Summary
Her er en protokoll for å lage tørre makroporøse alginat stillaser som medierer effektiv viral genoverføring for bruk i genteknologi av T-celler, inkludert T-celler for CAR-T celleterapi. Stillasene ble vist å transdusere aktiverte primære T-celler med >85% transduksjon.
Abstract
Genteknologi av T-celler for CAR-T-celleterapi har kommet i forkant av kreftbehandling de siste årene. CAR-T-celler produseres ved viral genoverføring til T-celler. Den nåværende gullstandarden for viral genoverføring innebærer spinoculation av retronektinbelagte plater, noe som er dyrt og tidkrevende. Det er et betydelig behov for effektive og kostnadseffektive metoder for å generere CAR-T-celler. Her beskrives en metode for fremstilling av billige, tørre makroporøse alginatstillaser, kjent som Drydux-stillaser, som effektivt fremmer viral transduksjon av aktiverte T-celler. Stillasene er designet for å brukes i stedet for gullstandard spinokulasjon av retronektinbelagte plater sådd med virus og forenkle prosessen for å transdusere celler. Alginat er kryssbundet med kalsium-D-glukonat og frosset over natten for å lage stillasene. De frosne stillasene frysetørkes i en lyofiliser i 72 timer for å fullføre dannelsen av de tørre makroporøse stillasene. Stillasene formidler viral genoverføring når virus og aktiverte T-celler sås sammen på toppen av stillaset for å produsere genmodifiserte celler. Stillasene produserer >85% primær T-celletransduksjon, som er sammenlignbar med transduksjonseffektiviteten av spinokulasjon på retronektinbelagte plater. Disse resultatene viser at tørre makroporøse alginatstillaser fungerer som et billigere og mer praktisk alternativ til den konvensjonelle transduksjonsmetoden.
Introduction
Immunterapi har dukket opp som et revolusjonerende kreftbehandlingsparadigme på grunn av sin evne til spesifikt å målrette svulster, begrense cytotoksisitet utenfor målet og forhindre tilbakefall. Spesielt har kimær antigenreseptor T (CAR-T) celleterapi blitt populær på grunn av sin suksess i behandling av lymfomer og leukemier. FDA godkjente den første CAR-T-celleterapien i 2017, og har siden da godkjent ytterligere fire CAR-T-celleterapier 1,2,3,4,5. CARs har et antigengjenkjenningsdomene som vanligvis består av et enkeltkjedevariabelt fragment av et monoklonalt antistoff som er spesifikt for et tumorassosiert antigen 3,4. Når en CAR interagerer med sitt tumorassosierte antigen, aktiveres CAR-T-cellene, noe som fører til en antitumorrespons som involverer cytokinfrigivelse, cytolytisk degranulering, transkripsjonsfaktoruttrykk og T-celleproliferasjon. For å produsere CAR-T-celler samles blod fra pasienten for å få sine T-celler. CARs blir genetisk tilsatt pasientens T-celler ved hjelp av et virus. CAR-T-cellene dyrkes in vitro og infunderes tilbake til pasienten 2,3,4,6. Vellykket generering av CAR-T-celler bestemmes av transduksjonseffektiviteten, som beskriver antall T-celler som er genetisk modifisert til CAR-T-celler.
For tiden er gullstandarden for CAR-T-cellegenerering spinoculation av aktiverte T-celler og virus på retronektinbelagte plater 7,8. Transduksjon begynner når virale partikler engasjerer seg med overflaten av T-cellene. Retronektin fremmer kolokalisering av virus og celler ved å øke bindingseffektiviteten mellom viruspartiklene og cellene, og forbedrer transduksjonen 7,8. Retronektin fungerer ikke bra alene og må ledsages av spinokulasjon, noe som forbedrer genoverføringen ved å konsentrere viruspartiklene og øke overflatepermeabiliteten til T-cellen, noe som muliggjør lettere virusinfeksjon8. Til tross for suksessen med spinokulasjon på retronektinbelagte plater, er det en kompleks prosess som krever flere sentrifugeringssykluser og dyre reagenser. Derfor er alternative metoder for viral genoverføring som er raskere og billigere svært ønskelige.
Alginat er et naturlig anionisk polysakkarid som er mye brukt i biomedisinsk industri på grunn av dets lave kostnader, gode sikkerhetsprofil og evne til å danne hydrogeler ved blanding med divalente kationer 9,10,11,12. Alginat er en GMP-kompatibel polymer og er generelt anerkjent som trygg (GRAS) av FDA13. Tverrbindende alginat med kationer skaper stabile hydrogeler som ofte brukes i sårheling, levering av små kjemiske stoffer og proteiner, og celletransport 9,10,11,12,14,15,16. På grunn av sine utmerkede geleringsegenskaper er alginat det foretrukne materialet for å lage porøse stillaser ved å frysetørke10,17. Disse egenskapene til alginat gjør det til en attraktiv kandidat for å produsere et stillas som kan formidle viral genoverføring av aktiverte celler.
Her beskrives en protokoll for fremstilling av tørre makroporøse alginatstillaser, kjent som Drydux-stillaser, som statisk transduserer T-celler ved viral genoverføring17,18. Prosessen for å lage disse stillasene er vist i figur 1. Disse stillasene eliminerer behovet for spinoculation av retronektinbelagte plater. De makroporøse alginatstillasene oppmuntrer til interaksjon mellom viruspartikler og T-celler for å muliggjøre effektiv genoverføring i et enkelt trinn uten å påvirke funksjonaliteten og levedyktigheten til de konstruerte T-cellene17. Når de følges riktig, har disse makroporøse alginatstillasene en transduksjonseffektivitet på minst 80%, noe som forenkler og forkorter den virale transduksjonsprosessen.
Figur 1: Skjematisk og tidslinje for protokollen . (A) Tidslinje for fremstilling av de tørre makroporøse alginatstillasene. Alginat er kryssbundet med kalsium-D-glukonat og fryses ned over natten. De frosne stillasene blir lyofilisert i 72 timer for å lage Drydux-stillasene. (B) Tidslinje for viral transduksjon av aktiverte celler. Aktiverte celler og virus (MOI 2) sås på toppen av stillaset og inkuberes i komplette medier supplert med IL-7 og IL-15. Stillasene absorberer blandingen og fremmer viral genoverføring. EDTA brukes til å løse opp stillasene og isolere de transduserte cellene. Etter vask to ganger med PBS, kan cellepelleten brukes til analyse. Forkortelser: PBS = fosfatbufret saltvann; PBMCs = mononukleære celler i perifert blod. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene som involverer humane forrangceller og retrovirale vektorer ble utført i samsvar med North Carolina State Universitys retningslinjer for biologisk sikkerhet og godkjent av Environmental Health and Safety Office. Humane mononukleære celler i perifert blod ble kjøpt som buffyfrakker fra kommersielle kilder. Primære humane celler må isoleres fra humane buffycoatfraksjoner og kreve biosikkerhetsnivå 2-klarering og detaljerte standard driftsprosedyrer og godkjenning fra institusjonen der arbeidet skal foregå. Virale vektorer, inkludert retrovirale vektorsupernatanter brukt til transduksjon fremstilt som tidligere beskrevet19, kan klassifiseres enten som biosikkerhetsnivå 1 eller biosikkerhetsnivå 2 avhengig av det kodede proteinet og krever godkjenning fra den relevante institusjonelle biosikkerhetskomiteen.
1. Lage de makroporøse alginatstillasene
- Forbered en stamløsning på 0,4% (vekt per volum) kalsium D-glukonat ved å tilsette sterilt filtrert avionisert vann til kalsium D-glukonat i et beger. Rør på middels hastighet til kalsiumglukonatet er oppløst (~ 1,5 timer), sterilt filter og oppbevar ved romtemperatur.
MERK: Det er ikke nødvendig å sjekke pH-verdien i oppløsningen. - Klargjør en oppløsning på 2% (vekt per volum) alginat i et hetteglass eller beger med skrukork. Tilsett forsiktig det ultrarene alginatet til karet og tilsett sterilt filtrert avionisert vann til alginatet. Velg den største rørstangen som ikke vil hindre blanding og legg den til fartøyet.
MERK: Informasjon om hvilken type ultrarent alginat som brukes til denne protokollen, finnes i materialtabellen og på Novamatrix-nettstedet20. For disse stillasene ble det ikke utforsket ulike alginater, da de kan føre til uønskede endringer i porøsitet og biokompatibilitet hos stillasene 9,10,11. - Rør oppløsningen i høy hastighet til alginatet er oppløst (~1 time). Hvis det er store klumper på sidene av fartøyet, vipp fartøyet for å løsne dem. Små mengder alginat på sidene vil løse seg opp under omrøring og er ikke grunn til bekymring.
MERK: Det er ikke nødvendig å sjekke pH-verdien i oppløsningen. - Når alginatet oppløses, reduser omrøringshastigheten, tilsett sakte et likt volum på 0,4% kalsium D-glukonat til alginatoppløsningen for å forhindre at tverrbindingsklumper dannes, og rør kraftig i 15 minutter.
- Vipp begeret eller hetteglasset sidelengs for å fjerne klumper som kan ha dannet seg.
MERK: Det anbefales å bruke en homogenisator. Den endelige oppløsningen skal være optisk klar. - Pipette ønsket volum av løsningen i hver brønn i en 48-brønnplate eller 24-brønnplate. Bruk 300 μL/brønn for en 48-brønns plate og 1 ml/brønn for en 24-brønns plate. Kast sakte og bytt tips ofte, da løsningen vil være viskøs og vil holde seg til spissen.
- Dekk platene med lokk og frys over natten ved -20 °C.
- Forbered platen til lyofilisatoren ved å fjerne lokket og feste toppen med kluter og gummibånd. Plasser platene i 750 ml til 2000 ml lyofiliseringsflasker, og legg på lyofilisatoren i 72 timer.
- Etter 72 timer, fjern platen fra lyofilisatoren og sett på lokket. Forsegl platen og oppbevar den ved 4 °C. For langtidsoppbevaring må platen støvsuges før den oppbevares ved 4 °C. Hold deg tørr til det er nødvendig.
MERK: Lag ekstra kalsiumalginatoppløsning på grunn av volumfeil (noen fester seg til veggene i hetteglasset, pipettespisser). For eksempel, for å lage fire stillaser i en 24-brønnsplate, er det nødvendig med 4 ml kombinert oppløsning (2 ml alginat + 2 ml kalsium D-glukonat), men det anbefales å fremstille 2,5 ml 2% alginatoppløsning og 2,5 ml 0,4% kalsium D-glukonatoppløsning.
2. Transduksjon
- Konsentrasjon av viral supernatant ved bruk av 100 kDa filtre
- Hydrater sentrifugalfilteret i 2 minutter med 1 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Kast PBS.
- Konsentrer den virale suspensjonen ved å tilsette 2 ml viral suspensjon (1 × 106 TU/ml) og sentrifugere den gjennom sentrifugalfilteret ved 1 500 × g i 10 minutter i en svingende bøtterotor.
MERK: En til to hundre mikroliter konsentrert virus er nødvendig per stillas. - Spinn i noen ekstra minutter hvis det konsentrerte virussuspensjonsvolumet er større enn 200 μL.
- Gjenta trinn 2.1.1-2.1.3 for hvert stillas.
MERK: Det er også akseptabelt å konsentrere et stort lager av virus og ta 100-200 μL aliquots fra den konsentrerte bestanden.
- Frø aktiverte celler og virus sammen.
- For hvert stillas, lag en aliquot ved å suspendere 1 × 106 aktiverte mononukleære celler i perifert blod (PBMCs) i 50 μL komplette cellekulturmedier (250 ml Clicks media + 250 ml RPMI 1640 media + 50 ml føtalt bovint serum + 5 ml glutaminsubstitutt + 5 ml penicillin / streptomycin).
MERK: Se Tilleggsfil 1 for en protokoll om hvordan du aktiverer PBMCer. - Tilsett den konsentrerte virale supernatanten (~2 × 106 TU, MOI 2) i cellesuspensjonen. Det totale volumet av cellevirussuspensjonen bør ikke overstige 200 μL for et 48-brønns stillas eller 350 μL for et 24-brønns stillas.
- Tilsett celle-virusblandingen dråpevis til toppen av det tørre stillaset. For negative kontrolleksperimenter, bruk komplette cellekulturmedier i stedet for det konsentrerte viruset. Tilsett cellesuspensjonen på toppen av det tørre stillaset.
- Gjenta trinn 2.2.1-2.2.3 for hvert stillas.
- Inkuber stillasene i en cellekulturinkubator ved 37 °C i 45-60 min. Fjern stillasene fra inkubatoren; Stillasene vil absorbere løsningen fullt ut i løpet av denne tiden.
- For å indusere spredning, legg til komplette cellekulturmedier supplert med IL-15 (5 ng / ml) og IL-7 (10 ng / ml) til hver brønn; IL-2 kan også brukes. Tilsett 500 μL til hvert stillas med 48 brønner eller 1 ml til hvert stillas med 24 brønner.
- Inkuber stillasene ved 37 °C i 72 timer. Når cellene sprer seg, blir mediene oransje.
- For hvert stillas, lag en aliquot ved å suspendere 1 × 106 aktiverte mononukleære celler i perifert blod (PBMCs) i 50 μL komplette cellekulturmedier (250 ml Clicks media + 250 ml RPMI 1640 media + 50 ml føtalt bovint serum + 5 ml glutaminsubstitutt + 5 ml penicillin / streptomycin).
- Isoler celler fra stillasene for analyse.
- Fortynn 0,5 M EDTA til 0,25 M EDTA i 1x PBS.
- Fjern overflødig medium fra hver brønn og samle i separate 15 ml sentrifugerør.
- For å isolere celler fra stillaset, tilsett 0,25 M EDTA til hvert stillas. Tilsett 300 μL til 48-brønns stillaser eller 1 ml til 24-brønns stillaser. La tallerkenen sitte eller forsiktig røre i 3-4 min.
- Når stillaset for det meste er oppløst, pipetter du forsiktig inn og ut inne i brønnen. Noen få inn-og-ut pipetteringstrinn kan være nødvendig for å løse opp stillaset helt. Hvis den ikke oppløses på 10 minutter, tilsett ytterligere 200 μL på 0,25 M EDTA.
- Når stillaset er fullstendig oppløst, overfører du oppløsningen til et 15 ml sentrifugerør.
- Gjenta trinn 2.3.4 og 2.3.5 for hvert stillas.
- Vask cellene to ganger ved å tilsette 12 ml PBS til hvert sentrifugerør og sentrifugere ved 400 × g i 5 minutter. En cellepellet vil danne seg i bunnen av hvert rør. Aspirer supernatanten og gjenta vasken. Vær forsiktig med å aspirere supernatanten helt med hver vask, da det er viktig å fjerne all EDTA.
- Etter den andre vasken med PBS er cellepelleten nå klar for analyse. Følg den aktuelle protokollen som kreves for analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse makroporøse alginatstillasene er enkle å lage og bør komme ut av lyofilisøren som porøse, luftige og hvite plater. Selv om det ikke er studert i dette eksperimentet, kan kalsiumalginatløsning støpes i forskjellige former for å lage stillaser av varierende former, avhengigav brukerens behov 9,10. Stillasene er elektrostatiske og kan feste seg til lokket på brønnplaten eller til en hansket finger. Figur 2 viser hvordan stillasene skal se ut når de er ferdige. Omtrentlige dimensjoner på 24- og 48-brønns stillaser er også vist i figuren.
Figur 2: Bilder av tørre makroporøse alginatstillaser . (A) En tallerken med 48 brønner full av stillaser. (B) En 24-brønns plate full av stillaser. (C) Sammenligning av et stillas på 48 brønner med et stillas på 24 brønner. Stillas dimensjoner er også vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Stillasenes porøsitet er svært viktig for vellykket transduksjon, og vi har tidligere eksperimentert med stillasenes porøsitet. For mer informasjon om porøsiteten, inkludert SEM-bilder av stillasene, se papirer av Agarwalla et. al. i referansene17,18.
Transduksjonseffektivitet ble analysert med flowcytometri og resultatene er vist i figur 3. Frosne PBMCs fra samme donor ble aktivert og brukt for alle eksperimentelle grupper. En protokoll for aktivering av PBMC-er finnes i tilleggsfil 1, og enhver standardmetode for å aktivere T-celler og validere aktivering kan brukes21,22,23. De aktiverte PBMCene ble sådd på enten et stillas med GFP-kodende retrovirus eller et stillas uten virus, kalt et "tomt" stillas. Aktiverte PBMC-er ble også sådd på plater spinokulert med retronektin og GFP-kodende retrovirus for å sammenligne transduksjonseffektiviteten til alginatstillasene med den konvensjonelle metoden. Ikke-transducerte (NT) celler-aktiverte PBMC-er sådd i ubelagte brønner av en 24-brønnsplate - ble brukt som den negative kontrollgruppen. Som forventet viste de ikke-transduserte cellene og cellene isolert fra det tomme stillaset ingen transduksjon. Celler isolert fra stillaset sådd med aktiverte PBMCs og GFP retrovirus viste sammenlignbar transduksjonseffektivitet til de retronektinbelagte platene. Stillaset hadde en gjennomsnittlig transduksjonseffektivitet på 85%, like under retronektingruppen. Disse resultatene viser at disse alginatstillasene fungerer som et enklere og billigere alternativ til viralt transdusere T-celler uten behov for spinokulasjon av retronektin.
Figur 3: FACS kvantifisering av transduksjonseffektivitet. (A) FACS-plott som viser GFP-uttrykk. Celler ble inngjerdet på levedyktige celler, FSC-singleter og GFP-positive celler. (B) Kvantifisering av GFP-positive celler ved FACS. Konvensjonell spinokulasjon av retronektinbelagte plater (lilla omvendt trekant) ble brukt som en positiv kontroll. Ikke-transduserte celler (blå sirkel) og aktiverte celler sådd på alginatstillasene uten virus (rød firkant) ble brukt som negative kontroller. Stillas sådd med aktiverte celler og GFP retrovirus (grønn trekant) hadde en transduksjonseffektivitet på 85%, sammenlignbar med retronektin. Data representert som gjennomsnitt ± standardavvik med n = 4. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; FACS = fluorescensaktivert cellesortering; SSC-A = side scatter-peak område; FSC = fremover scatter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1: Protokoll for aktivering av celler. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S1: Bilder av tørre makroporøse alginatstillaser fremstilt ved -80 °C. Frysing av stillas ved -80 °C fører til mindre konsistent stillas utseende og funksjon enn ved -20 °C. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAR-T celleterapi fortsetter å få interesse for både forskning og kommersielle applikasjoner. Til tross for suksessen CAR-T-celleterapi har hatt i behandling av blodkreft, begrenser de høye kostnadene ved prosedyren bruken. Protokollen som presenteres her introduserer en ny metode for viral genoverføring av T-celler uten behov for spinokulasjon av retronektinbelagte plater. Å produsere tørre makroporøse alginatstillaser for å formidle transduksjon er relativt enkelt og er en egnet rimelig erstatning for konvensjonell metode.
Av og til kan stillasutseendet avvike fra det som er vist i figur 2, og kan i stedet virke klart og krystallinsk i stedet for hvitt og luftig. Dette kan oppstå ved inkonsekvent frysing ved -20 °C på grunn av gjentatt åpning av fryserdøren, eller hvis platen som skal fryses isoleres ved å være ved siden av eller oppå store gjenstander i fryseren. Til tross for forskjellen i utseende, har laboratoriet vårt ikke opplevd noen forskjell i transduksjonseffektivitet med de krystallinske stillasene. Selv om tidligere arbeid med kryogering har brukt lavere frysetemperaturer 24,25, fant vi at frysing ved lavere temperaturer fører til mindre konsistent stillas utseende og funksjon enn når det er frosset ved -20 ° C. Bilder av et stillas laget ved frysing ved -80 °C finnes i supplerende figur S1. Derfor anbefales det fortsatt at stillaser fryses ved -20 °C med minimal forstyrrelse, og platen plasseres på en hylle i rack-stil som tillater luftstrøm under platen.
Selv om disse stillasene har vist utmerket transduksjonseffektivitet, bør noen få begrensninger noteres. Først må det tas hensyn når du arbeider med EDTA, noe som kan begrense cellens levedyktighet, selv i små mengder. Derfor bør EDTA fjernes helt. I tillegg vil stillasstørrelsen begrense mengden væske som kan absorberes og dermed antall celler som kan transduseres. Endelig kan denne protokollen ikke brukes til å transdusere ikke-aktiverte T-celler. Fremtidig arbeid vil fokusere på å rapportere fabrikasjon av stillaser som er i stand til samtidig mediert aktivering og spredning av celler, fremme kolokalisering av celler og viruspartikler for transduksjon, og frigjøre fullt funksjonelle transducerte celler in vivo18.
Publiserte studier av vårt laboratorium rapporterer fenotypisk analyse og funksjonalitet av CAR-T-celler generert ved hjelp av disse stillasene. De CD19-spesifikke CAR-T-cellene produsert av disse stillasene beholdt effektorfenotypen og var i stand til å eliminere CD19+ Daudi-celler in vitro når de ble kodyrket ved et effektor-til-mål-forholdpå 17. CAR-T-cellene dyrket sammen med Daudi-celler frigjorde også IL-2 og IFN-γ, som er proinflammatoriske cytokiner som indikerer at T-cellene aktiveres. Disse resultatene viser at disse stillasene produserer svært funksjonelle CAR-T-celler in vitro. CAR-T-celler generert av disse stillasene viste utmerket in vivo antitumorfunksjon mot CD19+ Daudi-celler merket med firefly luciferase. CAR-T-cellene kontrollerte effektivt tumorvekst, forbedret total overlevelsesrate og viste ingen signifikante tegn på toksisitet17. Disse resultatene indikerer at disse stillasene kan brukes til å genetisk modifisere celler for CAR-T-celleterapi uten å påvirke cellens funksjonalitet og antitumoraktivitet. Fremtidige studier med disse alginatstillasene innebærer optimalisering av transduksjonseffektivitet ved å justere makroporøsiteten samt alginat- og kalsiumkonsentrasjoner.
Avslutningsvis har disse makroporøse alginatstillasene en sammenlignbar transduksjonseffektivitet til retronektin, og gir en alternativ metode for å transdusere celler for CAR-T-celleterapi. Disse stillasene produserer også fullt funksjonelle CAR-T-celler med antitumoraktivitet både in vitro og in vivo17. Drydux stillaser tilbyr en alternativ metode som er enkel og billig for å transdusere T-celler til bruk i CAR-T-celleterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
P.A. og Y.B. er oppfinnere av patenter knyttet til bruk av biomaterialer for generering av CAR-T-celleterapi. Y.B. mottar et industrisponset forskningsstipend relatert til CAR-T-celleterapeutisk teknologi (ikke relatert til dette arbeidet). Alle andre forfattere erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gjennom Grant Award Numbers R37-CA260223, R21CA246414. Vi takker NCSU-flowcytometrikjernen for opplæring og veiledning i flowcytometrianalyse. Skjemaer ble opprettet med Biorender.com
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure, pH 8.0 |
| 1x DPBS | Gibco | 14190-144 | No calcium chloride or magnesium chloride |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies Inc | 07060 | |
| Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| Calcium-D-Gluconate | Alfa Aesar | A11649 | |
| CD28.2 Antibody | BD | 555725 | 1 mg/mL |
| CD3 Antibody | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μg/mL |
| Click's Media | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
| DI Water | - | - | |
| Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
| HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
| HyClone RPMI 1640 Media | Cytvia | SH3009601 | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Gibco | 15-140-122 | |
| Peripheral Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | Sodium alginate |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
| Recombinant Human IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
| Retrovirus | - | - | 1 x 106 TU/mL |
References
- Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing. Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).
- Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges. Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).
- Nair, R., Westin, J.
- Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J.
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
- Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).
- Lee, H. -J., et al. Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells. Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).
- Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
- Sun, J., Tan, H. Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications. Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).
- Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).
- Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
- Soccol, C., et al.
- Moody, C. T., et al. Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture. Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).
- Brudno, Y., et al. Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence. Biomaterials. 178, 373-382 (2018).
- Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots. Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).
- Agarwalla, P., et al. Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy. Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).
- Agarwalla, P., et al. Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells. Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).
- Vera, J., et al. T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells. Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).
- PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS. , Available from: https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/ (2022).
- Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies. Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).
- Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis. STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).
- Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true (2022).
- Lin, H. -R., Yeh, Y. -J. Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies. Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).
- Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique. Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).
