Summary
Häri finns ett protokoll för att skapa torra makroporösa alginatställningar som förmedlar effektiv viral genöverföring för användning vid genteknik av T-celler, inklusive T-celler för CAR-T-cellterapi. Ställningarna visade sig transducera aktiverade primära T-celler med >85% transduktion.
Abstract
Genteknik av T-celler för CAR-T-cellterapi har kommit i framkant inom cancerbehandling under de senaste åren. CAR-T-celler produceras genom viral genöverföring till T-celler. Den nuvarande guldstandarden för viral genöverföring innebär spinokulation av retronektinbelagda plattor, vilket är dyrt och tidskrävande. Det finns ett stort behov av effektiva och kostnadseffektiva metoder för att generera CAR-T-celler. Här beskrivs en metod för att tillverka billiga, torra makroporösa alginatställningar, så kallade Drydux-ställningar, som effektivt främjar viral transduktion av aktiverade T-celler. Ställningarna är utformade för att användas i stället för guldstandardspinokulation av retronektinbelagda plattor sådda med virus och förenkla processen för transducering av celler. Alginat är tvärbundet med kalcium-D-glukonat och fryses över natten för att skapa byggnadsställningarna. De frusna ställningarna frystorkas i en lyofilisator i 72 timmar för att slutföra bildandet av de torra makroporösa ställningarna. Ställningarna förmedlar viral genöverföring när virus och aktiverade T-celler sås ihop ovanpå ställningen för att producera genetiskt modifierade celler. Ställningarna producerar >85% primär T-celltransduktion, vilket är jämförbart med transduktionseffektiviteten för spinokulation på retronektinbelagda plattor. Dessa resultat visar att torra makroporösa alginatställningar fungerar som ett billigare och bekvämare alternativ till den konventionella transduktionsmetoden.
Introduction
Immunterapi har framstått som ett revolutionerande cancerbehandlingsparadigm på grund av dess förmåga att specifikt rikta in sig på tumörer, begränsa cytotoxicitet utanför målet och förhindra återfall. Särskilt har chimär antigenreceptor T (CAR-T) cellterapi vunnit popularitet på grund av dess framgång vid behandling av lymfom och leukemier. FDA godkände den första CAR-T-cellterapin 2017 och har sedan dess godkänt ytterligare fyra CAR-T-cellterapier 1,2,3,4,5. CARs har en antigenigenkänningsdomän som vanligtvis består av ett enda kedjevariabelt fragment av en monoklonal antikropp som är specifik för ett tumörassocierat antigen 3,4. När en CAR interagerar med sitt tumörassocierade antigen aktiveras CAR-T-cellerna, vilket leder till ett antitumörsvar som involverar cytokinfrisättning, cytolytisk degranulering, transkriptionsfaktoruttryck och T-cellproliferation. För att producera CAR-T-celler samlas blod från patienten för att få sina T-celler. CAR tillsätts genetiskt till patientens T-celler med hjälp av ett virus. CAR-T-cellerna odlas in vitro och infunderas tillbaka till patienten 2,3,4,6. Framgångsrik generering av CAR-T-celler bestäms av transduktionseffektiviteten, som beskriver antalet T-celler som genetiskt modifieras till CAR-T-celler.
För närvarande är guldstandarden för CAR-T-cellgenerering spinokulation av aktiverade T-celler och virus på retronektinbelagda plattor 7,8. Transduktion börjar när virala partiklar engagerar sig i T-cellernas yta. Retronektin främjar samlokalisering av virus och celler genom att öka bindningseffektiviteten mellan viruspartiklarna och cellerna, vilket förbättrar transduktionen 7,8. Retronectin fungerar inte bra på egen hand och måste åtföljas av spinokulation, vilket förbättrar genöverföringen genom att koncentrera viruspartiklarna och öka T-cellens ytpermeabilitet, vilket möjliggör enklare virusinfektion8. Trots framgången med spinokulation på retronektinbelagda plattor är det en komplex process som kräver flera centrifugeringscykler och dyra reagenser. Därför är alternativa metoder för viral genöverföring som är snabbare och billigare mycket önskvärda.
Alginat är en naturlig anjonisk polysackarid som används i stor utsträckning inom den biomedicinska industrin på grund av dess låga kostnad, goda säkerhetsprofil och förmåga att bilda hydrogeler vid blandning med tvåvärda katjoner 9,10,11,12. Alginat är en GMP-kompatibel polymer och är allmänt erkänd som säker (GRAS) av FDA13. Tvärbindande alginat med katjoner skapar stabila hydrogeler som ofta används vid sårläkning, leverans av små kemiska läkemedel och proteiner och celltransport 9,10,11,12,14,15,16. På grund av dess utmärkta gelningsegenskaper är alginat det föredragna materialet för att skapa porösa byggnadsställningar genom att frystorka10,17. Dessa egenskaper hos alginat gör det till en attraktiv kandidat för att producera en byggnadsställning som kan förmedla viral genöverföring av aktiverade celler.
Här beskrivs ett protokoll för att göra torra makroporösa alginatställningar, så kallade Drydux-ställningar, som statiskt transducerar T-celler genom viral genöverföring17,18. Processen för att göra dessa ställningar visas i figur 1. Dessa byggnadsställningar eliminerar behovet av spinokulation av retronektinbelagda plattor. De makroporösa alginatställningarna uppmuntrar interaktionen mellan viruspartiklar och T-celler för att möjliggöra effektiv genöverföring i ett enda steg utan att påverka funktionaliteten och livskraften hos de konstruerade T-cellerna17. När de följs korrekt har dessa makroporösa alginatställningar en transduktionseffektivitet på minst 80%, vilket förenklar och förkortar virustransduktionsprocessen.
Figur 1: Schematisk och tidslinje för protokollet . (A) Tidslinje för tillverkning av de torra makroporösa alginatställningarna. Alginat är tvärbundet med kalcium-D-glukonat och fryst över natten. De frusna ställningarna frystorkas i 72 timmar för att skapa Drydux byggnadsställningar. (B) Tidslinje för viral transduktion av aktiverade celler. Aktiverade celler och virus (MOI 2) sås ovanpå ställningen och inkuberas i kompletta medier kompletterade med IL-7 och IL-15. Ställningarna absorberar blandningen och främjar viral genöverföring. EDTA används för att lösa upp ställningarna och isolera de transducerade cellerna. Efter tvättning två gånger med PBS kan cellpelleten användas för analys. Förkortningar: PBS = fosfatbuffrad saltlösning; PBMC = mononukleära celler i perifert blod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som involverar mänskliga primatceller och retrovirala vektorer utfördes i enlighet med North Carolina State Universitys riktlinjer för biologisk säkerhet och godkändes av Environmental Health and Safety Office. Mänskliga mononukleära celler i perifert blod köptes som buffyrockar från kommersiella källor. Primära mänskliga celler måste isoleras från humana buffy coat-fraktioner och kräva godkännande på biosäkerhetsnivå 2 och detaljerade standardrutiner och godkännande från den institution där arbetet ska äga rum. Virala vektorer, inklusive de retrovirala vektorsupernatanter som används för transduktionen framställda enligt tidigare beskrivet19, kan klassificeras antingen som biosäkerhetsnivå 1 eller biosäkerhetsnivå 2 beroende på det kodade proteinet och kräva godkännande från den relevanta institutionella biosäkerhetskommittén.
1. Gör de makroporösa alginatställningarna
- Bered en stamlösning av 0,4% (vikt per volym) kalcium D-glukonat genom att tillsätta sterilfiltrerat avjoniserat vatten till kalcium D-glukonat i en bägare. Rör om medelhastighet tills kalciumglukonatet har lösts upp (~ 1,5 h), sterilfilter, och förvara vid rumstemperatur.
OBS: Det är inte nödvändigt att kontrollera lösningens pH. - Förbered en lösning av 2% (vikt per volym) alginat i en skruvlockflaska eller bägare. Tillsätt försiktigt ultrarent alginat i kärlet och tillsätt sterilfiltrerat avjoniserat vatten till alginatet. Välj den största omrörningsstången som är möjlig som inte hindrar blandning och lägg den till kärlet.
OBS: Information om vilken typ av ultrarent alginat som används för detta protokoll finns i materialförteckningen och på Novamatrix webbplats20. Olika alginater utforskades inte för dessa byggnadsställningar, eftersom de kan leda till oönskade förändringar i porositet och biokompatibilitet hos ställningarna 9,10,11. - Rör om lösningen på hög hastighet tills alginatet löser sig (~ 1 h). Om det finns stora klumpar på fartygets sidor, luta fartyget för att lossa dem. Små mängder alginat på sidorna kommer att lösas upp under omrörning och är inte oroande.
OBS: Det är inte nödvändigt att kontrollera lösningens pH. - När alginatet löser sig, minska omrörningshastigheten, tillsätt långsamt en lika stor volym av 0,4% kalcium D-glukonat till alginatlösningen för att förhindra att tvärbindningsklumpar bildas och rör om kraftigt i 15 minuter.
- Luta bägaren eller injektionsflaskan i sidled för att ta bort eventuella klumpar som kan ha bildats.
OBS: Det rekommenderas att använda en homogenisator. Den slutliga lösningen ska vara optiskt klar. - Pipettera den önskade volymen av lösningen i varje brunn på en 48-brunnsplatta eller 24-brunnsplatta. Använd 300 μl/brunn för en 48-brunnsplatta och 1 ml/brunn för en 24-brunnsplatta. Gjut långsamt och byt tips ofta, eftersom lösningen blir viskös och kommer att hålla fast vid spetsen.
- Täck plattorna med lock och frys över natten vid -20 °C.
- Förbered plattan för lyofilisatorn genom att ta bort locket och säkra toppen med våtservetter och gummiband. Placera plattorna i 750 ml till 2 000 ml lyofiliseringskolvar och lägg på lyofilisatorn i 72 timmar.
- Efter 72 timmar, ta bort plattan från lyofilisatorn och sätt tillbaka locket. Försegla plattan och förvara vid 4 °C. För långvarig förvaring, vakuumförsegla plattan innan den förvaras vid 4 °C. Håll det torrt tills det behövs.
OBS: Gör extra kalciumalginatlösning på grund av volymfel (vissa fastnar på injektionsflaskans väggar, pipettspetsar). Till exempel, för att göra fyra byggnadsställningar i en 24-brunnsplatta krävs 4 ml kombinerad lösning (2 ml alginat + 2 ml kalcium D-glukonat), men det rekommenderas att bereda 2,5 ml 2% alginatlösning och 2,5 ml 0,4% kalcium D-glukonatlösning.
2. Transduktion
- Koncentration av viral supernatant med 100 kDa-filter
- Hydrera centrifugalfiltret i 2 minuter med 1 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Kassera PBS.
- Koncentrera virussuspensionen genom att tillsätta 2 ml viral suspension (1 × 106 TU/ml) och centrifugera den genom centrifugalfiltret vid 1 500 × g i 10 minuter i en svängande skoprotor.
OBS: En till tvåhundra mikroliter koncentrerat virus behövs per byggnadsställning. - Snurra i ytterligare några minuter om den koncentrerade virussuspensionsvolymen är större än 200 μl.
- Upprepa steg 2.1.1–2.1.3 för varje byggnadsställning.
OBS: Det är också acceptabelt att koncentrera en stor virusstam och ta 100-200 μL alikvoter från det koncentrerade beståndet.
- Fröaktiverade celler och virus tillsammans.
- För varje byggnadsställning, förbered en alikvot genom att suspendera 1 × 106 aktiverade mononukleära celler i perifert blod (PBMC) i 50 μl komplett cellodlingsmedium (250 ml Clicks media + 250 ml RPMI 1640 media + 50 ml fetalt bovint serum + 5 ml glutaminsubstitut + 5 ml penicillin / streptomycin).
Se Tilläggsfil 1 för ett protokoll om hur du aktiverar PBMC. - Tillsätt den koncentrerade virala supernatanten (~ 2 × 106 TU, MOI 2) till cellsuspensionen. Den totala volymen av cellvirussuspensionen bör inte överstiga 200 μl för en 48-brunnsställning eller 350 μl för en byggnadsställning med 24 brunnar.
- Tillsätt cellvirusblandningen droppvis på toppen av den torra ställningen. För negativa kontrollexperiment, använd kompletta cellodlingsmedier i stället för det koncentrerade viruset. Lägg cellsuspensionen på toppen av den torra ställningen.
- Upprepa steg 2.2.1–2.2.3 för varje byggnadsställning.
- Inkubera ställningarna i en cellodlingsinkubator vid 37 °C i 45-60 min. Ta bort byggnadsställningarna från inkubatorn; Ställningarna absorberar lösningen helt under denna tid.
- För att inducera spridning, tillsätt kompletta cellodlingsmedier kompletterade med IL-15 (5 ng / ml) och IL-7 (10 ng / ml) till varje brunn; IL-2 kan också användas. Tillsätt 500 μL till varje 48-brunnsställning eller 1 ml till varje 24-brunnsställning.
- Inkubera ställningarna vid 37 °C i 72 timmar. När cellerna sprider sig blir mediet orange.
- För varje byggnadsställning, förbered en alikvot genom att suspendera 1 × 106 aktiverade mononukleära celler i perifert blod (PBMC) i 50 μl komplett cellodlingsmedium (250 ml Clicks media + 250 ml RPMI 1640 media + 50 ml fetalt bovint serum + 5 ml glutaminsubstitut + 5 ml penicillin / streptomycin).
- Isolera celler från ställningarna för analys.
- Späd 0,5 m EDTA till 0,25 m EDTA i 1x PBS.
- Ta bort överflödigt medium från varje brunn och samla i separata 15 ml centrifugrör.
- För att isolera celler från ställningen, lägg till 0,25 M EDTA till varje byggnadsställning. Tillsätt 300 μL till 48-brunnsställningar eller 1 ml till 24-brunnsställningar. Låt tallriken sitta eller försiktigt agitera i 3-4 min.
- När ställningen mestadels är upplöst, pipettera försiktigt in och ut i brunnen. Några in-och-ut-pipetterande steg kan vara nödvändiga för att helt lösa upp ställningen. Om det inte löser sig på 10 minuter, tillsätt ytterligare 200 μl 0,25 M EDTA.
- När ställningen har lösts upp helt, överför lösningen till ett 15 ml centrifugrör.
- Upprepa steg 2.3.4 och 2.3.5 för varje byggnadsställning.
- Tvätta cellerna två gånger genom att tillsätta 12 ml PBS till varje centrifugrör och centrifugera vid 400 × g i 5 minuter. En cellpellet bildas i botten av varje rör. Aspirera supernatanten och upprepa tvätten. Var noga med att aspirera supernatanten helt med varje tvätt eftersom det är viktigt att ta bort all EDTA.
- Efter den andra tvätten med PBS är cellpelleten nu klar för analys. Följ lämpligt protokoll som krävs för analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dessa makroporösa alginatställningar är lätta att göra och bör komma ut ur lyofilisatorn som porösa, fluffiga och vita skivor. Även om det inte studeras i detta experiment kan kalciumalginatlösning gjutas i olika formar för att skapa byggnadsställningar av varierande former, beroende på användarens behov 9,10. Ställningarna är elektrostatiska och kan fastna på locket på brunnsplattan eller på ett finger i handsken. Figur 2 visar hur ställningarna ska se ut när de är färdiga. Ungefärliga mått på 24- och 48-brunnsställningar visas också i figuren.
Figur 2: Bilder av torra makroporösa alginatställningar . (A) En 48-brunnsplatta full av byggnadsställningar. (B) En 24-brunnsplatta full av byggnadsställningar. (C) Jämföra en 48-brunns byggnadsställning med en 24-brunnsställning. Ställningens dimensioner visas också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ställningarnas porositet är mycket viktig för framgångsrik transduktion, och vi har tidigare experimenterat med ställningarnas porositet. För mer information om porositeten, inklusive SEM-bilder av byggnadsställningarna, se papper från Agarwalla et. al. i referenserna17,18.
Transduktionseffektiviteten analyserades med hjälp av flödescytometri och resultaten visas i figur 3. Frysta PBMC från samma givare aktiverades och användes för alla experimentella grupper. Ett protokoll för att aktivera PBMC finns i Supplemental File 1, och alla standardmetoder för att aktivera T-celler och validera aktivering kan användas21,22,23. De aktiverade PBMC:erna såddes på antingen en ställning med GFP-kodande retrovirus eller en byggnadsställning utan virus, en så kallad "tom" ställning. Aktiverade PBMC såddes också på plattor som spinokulerades med retronektin och GFP-kodande retrovirus för att jämföra transduktionseffektiviteten hos alginatställningarna med den konventionella metoden. Icke-transducerade (NT) cellaktiverade PBMC sådda i obelagda brunnar i en 24-brunnsplatta användes som den negativa kontrollgruppen. Som förväntat visade de icke-transducerade cellerna och cellerna isolerade från den tomma ställningen ingen transduktion. Celler isolerade från ställningen sådda med aktiverade PBMC och GFP-retrovirus visade jämförbar transduktionseffektivitet med de retronektinbelagda plattorna. Ställningen hade en genomsnittlig transduktionseffektivitet på 85%, strax under retronektingruppen. Dessa resultat visar att dessa alginatställningar fungerar som ett enklare och billigare alternativ för att viralt transducera T-celler utan behov av spinokulation av retronektin.
Figur 3: FACS-kvantifiering av transduktionseffektivitet . (A) FACS-diagram som visar GFP-uttryck. Celler var gated på livskraftiga celler, FSC singlets och GFP positiva celler. B) Kvantifiering av GFP-positiva celler med facs. Konventionell spinokulation av retronektinbelagda plattor (lila inverterad triangel) användes som en positiv kontroll. Icke-transducerade celler (blå cirkel) och aktiverade celler sådda på alginatställningarna utan virus (röd fyrkant) användes som negativa kontroller. Ställningar sådda med aktiverade celler och GFP-retrovirus (grön triangel) hade en transduktionseffektivitet på 85%, jämförbar med retronektin. Data representerade som medelvärde ± standardavvikelse med n = 4. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; SSC-A = sidospridningstopparearea; FSC = framåtspridning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggsfil 1: Protokoll för aktivering av celler. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S1: Bilder av torra makroporösa alginatställningar tillverkade vid -80 °C. Frysning av ställningar vid -80 °C leder till mindre konsekvent utseende och funktion av byggnadsställningen än vid frysning vid -20 °C. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAR-T-cellterapi fortsätter att få intresse för både forskning och kommersiella tillämpningar. Trots den framgång CAR-T-cellterapi har haft vid behandling av blodcancer begränsar den höga kostnaden för proceduren dess användning. Protokollet som presenteras här introducerar en ny metod för viral genöverföring av T-celler utan behov av spinokulation av retronektinbelagda plattor. Att producera torra makroporösa alginatställningar för att förmedla transduktion är relativt enkelt och är en lämplig billig ersättning för den konventionella metoden.
Ibland kan ställningens utseende skilja sig från dem som visas i figur 2 och kan istället verka klart och kristallint snarare än vitt och fluffigt. Detta kan uppstå vid inkonsekvent frysning vid -20 °C på grund av upprepad öppning av frysdörren eller om plattan som ska frysas är isolerad genom att vara bredvid eller ovanpå skrymmande föremål i frysen. Trots skillnaden i utseende har vårt laboratorium inte upplevt någon skillnad i transduktionseffektivitet med de kristallina ställningarna. Även om tidigare arbete med kryogelering har använt lägre frysningstemperaturer 24,25, fann vi att frysning vid lägre temperaturer leder till mindre konsekvent utseende och funktion av byggnadsställningen än vid fryst vid -20 ° C. Bilder av en byggnadsställning som skapats genom frysning vid -80 °C finns i kompletterande figur S1. Därför rekommenderas det fortfarande att byggnadsställningar fryses vid -20 °C med minimal störning, och plattan placeras på en hylla i rackstil som tillåter luftflöde under plattan.
Även om dessa byggnadsställningar har visat utmärkt transduktionseffektivitet, bör några begränsningar noteras. För det första måste man vara försiktig när man arbetar med EDTA, vilket kan begränsa cellviabiliteten, även i små mängder. Därför bör EDTA tas bort helt. Dessutom kommer ställningens storlek att begränsa mängden vätska som kan absorberas och därmed antalet celler som kan transduceras. Slutligen kan detta protokoll inte användas för att transducera oaktiverade T-celler. Framtida arbete kommer att fokusera på att rapportera tillverkning av byggnadsställningar som samtidigt kan förmedla aktivering och proliferation av celler, främja samlokalisering av celler och viruspartiklar för transduktion och frigöra fullt fungerande transducerade celler in vivo18.
Publicerade studier av vårt laboratorium rapporterar fenotypisk analys och funktionalitet hos CAR-T-celler som genereras med hjälp av dessa byggnadsställningar. De CD19-specifika CAR-T-cellerna som producerades av dessa byggnadsställningar behöll effektorfenotypen och kunde eliminera CD19 + Daudi-celler in vitro när de samodlades med ett 1: 5-effektor-till-mål-förhållande17. CAR-T-cellerna som odlades tillsammans med Daudi-celler släppte också IL-2 och IFN-γ, som är proinflammatoriska cytokiner som indikerar att T-cellerna är aktiverade. Dessa resultat visar att dessa byggnadsställningar producerar mycket funktionella CAR-T-celler in vitro. CAR-T-celler som genererades av dessa byggnadsställningar visade utmärkt in vivo antitumörfunktion mot CD19 + Daudi-celler märkta med firefly luciferas. CAR-T-cellerna kontrollerade effektivt tumörtillväxten, förbättrade den totala överlevnaden och visade inga signifikanta tecken på toxicitet17. Dessa resultat indikerar att dessa byggnadsställningar kan användas för att genetiskt modifiera celler för CAR-T-cellterapi utan att påverka cellernas funktionalitet och antitumöraktivitet. Framtida studier med dessa alginatställningar involverar optimering av transduktionseffektiviteten genom att justera makroporositeten samt alginat- och kalciumkoncentrationer.
Sammanfattningsvis har dessa makroporösa alginatställningar en jämförbar transduktionseffektivitet med retronektin, vilket ger en alternativ metod för att transducera celler för CAR-T-cellterapi. Dessa ställningar producerar också fullt fungerande CAR-T-celler med antitumöraktivitet både in vitro och in vivo17. Drydux ställningar erbjuder en alternativ metod som är enkel och billig för att transducera T-celler för användning i CAR-T-cellterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
P.A. och Y.B. är uppfinnare av patent relaterade till användning av biomaterial för generering av CAR-T-cellterapier. Y.B. får ett industrisponsrat forskningsanslag relaterat till CAR-T-cellterapiteknik (orelaterat till detta arbete). Alla andra författare förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health genom Grant Award Numbers R37-CA260223, R21CA246414. Vi tackar NCSU-flödescytometrikärnan för utbildning och vägledning om flödescytometrianalys. Scheman skapades med Biorender.com
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure, pH 8.0 |
| 1x DPBS | Gibco | 14190-144 | No calcium chloride or magnesium chloride |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies Inc | 07060 | |
| Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| Calcium-D-Gluconate | Alfa Aesar | A11649 | |
| CD28.2 Antibody | BD | 555725 | 1 mg/mL |
| CD3 Antibody | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μg/mL |
| Click's Media | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
| DI Water | - | - | |
| Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
| HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
| HyClone RPMI 1640 Media | Cytvia | SH3009601 | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Gibco | 15-140-122 | |
| Peripheral Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | Sodium alginate |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
| Recombinant Human IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
| Retrovirus | - | - | 1 x 106 TU/mL |
References
- Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing. Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).
- Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges. Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).
- Nair, R., Westin, J.
- Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J.
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
- Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).
- Lee, H. -J., et al. Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells. Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).
- Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
- Sun, J., Tan, H. Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications. Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).
- Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).
- Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
- Soccol, C., et al.
- Moody, C. T., et al. Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture. Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).
- Brudno, Y., et al. Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence. Biomaterials. 178, 373-382 (2018).
- Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots. Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).
- Agarwalla, P., et al. Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy. Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).
- Agarwalla, P., et al. Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells. Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).
- Vera, J., et al. T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells. Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).
- PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS. , Available from: https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/ (2022).
- Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies. Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).
- Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis. STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).
- Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true (2022).
- Lin, H. -R., Yeh, Y. -J. Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies. Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).
- Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique. Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).
