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Chemistry

Un paquete de herramientas analíticas establecidas para investigar la alteración en estado sólido de excipientes basados en lípidos

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/63993
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Research Center Pharmaceutical Engineering, GmbH, 2Institute of Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmaceutical Technology and Biopharmacy, University of Graz

Summary

Esta publicación muestra la aplicación de la difracción de rayos X y la calorimetría diferencial de barrido como estándares de oro para investigar el estado sólido de los excipientes a base de lípidos (LBE). Comprender la alteración del estado sólido en las EBL y su efecto sobre el rendimiento de los productos farmacéuticos de las mismas es el factor clave para la fabricación de formas farmacéuticas robustas basadas en lípidos.

Abstract

Los excipientes a base de lípidos (LBE) son poco tóxicos, biocompatibles y de base natural, y su aplicación apoya la sostenibilidad de la fabricación farmacéutica. Sin embargo, el principal desafío es su estado sólido inestable, que afecta la estabilidad del producto farmacéutico. Las propiedades físicas críticas de los lípidos para su procesamiento, como la temperatura y viscosidad de fusión, la reología, etc., están relacionadas con su estructura molecular y su cristalinidad. Los aditivos, así como el estrés térmico y mecánico involucrado en el proceso de fabricación, afectan el estado sólido de los lípidos y, por lo tanto, el rendimiento de los productos farmacéuticos de los mismos. Por lo tanto, comprender la alteración en el estado sólido es crucial. En este trabajo, la combinación de difracción de rayos X en polvo y calorimetría diferencial de barrido (DSC) se presenta como el estándar de oro para la caracterización del estado sólido de los lípidos. La difracción de rayos X es el método más eficiente para detectar el polimorfismo y el crecimiento de cristales. La disposición polimórfica y la longitud de la lámina se caracterizan en las regiones de ángulo amplio y pequeño de la difracción de rayos X, respectivamente. La región de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) se puede utilizar aún más para investigar el crecimiento de cristales. Se puede indicar la transición de fase y la separación. DSC se utiliza para examinar el comportamiento térmico de los lípidos, estimar la miscibilidad de aditivos y / o ingredientes farmacéuticos activos (API) en la matriz lipídica y proporcionar diagramas de fase. Se presentan cuatro estudios de caso en los que las EBL se utilizan como material de recubrimiento o como matriz de encapsulación para proporcionar sistemas multipartículas recubiertos de lípidos y nanosuspensiones lipídicas, respectivamente. El estado sólido lipídico y su posible alteración durante el almacenamiento se investigan y se correlacionan con la alteración en la liberación del API. Los métodos microscópicos cualitativos, como la microscopía de luz polarizada y la microscopía electrónica de barrido, son herramientas complementarias para investigar la cristalización a nivel micro. Se deben agregar métodos analíticos adicionales basados en el proceso de fabricación seleccionado. La relación estructura-función-procesabilidad debe entenderse cuidadosamente para diseñar productos farmacéuticos basados en lípidos robustos y estables.

Introduction

Los lípidos son una clase de materiales que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados. Cubren una amplia gama de estructuras químicas, incluyendo ácidos grasos, acilgliceroles, esteroles y ésteres de esteroles, ceras, fosfolípidos y esfingolípidos1. El uso de lípidos como excipientes farmacéuticos comenzó en 1960 para incrustar fármacos en una matriz de cera para proporcionar formulaciones de liberación sostenida2. Desde entonces, los excipientes a base de lípidos (LBE) han ganado una gran atención para diversas aplicaciones, como la liberación modificada de fármacos, el enmascaramiento del sabor, la encapsulación de fármacos y la biodisponibilidad mejorada de fármacos. Los LBE se pueden aplicar en una amplia gama de formas farmacéuticas a través de procesos de fabricación versátiles, a saber, recubrimiento termofusible, secado por pulverización, extrusión de lípidos sólidos, impresión 3D, comprimidos y homogeneización a alta presión, entre otros. Formas farmacéuticas como tabletas, películas de desintegración oral, sistemas de multipartículas, nano y micropartículas, pellets y formas impresas en 3D son el resultado 2,3,4.

Los LBE poseen el estado de "General Reconocido como Seguro", baja toxicidad, buena biocompatibilidad y tolerancia mejorada del paciente. Su origen natural y su amplia disponibilidad les permiten potenciar la fabricación farmacéutica ecológica y sostenible. Sin embargo, el uso de LBE se ha asociado con formas de dosificación inestables. Las alteraciones en las propiedades de los productos a base de lípidos después del almacenamiento han sido ampliamente reportadas. El estado sólido de las EBL y la existencia de polimorfismo lipídico se consideran las principales razones de la inestabilidad de las formas de dosificación basadas en lípidos 5,6,7,8.

Las propiedades mecánicas y físicas de los lípidos están estrechamente relacionadas con sus propiedades de cristalización y la estructura de su red cristalina, que muestra distintas jerarquías de organización estructural. Cuando se utilizan lípidos en la fabricación de productos farmacéuticos, la estructura cristalina se ve afectada por los parámetros del proceso aplicados, como la temperatura, los disolventes orgánicos, el cizallamiento y las fuerzas mecánicas, lo que a su vez afecta el rendimiento del producto farmacéutico 5,7,9,10,11,12 . Para comprender esta relación estructura-función, es importante conocer los fundamentos de la cristalización lipídica y la estructura cristalina y los métodos analíticos para cribarlos.

A nivel molecular, la unidad más pequeña de un cristal lipídico se denomina "célula unitaria". Una repetición tridimensional regular de células unitarias construye las redes cristalinas, con interacciones moleculares más fuertes junto con sus direcciones laterales que las longitudinales, lo que explica la construcción en capas de cristales lipídicos. El empaquetamiento transversal repetido de las cadenas de hidrocarburos se conoce como subcelda 1,12,13 (Figura 1). Las laminillas son el empaquetamiento lateral de las moléculas lipídicas. En el paquete de cristal, las interfaces entre diferentes laminillas están hechas de grupos extremos metilo, mientras que los grupos de glicerol polar se colocan en las partes interiores de la lámina14. Para diferenciar cada cadena de ácidos grasos en la lámina, se emplea el término folio, que representa una subcapa compuesta por cadenas individuales de ácidos grasos. Los acilgliceroles se pueden organizar en longitudes de cadena de foliolas dobles (2L) o triples (3L)14. La energía superficial de las laminillas las impulsa a apilarse epitaxialmente entre sí, para proporcionar nanocristalitos. Diferentes factores de procesamiento, como la temperatura y la velocidad de enfriamiento, afectan el número de laminillas apiladas y, por lo tanto, el grosor del cristalito (~ 10-100 nm). La agregación de cristalitos conduce a la formación de esferulitas a microescala, y la agregación de esferulitas proporciona a la red cristalina de LBE un comportamiento macroscópico definido13.

Las transiciones de estado sólido comienzan a nivel molecular. La transición geométrica de una subcélula a otra se llama polimorfismo. Tres polimorfos principales de forma α, β'' y β se encuentran generalmente en los acilgliceroles, ordenados de acuerdo con el aumento de la estabilidad. La inclinación de la lámina con respecto a los grupos finales ocurre durante las transiciones polimórficas 1,13. Las transiciones polimórficas mediadas por fusión y almacenamiento son experimentadas por LBE. Las transiciones de almacenamiento ocurren cuando la forma metaestable se almacena por debajo de su temperatura de fusión, mientras que las transiciones mediadas por fusión ocurren a medida que la temperatura aumenta por encima del punto de fusión de una forma metaestable provocando la fusión y la cristalización sucesiva de la forma más estable.

Además, la separación de fases y el crecimiento de cristales también pueden ocurrir. La separación de fases es impulsada por la cristalización multifásica inicial y el crecimiento de una fase o más. Las interacciones partícula-partícula, incluyendo la sinterización, las interacciones moleculares, las características microestructurales y los componentes extraños, también pueden desencadenar el crecimiento de cristales 1,5.

El monitoreo de las transiciones de estado sólido de las EBL y su impacto en el rendimiento de las formas de dosificación es de gran importancia. Entre otros, la calorimetría diferencial de barrido (DSC) y la difracción de rayos X, específicamente la dispersión simultánea de rayos X pequeños y gran angular (SWAXS), son dos estándares de oro para evaluar el estado sólido lipídico.

DSC se usa comúnmente para medir los cambios de entalpía del material de interés asociado con el flujo de calor en función del tiempo y la temperatura. El método es ampliamente utilizado para la detección del comportamiento térmico de los lípidos, como las posibles vías de fusión y cristalización, la temperatura y la entalpía correspondientes de diferentes formas polimórficas, así como las fracciones menores y principales de las composiciones lipídicas. Estos datos pueden ser utilizados para representar la heterogeneidad, las fases múltiples y el polimorfismo lipídico 5,7,13.

Las técnicas de difracción de rayos X son los métodos más poderosos para la determinación de estructuras en estado sólido. Al poseer una nanoestructura ordenada con laminillas repetidas, la reflexión del haz de rayos X de los cristales lipídicos se puede investigar utilizando la ley de Bragg:

d = λ/2sinθ (Ecuación 1)

donde λ es la longitud de onda de rayos X de 1.542 Å, θ es el ángulo de difracción del haz disperso, y d es el espaciado interplanar de capas repetidas, definida como longitud laminar en lípidos. La región de ángulo pequeño de la radiografía se puede utilizar perfectamente para detectar el patrón de espaciado largo y calcular la longitud de la lámina (d). Cuanto mayor sea la distancia repetida d, menor será el ángulo de dispersión (1-15°, región de ángulo pequeño) ya que d es inversamente proporcional al pecado θ. La disposición subcelular de los lípidos se puede caracterizar como el patrón de espaciado corto en la región gran angular de la difracción de rayos X. Tanto los patrones de espaciado largo como corto de los lípidos (longitud de la lámina y disposición de las subcélulas) se pueden usar para indicar la transformación polimórfica monotrópica. Por ejemplo, la forma α (hexagonal) puede modificarse a β (triclínica) debido a un cambio en el ángulo de inclinación de las cadenas, con alteraciones en la longitud de la lámina (patrón de espaciado largo, en la región de ángulo pequeño, 1-15°) y en el modo de empaquetamiento de sección transversal (patrón de espaciado corto, en la región gran angular, 16-25°) (Figura 2).

La información obtenida de la región SAXS se puede utilizar para investigar el crecimiento del cristal midiendo su espesor (D) a través de la ecuación de Scherrer15:

D = Kλ/FWHMcosθ (Ecuación 2)

Donde, FWHM es el ancho en radianes del máximo de difracción medido a una altura media entre el fondo y el pico, generalmente conocido como ancho completo a medio máximo (FWHM); θ es el ángulo de difracción; λ es la longitud de onda de rayos X (1.542 Å) y K (constante de Scherrer) es un número adimensional que proporciona información sobre la forma del cristal (en caso de ausencia de información detallada de la forma K = 0.9 es una buena aproximación). Tenga en cuenta que la ecuación de Scherrer se puede utilizar para estimar tamaños medios de cristal de hasta aproximadamente 100 nm, ya que el ensanchamiento del pico es inversamente proporcional al tamaño del cristalito. Por lo tanto, su aplicación es útil para determinar el grosor de las nanoplaquetas e, indirectamente, el número de laminillas agregadas. Ejemplos del uso de este enfoque bien conocido para la detección de las propiedades cristalinas de los lípidos en el desarrollo de la formulación farmacéutica y la inestabilidad correspondiente en el rendimiento del producto se pueden encontrar en 5,12,16,17,18.

El monitoreo del estado sólido de los LBE dentro de cada etapa de desarrollo a través de técnicas analíticas bien establecidas proporciona una estrategia efectiva para diseñar procesos de fabricación de alto rendimiento y productos farmacéuticos estables a base de lípidos.

Esta publicación presenta la aplicación crítica de un análisis exhaustivo de estado sólido de las EBL para monitorear los cambios en el estado sólido y su correlación con la alteración en el perfil de liberación del ingrediente farmacéutico activo (API) de la forma farmacéutica de dosificación. Los sistemas multiparticulados basados en cristales API recubiertos de lípidos mediante recubrimiento termofusible y las suspensiones de nanolípidos producidas mediante homogeneización a alta presión se toman como casos de estudio. El enfoque de esta publicación es la aplicación de la difracción de rayos X en polvo y DSC como herramientas analíticas. Los dos primeros ejemplos muestran el efecto de la transformación polimórfica y el crecimiento de cristales, respectivamente, en la alteración en la liberación de API de muestras recubiertas. El último ejemplo revela la correlación entre el estado sólido estable de los lípidos y el rendimiento estable del producto farmacéutico en sistemas multipartículas recubiertos de lípidos y en suspensiones de nanolípidos.

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Protocol

1. Calorimetría diferencial de barrido (DSC)

  1. Preparación del instrumento
    1. Utilice un calorímetro de barrido diferencial equipado con un intracooler, un muestreador automático y el software para el control del instrumento y el análisis de datos.
    2. Encienda el suministro de gas nitrógeno y ajuste la presión entre 0,2 y 0,5 bar y encienda el instrumento DSC y el cambiador automático de muestras.
    3. Abra el software y active el modo de espera haciendo clic en el botón Sí . Permitir el equilibrio del dispositivo durante al menos una hora
    4. Purgue el horno con nitrógeno, haga clic en el icono Nuevo método y vaya a Definición del método. Active la opción Modulación de temperatura en la ventana de resumen.  Vaya a la pestaña de encabezado y seleccione el método haciendo clic en "muestra".
    5. Vaya a la pestaña Programa de temperatura, seleccione Purgar 2 MFC y en MFC protector, ambos a 50 ml / min.
    6. Insértese el siguiente método de medición: en espera a 20 °C, ciclo de calentamiento a 5 K/min desde 20 °C hasta por encima de la temperatura de fusión de los lípidos, mantenimiento isotérmico a esta temperatura durante 5 min, ciclo de enfriamiento a 0 °C a 5 K/min a -20 °C, temperatura final de restablecimiento de emergencia a una temperatura de 10 grados °C por encima de la temperatura más alta del programa, y temperatura de espera final a 20 °C.
    7. Vaya a la pestaña de calibración y seleccione el archivo de temperatura y sensibilidad adecuado. Guardar el método
  2. Preparación y medición de muestras
    1. Pesar 3-4 mg de cada muestra en crisoles de aluminio. Registre el peso exacto cargado en cada crisol y selle el crisol de aluminio con una tapa perforada.
    2. Coloque los crisoles en la bandeja del muestreador automático y active el modo de muestreador automático en el software y el método relacionado con la carga para cada muestra.
    3. Complete la posición de la muestra, el nombre de la muestra y el peso de cada muestra, y la posición del crisol de referencia en la ventana Vista de bandeja de muestras e inicie las mediciones.
  3. Análisis de datos
    1. Abra los datos sin procesar utilizando el software para el análisis de datos y trace la temperatura frente al flujo de calor, haciendo clic en el botón "X-time / X-temperature"
    2. En la ventana emergente, haga clic en "Ocultar segmentos isotérmicos". En el lado izquierdo de la pantalla, seleccione solo las curvas que se van a analizar (por ejemplo, deshaga clic en los datos "Adicionales").
    3. Comprobar el comportamiento térmico de los lípidos como eventos endotérmicos y exotérmicos de energía absorbida o liberada en forma de calor, respectivamente, en función de la temperatura.
    4. Haga clic en la curva, seguida de Evaluación y Área, para calcular la entalpía de fusión como el área bajo la curva de endotermos.
    5. Seleccione los límites de integración moviendo las líneas verticales alrededor de 2 a 3 grados centígrados antes y después del inicio y el punto final del pico.
    6. Seleccione una línea base lineal para la integración de picos. El área entre la curva y la línea de base es proporcional al cambio en la entalpía. Haga clic en Aplicar para finalizar el cálculo. Del mismo modo, calcule la entalpía de cristalización como el área bajo la curva de exotermas
    7. Determine el inicio de la temperatura de fusión (To) haciendo clic en la curva a analizar y luego en Evaluación e inicio.
    8. Seleccione los límites de cuantificación moviendo las líneas verticales a la sección más recta de la curva. Esto suele ser alrededor de 5-10 ° C antes y después del pico. Luego, determine la temperatura de fusión haciendo clic en la curva a analizar, seguida de Evaluación y Pico. El valor obtenido es el máximo máximo.

2. Dispersión de rayos X de ángulo pequeño y gran angular (SWAXS)

  1. Preparación del instrumento
    1. Utilice un sistema de dispersión de rayos X, componiendo una cámara de enfoque puntual fijada a un generador de rayos X de tubo sellado y equipada con una unidad de control y software relacionado.
    2. Utilice cobre (λ = 1,54 Å) a 50 kV y 1 mA como fuente de rayos X y dos detectores sensibles colocados linealmente para cubrir las regiones de dispersión de rayos X de ángulo pequeño y amplio.
    3. Garantizar los requisitos de seguridad para proteger de la exposición a los rayos X.
    4. Encienda el sistema de agua de refrigeración en la unidad de control, la bomba de vacío, las válvulas de gas y el sistema de control de potencia y seguridad.
    5. Encienda las válvulas de control de voltaje y purga para los detectores a un flujo de gas entre 10 y 20 ml / min.
    6. Encienda el tubo de rayos X y la opción de espera y espere aproximadamente 10 minutos. Apague el modo de espera y encienda el tubo de rayos X a plena potencia (>50 kV) y espere al menos 30 minutos.
    7. Inicie el software de control y haga clic en RESTABLECER TPF. Elija el filtro Tugsten y establezca la posición. Vaya a Posición para fijar la posición del filtro de tungsteno
  2. Preparación y medición de muestras
    1. Asegúrese de que las muestras estén disponibles como polvo fino. Si es necesario, muele las muestras suavemente a bajas temperaturas para proporcionar un polvo fino.
    2. Llene las muestras en capilares de vidrio especiales con un diámetro externo de aproximadamente 2 mm, evitando cualquier atrapamiento de aire en los capilares. Selle el capilar de vidrio con cera y colóquelo cuidadosamente en el soporte capilar.
    3. Encienda el motor para la rotación de la muestra y cierre la válvula de vacío hasta que la presión sea inferior a 5 mbar.
    4. En el software, fije la configuración de mediciones seleccionando una resolución de posición de 1024. Fijar el tiempo de exposición a 1200 s.
    5. Configure los límites de energía haciendo clic en el toque Herramientas, luego haga clic en energía y resolución, y haga clic en reiniciar. Configure los límites de energía en un rango adecuado entre 400-900.
    6. Abra el obturador de seguridad e inicie las mediciones. Asegúrese de que la ventana de medición muestre un máximo de 80 recuentos por segundo. Si esto no se da, adapte la posición del filtro.
  3. Análisis de datos
    1. Exporte los datos como archivos p00. Los datos consisten en la intensidad de transmisión y absorción frente al número de canales y el ángulo de difracción.
    2. Transfiera los datos para su evaluación a un software estadístico y corrija los datos normalizando las intensidades utilizando la masa de dispersión medida con el filtro de tungsteno.
    3. Crear una gráfica de intensidad normalizada frente a dos veces el ángulo de difracción [(2Θ) 2xtheta].
    4. Utilice la función de "lector de pantalla" para encontrar picos de difracción en las regiones SAXS y WAXS.
    5. Aplique la ecuación de Bragg para calcular los picos de difracción con la intensidad máxima en un espaciado d corto y largo para las regiones WAXS y SAXS, respectivamente.
    6. Calcule las proporciones de la posición máxima de la región SAXS para averiguar la simetría cristalina de los lípidos (por ejemplo, laminar, hexagonal, cúbico).
    7. Utilice el pico de difracción principal de la región SAXS para cuantificar el espesor del cristalito (D). Ajuste el pico en una función gaussiana a través de mínimos cuadrados clásicos y obtenga el FWHM haciendo clic en Análisis, Picos y líneas de base, Analizador de picos, Diálogo Abrir.
    8. En la ventana emergente, seleccione la opción "Fit Peaks Pro". Seleccione una línea base constante con y = 0, seleccione el pico de difracción principal de la región SAXS y haga clic en "Control de ajuste" para seleccionar los parámetros de ajuste máximo.
    9. Elija la función GaussAmp. Establezca los parámetros y_0, xc_1 y A_1 como fijos y obtenga el FWHM del ajuste. Usa la ecuación de Scherrer para calcular el espesor del cristalito.

3. Ensayos de disolución

  1. Liberación de API de sistemas multipartículas recubiertos
    1. Utilice el aparato USP 2 (paleta) para estudios de disolución.
    2. Llenar los recipientes de prueba de disolución con tampón fosfato pH 6,8 y calentar a 37 °C.
    3. Pesar triplicados de muestras de partículas recubiertas equivalentes a una dosis única de API y colocar las muestras en recipientes de prueba de disolución.
    4. Arranque la paleta a una velocidad de 100 rpm.
    5. Configure el muestreador automático para tomar muestras de 1 ml en los siguientes puntos de muestreo: 30 min, 60 min, 90 min, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 18 h y 24 h.
    6. Analizar las muestras mediante un método de HPLC adecuado 5,7,17.
    7. Analice los datos trazando la versión acumulativa de la API en función del tiempo.
    8. Realizar los experimentos para muestras almacenadas a largo plazo (25 °C, 60% de humedad relativa) y aceleradas (40 °C y 70% de humedad relativa).
  2. Liberación de API a partir de nanopartículas lipídicas sólidas (SLN)
    1. Preparar líquido pulmonar simulado (SLF) mezclando 0,02% (p/p) de dipalmitoilfosfatidilcolina en solución salina tampón fosfato de Dulbecco (D-PBS), con la siguiente composición: KCl (2,683 mM), KH 2 PO 4 (1,47 mM), NaCl (136,893 mM), Na2HPO4· 2H 2O (8.058 mM), CaCl2· 2H 2O (0.884 mM), y MgCl2· 6H2O (0.492 mM). Precalentar a 37 °C.
    2. Utilice casetes de diálisis con una bolsa de membrana de celulosa de un corte controlado de 7.000 Da por triplicado para cada muestra.
    3. Asigne un casete de diálisis para cada tiempo de muestreo: 0,5 h, 1,5 h, 3 h, 5 h, 7 h y 24 h. Hidratar los casetes de diálisis durante 2 min sumergiéndolos en SLF. Luego, seque cuidadosamente su superficie con toallas de papel suaves.
    4. Inyectar 3 ml de la muestra (nanosuspensión lipídica), equivalente a 600 μg de dexametasona, en cada casete.
    5. Sumerja cada casete en 200 ml de SLF a 37 °C (condiciones de fregadero) y agite el sistema a 125 rpm.
    6. Tome muestras de 200 mg del interior del casete utilizando una jeringa en cada momento de muestreo determinado.
    7. Determinar el contenido de la API utilizando el método HPLC-MS desarrollado18.
    8. Calcule la API liberada de SLN por balance de masa, de acuerdo con18, brevemente como la diferencia entre la cantidad total de API en SLN y la cantidad restante de API después del muestreo.
    9. Repita el proceso para las muestras almacenadas.

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Representative Results

Correlación entre la transición polimórfica de la liberación de lípidos y API en cristales API recubiertos de lípidos:
Los cristales API recubiertos con monoestearato de glicerol se miden mediante DSC y rayos X directamente después del recubrimiento y después de 3 meses de almacenamiento en condiciones aceleradas (40 °C, 75% de humedad relativa)7. El monoestearato de glicerilo es un sistema multifásico que contiene 40% -55% monoglicéridos, 30% -45% diglicéridos y 5% -15% de glicéridos, principalmente tristearina19. Las formas polimórficas de sub-α, α, β-primo y β se reportan para la monoestearina20. La tristearina y la 1,2-distearina muestran formas α, β-prime y β polimórficas14.

Los datos DSC de muestras T0 y muestras almacenadas en condiciones aceleradas se muestran en la Figura 3A. El ciclo de calentamiento en la muestra T0 mostró un amplio evento endotérmico de hasta 10 °C, que puede correlacionarse con la transición reversible sub-α / α descrita para 1-monoestearina y 1-monopalmitina21. Dos eventos endotérmicos a To = 54.0 °C y 46.7 se correlacionan con la forma β y una fase coexistente de punto de fusión más bajo. Una fase coexistente se puede ver en los datos de rayos X como el espaciado d corto de 4.16 Å correspondiente a la forma polimórfica α, organizada en una fase lamelar de 57.3 Å y correspondiente a diferentes componentes de la mezcla. La disposición laminar del recubrimiento lipídico de la muestra T0 se da debido al pico armónico disponible a 18,7 Å correspondiente a la reflexión de tercer orden en el difractograma7 de SAXS (Figura 3B).

Los datos DSC de muestras después de 3 meses de almacenamiento en condiciones aceleradas muestran un endotermo a To = 55.7 °C, con dos eventos superpuestos a Tm = 60.2 °C para la forma α restante y a Tm = 63.8 °C como el evento principal para la fusión de la β-forma. La transición polimórfica se confirma con los datos de rayos X mediante la detección de espaciamientos d cortos de 4,66 Å, 4,58 Å, 4,37 Å, 3,92 Å y 3,83 Å, típicos de la forma β, combinados con la reducción del espesor de la lámina de 57,3 Å a 50,4 Å, debido a la inclinación molecular7.

La comparación del perfil de liberación de API del recubrimiento en T0 y después de 3 meses de almacenamiento en condiciones aceleradas (Figura 3C) muestra una alteración significativa en los perfiles de liberación, lo que puede explicarse por la evidente transformación polimórfica de α forma a β con una disposición subcelular más densa, lo que resulta en una superficie repelente al agua 7,21.

Correlación entre el crecimiento cristalino del recubrimiento lipídico, la posible separación de fases y la alteración de la liberación en cristales API recubiertos de lípidos: los cristales API están recubiertos con una mezcla de tripalmitina y polisorbato 65 en una proporción de 90:10 % p/p. La tripalmitina es un triglicérido con una pureza del 99%5. Los triglicéridos comúnmente muestran las formas α, β-prime y β polimórficas, ordenadas por el aumento de la densidad del paquete de cristal y el aumento de la estabilidad.

El polisorbato 65 es un emulsionante con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de 10,5 y una temperatura de fusión de 32 °C. Los triglicéridos se cristalizan comúnmente en su α-polimorfo de la masa fundida. Ciertos aditivos inducen la transformación de α a β de TAGs, entre ellos polisorbato 65. Además, el polisorbato 65 actúa como una impureza en el sistema, causando una cristalización heterogénea de tripalmitina a fuerzas impulsoras más bajas y desencadenando el crecimiento de cristales.

Los datos DSC y de rayos X de muestras T0 y muestras almacenadas en condiciones aceleradas se muestran en la Figura 4A, B. El ciclo de calentamiento de las mediciones DSC en la muestra T0 muestra un evento endotérmico agudo con un pico a 64,8 °C, correspondiente a la forma polimófica β de tripalmitina5. Esto también es detectable en la región WAXS, mostrando el espaciado corto a 4,6 Å, característico de la subcelda de la forma β (Figura 4A, B). Los datos muestran, claramente, la forma de β polimórfica inducida de tripalmitina en presencia de polisorbato 65 en muestras T0 y, por supuesto, en muestras almacenadas. El espesor laminar correspondiente se calcula utilizando la ecuación de Bragg como d = 2π/q001 = 42 Å5.

El espesor del cristal (D) de las muestras T0 y las muestras almacenadas se puede medir utilizando la ecuación de Scherrer descrita anteriormente. Los cálculos muestran un espesor de cristal de 24 nm en muestras T0 y un espesor aumentado de 37 nm en muestras almacenadas, correspondientes a 5,7 y 8,8 laminillas, respectivamente.

La comparación del perfil de liberación de API del recubrimiento en T0 y después de 3 meses de almacenamiento en condiciones aceleradas muestra nuevamente una alteración significativa en los perfiles de liberación después del almacenamiento (Figura 4C).

Debido al hecho de que la mezcla de tripalmitina y polisorbato 65 es un sistema bifásico, el crecimiento cristalítico de la tripalmitina se desencadena por la existencia de fase de polisorbato, especialmente en condiciones aceleradas (40 ° C, 75% de humedad relativa) donde el polisorbato 65 está en su forma líquida fundida. La transición de fase y el crecimiento de la fase de polisorbato en condiciones aceleradas se deben probablemente al movimiento del material líquido debido a las fuerzas de capilaridad y gravedad 5,22. La consecuencia es la alteración en la liberación de API del recubrimiento5.

Correlación entre el estado sólido estable de los lípidos y el rendimiento estable de los productos farmacéuticos a base de lípidos: Se evalúan dos productos farmacéuticos diferentes a base de lípidos: (a) una forma farmacéutica sólida compuesta de cristales API recubiertos con excipientes a base de lípidos 17 y (b) una forma farmacéutica líquida compuesta de nanopartículas de lípidos sólidos en suspensión cargadas con un API18 . Los LBE empleados para ambos productos son ésteres de poliglicerol de ácidos grasos (AGGP), un grupo de moléculas lipídicas que consisten en hidroxiéteres oligoméricos de glicerol total o parcialmente esterificados con ácidos grasos. Los AGGP se caracterizan por la cristalización monofásica en forma α, ausencia de transiciones polimórficas y estabilidad general de su estructura molecular, nano y microestructura23.

En el primer producto, los cristales API fueron recubiertos con PG3-C16/C18p, un PGFA compuesto por 3 unidades de glicerol parcialmente esterificadas con ácido palmítico y esteárico. Los datos DSC y de rayos X de muestras almacenadas a T0 y 3 meses en condiciones aceleradas se muestran en la Figura 5. El análisis DSC (Figura 5A) muestra un único pico de fusión en el primer ciclo de calentamiento correspondiente a la existencia de una sola forma polimórfica de PG3-C16/C18p con To = 54,2 °C. El ciclo de enfriamiento revela la cristalización monofásica del lípido a través de la existencia de un solo pico con Tc = 45.4°C. Las muestras almacenadas también revelan termogramas sin cambios, que no representan polimorfismo ni separación de fases. El estado sólido estable de PG3-C16/C18p está confirmado por los patrones SWAXS (Figura 5B). La región WAXS muestra un pico correspondiente a un espaciado corto de d = 4,15 Å en T0 y muestras almacenadas17. Este espaciado d corto está asociado con la forma α de los TAG 1,13. La señal WAXS inalterada después del almacenamiento confirma la ausencia de polimorfismo de PG3-C16/C18p. La región SAXS revela un pico principal con un largo espaciado d de d = 63.7 Å, correspondiente a una estructura laminar con configuración 2L. El tamaño de cristalito (D) de las muestras T0 obtenidas mediante el análisis de Scherrer representa 23 nm, correspondientes a cuatro laminillas apiladas. No se muestran alteraciones del grosor de la lámina (63,5 Å) ni del crecimiento cristalino (cuatro láminas) después del almacenamiento. Una comparación del perfil de liberación de las muestras T0 y después del almacenamiento (Figura 5C) muestra la excelente estabilidad del producto desarrollado. El estado sólido estable de la matriz lipídica proporcionada por PG3-C16/C18p da como resultado el rendimiento estable del perfil de liberación del producto17.

Para el segundo producto, se prepararon nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) cargadas con API en forma de nanosuspensión acuosa utilizando PG2-C18f como matriz lipídica y Poloxamer 188 como emulsionante18. PG2-C18f es una molécula de PGFA compuesta por 2 unidades de glicerol totalmente esterificadas con ácido esteárico. Poloxamer 188 es un polímero de bloque no iónico con un alto HLB de 29. La estructura química está compuesta de piezas de polioxipropileno y polioxietileno. El API está encapsulado en la matriz lipídica. Dentro de este producto, el estado sólido del lípido puede verse afectado no solo por las condiciones de procesamiento, sino también por las interacciones agua-nanopartícula y las interacciones emulsionante-lípido. Los datos DSC y de rayos X de nanosuspensiones en T0 y después de 3 meses de almacenamiento en condiciones aceleradas se muestran en la Figura 6. El análisis DSC muestra un evento endotérmico a To = 55,3 °C seguido de un endotermo amplio extendido hasta 100 °C. El primer evento atribuido a la fusión del SLN de PG2-C18f y el endotermo ancho se debe a la evaporación del agua. Dado que Poloxamer 188 se disuelve en la fase acuosa, no se representa ningún endotermo en el primer ciclo. El comportamiento térmico estable se representa en el análisis DSC de muestras almacenadas, que no muestran alteraciones. Aunque el polimorfismo lipídico suele acelerarse en sistemas de tamaño nanométrico, el análisis SWAXS confirma el comportamiento estable de la matriz lipídica. El espaciado d corto medido de 4,15 Å para PG2-C18f después de su cristalización en el SLN recién fabricado y después de 6 meses de almacenamiento de muestras en condiciones aceleradas (6 m/AC) indica la presencia de la forma α estable. El espesor de la lámina de PG2-C18f dentro del SLN en T0 (56,5 Å) y después del almacenamiento (56,3 Å) no muestra alteraciones. La estructura laminar del lípido se evidencia por una señal armónica a 18,7 Å. El tamaño del cristalito (D) de PG2-C18f por análisis de Scherrer es de 10,8 nm (dos laminillas), no mostrando crecimiento de cristales después del almacenamiento de las nanosuspensiones (11,7 nm, dos laminillas)18. El uso de SLN en la industria farmacéutica se ha visto obstaculizado debido a problemas de estabilidad bien informados después del almacenamiento, como la aglomeración y gelificación de partículas, la pérdida de encapsulación (expulsión de API) y el perfil de liberación inestable. En cambio, la aplicación de una matriz lipídica estable, PG2-C18f, como se muestra aquí, da como resultado el rendimiento del producto presentado en la Figura 7. No se representa la aglomeración de partículas, el perfil de liberación estable y la eficiencia de encapsulación estable. La inestabilidad general del GLC ha sido atribuida al polimorfismo lipídico y otras transiciones en estado sólido24. Los lípidos polimórficos sufren transiciones durante el almacenamiento de formas cristalinas menos densas (α-forma) a más densas (β-prime y β). Esta transición polimórfica puede afectar el área superficial de las nanopartículas fabricadas, especialmente si el área superficial no está suficientemente estabilizada por el emulsionante. Los consecuentes pueden ser inestabilidades como aglomeración o gelificación. Además, la alteración de la densidad cristalina de α a β provoca la pérdida de espacio suficiente para el API dentro de la matriz lipídica, lo que conduce a la expulsión del API, alteraciones en la eficiencia de encapsulación y el perfil de liberación. Teniendo en cuenta el pequeño tamaño de SLN (en este estudio x50 = 234.3 nm), los efectos del crecimiento de cristales en el rendimiento del producto también se vuelven críticos. El uso de una matriz lipídica con un estado sólido estable resultó en un rendimiento estable del producto18.

Figure 1
Figura 1: Las configuraciones de diapasón y silla de una molécula TAG, la subcélula, la lámina y la plaqueta cristalina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Patrones de espaciado corto (mano izquierda) y espaciado largo (mano derecha) de tripalmitina en regiones de gran angular y ángulo pequeño de difractogramas de rayos X, respectivamente . (A) La forma alfa, y (B) la forma beta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Cristales API recubiertos con monoestearato de glicerol: análisis en estado sólido de lípidos como material de recubrimiento y perfil de liberación de API de muestras recién preparadas (T0) y después de 3 meses de almacenamiento en condiciones aceleradas (AC). (A) DSC, (B) SWAXS, y (C) perfil de liberación. Esta cifra se ha modificado de7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Cristales API recubiertos con tripalmitina y polisorbato 65 (90:10 % p/p): Análisis en estado sólido del material de recubrimiento y liberación de API de muestras recién preparadas (T0) y después de 3 meses de almacenamiento en condiciones aceleradas (AC). (A) DSC, (B) SWAXS, (C) perfil de liberación API. Esta cifra se ha modificado de5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Cristales API recubiertos con PG3-C16/C18p: Análisis en estado sólido de PG3-C16/C18p como material de recubrimiento y perfil de liberación API de muestras recién preparadas (T0) y después de 3 meses de almacenamiento en condiciones aceleradas (AC). (A) DSC, (B) SWAXS, (C) perfil de liberación API. Esta cifra se ha modificado de17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Análisis en estado sólido de muestras de GLC recién preparadas (T0), después de 3 meses de almacenamiento en condiciones aceleradas (CA), y excipiente lipídico crudo . (A) DSC y (B) SWAXS. Esta cifra se ha modificado de18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Rendimiento del producto de SLN recién preparados (T0) y después de 3 y 6 meses de almacenamiento en condiciones aceleradas (3 m/CA, 6 m/CA). (A) Distribución del tamaño de partícula, (B) perfil de liberación, (C) eficiencia de encapsulación. Esta cifra se ha modificado de18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La difracción de rayos X en polvo y DSC se describieron en este manuscrito como estándares de oro para el análisis de estado sólido de LBE. La difracción de rayos X en polvo tiene la excelente ventaja de procesar las mediciones in situ, con una manipulación mínima del estado sólido de las muestras durante las mediciones. Además, los mismos capilares llenos se pueden almacenar en diferentes condiciones después de las mediciones iniciales para investigar la alteración del estado sólido durante el almacenamiento. En este trabajo, nos centramos en las regiones de ángulo amplio y pequeño de los rayos X, lo que nos permite entregar datos estructurales de dimensiones de hasta aproximadamente 100 nm.

Ultra SAXS (USAXS) se puede utilizar para rastrear la agregación de nanoplaquetas cristalinas (CNP) y el crecimiento cristalino en dimensiones más grandes. El método se ha aplicado con éxito en sistemas particulares para analizar tamaños CNP en la región de aproximadamente 100 a 1,000 nm 15,26,27. La caracterización de cristales lipídicos en sistemas líquidos requiere una mayor resolución. La radiación sincrotrón y el suministro de flujo de rayos X con mayor intensidad se utilizan normalmente para tal caracterización28. La difracción de rayos X sincrotrón y la dispersión de neutrones de ángulo pequeño (SANS) son herramientas poderosas para la caracterización de cristales líquidos y sistemas autoemulsionantes multicapa como los liposomas, que no son el alcance de este artículo25,28,29. Los sistemas líquidos también se pueden caracterizar utilizando la configuración de rayos X descrita en el protocolo ajustando el tiempo de radiación durante un período más largo.

Los siguientes puntos deben tenerse en cuenta para la implementación de los rayos X para la detección del estado sólido de los lípidos y sus composiciones: (i) En general, el tiempo de radiación debe seleccionarse individualmente, en función de la naturaleza de las muestras y la configuración del equipo. ii) La intensidad de las señales es directamente proporcional a la concentración de material en una mezcla. Por lo tanto, es importante cribar, al principio, la mezcla física de una composición multifásica. Esto evitará la interpretación errónea de los datos en dispersiones sólidas amorfas (ASD), si se investiga la recristalización de API amorfo en su composición procesada con un LBE. Para detectar pequeñas fracciones de cristales en tales composiciones, es importante acercar las regiones en las que se esperan las señales. (iii) La molienda de las muestras para proporcionar polvo fino para el llenado de capilares debe realizarse a baja temperatura para evitar el calor y el estrés externos. Esto puede causar alteración en el estado sólido del lípido en la muestra. El llenado denso de capilares es importante para evitar el atrapamiento de aire entre partículas y para asegurar la dispersión inmaculada de los rayos X por partículas.

DSC es una herramienta poderosa para evaluar el comportamiento térmico de los lípidos, estimar la miscibilidad de aditivos y / o API en la matriz lipídica y proporcionar diagramas de fase. El evento termodinámico, incluidos los inicios y picos de fusión y cristalización, así como la entalpía de cada evento, proporciona información útil sobre las formas polimórficas disponibles, las posibles transiciones polimórficas y las diferentes transiciones de fase. Sin embargo, contrariamente a la difracción de rayos X, el calor aplicado en las mediciones DSC puede manipular el comportamiento en estado sólido de los lípidos y causar transición polimórfica y de fase durante las mediciones. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente evitar el uso exclusivo de esta técnica para el análisis de estado sólido lipídico. Este método debe utilizarse como una técnica complementaria a la difracción de rayos X. La DSC acoplada y la difracción de rayos X se han utilizado ampliamente en la industria alimentaria para el análisis del estado sólido lipídico 30,31,32,33,34. Su aplicación en la industria farmacéutica se limita más bien a la detección de cambios polimórficos en APIs35,36,37. La otra desventaja del uso exclusivo de DSC es la caracterización de sistemas lipídicos multifásicos, porque la intensidad de los eventos térmicos depende de la concentración. Además, pueden ocurrir eventos térmicos superpuestos. El DSC de temperatura modulada puede ser utilizado para la caracterización de sistemas multifásicos, lo que permite la separación de eventos cinéticos y transiciones superpuestas38,39.

Los siguientes puntos deben tenerse en cuenta para implementar los ensayos DSC descritos en el protocolo: (i) Sobre la base de los experimentos, se puede aplicar un segundo ciclo de calentamiento si es necesario. (ii) Debido al comportamiento constante de la capacidad calorífica específica (Cp) de los lípidos durante el análisis, se apropia la selección de una línea base lineal. iii) Para obtener el inicio de la fusión(To), deben definirse los límites de cálculo. Los límites mínimo y máximo deben incluir el punto extremo de la curva derivada y el rango más lineal de la línea de base. El punto de intersección entre la tangente flexional y la línea de base se determina como To.

En el caso de termogramas con picos bien separados, se recomienda considerar la entalpía de cada evento calculando el área bajo la curva. Los datos son útiles para explicar el grado de transición polimórfica o de fase en el sistema, en combinación con los datos de difracción de rayos X.

Este manuscrito trata sobre los estándares de oro para el análisis de LBE y sus productos farmacéuticos. Se pueden utilizar otros métodos analíticos como métodos complementarios. Algunos ejemplos son los métodos microscópicos cualitativos, como la microscopía de luz polarizada y la microscopía electrónica de barrido, para investigar el efecto del estrés del proceso en la velocidad de cristalización y, en consecuencia, la forma y morfología de los cristales. El enfoque del desarrollo de productos farmacéuticos basados en lípidos debe basarse en la caracterización de los LBE fisicoquímicos, para definir sus atributos críticos relevantes para los procesos de fabricación seleccionados y predecir su procesabilidad. Las interacciones excipiente-API también deben examinarse cuidadosamente para cada API40 individual. Se deben agregar métodos analíticos adicionales basados en el proceso de fabricación seleccionado. La relación estructura-función-procesabilidad debe entenderse cuidadosamente para diseñar productos farmacéuticos basados en lípidos robustos y estables.

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Disclosures

Los autores revelan todos y cada uno de los conflictos de intereses.

Acknowledgments

El Centro de Investigación de Ingeniería Farmacéutica (RCPE) está financiado en el marco de COMET - Centros de Competencia para Tecnologías Excelentes por BMK, BMDW, Land Steiermark y SFG. El programa COMET es administrado por el FFG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2·2H2O Sigma-Aldrich 223506
Cassettes with a cellulose membrane bag with a cut-off of 7000 Da, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer 7K Fisher Scientific Inco, USA
Control software of x-ray system HECUS dedicated house equipment
Control unit of x-ray system HECUS dedicated house equipment
Differential scanning calorimeter (DSC) aluminum crucibles and lids Netzsch, Germany
Differential scanning calorimeter DSC 204 F1 Phoenix (NETZSCH, Germany). Netzsch, Germany
Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) Sigma-Aldrich 850355P
Dissolution paddle apparatus II, Erweka DT 828 LH Erweka GmbH, Langen, Germany
Dynasan 116 IOI OLEO Tripalmitin
Geleol Gattefosse Glyceryl monosterarate 
KCl  Sigma-Aldrich 529552
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662
Kolliphor P 188 BASF Chem Trade Poloxamer 188 
MgCl2·6H2O Sigma-Aldrich M2670
Na2HPO4·2H2O Sigma-Aldrich S9763
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Netzsch DSC 204F1 Software Version 8.0.1 Netzsch, Germany 6.239.2-64.51.00
Origin Pro (OriginLab, Northampton, MA) (statistical software OriginLab, Northampton, MA
Proteous Analysis Software Netzsch, Germany
Tween 65 Polysorbate 65
Witepsol PMF 1683 IOI OLEO Triglycerol ester of stearatic/palmitic acid (partially esterified)
Witepsol PMF 282 IOI OLEO Diglycerol ester of stearic acid 
X-ray HECUS system composed of a point-focusing camera and two linearly positioned sensitive detectors HECUS dedicated house equipment

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Química Número 186
Un paquete de herramientas analíticas establecidas para investigar la alteración en estado sólido de excipientes basados en lípidos
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Salar-Behzadi, S., Corzo, C.,… More

Salar-Behzadi, S., Corzo, C., Laggner, P. A Package of Established Analytical Tools to Investigate the Solid-State Alteration of Lipid-Based Excipients. J. Vis. Exp. (186), e63993, doi:10.3791/63993 (2022).

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