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Neuroscience

मांसपेशियों की क्षति के कम जोखिम के साथ चूहों में खुराक-समायोजित प्रतिरोध प्रशिक्षण

Published: August 31, 2022 doi: 10.3791/64000
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Physical Therapy Program, Department of Health Care Sciences, Eugene Applebaum College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University, 2Department of Pharmacology, University of Nevada, Reno School of Medicine

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल खुराक-समायोजित प्रतिरोध प्रशिक्षण (डार्ट) नामक एक अनूठी तकनीक का वर्णन करता है, जिसे चूहों जैसे छोटे जानवरों में किए गए सटीक पुनर्वास अध्ययनों में शामिल किया जा सकता है।

Abstract

प्रगतिशील प्रतिरोध प्रशिक्षण (पीआरटी), जिसमें उत्तरोत्तर अधिक बाहरी भार के खिलाफ मांसपेशियों के संकुचन करना शामिल है, स्वस्थ व्यक्तियों और रोगी आबादी में मांसपेशियों और ताकत को बढ़ा सकता है। छोटे और बड़े पशु मॉडल पर प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में मांसपेशियों के द्रव्यमान और ताकत को बनाए रखने और / या बहाल करने के लिए पीआरटी की सुरक्षा और प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए सटीक पुनर्वास उपकरणों की आवश्यकता है। इस आलेख में वर्णित पीआरटी पद्धति और डिवाइस का उपयोग खुराक-समायोजित प्रतिरोध प्रशिक्षण (डार्ट) करने के लिए किया जा सकता है। डार्ट डिवाइस का उपयोग चूहों में टखने डोर्सिफ्लेक्सर्स द्वारा उत्पन्न संकेंद्रित सिकुड़ा हुआ टोक़ का निष्पक्ष रूप से आकलन करने के लिए एक स्टैंडअलोन डायनेमोमीटर के रूप में किया जा सकता है या इसे पहले से मौजूद आइसोकाइनेटिक डायनेमोमेट्री सिस्टम में जोड़ा जा सकता है। डार्ट डिवाइस को इस काम में प्रदान किए गए निर्देशों और ओपन-सोर्स 3 डी प्रिंट फ़ाइलों के आधार पर एक मानक 3 डी प्रिंटर के साथ बनाया जा सकता है। लेख में लिंब-गर्डल मस्कुलर डिस्ट्रॉफी टाइप 2 बी / आर 2 (बीएलएजे चूहों) के माउस मॉडल में आइसोमेट्रिक संकुचन (आईएसओएम) के तुलनीय मुकाबले के कारण डार्ट के एकल मुकाबले के कारण संकुचन-प्रेरित मांसपेशियों की क्षति की तुलना करने के लिए एक अध्ययन के लिए वर्कफ़्लो का भी वर्णन किया गया है। आठ बीएलएजे चूहों (प्रत्येक स्थिति के लिए चार जानवर) के आंकड़ों से पता चलता है कि डार्ट या आईएसओएम के एक मुकाबले से टिबियलिस एंटीरियर (टीए) मांसपेशी का 10% से कम क्षतिग्रस्त हो गया था, जिसमें डार्ट आईएसओएम की तुलना में कम हानिकारक था।

Introduction

व्यायाम कंकाल की मांसपेशियों पर कई स्वास्थ्य लाभ प्रदान करता है (विना एट अल 1 में समीक्षा की गई)। विशेष रूप से, प्रगतिशील प्रतिरोध प्रशिक्षण (पीआरटी), जिसमें उत्तरोत्तर अधिक बाहरी भार (जैसे, बारबेल, डंबल, केबल-पुली-वजन सर्किट) के खिलाफ मांसपेशियों के संकुचन का प्रदर्शन करना शामिल है, स्वस्थ व्यक्तियों और रोगी आबादी दोनों में मांसपेशियों के द्रव्यमान और ताकत को बढ़ाने में मदद करने के लिए जाना जाता है (पिछले प्रकाशनोंमें समीक्षा 2,3) ). पीआरटी अधिभार सिद्धांत पर आधारित है, जो बताता है कि, जब मांसपेशी उत्तरोत्तर अधिक बाहरी भार के खिलाफ सिकुड़ती है, तो यह अपने शारीरिक क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र के साथ-साथ बल-उत्पादन क्षमता4 को बढ़ाकर अनुकूलित होती है। कृन्तकों में पीआरटी के मौजूदा मॉडल में पूंछ पर लागू प्रतिरोध के साथ सीढ़ी चढ़ना, विरोधी के प्रतिरोध के खिलाफ एगोनिस्ट मांसपेशियों का सह-संकुचन, भारित हार्नेस के साथ दौड़ना, बिजली के झटके से प्राप्त एक स्क्वैटिंग व्यायाम और 5,6,7,8,9,10 (पिछलेप्रकाशनों में समीक्षा की गई) शामिल हैं। ). हालांकि, वर्तमान में चूहों में मांसपेशियों-लक्षित, खुराक-समायोजित पीआरटी करने के लिए कोई शोध उपकरण नहीं हैं जो मानव नैदानिक अनुसंधान और अभ्यास12,13 में उपयोग किए जाने वाले पीआरटी विधियों और उपकरणों से निकटता से मिलते जुलते हैं। यह चूहों में बुनियादी और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में सटीक खुराक वाले पीआरटी की सुरक्षा और प्रभावशीलता का अध्ययन करने के लिए जांचकर्ताओं की क्षमता को सीमित करता है।

इस बाधा को दूर करने के लिए, आधुनिक व्यायामशालाओं14,15,16 में प्रतिरोध प्रशिक्षण उपकरणों में नियोजित केबल-पुली-वजन सर्किट डिजाइनों के आधार पर इस अध्ययन में एक पीआरटी पद्धति और उपकरण विकसित किया गया है। पीआरटी की इस विधि को खुराक-समायोजित प्रतिरोध प्रशिक्षण (डार्ट) के रूप में जाना जाता है, और डिवाइस को डार्ट डिवाइस कहा जाता है। एक सटीक पुनर्वास प्रशिक्षण उपकरण के रूप में इसकी कार्यक्षमता के अलावा, डार्ट डिवाइस का उपयोग माउस में टिबियलिस एंटीरियर (टीए) मांसपेशी द्वारा उत्पन्न अधिकतम संकेंद्रित सिकुड़ा हुआ टोक़ का निष्पक्ष रूप से आकलन करने के लिए एक स्टैंडअलोन उपकरण के रूप में भी किया जा सकता है, ठीक उसी तरह जैसे एक-पुनरावृत्ति अधिकतम (1आरएम, अधिकतम भार जिसे अच्छे रूप को बनाए रखते हुए केवल एक बार सफलतापूर्वक उठाया / स्थानांतरित / दबाया जा सकता है) कामूल्यांकन मनुष्यों में किया जाता है। 18. डार्ट डिवाइस को एक माउस में टीए मांसपेशी द्वारा उत्पादित पीक आइसोमेट्रिक टेटेनिक बल को मापने के लिए एक कस्टम-निर्मित या वाणिज्यिक आइसोकाइनेटिक डायनेमोमीटर के साथ भी जोड़ा जा सकता है (मनुष्यों में अधिकतम स्वैच्छिक संकुचन [एमवीसी] के बराबर) और फिर एक प्रतिरोध के साथ खुराक-समायोजित पीआरटी का प्रदर्शन करता है जो पीक टेटेनिक बल (जैसे, पीक बल का 50%) पर आधारित होता है।

यह लेख डार्ट डिवाइस के निर्माण का वर्णन करता है और बताता है कि इसे कस्टम-निर्मित डायनेमोमीटर के साथ कैसे जोड़ा जा सकता है, जिसे पूर्वप्रकाशनों 19,20,21,22 में वर्णित किया गया है, ताकि सिकुड़ा हुआ टोक़ का आकलन किया जा सके और डार्ट किया जा सके। अध्ययन में यह भी बताया गया है कि कैसे डार्ट डिवाइस का उपयोग डार्ट के एकल मुकाबले (50% 1आरएम के साथ 10 संकेंद्रित पक्षपाती संकुचन के 4 सेट) के कारण होने वाली व्यायाम-प्रेरित मांसपेशियों की क्षति की तुलना लिम्ब-गर्डल मस्कुलर डिस्ट्रॉफी टाइप 2 बी (एलजीएमडी 2 बी) के माउस मॉडल में आइसोमेट्रिक संकुचन (10 आइसोमेट्रिक संकुचन के 4 सेट) के कारण होने वाली क्षति से करने के लिए किया गया था। या एलजीएमडीआर 2) 23,24। अध्ययन किए गए माउस मॉडल में डिस्फेरिन नामक प्रोटीन की कमी है, जो हानिकारक सनकी संकुचन 22,25,26,27,28,29,30 के बाद देरी से शुरू होने वाली मांसपेशियों की क्षति के खिलाफ कंकाल की मांसपेशियों की रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है . डिस्फेरिन की कमी वाले नर चूहों में यह भी प्रदर्शित किया गया है कि संकेंद्रित रूप से पक्षपाती जबरन व्यायाम उतना हानिकारक नहीं है जितना कि सनकी रूप से पक्षपाती मजबूर व्यायाम और यह कि संकेंद्रित रूप से पक्षपाती प्रशिक्षण के पूर्व संपर्क में आने से सनकी रूप से पक्षपाती संकुचन के बाद की चोट से सुरक्षामिलती है। चूंकि वर्तमान अध्ययन खुराक-समायोजित, संकेंद्रित पक्षपाती प्रतिरोध प्रशिक्षण करने में वर्तमान डार्ट पद्धति और डिवाइस की व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए आयोजित किया गया था, इसलिए पिछले डेटा के साथ डार्ट डिवाइस से नए डेटा की तुलना करने के लिए जांच के लिए पुरुष डिस्फेर्लिन-कमी वाले चूहों को चुना गया था। भविष्य के अध्ययनों में, मादा BLAJ चूहों को डार्ट की प्रतिक्रिया के संबंध में जैविक चर के रूप में सेक्स के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए शामिल किया जाएगा। चूहों जो ~ 1.5 वर्ष के थे, उनका अध्ययन किया गया था क्योंकि उनके पास पहले से ही कई मांसपेशी समूहों में डिस्ट्रोफिक परिवर्तन हैं और इसलिए, पैथोफिजियोलॉजिकल स्थिति का मॉडल बनाते हैं जिसमें मांसपेशियां उन रोगियों में हो सकती हैं जिनके पास पहले से ही मांसपेशियों की कमजोरी और बर्बादी है और मांसपेशियों और ताकतको बनाए रखने के लिए पुनर्वास देखभाल की मांग कर रहे हैं।

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Protocol

इस लेख में वर्णित प्रयोगों को वेन स्टेट यूनिवर्सिटी, डेट्रायट, मिशिगन, यूएसए में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड (1996, नेशनल एकेडमी प्रेस, 2101 संविधान एवे एनडब्ल्यू, वाशिंगटन, डीसी 20055, यूएसए द्वारा प्रकाशित) के अनुसार अनुमोदित किया गया था। B6. जीनजे चूहों (ए.के.ए. बीएलएजे चूहों, पुरुषों, ~ 1.5 वर्ष) का उपयोग वर्तमान अध्ययन के लिए एलजीएमडी 2 बी / आर 2 मॉडल के रूप में किया गया था। चूहों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था (सामग्री की तालिका देखें)।

1. अध्ययन डिजाइन

  1. अनुसंधान प्रश्न (ओं) के लिए प्रासंगिक माउस तनाव चुनें - उदाहरण के लिए, बी 6 का अध्ययन करें। जीनजे चूहों (बीएलएजे चूहों) यदि इस सवाल का जवाब देने की कोशिश कर रहे हैं कि क्या संकेंद्रित रूप से पक्षपाती डार्ट एलजीएमडी 2 बी / आर 2 मॉडल करने वाले चूहों में व्यापक मांसपेशियों की क्षति को प्रेरित करता है या नहीं।
  2. अध्ययन डिजाइन के आधार पर अध्ययन समूहों के लिए चूहों को असाइन करें- उदाहरण के लिए, यादृच्छिक रूप से चूहों को खुराक-समायोजित प्रतिरोध प्रशिक्षण (डार्ट) समूह या एक आइसोमेट्रिक प्रशिक्षण समूह (आईएसओएम) को असाइन करें, और कूड़े और / या उम्र (जैसे, तालिका 1) के मिलान के आधार पर समूहों को यथासंभव संतुलित करने का प्रयास करें।

2. डार्ट डिवाइस का निर्माण

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए उपयुक्त कंप्यूटर-एडेड (सीएडी) सॉफ्टवेयर (चित्रा 1) के साथ डार्ट डिवाइस घटकों को डिज़ाइन करें।
    1. कम घर्षण पहिया असर के लिए आवास डिजाइन करें (तकिया ब्लॉक असर डिजाइन के आधार पर सामग्री की तालिका देखें) एक अंतर्निहित प्रोट्रैक्टर (टखने के संयुक्त कोण को मापने के लिए गोनोमीटर के रूप में उपयोग के लिए)।
    2. व्हील बेयरिंग हाउसिंग के साथ-साथ एक प्रोट्रैक्टर के लिए एक टॉवर डिजाइन करें।
    3. माउस के पैर की स्थिति के लिए एक फुटप्लेट डिजाइन करें। फुटप्लेट को व्हील बेयरिंग से जोड़ने के लिए एक धुरी डिजाइन करें।
  2. एक उपयुक्त 3 डी प्रिंटर (चित्रा 1) के साथ डार्ट डिवाइस घटकों का निर्माण करें।
    1. सीएडी सॉफ्टवेयर के साथ बनाए गए डिजाइनों को स्टीरियोलिथोग्राफी के रूप में सहेजें (। एसटीएल एक्सटेंशन) फाइलें।
      नोट: . एसटीएल फाइलों (पूरक कोडिंग फाइलें 1-4) का उपयोग इस लेख के संबंधित लेखक को क्रेडिट देकर और इस लेख का हवाला देकर और संशोधित किया जा सकता है।
    2. खोलें। उपयुक्त स्लाइसिंग सॉफ्टवेयर के साथ एसटीएल फाइलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: स्लाइसिंग सॉफ्टवेयर एक वर्चुअल 3 डी मॉडल को स्लाइस के ढेर में परिवर्तित करता है, जिसे 3 डी ऑब्जेक्ट उत्पन्न करने के लिए 3 डी प्रिंटर द्वारा क्रमिक रूप से मुद्रित किया जा सकता है।
    3. स्लाइसिंग सॉफ्टवेयर के साथ, जी-कोड कंप्यूटर-एडेड विनिर्माण (सीएएम, । GCODE एक्सटेंशन) फाइलें, जो 3 D प्रिंटर और फिलामेंट के लिए विशिष्ट हैं जिनका उपयोग किया जाएगा।
    4. डार्ट डिवाइस घटकों को मुद्रित करने के लिए 3D प्रिंटर मैनुअल ( सामग्री तालिका देखें) का पालन करें। GCODE फ़ाइलें.
    5. एक उपयुक्त 3 डी प्रिंटर फिलामेंट चुनें, जैसे कि पॉलीलैक्टिक एसिड (पीएलए) 1.75 मिमी 1 किलो / स्पूल, ग्रे ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए डार्ट डिवाइस को इकट्ठा करें।
    1. पहिया असर आवास में 608 कम घर्षण पहिया असर (8 मिमी बोर व्यास, 22 मिमी बाहरी व्यास, जैसे सिलिकॉन नाइट्राइड सिरेमिक गेंदों के साथ 420 स्टेनलेस स्टील में रखा गया, सामग्री की तालिका देखें) को पहिया असर आवास में डालें (चित्रा 1)।
    2. धुरी को पहिया असर के बोर में डालें (चित्र 1)।
    3. गोंद के साथ धुरी पर फुटप्लेट पेस्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें) जो पीएलए को बांधने के लिए उपयुक्त है (चित्रा 1)।
    4. व्हील असर हाउसिंग टॉवर के ऊपर व्हील बेयरिंग हाउसिंग रखें और पूरी असेंबली को स्क्रू फास्टनर के साथ एक ऐक्रेलिक बेस से संलग्न करें (चित्रा 1)।
      नोट: ऐक्रेलिक बेस के लिए कोई विशिष्ट आकार की आवश्यकता नहीं है - यह सिर्फ पशु और डार्ट डिवाइस को समायोजित करने के लिए पर्याप्त बड़ा होना चाहिए और काम की सतह पर फिट होने के लिए पर्याप्त छोटा होना चाहिए। वर्तमान अध्ययन के लिए उपयोग किया जाने वाला ऐक्रेलिक आधार लगभग 30 सेमी चौड़ा, 45 सेमी लंबा और 0.5 सेमी मोटा है।

3. डार्ट या आईएसओएम के लिए चूहों की तैयारी

  1. तनाव और दर्द को कम करने के लिए प्रत्येक माउस को एक उपयुक्त संज्ञाहरण प्रणाली के माध्यम से दिए गए इनहेल्ड आइसोफ्लुरेन के साथ सामान्य संज्ञाहरण के तहत रखें ( सामग्री की तालिका देखें, प्रेरण के लिए 2% -5%; रखरखाव के लिए 1% -4%; प्रभाव के लिए)।
    1. संज्ञाहरण प्रणाली के प्रेरण कक्ष में संज्ञाहरण को प्रेरित करें (2% -5% आइसोफ्लुरेन)।
    2. जानवर पर प्रक्रियाओं को करते समय संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए माउस को नाक शंकु में स्थानांतरित करें (1% -4% आइसोफ्लुरेन)। चिमटी की एक जोड़ी से पैर की अंगुली की चुटकी के लिए हिंदलिम्ब वापसी की कमी के आधार पर संज्ञाहरण प्रभावशीलता की पुष्टि करें।
    3. थर्मल समर्थन प्रदान करें - उदाहरण के लिए, एक इज़ोटेर्मल जेल हीटिंग पैड और माउस से ~ 1 मीटर ऊपर रखा गया एक गर्मी लैंप। यह सुनिश्चित करने के लिए थर्मामीटर से जांचें कि ऐक्रेलिक बेस पर और उसके आसपास का तापमान ~ 38 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया है, इसलिए माउस अधिक गर्म न हो।
  2. डार्ट या आईएसओएम के लिए माउस के बाएं टिबियलिस एंटीरियर (टीए) मांसपेशी पर और बाएं हिंदलिम्ब के पूरे पूर्ववर्ती और पार्श्व पहलुओं पर त्वचा तैयार करें।
    1. बाल हटाने वाली क्रीम (डिपिलेटरी क्रीम, सामग्री की तालिका देखें) के साथ माउस के फर को हटा दें। डिपिलेटरी क्रीम लागू करें और इसे ~ 2 मिनट के लिए काम करने दें।
    2. त्वचा से फर और सभी अवशिष्ट क्रीम को हटाने के लिए आसुत जल में भिगोए गए पोंछे से पैर को साफ करें। लंबे समय तक माउस की त्वचा पर छोड़े जाने पर डिपिलेटरी क्रीम त्वचा को परेशान और / या नुकसान पहुंचा सकती है और इसलिए, पूरी तरह से हटा दें।
    3. फर हटाने के बाद, एक अनुमोदित स्क्रबिंग विधि के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें, जैसे कि पोविडोन-आयोडीन स्क्रबिंग समाधान और 70% इथेनॉल के साथ।
  3. आंखों और विकृत त्वचा को सूखने से बचाने के लिए एक साफ सूती फाहे के साथ आंखों और विकृत त्वचा पर एक प्रोटेक्टेंट (जैसे, पेट्रोलाटम) लागू करें।
  4. टिबियल मेटाफिसिस के माध्यम से एक स्थिर पिन रखें।
    1. क्षेत्र को सुन्न करने के लिए टिबिया के ऊपर 5% लिडोकेन क्रीम लागू करें।
    2. टिबियल हड्डी के समीपस्थ भाग के सबसे चौड़े हिस्से के माध्यम से एक 26 ग्राम, आधा इंच, बाँझ, हाइपोडर्मिक सुई पास करें (यानी, टिबियल मेटाफिसिस, जिसे टिबियल सिर के रूप में भी जाना जाता है)। एक बार स्थिर करने वाला पिन सुरक्षित हो जाने के बाद, सुई को बाँझ हेमोस्टैट के साथ पकड़कर हाइपोडर्मिक सुई के प्लास्टिक के हिस्से को हटा दें और प्लास्टिक के हिस्से को तब तक झुकाएं जब तक कि यह टूट न जाए।
  5. डार्ट या ISOM प्रशिक्षण के लिए माउस रखें।
    1. माउस को लापरवाह स्थिति में रखें। सुनिश्चित करें कि एनेस्थीसिया बनाए रखने के लिए माउस अभी भी नाक शंकु से सुरक्षित रूप से जुड़ा हुआ है।
    2. बाँझ-टिप्ड चिमटी की एक जोड़ी के साथ, टिबियल पिन को धातु घड़ियाल क्लिप में खिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें), जैसे कि टिबियल पिन के सिरों को मगरमच्छ क्लैंप द्वारा रखा जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि माउस का पैर डार्ट डिवाइस के फुटप्लेट पर रखा गया है, मगरमच्छ क्लैंप के समायोज्य हाथ को स्थानांतरित करें।
    3. चिपकने वाली प्रयोगशाला टेप के साथ डार्ट डिवाइस फुटप्लेट पर माउस के पैर को स्ट्रैप करें।
    4. माउस के पैर को माउस की टिबियल हड्डी की लंबी धुरी के संबंध में 90 ° कोण पर रखें। यदि सही ढंग से रखा जाता है, तो फुटप्लेट ऐक्रेलिक बेस (यानी, फर्श या जिसे क्षैतिज विमान माना जाता है) के लंबवत होगा।
    5. डार्ट डिवाइस के प्रोट्रैक्टर (चित्रा 1) पर प्रीड्रिल्ड छेद के माध्यम से लंबी हाइपोडर्मिक सुई में 18 जी, 1.5 रखकर बनाए गए प्लांटरफ्लेक्सन स्टॉप पर फुटप्लेट को आराम दें।

4. डार्ट या आईएसओएम प्रशिक्षण

  1. माउस के घुटने के जोड़ (चित्रा 1 बी) के इनफेरोलेटरल पहलू पर द्विध्रुवी, ट्रांसक्यूटेनियस, न्यूरोमस्कुलर विद्युत उत्तेजना (एनएमईएस, सामग्री की तालिका देखें) इलेक्ट्रोड रखकर इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट को अनुकूलित करें।
    1. प्रयोगशाला विद्युत उत्तेजक से एकल दालों (1 हर्ट्ज) के साथ ( सामग्री की तालिका देखें), साइटिक तंत्रिका की फाइबुलर शाखा को उत्तेजित करता है, जो टखने डोर्सिफ्लेक्सर मांसपेशियों को मोटर संक्रमण प्रदान करता है (चित्रा 1 बी)।
    2. चूंकि टिबियलिस एंटीरियर (टीए) मांसपेशी टखने डोर्सिफ्लेक्सर मांसपेशियों द्वारा उत्पादित कुल सिकुड़ा हुआ बलका 90% से अधिक है, इसलिए विद्युत रूप से प्राप्त ट्विच संकुचन के प्रमाण के लिए टीए मांसपेशी पेट और कण्डरा का निरीक्षण करें।
      नोट: एक मामूली बोनी प्रमुखता जो फिबुला हड्डी से मेल खाती है, इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट में मदद कर सकती है यदि परीक्षक इसे इलेक्ट्रोड के माध्यम से महसूस कर सकता है। इष्टतम इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट के लिए महसूस करने के लिए परीक्षक की ओर से कुछ अभ्यास और सीखने की आवश्यकता होती है।
    3. प्लांटरफ्लेक्सन स्टॉप को प्रोट्रैक्टर पर छेद में ले जाएं जो 20 डिग्री प्लांटरफ्लेक्सन से मेल खाती है, उस स्थिति से जिस पर पैर ऑर्थोगोनल (90 डिग्री) टिबिया से मेल खाता है - यह वह स्थिति है जिस पर टीए मांसपेशी से अधिकतम सिकुड़ा हुआ टोक़ आमतौर पर पिछली रिपोर्ट21 के आधार पर देखा जाता है। यह अध्ययन किए जा रहे चूहों के लिए विशिष्ट कारकों के आधार पर उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है।
    4. डार्ट डिवाइस फुटप्लेट को डायनेमोमीटर फुटप्लेट से जोड़कर माउस डायनेमोमीटर के साथ ट्विच टोक़ की कल्पना करें - उदाहरण के लिए, डार्ट डिवाइस फुटप्लेट को एक गैर-लोचदार रेशम सीवन ( चित्रा 1 ए के समान) के साथ कस्टम-निर्मित रोबोटिक टखने डायनेमोमीटर फुटप्लेट से लिंक करें और सीवन को डायनेमोमीटर फुटप्लेट से स्ट्रैप करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: फुटप्लेट में 3 डी प्रिंट डिजाइन में बनाए गए छेद हैं। फुटप्लेट के पैर की अंगुली के अंत से दूसरी पंक्ति में छेद की जोड़ी के माध्यम से सीवन को रखने से सीवन डोर्सिफ्लेक्सन / प्लांटरफ्लेक्सन की धुरी से ~ 20 मिमी पर पहुंच जाता है (चित्रा 1 ए, बी)। डायनेमोमीटर को पिछली रिपोर्ट 19,20,21,22 में वर्णित किया गया है।
  2. एनएमईएस उत्तेजक से वोल्टेज आउटपुट को अनुकूलित करें।
    1. इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट को अनुकूलित करने के बाद, विद्युत उत्तेजक से वोल्टेज आउटपुट के आयाम को अनुकूलित करें - यह एनएमईएस को सामान्य फाइबुलर तंत्रिका और टीए मांसपेशी तक सीमित करने और प्लांटारफ्लेक्सर्स में सह-संकुचन प्राप्त करने के जोखिम को कम करने के लिए आवश्यक है।
      नोट: यदि सह-संकुचन प्राप्त किए जाते हैं, तो उन्हें डायनेमोमीटर से टोक़ आउटपुट के माध्यम से देखा जा सकता है और पैर की उंगलियों के प्लांटरफ्लेक्सिंग में भी देखा जा सकता है।
  3. डार्ट या आईएसओएम प्रशिक्षण के लिए एनएमईएस उत्तेजक सेट करें।
    नोट: अध्ययन किए जा रहे चूहों के लिए विशिष्ट कारकों और अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर उपयोगकर्ता द्वारा निम्नलिखित सेटिंग्स को अनुकूलित करना पड़ सकता है।
    1. बार-बार पल्स ट्रेनों का उत्पादन करने के लिए उत्तेजक सेट करें जो आवृत्ति में 125 हर्ट्ज हैं - यह आवृत्ति बीएलएजे चूहों21 में अन्य मांसपेशी समूहों में एनएमईएस के अतिप्रवाह के बिना अधिकतम फ्यूज्ड टेटेनिक संकुचन पैदा करती है। पल्स फ्रीक्वेंसी (125 हर्ट्ज), ट्रेन अवधि (500 एमएस), और ट्रेन प्रति सेकंड (1 ट्रेन / सेकंड) के लिए डायल को समायोजित करके और पल्स ट्रेनों को दोहराने के लिए टॉगल स्विच चालू करके ऐसा करें।
    2. पल्स ट्रेनों का उत्पादन करने के लिए उत्तेजक सेट करें जो 500 एमएस की अवधि में हैं और पल्स ट्रेनों के बीच 500 एमएस आराम के साथ हैं।
    3. प्लांटरफ्लेक्सन स्टॉप को प्रोट्रैक्टर पर छेद में ले जाएं जो टिबिया की लंबी धुरी से 160 डिग्री से मेल खाता है (पैर ऑर्थोगोनल से टिबिया तक 70 डिग्री प्लांटरफ्लेक्सन)। यह वह स्थिति है जिसमें BLAJ माउस के पैर को नरम ऊतक प्रतिरोध21 के बिना निष्क्रिय रूप से स्थानांतरित किया जा सकता है।
    4. डार्ट के लिए, एक उपयुक्त प्रतिरोध लागू करें जिसके खिलाफ टीए मांसपेशी को संकेंद्रित रूप से काम करना पड़ता है - उदाहरण के लिए, 5 ग्राम जैसा कि चित्रा 1 ए, बी में दिखाया गया है; पूरक फ़ाइल 1 में टोक़ अंशांकन वक्र के लिए वजन देखें।
    5. एक गैर-लोचदार रेशम सीवन के साथ वजन लटकाकर प्रतिरोध लागू करें जो डार्ट डिवाइस फुटप्लेट (चित्रा 1 ए, बी) से जुड़ा हुआ है।
    6. प्रतिरोध को समायोजित करें - यानी, एक-पुनरावृत्ति अधिकतम (1आरएम) का ~ 50% लागू करें (उदाहरण के लिए, 5 ग्राम यदि माउस एकल संकुचन के साथ 10 ग्राम का अधिकतम वजन उठा सकता है), जो डोर्सिफ्लेक्सन की उपलब्ध सक्रिय सीमा के कम से कम आधे हिस्से के माध्यम से पैर खींचता है।
    7. डार्ट समूह को सौंपे गए चूहों में उपयुक्त डार्ट प्रशिक्षण करें - उदाहरण के लिए, डार्ट प्रशिक्षण का एक मुकाबला करें, जिसमें सेट के बीच 2 मिनट के आराम के साथ संकेंद्रित संकुचन के 10 दोहराव के चार सेट शामिल हैं, जो मनुष्यों में उपयोग किए जाने वाले प्रगतिशील प्रतिरोध प्रशिक्षणकार्यक्रमों के समान हैं (पूरक वीडियो 1 देखें)।
    8. आईएसओएम समूह को सौंपे गए चूहों में उपयुक्त आईएसओएम प्रशिक्षण करें - उदाहरण के लिए, आईएसओएम प्रशिक्षण का एक मुकाबला करें, जिसमें डार्ट के समान सेटों के बीच 2 मिनट के आराम के साथ आइसोमेट्रिक संकुचन के 10 दोहराव के चार सेट शामिल हैं ( पूरक वीडियो 2 देखें)।
    9. आईएसओएम प्रशिक्षण के लिए, माउस के पैर को टिबिया की लंबी धुरी पर 160 डिग्री पर रखें (पैर ऑर्थोगोनल से टिबिया तक 70 डिग्री प्लांटरफ्लेक्सन), और रेशम सीवन को रोबोटिक डायनेमोमीटर के फुटप्लेट पर टैप करके इस स्थिर स्थिति को बनाए रखें।
      नोट: चूंकि सीवन स्लाइड नहीं कर सकता है, इसलिए डार्ट डिवाइस फुटप्लेट डोर्सिफ्लेक्सन में नहीं जा सकता है, इस प्रकार डोर्सिफ्लेक्सर्स को आइसोमेट्रिक रूप से अनुबंध करने के लिए बाधित करता है।

5. चूहों के लिए पोस्ट-प्रक्रियात्मक देखभाल

  1. व्यायाम किए गए हिंदलिम्ब की उचित स्वच्छता बनाए रखने और सुई साइट के दर्द को कम करने के लिए सावधानी बरतें।
    1. डार्ट या आईएसओएम प्रशिक्षण के बाद, टिबियल पिन के दृश्य भाग को ट्रिपल एंटीबायोटिक मलहम (400 यू / जी बेसिट्रासिन, 3.5 मिलीग्राम / जी नियोमाइसिन, और 5000 यू / जी पॉलीमिक्सिन-बी, सामग्री की तालिका देखें) के साथ कोट करें और फिर टिबिया के मध्यवर्ती पक्ष से पिन को सावधानीपूर्वक वापस लें। पार्श्व जांघ और ऊपरी पैर पर पोविडोन-आयोडीन और बाँझ पानी से त्वचा को धोएं। सुई साइट के दर्द को नियंत्रित करने के लिए टिबिया पर 5% लिडोकेन क्रीम लागू करें।
  2. चूहों को संज्ञाहरण से ठीक होने दें।
    1. नाक शंकु से माउस को हटा दें और इसे एक रिकवरी पिंजरे में संज्ञाहरण से ठीक होने दें जो बिस्तर से मुक्त है। माउस को थर्मल सहायता प्रदान करें, जबकि यह संज्ञाहरण से ठीक हो जाता है, उदाहरण के लिए, एक आइसोथर्मल जेल हीटिंग पैड के साथ।
  3. एनेस्थीसिया से पूरी तरह से ठीक होने के बाद माउस को उसके मूल पिंजरे में वापस कर दें। फिर, पिंजरे को पशु सुविधा में वापस कर दें, जहां अध्ययन चूहों को तब तक रखा जाता है जब तक कि अनुवर्ती प्रयोग नहीं किए जाते हैं। रोजाना चूहों की निगरानी करें।

6. ऊतक संग्रह

  1. माउस टीए मांसपेशी को इसकी संपूर्णता में काटें और नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए फ्रीज करें।
    1. अनुसंधान प्रश्न (ओं) के आधार पर, प्रशिक्षण के बाद उपयुक्त समय पर (उदाहरण के लिए, डार्ट या आईएसओएम के 3 दिन बाद), अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों को इच्छामृत्यु दें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, चूहों को सामान्य संज्ञाहरण (इनहेल्ड आइसोफ्लुरेन, 2% -5% प्रभाव) के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु दी गई थी। द्विपक्षीय थोराकोटॉमी ने मृत्यु सुनिश्चित की।
    2. व्यायाम की गई टीए मांसपेशी (बाएं) और अनियंत्रित टीए मांसपेशी (दाएं) को हटाने के लिए माउस हिंदलिम्ब्स को विच्छेदित करें। कटी हुई मांसपेशियों का वजन करें। फिर, क्रायोप्रोटेक्शन के लिए खनिज तेल में प्रत्येक मांसपेशी को डुबोएं और अतिरिक्त तेल21 को मिटाने के लिए मांसपेशियों को एक साफ लैब वाइप पर रखें।
  2. मांसपेशियों को एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े पर रखें। एक लंबे हेमोस्टैट के साथ पन्नी के किनारे को पकड़ें और मांसपेशियों को स्नैप फ्रीज करने के लिए एक उपयुक्त प्लास्टिक कंटेनर में निहित तरल नाइट्रोजन में पन्नी और मांसपेशियों को तेजी से डुबो दें।
    1. तरल नाइट्रोजन में विसर्जन के लगभग 2 मिनट के बाद, जमे हुए मांसपेशियों को लेबल क्रायोजेनिक शीशियों में स्थानांतरित करें। आगे के अध्ययन के लिए आवश्यक होने तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में शीशियों को स्टोर करें।

7. मांसपेशियों के ऊतकों पर हिस्टोलॉजिकल अध्ययन

  1. टीए मांसपेशी के क्रायोस्टेट अनुभाग तैयार करें जो मोटाई में 5 μm हैं। चार्ज माइक्रोस्कोप स्लाइड पर क्रायोस्टेट अनुभाग एकत्र करें। एसीटोन के साथ अनुभागों को ठीक करें जिन्हें -30 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा रखा जाता है और अनुभागों को हवा में सूखने दें।
  2. मांसपेशियों के ऊतकों को हेमटोक्सिलिन के साथ दाग दें, इसके बाद ईओसिन (एच एंड ई धुंधला, सामग्री की तालिका देखें)।
    1. कांच के दाग वाले जार में हेमटोक्सिलिन (गहरे नीले परमाणु दाग) में 5 मिनट के लिए अनुभागों को डुबोएं। नल के पानी से खंडों को धोकर अतिरिक्त हेमटोक्सिलिन को हटा दें जब तक कि पानी का कोई और धुंधलापन न दिखाई दे।
    2. एक ग्लास जार में ब्लिंग अभिकर्मक में 5 मिनट के लिए अनुभागों को डुबोएं। ग्लास सक्शन पिपेट के साथ अनुभागों से अतिरिक्त नीला अभिकर्मक को एस्पिरेटेड करें।
    3. कांच के दाग वाले जार में ईओसिन (गुलाबी साइटोप्लाज्मिक दाग) में 5 मिनट के लिए अनुभागों को डुबोएं। कांच के धुंधला जार में 95% इथेनॉल में अनुभागों को जल्दी और बार-बार (~ 10 बार) डुबोकर अतिरिक्त ईओसिन को हटा दें।
    4. अनुभागों को हवा में सूखने दें और प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना करने के लिए आगे बढ़ें।
  3. माइक्रोस्कोप इमेजिंग के माध्यम से पूरे टीए मांसपेशी क्रॉस-सेक्शन की उच्च-रिज़ॉल्यूशन टाइल वाली छवियां तैयार करें।
    नोट: उपयोगकर्ता को इमेजिंग और छवि विश्लेषण चरणों को अनुकूलित करना पड़ सकता है जो उनके माइक्रोस्कोप और छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के आधार पर अनुसरण करते हैं।
    1. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के 10x उद्देश्य लेंस और माइक्रोस्कोप पर लगे एक डिजिटल कैमरे के साथ डिजिटल छवियों को कैप्चर करें।
    2. लगभग 15-20 छवियों को कैप्चर करें, प्रत्येक मांसपेशी के क्रॉस-सेक्शन के साथ ग्रिड जैसे तरीके से आगे बढ़ें, जैसे कि प्रत्येक नई छवि पिछली छवि के साथ ~ 25% ओवरलैप होती है।
      नोट: यह प्रक्रिया छवियों के एक सेट को कैप्चर करने में मदद करती है जिसे पूरे टीए मांसपेशी क्रॉस-सेक्शन (चित्रा 2) की उच्च-रिज़ॉल्यूशन समग्र छवि बनाने के लिए डिजिटल रूप से टाइल किया जा सकता है (जिसे छवि सिलाई के रूप में भी जाना जाता है)।
    3. में डिजिटल छवियों को सहेजें। टीआईएफएफ प्रारूप।
    4. उपयुक्त छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डिजिटल छवियां खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    5. निम्नलिखित चरणों के माध्यम से पूरे टीए मांसपेशी की समग्र छवि में अलग-अलग छवियों को टाइल या सिलाई करें: सॉफ्टवेयर में प्रत्येक टीए मांसपेशी की सभी अलग-अलग ओवरलैपिंग छवियों को खोलने के साथ, फ़ाइल पर क्लिक करें > स्वचालित > फोटोमर्ज का चयन करें > कोलाज का चयन करें > खुली फ़ाइलें जोड़ें > क्लिक करें।
    6. जब टीए मांसपेशी की एक नई टाइल/ सिले हुए छवि तैयार और प्रदर्शित की जाती है, तो छवि को सहेजें। आगे के विश्लेषण के लिए टीआईएफएफ प्रारूप।
  4. उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ पूरे टीए मांसपेशी की टाइल वाली छवियों में दृश्य विश्लेषण द्वारा मांसपेशियों की क्षति की मात्रा निर्धारित करें।
    1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, पूरे टीए मांसपेशी क्रॉस-सेक्शन (चित्रा 2) के क्षेत्र को रेखांकित करने और मापने के लिए विश्लेषण मेनू में माप फ़ंक्शन का चयन करें।
    2. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, क्षतिग्रस्त प्रत्येक टीए मांसपेशी के क्षेत्रों को रेखांकित करने और मापने के लिए विश्लेषण मेनू में माप फ़ंक्शन का चयन करें - यानी, ऐसे क्षेत्र जो मांसपेशी फाइबर, अनुपस्थित मांसपेशी फाइबर और भड़काऊ सेल घुसपैठ के साइटोप्लाज्मिक व्यवधान दिखाते हैं22 (चित्रा 2)।
    3. क्षति के कुल क्षेत्र के योग को पूरे टीए मांसपेशी क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में व्यक्त करें (चित्रा 2, तालिका 2)।

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. तालिका 1-3 में दिखाए गए अनुसार डेटा को व्यवस्थित करें और गैर-युग्मित टी-परीक्षण करें (यदि सामान्यता और समरूप भिन्नता के परीक्षण पारित किए जाते हैं)33 या मान-व्हिटनी रैंक योग परीक्षण (यदि सामान्यता और समरूप भिन्नता के परीक्षण पारित नहीं होते हैं)21 उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ (सामग्री की तालिका देखें)।

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Representative Results

BLAJ नर चूहों, जो ~ 1.5 वर्ष की उम्र के थे, का अध्ययन किया गया था। BLAJ चूहे मानव मांसपेशियों की बीमारी, LGMD2B / R2 का मॉडल करते हैं। ये चूहे विशेष रूप से सनकी मांसपेशियों के संकुचन22,29 के एक मुकाबले से मांसपेशियों की क्षति में देरी के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इसलिए, बीएलएजे चूहों को इन अध्ययनों के लिए चुना गया था, यह जानने के लिए कि क्या डार्ट को गैर-हानिकारक तरीके से किया जा सकता है, उस प्रतिरोध को ठीक से समायोजित करके जिसके खिलाफ टीए मांसपेशियों को संकेंद्रित रूप से पक्षपाती तरीके से काम करना पड़ता है। यदि यह पाया गया कि डार्ट बीएलएजे चूहों के लिए गैर-हानिकारक था, तो यह संभवतः गैर-हानिकारक प्रतिरोध प्रशिक्षण के रूप में उपयोगी होगा, जिसे अकेले या पुनर्योजी चिकित्सा, आनुवंशिक, औषधीय और अन्य हस्तक्षेपों के सहायक के रूप में लागू किया जा सकता है।

BLAJ चूहों की उम्र और वजन डार्ट और ISOM समूहों (तालिका 1) के बीच निकटता से मेल खाते थे। दिन 3 (~ 72 घंटे) पर, प्रशिक्षण के एक मुकाबले के बाद, व्यायाम की गई टीए मांसपेशियों में डार्ट और आईएसओएम समूहों (<10% क्षतिग्रस्त क्षेत्र) दोनों में क्षति का निम्न स्तर था - यह सनकी मांसपेशियों के संकुचन के लिए बीएलएजे चूहों की प्रतिक्रिया के पिछले अध्ययनों के विपरीत है, जहां ~ 40% क्षतिग्रस्त फाइबर को दिन 3 में रिपोर्ट किया गया है (चित्रा 2, चित्र 2, तालिका 2)। जब डार्ट और आईएसओएम समूहों से व्यायाम की गई टीए मांसपेशियों के बीच मांसपेशियों की क्षति के क्षेत्र की तुलना की गई, तो यह पाया गया कि डार्ट समूह में आईएसओएम समूह की तुलना में मांसपेशियों की क्षति का स्तर कम था (चित्रा 2, तालिका 2)। दिन 0 (बेसलाइन) और दिन 3 पर दर्ज अधिकतम टेटनिक टोक़ डार्ट और आईएसओएम समूहों (तालिका 3) के बीच सांख्यिकीय रूप से भिन्न नहीं था।

Figure 1
चित्र 1: डार्ट डिवाइस का निर्माण करना और इसे एक प्रशिक्षण अध्ययन में लागू करना। (A, B) डार्ट डिवाइस एक केबल-पुली-वजन सर्किट डिज़ाइन पर आधारित है, जो मनुष्यों के लिए डिज़ाइन किए गए प्रतिरोध प्रशिक्षण उपकरण के लिए आम है। (ए) डार्ट प्रशिक्षण सत्र के दौरान एक जानवर के साथ डार्ट डिवाइस। (बी) टीए मांसपेशी (घुमावदार हरे तीर, दाएं) के संकेंद्रित संकुचन के दौरान डोर्सिफ्लेक्सन में जाने वाली फुटप्लेट। संकेंद्रित संकुचन 5 ग्राम प्रतिरोध को गुरुत्वाकर्षण (ऊर्ध्वाधर हरे तीर, बाएं) के खिलाफ लंबवत रूप से स्थानांतरित करने का कारण बनता है। मांसपेशियों के संकुचन को ट्रांसक्यूटेनियस बाइपोलर इलेक्ट्रोड के माध्यम से लागू विद्युत उत्तेजना के साथ प्राप्त किया गया था। (ग) डार्ट डिवाइस के विभिन्न घटकों को उत्पन्न करने के लिए स्टीरियोलिथोग्राफी सॉफ्टवेयर के साथ डिजाइन किया गया था। एसटीएल फाइलें, जिन्हें स्लाइसिंग सॉफ्टवेयर के साथ खोला जा सकता है। स्लाइसिंग सॉफ्टवेयर के साथ, जी-कोड फाइलें 3 डी प्रिंटर और फिलामेंट के लिए विशिष्ट रूप से उत्पन्न हुईं। डार्ट डिवाइस के 3 डी मुद्रित घटकों में (सी) 608 कम घर्षण पहिया असर के लिए आवास, (डी) पहिया असर आवास के लिए एक टॉवर, (ई) एक फुटप्लेट, और (एफ) फुटप्लेट को पहिया असर से जोड़ने के लिए एक धुरा शामिल था। 3 डी मुद्रित घटकों को जोड़ा गया और गोंद और स्क्रू फास्टनर के साथ एक ऐक्रेलिक बेस पर रखा गया, जैसा कि पाठ में वर्णित है और (ए) में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: हिस्टोलॉजिकल अध्ययन। दिन 3 (ए) पोस्ट-डार्ट या (बी) पोस्ट-आईएसओएम में टीए मांसपेशियों में हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन। क्रायोसेक्शन, जो मोटाई में 5 μm थे, हेमटोक्सीलिन और ईओसिन से दागदार थे। कई ओवरलैपिंग डिजिटल छवियों को कैप्चर किया गया और पूरे टीए मांसपेशी क्रॉस-सेक्शन की उच्च-रिज़ॉल्यूशन टाइल वाली छवियों को उत्पन्न करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ विलय कर दिया गया। गुणात्मक हिस्टोलॉजिकल डेटा ने संकेत दिया कि डार्ट और आईएसओएम दोनों समूहों में मांसपेशियों की क्षति की सीमा कम थी, लेकिन आईएसओएम समूह में मांसपेशियों की क्षति थोड़ी अधिक स्पष्ट थी। पीले तीर टीए मांसपेशी क्रॉस-सेक्शन में कुछ क्षतिग्रस्त क्षेत्रों को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: चूहों की उम्र और शरीर का वजन। अध्ययन किए गए बीएलएजे चूहों को उम्र और शरीर के वजन में बारीकी से मिलान किया गया था, जिसमें डार्ट और आईएसओएम समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: टीए मांसपेशी क्षति का मात्रात्मक विश्लेषण। मांसपेशियों की क्षति की सीमा को टीए मांसपेशी क्रॉस-सेक्शन के कुल क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था और टी-टेस्ट द्वारा विश्लेषण किया गया था। डीएआरटी और आईएसओएम प्रशिक्षण दोनों के परिणामस्वरूप पिछले अध्ययनों की तुलना में दिन 3 में मांसपेशियों की क्षति का निम्न स्तर था, जिसमें बीएलएजे चूहों में सनकी संकुचन का एक समान मुकाबला शामिल था। हालांकि डार्ट और आईएसओएम दोनों समूहों में मांसपेशियों की क्षति का परिमाण छोटा था, लेकिन डार्ट समूह में क्षति की सीमा सांख्यिकीय रूप से कम थी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: सिकुड़ा हुआ टोक़ डेटा। डोर्सिफ्लेक्सर मांसपेशियों द्वारा उत्पादित सिकुड़ा हुआ टोक़ डार्ट डिवाइस से जुड़े रोबोटिक डायनेमोमीटर के साथ अध्ययन किया गया था। व्यायाम के दिन (ए, दिन 0) या व्यायाम के बाद 3 दिनों (बी, दिन 3) पर मापा गया अधिकतम बेसलाइन टेटेनिक टोक़ में डार्ट और आईएसओएम समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। व्यापक मांसपेशियों की क्षति के हिस्टोलॉजिकल सबूत की कमी के बावजूद, डार्ट और आईएसओएम का एक मुकाबला तीसरे दिन सिकुड़ा हुआ टोक़ घाटे (~ 40%) से जुड़ा था। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 1: चूहों में डार्ट प्रशिक्षण। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो 2: चूहों में आईएसओएम प्रशिक्षण। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: वजन से टोक़ अंशांकन डेटा, वक्र और सेटअप। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइलें 1-4: डार्ट डिवाइस घटकों के लिए डिज़ाइन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह लेख खुराक-समायोजित प्रतिरोध प्रशिक्षण (डार्ट) नामक एक प्रकार के सटीक पुनर्वास प्रशिक्षण को करने के लिए एक उपकरण का निर्माण करने के तरीके पर चरण-दर-चरण निर्देश प्रस्तुत करता है। यह काम एक प्रशिक्षण अध्ययन में डार्ट डिवाइस और कार्यप्रणाली के अनुप्रयोग का भी वर्णन करता है ताकि डार्ट (डार्ट समूह) के एकल मुकाबले के 3 दिन बाद मांसपेशियों की क्षति की तुलना आइसोमेट्रिक प्रशिक्षण (आईएसओएम समूह) के तुलनीय मुकाबले के 3 दिन बाद क्षति के साथ की जा सके।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम डार्ट डिवाइस34,35 का उचित निर्माण, डार्ट या आईएसओएम प्रशिक्षण करने में शामिल सटीक कदम, मांसपेशियों के ऊतकों की उचित कटाई और क्रायोप्रिजर्वेशन, क्रायोस्टैट के साथ मांसपेशियों के ऊतकों का उचित विभाजन, और हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन 22,36 के साथ मांसपेशी क्रॉस-सेक्शनका उचित धुंधलापन है। . विशेष रूप से, डार्ट डिवाइस का निर्माण करने के लिए, भागों को सटीक आयामों और इष्टतम सामग्री गुणों के साथ गढ़ा जाना चाहिए। यदि व्हील बेयरिंग हाउसिंग के लिए आयाम गलत हैं, तो 608-प्रकार का व्हील बेयरिंग व्हील बेयरिंग हाउसिंग के भीतर अच्छी तरह से फिट नहीं होगा। यदि माउस फुटप्लेट और एक्सल के आयाम सटीक नहीं हैं, तो यह माउस के पैर के साथ चलने के लिए पहिया असर की क्षमता पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकता है। यदि डार्ट डिवाइस भागों को अनुपयुक्त सामग्री और / या 3 डी प्रिंटर सेटिंग्स के साथ बनाया गया है, तो डार्ट डिवाइस भागों में पर्याप्त यांत्रिक शक्ति की कमी हो सकती है, जिससे विभिन्नघटकों का झुकाव और / या टूटना हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल के संशोधनों की आवश्यकता विशिष्ट शोध प्रश्नों के आधार पर हो सकती है जो जांचकर्ता जवाब देना चाहते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल एक अध्ययन में डार्ट डिवाइस को डिजाइन करने और कार्यान्वित करने के लिए विशिष्ट है, जिसने इस सवाल का जवाब देने का प्रयास किया कि क्या डार्ट का एक मुकाबला डिस्फेरिन की कमी वाले चूहों में टीए मांसपेशियों को व्यापक नुकसान पहुंचाता है या नहीं, जैसा कि हमने पहले सनकी संकुचन22 के समान मुकाबले के साथ बताया था। चूंकि दूसरों ने सुझाव दिया है कि आइसोमेट्रिक संकुचन से युक्त व्यायाम गैर-हानिकारक हो सकता है और इसलिए, कुछ मांसपेशियों की बीमारियों वाले मनुष्यों के लिए उपयुक्त हो सकता है, इसलिए हमने डार्ट के कारण मांसपेशियों की क्षति की सीमा की तुलना आइसोमेट्रिक संकुचन (आईएसओएम) 37,38 के तुलनीय मुकाबले से की। इस अध्ययन में, हमने पाया कि डार्ट और आईएसओएम दोनों न्यूनतम मांसपेशियों की क्षति को प्रेरित करते हैं, जिसमें डार्ट आईएसओएम की तुलना में थोड़ा लेकिन काफी कम स्तर की क्षति दिखाता है।

समस्या निवारण के संबंध में, प्रोटोकॉल का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू साइटिक तंत्रिका की फाइबुलर शाखा को ठीक से उत्तेजित कर रहा है, जो टीए मांसपेशी को मोटर संक्रमण देता है। यह तकनीक विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि परीक्षक एक ट्रांसक्यूटेनियस इलेक्ट्रोड रखता है और इसे मैन्युअल रूप से एक सटीक स्थान पर रखता है जो माउस के घुटने के जोड़20,39 से हीन और पार्श्व है। परीक्षक को माउस के फाइबुलर हड्डी40 के सिर के अनुरूप थोड़ी बोनी प्रमुखता के लिए महसूस करके माउस के हिंदलिम्ब पर इस स्थान का पता लगाने का तरीका सीखना चाहिए। यह पुष्टि करने के लिए कि साइटिक तंत्रिका की फाइबुलर शाखा की इष्टतम विद्युत उत्तेजना प्राप्त की जा रही है, जैसे कि टीए मांसपेशी से अधिकतम संकुचन प्राप्त किए जाते हैं, यह सबसे अच्छा है कि एक विश्वसनीय डायनेमोमीटर प्रणाली का उपयोग 20,21,22,41 किया जाए। इसके अलावा, क्लैंप द्वारा स्थिर ट्रांसक्यूटेनियस या चमड़े के नीचे के इलेक्ट्रोड को उपयोगकर्ता-प्रेरित परिवर्तनशीलता और त्रुटियों 20,41,42,43 को कम करने के लिए इलेक्ट्रोड के विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्लेसमेंट के लिए भी माना जा सकता है।

प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा यह है कि यह विशेष रूप से चूहों में टीए मांसपेशियों पर डार्ट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कृन्तकों में क्वाड्रिसेप्स फेमोरिस मांसपेशी समूह पर डायनेमोमेट्रिक आकलन और जबरन व्यायाम करने के लिए विकसित किए गए तरीकों के साथ, डार्ट डिवाइस को आसानी से क्वाड्रिसेप्स फेमोरिस मांसपेशी समूह42,43 के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अन्य मांसपेशी समूहों में डार्ट डिवाइस को लागू करना अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है; हालांकि, केबल-पुली-वजन सर्किट डिज़ाइन, जिसका उपयोग डार्ट डिवाइस में किया गया है, को उन उपकरणों में शामिल किया जा सकता है जो अन्य मांसपेशी समूहों के लिए उपयुक्त हैं। एक और सीमा यह है कि प्रोटोकॉल सामान्य संज्ञाहरण के तहत किया जाता है, जिससे व्यायाम मजबूर हो जाता है और स्वैच्छिक नहीं होता है; यह मनुष्यों के लिए विकसित अधिकांश प्रतिरोध प्रशिक्षण प्रतिमानों से अलग है12,21.

मौजूदा या वैकल्पिक तरीकों के संबंध में डार्ट डिवाइस और पद्धति का महत्व यह है कि प्रतिरोध प्रशिक्षण के लिए खुराक को ठीक से समायोजित किया जा सकता है और व्यायाम को एक विशेष मांसपेशी समूह12 के लिए सटीक रूप से लक्षित किया जा सकता है। सटीक पुनर्वास संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के लिए एक नई रणनीतिक प्राथमिकता है, और, चूंकि डार्ट चूहों में सटीक प्रतिरोध प्रशिक्षण करना संभव बनाता है, डार्ट सटीक शारीरिक पुनर्वास44,45 पर बुनियादी और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए खुद को अच्छी तरह से उधार देता है।

खुराक-समायोजित प्रतिरोध प्रशिक्षण करने की वर्तमान विधि का महत्व और संभावित अनुप्रयोग यह है कि यह नैदानिक पुनर्वास अनुसंधान और अभ्यास में उपयोग किए जाने वाले मानव परीक्षण और प्रशिक्षण प्रोटोकॉल के तुलनीय तरीकों से चूहों में प्रतिरोध प्रशिक्षण अध्ययन करना संभव बनाता है। उदाहरण के लिए, जिस तरह एक-पुनरावृत्ति अधिकतम (1आरएम, अधिकतम भार जिसे अच्छे रूप को बनाए रखते हुए केवल एक बार सफलतापूर्वक उठाया / स्थानांतरित / दबाया जा सकता है ) का उपयोग मनुष्यों के लिए प्रशिक्षण मुकाबलों17,18 के लिए प्रतिरोध के परिमाण को समायोजित करने के लिए किया जाता है, अधिकतम भार जो टीए मांसपेशी सफलतापूर्वक उठा सकती है, का उपयोग डार्ट डिवाइस के साथ चूहों में प्रशिक्षण के लिए प्रतिरोध निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। एक जानवर की क्षमता के आधार पर प्रतिरोध को समायोजित करने के अलावा, अतिरिक्त लाभ यह है कि संकुचन संकेंद्रित रूप से पक्षपाती हैं, जो संकुचन-प्रेरित मांसपेशियों की चोट को कम करने में मदद करताहै। प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि डार्ट का एक मुकाबला आइसोमेट्रिक संकुचन (आईएसओएम समूह) के तुलनीय मुकाबले की तुलना में भी कम हानिकारक है। डार्ट की गैर-हानिकारक प्रकृति प्रशिक्षण अध्ययनों के लिए उपयुक्त बनाती है जहां हानिकारक संकुचन से बचना सबसे अच्छा है - उदाहरण के लिए, चूहों में प्रशिक्षण अध्ययन जो मांसपेशियों की डिस्ट्रोफी का मॉडल बनाते हैं और प्रशिक्षण अध्ययन मांसपेशियों और / या कण्डरा 22,46,47 पर प्रयोगात्मक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के बाद धीरे-धीरे मांसपेशियों को फिर से लोड करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस अध्ययन को जैन फाउंडेशन इंक, एनआईसीएचडी से आर03एचडी091648, एनआईएच पी 2 सीएचडी 086843 के तहत एआर3टी से पायलट अनुदान, वेन स्टेट यूनिवर्सिटी में ईएसीपीएचएस से एफआरएपी पुरस्कार, वेन स्टेट यूनिवर्सिटी से एक संकाय स्टार्टअप पैकेज और जेएआर को 1 आर 01 एआर 079884-01 (पीटर एल जोन्स पीआई) से एक उप-अनुबंध द्वारा वित्त पोषित किया गया था। इस अध्ययन को अमेरिकन फिजिकल थेरेपी एसोसिएशन - मिशिगन (एपीटीए-एमआई) द्वारा जेएमबी, एमईपी और जेएआर को अनुसंधान अनुदान द्वारा भी वित्त पोषित किया गया था। रेणुका रोश (एसोसिएट प्रोफेसर, पूर्वी मिशिगन विश्वविद्यालय, एमआई) को पांडुलिपि को गंभीर रूप से पढ़ने और प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए स्वीकार करते हैं। लेखक 3 डी प्रिंटिंग पर सलाह के लिए श्री एंसलम डी मोथा को स्वीकार करते हैं। लेखक डिस्फेर्लिनोपैथी वाले रोगियों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories जैन फाउंडेशन की वेबसाइट पर अपनी कहानियों को साझा किया है, विशेष रूप से व्यायाम के साथ उनके अनुभव।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing Anmiao Star (N/A) AMS127 High precision, low friction wheel bearing.  If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter,  22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice.  Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions.
Axio Scope.A1 microscope Carl Zeiss (Peabody, MA) Product #Axio Scope.A1 Light and fluorescence microscope
B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice) The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin. Stock #012767 Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2.
Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode Harvard Apparatus, Holliston, MA BS4 50–6824 Electrode for NMES.  If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives.
Coplin Staining Dish ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog No. S17495 Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections
Cura 4.4.1. Software Ultimaker, Utrecht, Netherlands Ultimaker Cura 4.4.1. Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files
Deltaphase isothermal gel heating pad Braintree Scientific (Braintree, MA) Item #39DP Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
Eosin Y Millipore Sigma (Burlington, MA) HT110132-1L Pink cytoplasmic stain
Gorilla Super Glue The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH) Gorilla Super Glue Micro Precise Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components
Hematoxylin solution, Gill No.3 Millipore Sigma (Burlington, MA) GHS332-1L Dark blue stain for nuclei
HM525NX cryostat ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog #HM525NX Cryostat to make frozen sections of muscle
Lab Wipes.  Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog No. 06-666.  Manufacturer #34120 Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes.
Labview 2014 National Instruments, Austin, Texas, USA Labview 2014 Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator.
Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks ThermoFisher (Waltham, MA) S34074B.  Thermo Scientific 41502000/EMD Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue
Magic depilatory cream Softsheen Carson (New York, NY) N/A Razorless hair removal cream
Metal alligator clip JINSHANGTOPK (web-based business) 24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps Spring clamp to hold tibial pin
Micrscope slides Globe Scientific (Mahwah, NJ) 1354W. Diamond White Glass Slides Charged microscope slides
Mineral Oil ThermoFisher (Waltham, MA) BP26291 Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) #11778 Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray.  This is the material used to 3D print device components.
Monoprice Select Mini V2 3D printer Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) Mini V2 3D 3D printer for computer-aided fabrication of device components.
NIH Image software National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD) NIH Image for Windows Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage.  NIH Image is also known as Image J.
Photoshop CS4 Adobe (San Jose, CA) Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields
PSIU6 stimulation isolation unit Grass Instruments (West Warwick, RI) PSIU6 isolation unit Isolation unit for NMES.  Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit
Roboz 4-0 silk black braided suture material Roboz Surgical (Gaithersburg, MD) Roboz Surgical SUT152 Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training
S48 square pulse stimulator Grass Instruments (West Warwick, RI) S48 Stimulator Laboratory electrical stimulator for NMES .  If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative.  Please contact co-author Jones for more information.
Scott’s bluing reagent Ricca Chemical Company (Arlington, TX) 6697-32 Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining
SigmaStat version 3.5 Systat Software (San Jose, CA) SigmaStat version 3.5 Statistical software package for statistical analyses
Tabletop isoflurane vaporizer VetEquip (Livermore, CA) Item #901801 Inhaled tabletop anesthesia system
Triple antibiotic first aid ointment Global Health Products (wed-based business) Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care

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तंत्रिका विज्ञान अंक 186 कंकाल की मांसपेशी प्रतिरोध प्रशिक्षण पुनर्योजी पुनर्वास सटीक पुनर्वास मांसपेशियों की चोट डिस्फेर्लिन अंग-गर्डल मस्कुलर डिस्ट्रॉफी
मांसपेशियों की क्षति के कम जोखिम के साथ चूहों में खुराक-समायोजित प्रतिरोध प्रशिक्षण
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Begam, M., Narayan, N., Mankowski, D., Camaj, R., Murphy, N., Roseni, K., Pepin, M. E., Blackmer, J. M., Jones, T. I., Roche, J. A. Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage. J. Vis. Exp. (186), e64000, doi:10.3791/64000 (2022).

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