Summary
本文是用于创建干燥的大孔藻酸盐支架的方案，该支架介导有效的病毒基因转移，用于T细胞的基因工程，包括用于CAR-T细胞治疗的T细胞。支架被证明以>85%的转导转导活化的原代T细胞。
Abstract
在过去几年中，用于CAR-T细胞治疗的T细胞基因工程已成为癌症治疗的最前沿。CAR-T细胞是通过病毒基因转移到T细胞中产生的。目前病毒基因转移的黄金标准涉及再连蛋白包被板的棘刺，这既昂贵又耗时。非常需要高效且具有成本效益的方法来生成CAR-T细胞。这里描述的是一种制造廉价、干燥的大孔海藻酸盐支架的方法，称为 Drydux 支架，可有效促进活化 T 细胞的病毒转导。支架设计用于代替接种病毒的再连蛋白包被板的金标准棘刺，并简化转导细胞的过程。海藻酸盐与钙-D-葡萄糖酸盐交联并冷冻过夜以产生支架。将冷冻支架在冻干机中冷冻干燥72小时，以完成干燥的大孔支架的形成。当病毒和活化的T细胞一起接种在支架顶部以产生转基因细胞时，支架介导病毒基因转移。支架产生>85%的原代T细胞转导，这与棘皮膜在Retronectin包被的板上的转导效率相当。这些结果表明，干式大孔海藻酸盐支架是传统转导方法的更便宜、更方便的替代方案。
Introduction
免疫疗法已成为一种革命性的癌症治疗范例，因为它能够特异性靶向肿瘤、限制脱靶细胞毒性和预防复发。特别是嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法因其在治疗淋巴瘤和白血病方面的成功而广受欢迎。FDA于2017年批准了第一种CAR-T细胞疗法，此后又批准了四种CAR-T细胞疗法1，2，3，4，5。CAR 具有抗原识别结构域，通常由单克隆抗体的单链可变片段组成，该片段对肿瘤相关抗原3，4 具有特异性。当CAR与其肿瘤相关抗原相互作用时，CAR-T细胞被激活，导致涉及细胞因子释放，细胞溶解脱颗粒，转录因子表达和T细胞增殖的抗肿瘤反应。为了产生CAR-T细胞，从患者身上收集血液以获得他们的T细胞。CAR是使用病毒遗传添加到患者的T细胞中的。CAR-T细胞在体外生长并输回患者体内2，3，4，6。CAR-T细胞的成功生成取决于转导效率，转导效率描述了转基因成CAR-T细胞的T细胞数量。
目前，CAR-T细胞生成的金标准是活化的T细胞和病毒在再连蛋白包被的平板7，8上的棘化。当病毒颗粒与T细胞表面接触时，转导开始。Retronectin通过增加病毒颗粒和细胞之间的结合效率来促进病毒和细胞的共定位，增强转导7，8。Retronectin本身不能很好地工作，需要伴随着脊髓，这通过浓缩病毒颗粒和增加T细胞的表面通透性来增强基因转移，从而使病毒感染更容易8。尽管在 retronectin 包被的板上成功了脊髓成形，但这是一个复杂的过程，需要多次旋转循环和昂贵的试剂。因此，非常需要更快、更便宜的病毒基因转移替代方法。
海藻酸盐是一种天然阴离子多糖，由于其成本低、安全性好以及与二价阳离子9，10，11，12 混合后形成水凝胶的能力，广泛用于生物医学行业。海藻酸盐是一种符合 GMP 标准的聚合物，通常被 FDA13 认可为安全 （GRAS）。海藻酸盐与阳离子交联产生稳定的水凝胶，通常用于伤口愈合，小化学药物和蛋白质的递送以及细胞运输9，10，11，12，14，15，16。由于其优异的胶凝性能，海藻酸盐是通过冷冻干燥制造多孔支架的首选材料10，17。藻酸盐的这些特性使其成为生产可以介导活化细胞病毒基因转移的支架的有吸引力的候选者。
这里描述的是用于制造干大孔藻酸盐支架的方案，称为 Drydux 支架，其通过病毒基因转移静态转导 T 细胞17，18。制作这些支架的过程如图 1所示。这些支架消除了对再连接蛋白涂层板的棘刺形成的需要。大孔藻酸盐支架促进病毒颗粒和T细胞的相互作用，从而在一步中实现高效的基因转移，而不会影响工程T细胞的功能和活力17。如果正确遵循，这些大孔藻酸盐支架的转导效率至少为80%，简化和缩短了病毒转导过程。
图 1：协议的示意图和 时间表。 （A）制作干式大孔海藻酸盐支架的时间表。海藻酸盐与钙-D-葡萄糖酸交联并冷冻过夜。将冷冻支架冻干72小时以创建Drydux支架。（B）活化细胞病毒转导的时间表。将活化的细胞和病毒（MOI 2）接种在支架顶部，并在补充有IL-7和IL-15的完整培养基中孵育。支架吸收混合物并促进病毒基因转移。EDTA用于溶解支架并分离转导细胞。用PBS洗涤两次后，细胞沉淀可用于分析。缩写：PBS = 磷酸盐缓冲盐水;PBMC=外周血单核细胞。 请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
所有涉及人类原代细胞和逆转录病毒载体的程序均符合北卡罗来纳州立大学的生物安全指南，并得到环境健康与安全办公室的批准。人外周血单核细胞是从商业来源购买的血沉棕黄层。原代人类细胞必须从人血沉棕黄层部分中分离出来，并需要生物安全2级许可和详细的标准操作程序以及工作所在机构的批准。病毒载体，包括用于如前所述制备的转导的逆转录病毒载体上清液19，可根据编码的蛋白质分为生物安全1级或生物安全2级，并需要相关机构生物安全委员会的批准。
1.制作大孔海藻酸盐支架
- 通过在烧杯中向D葡萄糖酸钙中加入无菌过滤的去离子水，制备0.4%（每体积重量）葡萄糖酸钙的储备溶液。中速搅拌直至葡萄糖酸钙溶解（~1.5小时），无菌过滤，并在室温下储存。
注意：没有必要检查溶液的pH值。 - 在螺旋盖小瓶或烧杯中制备2%（每体积重量）藻酸盐的溶液。小心地将超纯海藻酸盐添加到容器中，并向海藻酸盐中加入无菌过滤的去离子水。选择不会妨碍混合的最大搅拌棒并将其添加到容器中。
注意：有关用于此协议的超纯藻酸盐类型的信息可以在材料表和Novamatrix网站20上找到。没有为这些支架探索不同的藻酸盐，因为它们可能导致支架9，10，11的孔隙率和生物相容性发生不希望的变化。 - 高速搅拌溶液，直到藻酸盐溶解（~1小时）。如果容器侧面有大团块，请倾斜容器以将其移开。侧面的少量藻酸盐在搅拌时会溶解，无需担心。
注意：没有必要检查溶液的pH值。 - 当藻酸盐溶解时，降低搅拌速度，向海藻酸盐溶液中缓慢加入等体积的0.4%葡萄糖酸钙D，以防止形成交联团块，并剧烈搅拌15分钟。
- 将烧杯或小瓶侧向倾斜以去除可能已形成的任何团块。
注意：建议使用均质机。最终的解决方案应该是光学清晰的。 - 将所需体积的溶液移液到48孔板或24孔板的每个孔中。48 孔板使用 300 μL/孔，24 孔板使用 1 mL/孔。慢慢浇注并经常更换吸头，因为溶液会很粘稠并粘在吸头上。
- 用盖子盖住板，并在-20°C下冷冻过夜。
- 通过取下盖子并用湿巾和橡皮筋固定顶部来为冻干机准备板。将板放入750mL至2，000mL冻干瓶中，并置于冻干器上72小时。
- 72小时后，从冻干器中取出板并盖上盖子。密封板并储存在4°C。对于长期储存，在4°C储存之前真空密封板。保持干燥，直到需要。
注意：由于体积误差（有些粘在小瓶壁上，移液器吸头），制作额外的海藻酸钙溶液。例如，要在 24 孔板中制作四个支架，需要 4 mL 组合溶液（2 mL 海藻酸盐 + 2 mL 葡萄糖酸 D 钙），但建议制备 2.5 mL 2% 海藻酸盐溶液和 2.5 mL 0.4% 葡萄糖酸钙溶液。
2. 转导
- 使用100 kDa过滤器的病毒上清液浓度
- 用 1 mL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 水合离心过滤器 2 分钟。丢弃 PBS。
- 通过加入 2 mL 病毒悬液 （1 × 106 TU/mL） 并在摆动桶转子中以 1，500 × g 离心通过离心过滤器浓缩病毒悬液 10 分钟。
注意：每个支架需要一到两百微升浓缩病毒。 - 如果浓缩的病毒悬浮液体积大于 200 μL，则再旋转几分钟。
- 对每个脚手架重复步骤2.1.1-2.1.3。
注意：浓缩大量病毒并从浓缩原液中取出 100-200 μL 等分试样也是可以接受的。
- 将活化的细胞和病毒一起播种。
- 对于每个支架，将 1 × 106 活化的外周血单核细胞 （PBMC） 悬浮在 50 μL 全细胞培养基（250 mL Click's 培养基 + 250 mL RPMI 1640 培养基 + 50 mL 胎牛血清 + 5 mL 谷氨酰胺替代品 + 5 mL 青霉素/链霉素）中来制备等分试样。
注意：有关如何激活 PBMC 的协议，请参阅 补充文件 1 。 - 将浓缩的病毒上清液（~2×106TU ，MOI 2）加入细胞悬液中。对于 48 孔支架，细胞病毒悬液的总体积不应超过 200 μL，对于 24 孔支架，细胞病毒悬浮液的总体积不应超过 350 μL。
- 将细胞病毒混合物滴加到干支架的顶部。对于阴性对照实验，使用完整的细胞培养基代替浓缩的病毒。将细胞悬液添加到干支架的顶部。
- 对每个脚手架重复步骤 2.2.1-2.2.3。
- 将支架在37°C的细胞培养箱中孵育45-60分钟。从培养箱中取出支架;在此期间，支架将完全吸收溶液。
- 为了诱导增殖，向每个孔中加入补充有IL-15（5ng / mL）和IL-7（10 ng / mL）的完整细胞培养基;也可以使用IL-2。向每个 48 孔支架添加 500 μL，或向每个 24 孔支架添加 1 mL。
- 将支架在37°C孵育72小时。随着细胞增殖，培养基会变成橙色。
- 对于每个支架，将 1 × 106 活化的外周血单核细胞 （PBMC） 悬浮在 50 μL 全细胞培养基（250 mL Click's 培养基 + 250 mL RPMI 1640 培养基 + 50 mL 胎牛血清 + 5 mL 谷氨酰胺替代品 + 5 mL 青霉素/链霉素）中来制备等分试样。
- 从支架中分离细胞进行分析。
- 在 1x PBS 中将 0.5 M EDTA 稀释至 0.25 M EDTA。
- 从每个孔中取出多余的培养基，并收集到单独的 15 mL 离心管中。
- 要从支架中分离细胞，请向每个支架添加 0.25 M EDTA。将 300 μL 添加到 48 孔支架中或 1 mL 添加到 24 孔支架中。让板静置或轻轻搅拌3-4分钟。
- 一旦支架大部分溶解，在井内轻轻移入和移出。可能需要一些进出移液步骤才能完全溶解支架。如果它在 10 分钟内没有溶解，则再加入 200 μL 的 0.25 M EDTA。
- 支架完全溶解后，将溶液转移到 15 mL 离心管中。
- 对每个脚手架重复步骤 2.3.4 和 2.3.5。
- 通过向每个离心管中加入 12 mL PBS 并以 400 × g 离心 5 分钟来洗涤细胞两次。每个管的底部将形成细胞沉淀。吸出上清液并重复洗涤。每次洗涤时都要小心完全吸出上清液，因为去除所有EDTA至关重要。
- 用PBS第二次洗涤后，细胞沉淀现在就可以进行分析了。遵循分析所需的适当方案。
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Representative Results
这些大孔藻酸盐支架易于制作，应以多孔、蓬松和白色圆盘的形式从冻干机中出来。虽然没有在这个实验中研究，但海藻酸钙溶液可以铸造到不同的模具中，以创建不同形状的支架，具体取决于用户的需要9，10。支架是静电的，可能会粘在孔板的盖子上或戴手套的手指上。 图 2 演示了脚手架完成后的外观。图中还显示了 24 孔和 48 孔支架的近似尺寸。
图2：干大孔藻酸盐支架的图像 。 （A）装满支架的48孔板。（B） 装满支架的 24 孔板。（C）比较48孔支架和24井支架。还显示了脚手架尺寸。 请点击此处查看此图的大图。
支架的孔隙率对于成功转导非常重要，我们之前已经对支架的孔隙率进行了实验。有关孔隙率的更多信息，包括支架的SEM图像，请参阅Agarwalla等人的论文。在参考文献17，18中。
使用流式细胞术分析转导效率，结果如图3所示。来自同一供体的冷冻PBMC被激活并用于所有实验组。激活PBMC的协议可以在补充文件1中找到，可以使用任何激活T细胞和验证激活的标准方法21，22，23。激活的PBMC接种在具有GFP编码逆转录病毒的支架或没有病毒的支架上，称为“空白”支架。还将活化的PBMC接种在用Retron连蛋白和GFP编码逆转录病毒的棘刺板上，以比较藻酸盐支架与传统方法的转导效率。接种在24孔板的未包被孔中的非转导（NT）细胞激活的PBMC用作阴性对照组。正如预期的那样，非转导细胞和从空白支架分离的细胞没有显示出任何转导。从接种有活化的PBMC和GFP逆转录病毒的支架中分离的细胞显示出与retron连蛋白包被板相当的转导效率。支架的平均转导效率为85%，略低于再生连蛋白组。这些结果表明，这些藻酸盐支架是一种更容易、更便宜的替代病毒转导T细胞，而无需再连接蛋白的棘化。
图3：转导效率的FACS量化 。 （A）显示GFP表达的FACS图。在活细胞、FSC单体和GFP阳性细胞上对细胞进行门控。（B）通过FACS定量GFP阳性细胞。常规棘突涂覆板（紫色倒三角形）作为阳性对照。非转导细胞（蓝色圆圈）和接种在无病毒的藻酸盐支架上的活化细胞（红色方块）用作阴性对照。接种活化细胞和GFP逆转录病毒（绿色三角形）的支架的转导效率为85%，与瑞连蛋白相当。数据表示为平均值±标准差，n = 4。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;FACS = 荧光激活细胞分选;SSC-A = 侧散射峰面积;FSC = 前向散射。请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：激活细胞的方案。请点击此处下载此文件。
补充图S1：在-80°C下制造的干大孔海藻酸盐支架的图像。 与在-20°C冷冻相比，在-80°C下冷冻支架会导致支架的外观和功能不太一致。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
CAR-T细胞疗法继续引起人们对研究和商业应用的兴趣。尽管CAR-T细胞疗法在治疗血癌方面取得了成功，但该程序的高成本限制了其使用。这里介绍的方案介绍了一种用于T细胞病毒基因转移的新方法，而无需对retronectin包被的板进行棘刺。生产干燥的大孔海藻酸盐支架来介导转导相对简单，是传统方法的合适低成本替代品。
有时，支架外观可能与图2所示不同，而是可能看起来透明和结晶，而不是白色和蓬松。这可能是由于反复打开冷冻室门而导致的-20°C冷冻不一致，或者如果要冷冻的板因在冰箱中的大件物品旁边或顶部而绝缘。尽管外观不同，但我们的实验室在转导效率方面与结晶支架没有任何差异。尽管以前的冷冻凝胶工作使用了较低的冷冻温度24，25，但我们发现，与在-20°C下冷冻相比，在较低温度下冷冻会导致支架的外观和功能不太一致。在-80°C下冷冻产生的支架的图像可以在补充图S1中找到。因此，仍然建议将支架冷冻在-20°C下，破坏最小，并且板应放置在架式架子上，允许板下方的空气流动。
尽管这些支架显示出出色的转导效率，但应注意一些局限性。首先，使用EDTA时必须小心，EDTA会限制细胞活力，即使是少量的。因此，EDTA应该完全删除。此外，支架尺寸将限制可以吸收的液体量，从而限制可以转导的细胞数量。最后，该协议不能用于转导未活化的T细胞。未来的工作将集中在报告能够同时介导细胞活化和增殖的支架的制造，促进细胞和病毒颗粒的共定位以进行转导，并在体内释放功能齐全的转导细胞18。
我们实验室发表的研究报告了使用这些支架生成的CAR-T细胞的表型分析和功能。这些支架产生的CD19特异性CAR-T细胞保留了效应表型，并且在以1：5的效应子与靶标比共培养时能够在体外消除CD19 + Daudi细胞17。与Daudi细胞共培养的CAR-T细胞也释放IL-2和IFN-γ，它们是促炎细胞因子，表明T细胞被激活。这些结果表明，这些支架在体外产生功能强大的CAR-T细胞。这些支架产生的CAR-T细胞对用萤火虫荧光素酶标记的CD19 + Daudi细胞表现出优异的体内抗肿瘤功能。CAR-T细胞有效控制肿瘤生长，提高总存活率，并且未显示出任何明显的毒性迹象17。这些结果表明，这些支架可用于对细胞进行基因修饰，用于CAR-T细胞治疗，而不会影响细胞的功能和抗肿瘤活性。这些藻酸盐支架的未来研究涉及通过调整大孔隙率以及藻酸盐和钙浓度来优化转导效率。
总之，这些大孔海藻酸盐支架具有与retronectin相当的转导效率，为转导用于CAR-T细胞治疗的细胞提供了一种替代方法。这些支架还产生功能齐全的CAR-T细胞，在体外和体内均具有抗肿瘤活性17。Drydux 支架提供了一种替代方法，该方法简单且便宜，用于转导 T 细胞以用于 CAR-T 细胞治疗。
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Disclosures
P.A.和Y.B.是与使用生物材料产生CAR-T细胞疗法相关的专利的发明人。Y.B.获得与CAR-T细胞治疗技术相关的行业赞助研究资助（与这项工作无关）。所有其他作者声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院通过拨款编号R37-CA260223，R21CA246414的支持。我们感谢NCSU流式细胞术核心对流式细胞术分析的培训和指导。原理图是用 Biorender.com 创建的
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure, pH 8.0 |
| 1x DPBS | Gibco | 14190-144 | No calcium chloride or magnesium chloride |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies Inc | 07060 | |
| Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| Calcium-D-Gluconate | Alfa Aesar | A11649 | |
| CD28.2 Antibody | BD | 555725 | 1 mg/mL |
| CD3 Antibody | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μg/mL |
| Click's Media | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
| DI Water | - | - | |
| Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
| HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
| HyClone RPMI 1640 Media | Cytvia | SH3009601 | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Gibco | 15-140-122 | |
| Peripheral Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | Sodium alginate |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
| Recombinant Human IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
| Retrovirus | - | - | 1 x 106 TU/mL |
References
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