前后的5-10°C左右。然后，通过单击要分析的曲线来确定熔化温度，然后单击评估和峰值。获得的值是峰值最大值。

2. 小角和广角 X 射线散射 （SWAXS）

  1. 仪器准备
    1. 使用X射线散射系统，将点聚焦相机固定在密封管X射线发生器上，并配备控制单元和相关软件。
    2. 使用50 kV和1 mA的cooper（λ = 1.54 Å）作为X射线源和两个线性定位的敏感探测器，以覆盖小角和广角X射线散射区域。
    3. 确保安全要求以防止 X 射线暴露。
    4. 打开控制单元、真空泵、气阀以及动力和安全控制系统上的冷却水系统。
    5. 在 10–20 mL/min 的气体流量下打开检测器的电压控制和吹扫阀。
    6. 打开 X 射线管和待机选项并等待大约 10 分钟。关闭待机模式并将 X 射线管通电至全功率 （>50kV） 并等待至少 30 分钟。
    7. 启动控制软件，然后单击重置TPF。选择Tugsten过滤器并设置位置。转到位置以固定钨过滤器的位置
  2. 样品制备和测量
    1. 确保样品以细粉形式提供。如有必要，在低温下轻轻研磨样品以提供细粉。
    2. 将样品填充到外径约为 2 mm 的特殊玻璃毛细管中，避免毛细管中的任何空气滞留。用蜡密封玻璃毛细管，然后小心地将其放入毛细管支架中。
    3. 打开电机进行样品旋转并关闭真空阀，直到压力低于 5 mbar。
    4. 在软件中，通过选择位置分辨率 1024 来修复测量设置。将曝光时间固定为 1200 秒。
    5. 通过单击点击设置能量限制工具，然后单击能量和分辨率，然后单击重新启动。将能量限制设置为400-900之间的合适范围。
    6. 打开安全快门并开始测量。确保测量窗口每秒最多显示 80 个计数。如果未给出，请调整过滤器位置。
  3. 数据分析
    1. 将数据导出为 p00 文件。数据包括透射和吸收强度与通道数和衍射角的关系。
    2. 将用于评估的数据传输到统计软件，并使用钨滤光片测量的散射质量对强度进行归一化，从而校正数据。
    3. 创建归一化强度与衍射角 [（2Θ） 2xtheta] 两倍的图。
    4. 使用“屏幕阅读器”功能查找SAXS和WAXS区域的衍射峰。
    5. 应用布拉格方程分别计算WAXS和SAXS区域的短d间距和长d间距的最大衍射峰。
    6. 计算SAXS区域的峰位置的比率，以找出脂质的晶体对称性（例如，层状，六角形，立方体）。
    7. 使用SAXS区域的主衍射峰来量化微晶厚度（D）。通过经典最小二乘 法将 峰拟合到高斯函数中，并通过单击“分析”、“峰和基线”、“峰值分析器”、“打开”对话框获得FWHM。
    8. 在弹出的窗口中，选择选项“Fit Peaks Pro”。选择y = 0的恒定基线，选择SAXS区域的主衍射峰，然后单击“拟合控制”以选择峰拟合参数。
    9. 选择高桑普函数。将参数y_0、xc_1和A_1设置为固定，并从拟合中获取 FWHM。使用谢勒方程计算微晶厚度。

3. 溶出度测试

  1. 包衣多颗粒系统中的API释放
    1. 使用 USP 仪器 2（桨）进行溶出度研究。
    2. 用磷酸盐缓冲液pH 6.8填充溶出度测试容器，并加热至37°C。
    3. 称量相当于单剂量API的包被颗粒样品一式三份，并将样品放入溶出度测试容器中。
    4. 以 100 rpm 的速度启动桨。
    5. 将自动进样器设置为在以下采样点采集 1 mL 的样品：30 分钟、60 分钟、90 分钟、2 小时、4 小时、6 小时、8 小时、10 小时、12 小时、18 小时和 24 小时。
    6. 通过合适的HPLC方法5，7，17分析样品。
    7. 通过绘制累积 API 版本与时间的关系来分析数据。
    8. 在长期（25°C，60%相对湿度）和加速（40°C和70%相对湿度）下对储存的样品进行实验。
  2. 从固体脂质纳米颗粒 （SLN） 中释放 API
    1. 通过在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）中混合0.02%（w / w）的二棕榈酰磷脂酰胆碱来制备模拟肺液（SLF），其组成如下：KCl（2.683 mM），KH 2 PO 4（1.47 mM），NaCl（136.893 mM），Na2HPO4·2H2O （8.058 mM）， 氯化钙2·2H2O （0.884 mM），和 MgCl2·6H2O （0.492 mM）。在37°C下预热。
    2. 使用带有纤维素膜袋的透析盒，每个样品一式三份，受控截止值为7，000 Da。
    3. 为每个采样时间分配一个透析盒：0.5小时，1.5小时，3小时，5小时，7小时和24小时。通过将透析盒浸入SLF中，将透析盒水合2分钟。然后，用柔软的纸巾小心地擦干它们的表面。
    4. 将 3 mL 样品（脂质纳米悬浮液），相当于 600 μg 地塞米松注入每个盒中。
    5. 将每个盒浸入 37 °C（下沉条件）的 200 mL SLF 中，并以 125 rpm 的速度搅拌系统。
    6. 在每个确定的采样时间使用注射器从盒内取200mg样品。
    7. 使用开发的HPLC-MS方法18测定API含量。
    8. 根据18，通过质量平衡计算SLN释放的API，简要为SLN中API总量与采样后剩余API量的差额。
    9. 对存储的样品重复该过程。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

脂质多态转变与脂质包被API晶体中API释放的相关性：
涂有甘油单硬脂酸酯的API晶体在包被后直接通过DSC和X射线 进行 测量，并在加速条件（40°C，75%相对湿度）下储存3个月后7。单硬脂酸甘油酯是一种多相系统，含有40%-55%的甘油单酯、30%-45%的甘油二酯和5%-15%的甘油酯，主要是三硬脂酸19。据报道，单硬脂酸20 的亚α、α、β素数和β的多态性。三硬脂蛋白和 1，2-二硬脂蛋白显示α、β素数和β多态型14。

T0样品和加速条件下储存的样品的DSC数据如图 3A所示。T0样品的加热循环显示出高达10°C的宽吸热事件，这可能与描述的1-单硬脂酸和1-单棕榈酸21的可逆亚α/α转变相关。To = 54.0 °C和46.7的两个吸热事件与较低熔点的β型和共存相相关。在X射线数据中可以看到共存相，作为4.16 Å的短d间距对应于多晶型α形式，以57.3 Å的层状相组织，对应于混合物的不同成分。由于 18.7 Å 处的可用谐波峰对应于 SAXS 衍射图 7 中的三阶反射，因此给出了 T0 样品脂质涂层的层状排列（图 3B）。

在加速条件下储存3个月的样品DSC数据显示，在To = 55.7 °C时吸热，剩余α型在Tm = 60.2 °C和Tm = 63.8 °C时的两个重叠事件作为β型熔化的主要事件。通过检测 4.66 Å、4.58 Å、4.37 Å、3.92 Å 和 3.83 Å 的短 d 间距，通过 X 射线数据确认多态转变，这是β型的典型特征，再加上由于分子倾斜7，薄片厚度从 57.3 Å 减少到 50.4 Å。

比较API在T0涂层和在加速条件下储存3个月后的释放曲线（图3C）显示释放曲线的显着变化，这可以通过α型到β型的明显多态性转变来解释，具有更密集的亚细胞排列，导致防水表面7，21。

脂质包被的API晶体的晶体生长，潜在的相分离和释放改变之间的相关性：API晶体以90：10 %w/w的比例包被三帕尔米丁和聚山梨酯65的混合物。三棕榈素是一种甘油三酯，纯度为99%5。甘油三酯通常显示α、β素数和β多晶型形式，按晶体堆密度增加和稳定性增加排序。

聚山梨酯65是一种乳化剂，亲水亲脂平衡（HLB）值为10.5，熔融温度为32°C。 甘油三酯通常从熔体中以α多晶型结晶。某些添加剂诱导α转化为TAG的β，其中包括聚山梨酯65。此外，聚山梨酯65在系统中充当杂质，在较低的驱动力下导致三帕尔米丁的非均相结晶并触发晶体生长。

T0样品和加速条件下储存的样品的DSC和X射线数据如图 4A，B所示。T0样品上DSC测量的加热循环显示出尖锐的吸热事件，在64.8 °C处达到峰值，对应于三帕尔米丁5的多渗β形式。这在WAXS区域也可以检测到，显示出4.6 Å处的短间距，这是β型亚细胞的特征（图4A，B）。数据清楚地显示了在T0样品中，当然在储存的样品中，在聚山梨酯65存在下诱导的三帕尔米丁的多态型β形式。相应的层状厚度使用布拉格方程计算，如d = 2π/q001 = 42 Å5。

T0样品和储存样品的晶体厚度（D）可以使用上述Scherrer方程进行测量。计算显示，T0样品中的晶体厚度为24 nm，储存样品中的厚度增加了37 nm，分别对应于5.7和8.8片。

比较API在T0包衣和在加速条件下储存3个月后的释放曲线再次显示储存后释放曲线的显着变化（图4C）。

由于三帕尔米丁和聚山梨酯65的混合物是一个两相系统，三帕尔米丁的微晶生长是由聚山梨酯相的存在触发的，特别是在加速条件下（40°C，75%相对湿度），其中聚山梨酯65处于液态熔融形式。加速条件下聚山梨酯相的相变和生长很可能是由于毛细作用和重力5，22引起的液体材料的运动。其结果是涂层5 的 API 释放发生变化。

脂质的稳定固态与脂质基药品的稳定性能之间的相关性：评估了两种不同的脂质基制药产品：（a）由涂有脂质赋形剂的API晶体组成的固体剂型17和（b）由负载有API18的悬浮固体脂质纳米颗粒组成的液体剂型.两种产品使用的LBEs都是脂肪酸聚甘油酯（PGFAs），这是一组脂质分子，由完全或部分与脂肪酸酯化的甘油低聚羟基醚组成。PGFA的特征是单相结晶成α形式，没有多晶型转变，以及其分子，纳米和微观结构的整体稳定性23。

在第一个产品中，API晶体涂覆PG3-C16 / C18p，PGFA由3个甘油单元组成，部分用棕榈酸和硬脂酸酯化。T0和3个月储存样品在加速条件下的DSC和X射线数据如图5所示。DSC分析（图5A）显示第一个加热循环中的单个熔解峰对应于仅存在一种多晶型的PG3-C16 / C18p，To = 54.2°C。 冷却循环通过存在一个Tc=45.4°C的单峰来揭示脂质的单相结晶。 储存的样品也显示出不变的热图，它没有多态性，也没有相分离。PG3-C16/C18p的稳定固态由SWAXS模式证实（图5B）。WAXS区域显示对应于T0和存储样品17中d = 4.15 Å的短间距的峰。这种短的d间距与TAG的α形式1，13有关。储存后未改变的WAXS信号证实了PG3-C16 / C18p不存在多态性。 SAXS区域在d = 63.7 Å的长d间距处显示主峰，对应于具有2L构型的层状结构。通过Scherrer分析获得的T0样品的微晶尺寸（D）描绘了23nm，对应于四个堆叠的薄片。储存后没有显示薄片厚度（63.5 Å）或晶体生长（四个薄片）的变化。T0样品和储存后的释放曲线（图5C）的比较显示了开发产品的出色稳定性。PG3-C16/C18p提供的脂质基质的稳定固态导致产物释放曲线的稳定性能17。

对于第二种产品，以PG2-C18f为脂质基质，泊洛沙姆188为乳化剂18，制备了水性纳米悬浮液形式的API负载固体脂质纳米颗粒（SLN）。PG2-C18f是一种PGFA分子，由2个甘油单元与硬脂酸完全酯化组成。泊洛沙姆188是一种非离子嵌段聚合物，HLB高达29。化学结构由聚氧丙烯和聚氧乙烯部分组成。API被封装到脂质基质中。在该产品中，脂质的固态不仅会受到加工条件的影响，还会受到水-纳米颗粒相互作用和乳化剂-脂质相互作用的影响。纳米悬浮液在T0和加速条件下储存3个月后的DSC和X射线数据如图 6所示。DSC分析显示，在To = 55.3°C时发生吸热事件，随后出现宽吸热，直至100°C。 PG2-C18f的SLN熔化和宽吸热的第一个事件是由于水蒸发。由于泊洛沙姆188溶解在水相中，因此在第一个循环中没有描述吸热。在存储样品的DSC分析中描述了稳定的热行为，没有显示任何变化。尽管脂质多态性通常在纳米级系统中加速，但SWAXS分析证实了脂质基质的稳定行为。PG2-C18f在新制造的SLN中结晶后以及在加速条件（6m / AC）下储存样品6个月后，测得的4.15 Å的短d间距表明存在稳定α形式。SLN内PG2-C18f在T0（56.5 Å）和储存后（56.3 Å）的薄片厚度没有变化。脂质的层状结构由18.7 Å处的谐波信号证明。通过Scherrer分析发现PG2-C18f的微晶尺寸（D）为10.8nm（两个薄片），在储存纳米悬浮液（11.7nm，两个薄片）后没有晶体生长18。由于充分报告的储存后的稳定性问题，例如颗粒团聚和凝胶化、包封丢失（API 排出）和不稳定的释放曲线，SLN 在制药行业的使用受到阻碍。相反，应用稳定的脂质基质PG2-C18f，如本文所示，导致产品性能如图 7所示。描绘了无颗粒团聚、稳定的释放曲线和稳定的包封效率。SLN的一般不稳定性归因于脂质多态性和其他固态转变24。多晶型脂质在储存过程中从密度较低的晶型（α型）转变为密度较高的晶型（β素数和β）。这种多晶型转变会影响制造的纳米颗粒的表面积，特别是如果乳化剂不能充分稳定表面积。结果可能是不稳定的，例如团聚或凝胶化。此外，晶体密度从α到β的改变会导致脂质基质中API失去足够的空间，从而导致API排出，包封效率和释放曲线发生变化。考虑到SLN的小尺寸（在本研究中x50 = 234.3 nm），晶体生长对产品性能的影响也变得至关重要。使用具有稳定固态的脂质基质可实现稳定的产品性能18。

Figure 1
图 1：TAG 分子、亚细胞、薄片和结晶血小板的调叉和椅子配置。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图 2：三帕尔米丁的短间距（左侧）和长间距（右侧）图案分别在 X 射线衍射图的广角和小角度区域中。 （A）α形式，和（B）β形式。请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3：涂有甘油单硬脂酸酯的API晶体：脂质作为包衣材料的固态分析和新鲜制备的样品（T0）和在加速条件下储存3个月后（AC）的API释放曲线。 （A）DSC，（B）SWAXS和（C）释放曲线。这个数字是从7修改的。请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4：涂有三帕尔米丁和聚山梨酯 65 （90：10 %w/w） 的 API 晶体：包衣材料的固态分析和新鲜制备样品 （T0） 和在加速条件下储存 3 个月后 API 释放。 （A）DSC，（B）SWAXS，（C）API释放概况。这个数字是从5修改而来的。请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图 5：涂有 PG3-C16/C18p 的 API 晶体：PG3-C16/C18p 作为包被材料的固态分析和新鲜制备样品 （T0） 和在加速条件下储存 3 个月后 API 释放曲线 （AC）。 （A）DSC，（B）SWAXS，（C）API发布配置文件。这个数字是从17修改的。请点击此处查看此图的大图。

Figure 6
图 6：在加速条件下 （AC） 下储存 3 个月后新鲜制备的 SLN 样品 （T0） 和原始脂质赋形剂的固态分析 。 （A） DSC 和 （B） SWAXS。这个数字是从18修改的。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 7
图 7：新鲜制备的 SLN （T0） 以及加速条件下储存 3 个月和 6 个月后的产品性能（3m/AC、6m/AC）。 （A）粒度分布，（B）释放曲线，（C）包封效率。这个数字是从18修改的。 请点击此处查看此图的大图。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

粉末X射线衍射和DSC在本手稿中被描述为LBE固态分析的金标准。粉末X射线衍射具有原 位处理测量的突出优势，在测量过程中对样品的固态操作最少。此外，相同填充的毛细管可以在初始测量后在不同条件下储存，以研究储存过程中的固态变化。在这项工作中，我们专注于X射线的广角和小角区域，使我们能够提供尺寸高达约100 nm的结构数据。

Ultra SAXS （USAXS） 可用于跟踪微晶纳米片 （CNP） 聚集和更大尺寸的晶体生长。该方法已成功应用于特定系统，以分析大约100至1，000nm范围内的CNP尺寸15，26，27。表征液体系统中的脂质晶体需要更高的分辨率。同步辐射和提供更高强度的X射线通量通常用于这种表征28。同步加速器X射线衍射和小角中子散射（SANS）是表征液晶和多层自乳化系统（如脂质体）的有力工具，这些系统不属于本文25，28，29的范围。液体系统还可以使用协议中描述的X射线设置，通过调整更长的辐射时间来表征。

在实施X射线以筛选脂质及其组合物的固态时，需要注意以下几点：（i）通常，应根据样品的性质和设备设置单独选择辐射时间。（ii） 信号强度与混合物中的材料浓度成正比。因此，首先筛选多相组合物的物理混合物非常重要。如果研究非晶态API在其处理组合物中使用LBE的重结晶，这将避免对无定形固体分散体（ASD）中数据的错误解释。为了检测此类组合物中的小部分晶体，放大预期信号的区域非常重要。 （iii） 研磨样品以提供填充毛细管的细粉应在低温下进行，以避免外部热量和应力。这可能会导致样品中脂质固态的改变。毛细管的密集填充对于避免颗粒之间的空气滞留和确保颗粒对X射线的无瑕散射非常重要。

DSC是一种强大的工具，用于筛选脂质的热行为，估计脂质基质中添加剂和/或API的混溶性，并提供相图。热力学事件，包括熔融和结晶的开始和峰值，以及每个事件的焓，提供了有关可用多晶型形式、可能的多晶型转变和不同相变的有用信息。然而，与X射线衍射相反，DSC测量中施加的热量可以操纵脂质的固态行为，并在测量过程中引起多晶型和相变。因此，强烈建议避免将该技术单独用于脂质固态分析。这种方法应用作X射线衍射的补充技术。耦合DSC和X射线衍射已广泛用于食品工业中的脂质固态分析30，31，32，33，34。它在制药工业中的应用相当局限于检测API35，36，37的多态性变化。单独使用DSC的另一个缺点是表征多相脂质系统，因为热事件的强度与浓度有关。此外，还可能发生重叠的热事件。温度调制DSC可用于表征多相系统，从而能够分离动力学事件和重叠跃迁38，39。

在实施协议中描述的DSC试验时需要注意以下几点：（i）基于实验，如有必要，可以应用第二个加热循环。（ii）由于分析过程中脂质比热容（Cp）的恒定行为，因此选择线性基线是合适的。（三） 为了获得熔化起始点（To），应确定计算限值。最小和最大限值应包括导数曲线的极值点和基线的最线性范围。拐点切线和基线之间的交点确定为 To。

对于峰分离良好的温度图，建议通过计算曲线下的面积来考虑每个事件的焓。这些数据与X射线衍射数据相结合，可用于解释系统中的多晶型或相变程度。

本手稿涉及分析LBE及其药品的黄金标准。其他分析方法可以作为补充方法。例如定性显微镜方法，如偏振光显微镜和扫描电子显微镜，以研究过程应力对结晶速率的影响，从而研究晶体的形状和形态。基于脂质的医药产品开发方法应基于物理化学LBE的表征，以确定其与所选制造工艺相关的关键属性，并预测其可加工性。还应仔细筛选每个单独的API40的赋形剂-API相互作用。应根据所选的制造工艺添加进一步的分析方法。应仔细了解结构-功能-加工性关系，以设计稳健稳定的脂质基药品。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者披露任何和所有利益冲突。

Acknowledgments

药物工程研究中心（RCPE）由BMK，BMDW，Land Steiermark和SFG在COMET的框架内资助 - 卓越技术能力中心。COMET计划由FFG管理。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2·2H2O Sigma-Aldrich 223506
Cassettes with a cellulose membrane bag with a cut-off of 7000 Da, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer 7K Fisher Scientific Inco, USA
Control software of x-ray system HECUS dedicated house equipment
Control unit of x-ray system HECUS dedicated house equipment
Differential scanning calorimeter (DSC) aluminum crucibles and lids Netzsch, Germany
Differential scanning calorimeter DSC 204 F1 Phoenix (NETZSCH, Germany). Netzsch, Germany
Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) Sigma-Aldrich 850355P
Dissolution paddle apparatus II, Erweka DT 828 LH Erweka GmbH, Langen, Germany
Dynasan 116 IOI OLEO Tripalmitin
Geleol Gattefosse Glyceryl monosterarate 
KCl  Sigma-Aldrich 529552
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662
Kolliphor P 188 BASF Chem Trade Poloxamer 188 
MgCl2·6H2O Sigma-Aldrich M2670
Na2HPO4·2H2O Sigma-Aldrich S9763
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Netzsch DSC 204F1 Software Version 8.0.1 Netzsch, Germany 6.239.2-64.51.00
Origin Pro (OriginLab, Northampton, MA) (statistical software OriginLab, Northampton, MA
Proteous Analysis Software Netzsch, Germany
Tween 65 Polysorbate 65
Witepsol PMF 1683 IOI OLEO Triglycerol ester of stearatic/palmitic acid (partially esterified)
Witepsol PMF 282 IOI OLEO Diglycerol ester of stearic acid 
X-ray HECUS system composed of a point-focusing camera and two linearly positioned sensitive detectors HECUS dedicated house equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, K. Crystallization behaviour of fats and lipids a review. Chemical Engineering Science. 56 (7), 2255-2265 (2001).
  2. Becker, K., Salar-Behzadi, S., Zimmer, A. Solvent-free melting techniques for the preparation of lipid-based solid oral formulations. Pharmaceutical Research. 32 (5), 1519-1545 (2015).
  3. Rosiaux, Y., Jannin, V., Hughes, S., Marchaud, D. Solid lipid excipients - Matrix agents for sustained drug delivery. Journal of Controlled Release. 188, 18-30 (2014).
  4. Siepmann, J., et al. Lipids and polymers in pharmaceutical technology: lifelong companions. International Journal of Pharmaceutics. 558, 128-142 (2019).
  5. Lopes, D., et al. Microphase separation in solid lipid dosage forms as the cause of drug release instability. International Journal of Pharmaceutics. 517 (1-2), 403-412 (2017).
  6. Reitz, C., Kleinebudde, P. Solid lipid extrusion of sustained release dosage forms. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 67 (2), 440-448 (2007).
  7. Salar-Behzadi, S., Corzo, C., Schaden, L., Laggner, P., Zimmer, A. Correlation between the solid state of lipid coating and release profile of API from hot melt coated microcapsules. International Journal of Pharmaceutics. 565, 569-578 (2019).
  8. Windbergs, M., Gueres, S., Strachan, C. J., Kleinebudde, P. Two-step solid lipid extrusion as a process to modify dissolution behavior. AAPS PharmSciTech. 11 (1), 2-8 (2010).
  9. Schertel, S., Salar-Behzadi, S., Zimmer, A. Impact of surface properties of core material on the stability of hot melt-coated multiparticulate systems. Pharmaceutics. 13 (3), 366 (2021).
  10. Tang, D., Marangoni, A. G. Microstructure and fractal analysis of fat crystal networks. Journal of the American Oil Chemists' Society. 83, 377-388 (2006).
  11. Corzo, C., et al. Lipid-microparticles for pulmonary delivery of active pharmaceutical ingredients: Impact of lipid crystallization on spray-drying processability. International Journal of Pharmaceutics. 610, 121259 (2021).
  12. Acevedo, N. C. Characterization of the nanostructure of triacylglycerol crystal networks. Structure-Function Analysis of Edible Fats. Marangoni, A. G. , AOCS Press. Urbana, USA. (2012).
  13. Marangoni, A. G. Structure-function analysis of edible fats. Structure-Function Analysis of Edible Fats. , (2018).
  14. Sato, K. Crystallization of lipids. Fundamentals and Applications in Food, Cosmetics, and Pharmaceuticals. Sato, K. , Wiley. Blackwell, NJ, USA. (2018).
  15. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Toward nanoscale engineering of triacylglycerol crystal networks. Crystal Growth and Design. 10 (8), 3334-3339 (2010).
  16. Lopes, D. G., et al. Role of lipid blooming and crystallite size in the performance of highly soluble drug-loaded microcapsules. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (12), 4257-4265 (2015).
  17. Salar-Behzadi, S., et al. Novel approach for overcoming the stability challenges of lipid-based excipients. Part 2: Application of polyglycerol esters of fatty acids as hot melt coating excipients. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 148, 107-117 (2020).
  18. Corzo, C., Meindl, C., Lochmann, D., Reyer, S., Salar-Behzadi, S. Novel approach for overcoming the stability challenges of lipid-based excipients. Part 3: Application of polyglycerol esters of fatty acids for the next generation of solid lipid nanoparticles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 152, 44-55 (2020).
  19. Tylor, A. K. Glyceryl monostearate. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Quinn, M. E. , Pharmaceutical Press and American Pharmacists Association. UK, USA. 290-293 (2009).
  20. Lutton, R. S., Jackson, F. L. The polymorphism of 1- monostearin and 1-monopalmitin. Journal of the American Chemical Society. 70 (7), 2445-2449 (1948).
  21. Fang, W., Mayama, H., Tsujii, K. Spontaneous formation of fractal structures on triglyceride surfaces with reference to their super water-repellent properties. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (3), 564-571 (2007).
  22. Maleky, F., Marangoni, A. Nanoscale effects on oil migration through triacylglycerol polycrystalline colloidal networks. Soft Matter. 7, 6012-6024 (2011).
  23. Corzo, C., et al. Novel approach for overcoming the stability challenges of lipid-based excipients. Part 1: Screening of solid-state and physical properties of polyglycerol esters of fatty acids as advanced pharmaceutical excipients. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 148, 134-147 (2020).
  24. Gordillo-Galeano, A., Mora-Huertas, C. E. Solid lipid nanoparticles and nanostructured lipid carriers: A review emphasizing on particle structure and drug release. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 133, 285-308 (2018).
  25. Fan, Y., Marioli, M., Zhang, K. Analytical characterization of liposomes and other lipid nanoparticles for drug delivery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 192, 113642 (2021).
  26. Peyronel, F., Pink, D. A., Marangoni, A. G. Triglyceride nanocrystal aggregation into polycrystalline colloidal networks: Ultra-small angle X-ray scattering, models and computer simulation. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 19 (5), 459-470 (2014).
  27. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Functionalization of non-interesterified mixtures of fully hydrogenated fats using shear processing. Food and Bioprocess Technology. 7 (2), 575-587 (2014).
  28. Dong, Y. D., Boyd, B. J. Applications of X-ray scattering in pharmaceutical science. International Journal of Pharmaceutics. 417 (1-2), 101-111 (2011).
  29. Di Cola, E., Grillo, I., Ristori, S. Small angle X-ray and neutron scattering: Powerful tools for studying the structure of drug-loaded liposomes. Pharmaceutics. 8 (2), 10 (2016).
  30. Lopez, C., Lesieur, P., Bourgaux, C., Ollivin, M. Thermal and structural behavior of anhydrous milk fat. 3. Influence of cooling rate. Journal of Dairy Science. 88 (2), 511-526 (2005).
  31. Kalnin, D., Garnaud, G., Amenitsch, H. Ollivon. Monitoring fat crystallization in aerated food emulsions by combined DSC and time-resolved synchrotron X-ray diffraction. Food Research International. 35 (10), 927-934 (2002).
  32. Bugeat, S., et al. Unsaturated fatty acid enriched vs. control milk triacylglycerols: Solid and liquid TAG phases examined by Synchrotron radian X-ray diffraction coupled with DSC. Food Research International. 67, 91-101 (2015).
  33. Brubach, J. B., et al. Structural and thermal characterization of glyceryl behenate by X-ray diffraction coupled to differential calorimetry and infrared spectroscopy. International Journal of Pharmaceutics. 336 (2), 248-256 (2007).
  34. Chong, C. L., et al. Thermal and structural behaviour of crude palm oil: Crystallisation at very low cooling rate. European Journal of Lipid Science and Technology. 109 (4), 410-421 (2007).
  35. Askin, S., et al. A simultaneous differential scanning calorimetry-X-ray diffraction study of olanzapine crystallization from amorphous solid dispersions. Molecular Pharmaceutics. 17 (11), 4364-4374 (2020).
  36. Clout, A., et al. Simultaneous differential scanning calorimetry - synchrotron X-ray powder diffraction: A powerful technique for physical form characterization in pharmaceutical materials. Analytical Chemistry. 88 (20), 10111-10117 (2016).
  37. Jendrzejewska, I., Goryczka, T., Pietrasik, E., Klimontko, J., Jampilek, J. X-ray and thermal analysis of selected drugs containing acetaminophen. Molecules. 25 (24), 5909 (2020).
  38. Righetti, M. C. Crystallization of Polymers Investigated by Temperature-Modulated DSC. Materials. 10 (4), 442 (2017).
  39. Sauer, B. B., Kampert, W. G., Neal Blanchard, E., Threefoot, S. A., Hsiao, B. S. Temperature modulated DSC studies of melting and crystallization in polymers exhibiting multiple endotherms. Polymer. 41 (3), 1099-1108 (2000).
  40. Ali, F., Kumar, R., Lal Sahu, P., Singh, G. N. Physicochemical characterization and compatibility study of roflumilast with various pharmaceutical excipients. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 130, 1627-1641 (2017).

Tags

化学，第186期，
一套成熟的分析工具，用于研究脂质赋形剂的固态变化
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salar-Behzadi, S., Corzo, C.,… More

Salar-Behzadi, S., Corzo, C., Laggner, P. A Package of Established Analytical Tools to Investigate the Solid-State Alteration of Lipid-Based Excipients. J. Vis. Exp. (186), e63993, doi:10.3791/63993 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter