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Immunology and Infection

विवो में मानव प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में हेरफेर करने के लिए जेनोग्राफ्ट स्किन मॉडल

Published: June 29, 2022 doi: 10.3791/64040
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Department of Dermatology, UCSF, 2TRex Bio

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल बताता है कि गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (एनओडी) -स्सिड इंटरल्यूकिन -2 गामा चेन रिसेप्टर (एनएसजी) चूहों पर मानव त्वचा को कैसे ग्राफ्ट किया जाए। प्रत्यारोपण के लिए मानव त्वचा की तैयारी, प्रत्यारोपण के लिए चूहों की तैयारी, विभाजित मोटाई वाली मानव त्वचा का प्रत्यारोपण, और प्रत्यारोपण के बाद की वसूली प्रक्रिया का विस्तृत विवरण रिपोर्ट में शामिल है।

Abstract

मानव त्वचा जेनोग्राफ्ट मॉडल, जिसमें मानव दाता त्वचा को एक इम्यूनोडेफिशिएंट माउस होस्ट पर प्रत्यारोपित किया जाता है, त्वचा इम्यूनोलॉजी में ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण विकल्प है। म्यूरिन और मानव त्वचा शरीर रचना विज्ञान और प्रतिरक्षा कोशिका संरचना में काफी भिन्न होती है। इसलिए, पारंपरिक माउस मॉडल में त्वचाविज्ञान अनुसंधान और दवा की खोज के लिए सीमाएं हैं। हालांकि, सफल क्सीनट्रांसप्लांट तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं और ग्राफ्ट और मेजबान अस्तित्व के लिए इष्टतम नमूना और माउस ग्राफ्ट साइट तैयार करने की आवश्यकता होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों पर मानव त्वचा के प्रत्यारोपण के लिए एक अनुकूलित तकनीक प्रदान करता है और डाउनस्ट्रीम प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए आवश्यक विचारों पर चर्चा करता है। यह रिपोर्ट मानव दाता त्वचा के नमूने की उचित तैयारी, सर्जिकल सेटअप की असेंबली, माउस और सर्जिकल साइट की तैयारी, त्वचा प्रत्यारोपण और पोस्ट-सर्जिकल निगरानी का वर्णन करती है। इन विधियों का पालन सर्जरी के बाद 6 सप्ताह से अधिक समय तक जेनोग्राफ्ट्स के रखरखाव की अनुमति देता है। नीचे उल्लिखित तकनीकें इंजीनियरिंग नियंत्रण, बाँझ तकनीक और पूर्व और बाद की सर्जिकल कंडीशनिंग के विकास के कारण अधिकतम ग्राफ्टिंग दक्षता की अनुमति देती हैं। जेनोग्राफ्ट मॉडल के उचित प्रदर्शन के परिणामस्वरूप मानव त्वचा के प्रयोगात्मक लक्षण वर्णन और विवो में यौगिकों के प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए लंबे समय तक जीवित रहने वाले मानव त्वचा ग्राफ्ट नमूने होते हैं।

Introduction

माउस मॉडल का उपयोग अक्सर मानव जीव विज्ञान और बीमारी के बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए किया जाता है, आंशिक रूप से उनकी प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता और आनुवंशिक हेरफेर की क्षमता के कारण। हालांकि, माउस फिजियोलॉजी मानव अंग प्रणालियों, विशेष रूप से त्वचा को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न नहीं करता है, और इसलिए दवा के विकास में प्रीक्लिनिकल मॉडल के रूप में उपयोग के लिए सीमाएंहैं। माउस और मानव त्वचा के बीच शारीरिक अंतर में उपकला मोटाई और वास्तुकला में अंतर, मुराइन एक्क्राइन पसीने की ग्रंथियों की कमी और बालों के साइकिल चलाने में भिन्नता2 शामिल हैं। इसके अलावा, प्रतिरक्षा प्रणाली की जन्मजात और अनुकूली भुजाएं दोनोंदो प्रजातियों के बीच भिन्न होती हैं। माउस त्वचा में डेंड्राइटिक एपिडर्मल टी कोशिकाओं (डीईटीसी) की एक अनूठी प्रतिरक्षा आबादी होती है, इसमें त्वचीय टी कोशिकाओं की अधिक प्रचुरता होती है, और मानव ऊतक4 की तुलना में प्रतिरक्षा कोशिका उप-समूह स्थानीयकरण में भिन्न होती है। इसलिए, मानव त्वचा जीव विज्ञान और सूजन के बारे में प्रयोगात्मक निष्कर्ष मानव ऊतक के साथ सत्यापन से लाभ उठाते हैं। जबकि इन विट्रो और ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम मानव ऊतक का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं, ये सिस्टम अनुपस्थित या अपूर्ण प्रतिरक्षा पुनर्गठन और परिधीय वाहिका5 से संबंध की कमी से सीमित हैं। मानवकृत जेनोग्राफ्ट त्वचा प्रत्यारोपण मॉडल का उद्देश्य विवो में मानव ऊतकों में प्रतिरक्षा और गैर-प्रतिरक्षा मार्गों के चिकित्सीय या जैविक हेरफेर की अनुमति देना है।

मानव त्वचा जेनोग्राफ्ट मॉडल का उपयोग त्वचा शरीर विज्ञान और फार्माकोलॉजी का अध्ययन करने, प्रतिरक्षा अस्वीकृति और प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने, मानव त्वचा कैंसर तंत्र को विच्छेदित करने और त्वचा रोगों और घाव भरने को समझनेके लिए किया गया है। त्वचा अनुसंधान के कई क्षेत्रों पर लागू होने के बावजूद, जेनोग्राफ्ट मॉडल में इन विट्रो अध्ययनों की तुलना में कम थ्रूपुट है और माउस मॉडल में नियोजित आनुवंशिक हेरफेर की आसानी का अभाव है। इस मॉडल के भीतर समय बिंदु हफ्तों से महीनों तक हो सकते हैं, और सफल ग्राफ्टिंग के लिए इन सर्जरी को करने के लिए उचित सुविधाओं और उपकरणों की आवश्यकता होती है। हालांकि, जेनोग्राफ्ट मॉडल प्रयोगों के लिए जैविक और शारीरिक संदर्भ प्रदान करता है, जबकि ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम, जैसे ऊतक खोज, को अक्सर विशिष्ट समय अंतराल पर बहिर्जात संकेतों जैसे गतिशील भागों के असंख्य की प्रतिकृति की आवश्यकता होतीहै। इसलिए, इस मॉडल का उपयोग विट्रो और माउस मॉडल के भीतर देखे गए निष्कर्षों को और अधिक मान्य करने के लिए किया जाता है, या ऐसे काम के लिए जो अन्यथा जैविक रूप से संभव नहीं है। जेनोग्राफ्ट मॉडल का उचित उपयोग विवो में बरकरार मानव ऊतक का अध्ययन और हेरफेर करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है।

जेनोग्राफ्ट त्वचा प्रत्यारोपण मॉडल का अनुकूलन समय के साथ ग्राफ्ट अखंडता को संरक्षित करने के लिए दशकों के शोध पर निर्भर है। इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण गैर-मोटे मधुमेह (एनओडी)-स्सिड इंटरल्यूकिन -2 गामा चेन रिसेप्टर (एनएसजी) माउस का उपयोग कर रहा है, जिसमें बी और टी अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं, कार्यात्मक एनके कोशिकाओं की कमी है, और मैक्रोफेज और डेंड्राइटिककोशिकाओं में कमी है। इन एनएसजी मेजबानों की इम्यूनोडेफिशिएंसी प्रकृति मानव हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं, रोगी-व्युत्पन्न कैंसर और त्वचा 8,9,10 के प्रत्यारोपण की अनुमति देती है। इस इम्यूनोसप्रेसिव मेजबान वातावरण के बावजूद, ग्राफ्ट सफलता10 के लिए एंटी-जीआर 1 प्रशासन द्वारा माउस न्यूट्रोफिलिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अतिरिक्त दमन आवश्यक है। बरकरार ऊतक के प्रत्यारोपण में प्रमुख बाधाएं संक्रमण, अस्वीकृति और ग्राफ्ट में रक्त के प्रवाह को फिर से स्थापित करने में कठिनाई हैं, जिससे कभी-कभी त्वचीय और एपिडर्मल अखंडता का नुकसान होताहै। एंटी-एफआर 1 के प्रशासन और उचित ग्राफ्ट गहराई के उपयोग सहित तकनीकें ग्राफ्ट उत्तरजीविता में सुधारकरती हैं। सावधानीपूर्वक अनुकूलन एनएसजी चूहों पर 90% -100% तक उच्च दक्षता और जीवित रहने की दर के साथ मानव जेनोग्राफ्ट त्वचा प्रत्यारोपण करना संभव बनाता है।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन यूसीएसएफ आईएसीयूसी (एएन 191105-01 एच) और आईआरबी (13-11307) प्रोटोकॉल के अनुपालन में अनुमोदित और प्रदर्शन किया गया था। त्वचा के नमूने, नियमित वैकल्पिक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के हिस्से के रूप में त्याग दिए गए, जैसे कि हर्निया की मरम्मत, वर्तमान शोध के लिए उपयोग किया गया था। त्वचा के नमूनों को या तो मानव विषय अनुसंधान के रूप में डी-आइडेंटिफाई और प्रमाणित किया जाता है या, यदि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए नैदानिक रूप से पहचानने वाली जानकारी की आवश्यकता होती है, तो रोगियों को आईआरबी प्रोटोकॉल 13-11307 के तहत लिखित सहमति प्रदान की जाती है। किसी अन्य समावेश या बहिष्करण मानदंड का उपयोग नहीं किया गया था। अध्ययन में 8-10 सप्ताह की उम्र के किसी भी लिंग के एनएसजी चूहों को नियोजित किया गया था। चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. दाता मानव त्वचा के नमूने का प्रसंस्करण

नोट: इस प्रत्यारोपण में उपयोग किया गया मानव त्वचा का नमूना एक स्वस्थ रोगी के पेट से एकत्र किया गया एक बड़ा नमूना था। नमूना कम से कम 15 सेमी x 7.5 सेमी होना चाहिए। आकार की सीमाएं चूहों की संख्या को प्रभावित कर सकती हैं जिनके लिए त्वचा उपलब्ध है और ग्राफ्ट आकार की पसंद।

  1. तैयारी और ग्राफ्टिंग से पहले ठंडे तापमान (बर्फ पर; 4 डिग्री सेल्सियस) पर त्वचा के नमूने को बनाए रखें। नमूने को फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में भिगोए गए धुंध के साथ एक बंद नमूना संग्रह कप में नम रखें।
    नोट: 2 दिनों से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर त्वचा के नमूने को संग्रहीत करने की सिफारिश नहीं की जाती है। हालांकि, रिपोर्ट मौजूद हैं जहां त्वचा के नमूनेलंबे समय तक संग्रहीत किए जाते हैं।
    चेतावनी: मानक बायोहाजार्ड सावधानियों के साथ सभी मानव ऊतक का इलाज करें।
  2. एक निष्फल विच्छेदन बोर्ड पर एक निष्फल नकारात्मक दबाव ऊतक संवर्धन हुड में मानव त्वचा के नमूने को डर्माटोम करने के लिए तैयार करें।
  3. विच्छेदन बोर्ड पर त्वचा के नमूने, एपिडर्मिस साइड को रखें। एपिडर्मिस को बाँझ अल्कोहल प्रेप पैड के साथ और फिर पीबीएस के साथ पोंछें।
  4. टी-पिन को विच्छेदित करने में 1.5 के साथ त्वचा के करीब किनारे को पिन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. डर्माटोम त्वचा का नमूना 400 μm मोटाई पर, 30 ° -45 ° कोण पर आगे काटते हुए स्थिर दबाव लागू करता है। सभी उपकरण-विशिष्ट निर्देशों और सुरक्षा उपायों का पालन करें (सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: डर्माटोम तकनीक के बारे में विवरण के लिए, कृपया पहले प्रकाशित रिपोर्ट13 देखें।
  6. पकवान के तल पर बाँझ पीबीएस में भिगोए हुए बाँझ धुंध को रखकर 100 मिमी x 20 मिमी पेट्री डिश तैयार करें। गीली धुंध पर त्वचा, एपिडर्मिस साइड को ऊपर रखें।
  7. प्लेट किनारों को एक अर्धपारदर्शी सीलिंग फिल्म ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ सील करें और कवर करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि नमूना दूषित नहीं है। ग्राफ्टिंग से पहले नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. पूर्व-सर्जरी कंडीशनिंग और तैयारी

  1. ग्राफ्टिंग के लिए बाँझ उपकरण और एक बाँझ सर्जिकल स्टेशन तैयार करें। उपकरण और माउस प्लेसमेंट के लिए बाँझ सतहों के रूप में आटोक्लेव पेपर तौलिए का उपयोग करें।
    नोट: चूहों को दूध पिलाने के बाद ग्राफ्ट किया जा सकता है, लेकिन अधिमानतः 8-10 सप्ताह की उम्र के बीच ग्राफ्ट किया जाता है। किसी भी लिंग के चूहों को ग्राफ्ट किया जा सकता है।
  2. सर्जिकल स्टेशन से शारीरिक रूप से अलग किए गए क्षेत्र में बाल हटाने जैसे सर्जिकल तैयारी करें।
  3. बाँझ खारा में 1 मिलीग्राम / एमएल तक पतला करके एंटी-जीआर 1 ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। एनेस्थीसिया प्रेरण के बाद इंट्रापेरिटोनियल रूप से एंटी-जीआर 1 समाधान के प्रत्येक माउस को 100 μg / 100 μL के साथ खुराक दें।
  4. चूहों को एनेस्थेटाइज करें, एक समय में, आइसोफ्लुरेन या अन्य संस्थागत रूप से अनुमोदित एनेस्थेटिक्स के साथ।
    नोट: प्रेरण के दौरान आइसोफ्लुरेन को 3% -5% एकाग्रता पर दिया जाना चाहिए। एक बार जब माउस गतिहीन हो जाता है, तो सर्जरी की अवधि के लिए प्रभाव के लिए आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को 1% -3% तक कम करें।
    1. श्वसन दर, पैर की अंगुली-चुटकी प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति, और कान और मुंह के उचित गुलाबी रंग को देखकर संज्ञाहरण की उचित गहराई के लिए माउस की निगरानी करें।
      सावधानी: उचित एनेस्थेटिक मशीनरी और स्कैवेंजिंग विधियों का उपयोग करें, और आइसोफ्लुरेन वाष्प के संपर्क से बचें।
  5. माउस को हीटिंग पैड या किसी अन्य गर्मी स्रोत में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. नेत्र मरहम की एक छोटी सी बूंद को आंख पर रगड़कर नेत्र मरहम का प्रबंधन करें।
  7. त्वचा को चुटकी मारकर और शरीर के समानांतर कोण पर इंजेक्शन लगाकर एनाल्जेसिक ब्यूप्रेनोर्फिन (0.08 मिलीग्राम / किग्रा) और कारप्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा) ( सामग्री की तालिका देखें) का प्रशासन करें।
    नोट: संस्थागत प्रोटोकॉल का पालन करते हुए पूर्व-उपचार एनाल्जेसिया तैयार करें। एनाल्जेसिक के चयन और प्रशासन के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करें। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली एनाल्जेसिया की विधि चरण 2.7 और पूरक चित्रा 1 में उल्लिखित है।
  8. एंटी-जीआर 1 (चरण 2.4 में तैयार) को पूंछ से माउस को थोड़ा उठाकर, पेट को उजागर करके, और इंसुलिन 1 एमएल (12.7 मिमी) सिरिंज का उपयोग करके 30 डिग्री कोण पर इंजेक्ट करके इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करें।
  9. माउस के पृष्ठीय पक्ष के मध्य और ऊपरी भागों को शेव करने के लिए पशु-सुरक्षित इलेक्ट्रिक क्लिपर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
  10. सभी बालों को साफ करें और 30 सेकंड से 1 मिनट के लिए मुंडा त्वचा पर बाल हटाने के मलहम की एक उदार मात्रा लागू करें।
  11. एक पेपर तौलिया और पीबीएस के साथ बाल हटाने के मलहम को पूरी तरह से पोंछ लें।

3. प्रत्यारोपण प्रक्रिया

  1. माउस को बाल हटाने वाले स्टेशन से दूर एक द्वितीयक शल्य चिकित्सा स्थान पर स्थानांतरित करें।
  2. आयोडीन स्वैब स्टिक के साथ सर्जिकल साइट को एक गोलाकार गति में निष्फल करें, बीच में शुरू करें और विघटित क्षेत्र के किनारे की ओर काम करें।
  3. माउस के ऊपर बाँझ प्लास्टिक रैप का एक टुकड़ा रखें और प्लास्टिक में एक खिड़की काटें जो ग्राफ्ट किए जाने वाले क्षेत्र के आकार से थोड़ी बड़ी है।
  4. दाता त्वचा के एक आयत के आकार के 10 मिमी x 10 मिमी हिस्से को स्केलपेल के साथ ग्राफ्ट करने के लिए काटें। दाता की त्वचा को बल के पीछे की ओर मजबूती से पकड़कर और स्केलपेल के साथ बल के साथ काटकर ऐसा करें।
  5. सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, दाता त्वचा के टुकड़े के आकार से मेल खाने वाले माउस त्वचा के एक आयताकार क्षेत्र को स्निप करें, जिससे एक ग्राफ्ट बेड बन जाए। त्वचा को शरीर से दूर खींचने के लिए बल का उपयोग करें, और फेसिया में गहराई से काटने से बचने के लिए शरीर से दूर कैंची से त्वचा को काटें।
  6. दाता त्वचा के टुकड़े, एपिडर्मिस साइड को तैयार ग्राफ्ट बेड पर रखें।
  7. बल के पीछे का उपयोग करके, त्वचा में हेरफेर करें, आगे और पीछे फिसलें जब तक कि दाता त्वचा ग्राफ्ट बेड के खिलाफ पूरी तरह से सपाट न हो।
  8. सर्जिकल गोंद ऊतक चिपकने वाला की बूंदें जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) जहां दाता त्वचा माउस त्वचा से मिलती है और माउस और दाता त्वचा को 1-2 सेकंड के लिए बल के साथ एक साथ पकड़ती है ताकि गोंद ऊतकों का पालन करे। ग्राफ्ट के किनारे को पूरी तरह से सील करें और गोंद को पूरी तरह से सूखने दें।
  9. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए चूहों (चित्रा 1) को बैंड करें।
    1. ग्राफ्ट क्षेत्र को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त बड़ा पेट्रोलाटम धुंध का एक टुकड़ा काटें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. ग्राफ्ट को पेट्रोलाटम धुंध के साथ कवर करें, और बल का उपयोग करके त्वचा के खिलाफ धुंध को हल्के से दबाएं।
    3. एक पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग की एक पट्टी को लंबाई में काटें ताकि चौड़ाई माउस के घाव को कवर करने के लिए पर्याप्त हो।
    4. धुंध के ऊपर पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग, चिपकने वाला पक्ष को दृढ़ता से दबाएं। ड्रेसिंग को धड़ के चारों ओर पूरी तरह से लपेटने के लिए माउस को जल्दी से रोल करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह श्वसन को बाधित किए बिना कसकर फिट बैठता है और सभी अंग आंदोलन के लिए स्वतंत्र हैं।
    5. माउस को रिकवरी पिंजरे में रखें और इसे तब तक मॉनिटर करें जब तक कि यह सतर्क न हो जाए और चारों ओर घूम न जाए। वसूली के बाद कम से कम 15 मिनट के लिए पिंजरे के हिस्से पर एक गर्मी स्रोत प्रदान करें।
      नोट: जानवरों को रिकवरी पिंजरे में रखने के बाद 1-5 मिनट के भीतर ठीक होने की उम्मीद है।
  10. ग्राफ्टिंग के बाद सिंगली चूहों को घर देता है।
  11. संस्थागत प्रोटोकॉल द्वारा आवश्यक पोस्ट-सर्जिकल एनाल्जेसिया का प्रबंधन करें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन के दौरान 4-6 घंटे बाद ब्यूप्रेनोर्फिन (0.08 मिलीग्राम / किग्रा) को चमड़े के नीचे प्रशासित किया गया था।

4. पोस्ट-सर्जिकल प्रक्रियाएं

  1. ग्राफ्ट अस्वीकृति को रोकने के लिए ग्राफ्टिंग के बाद 4 दिन, 7 दिन और 11 दिनों में एंटी-जीआर 1 इंट्रा-पेरिटोनियल के 100 μL (100 μg) इंजेक्ट करें (पूरक चित्र 1)।
  2. आवश्यकतानुसार पट्टियों को बदलें और यदि चूहों द्वारा हटा दिया जाए।
  3. 7 वें दिन सभी चूहों को फिर से बंद करें।
  4. 14 वें दिन पट्टियों को हटा दें।
  5. ग्राफ्ट अस्वीकृति और प्रणालीगत सूजन (वजन घटाने, बालों का झड़ना, अत्यधिक सुस्ती) के संकेतों के लिए चूहों की निगरानी करें।
  6. ग्राफ्ट के बाद 3 से 6 सप्ताह के बीच चूहों को काट लें।
    1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद नियामक-नियंत्रित कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) प्रशासन के माध्यम से चूहों को इच्छामृत्यु करें।
      नोट: इच्छामृत्यु के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करें।
    2. चूहों से त्वचा ग्राफ्ट का विच्छेदन14. पैराफिन एम्बेडिंग से पहले ग्राफ्ट के एक हिस्से को 24 घंटे के लिए 10% फॉर्मलिन मेंरखें और हिस्टोलॉजी स्टेनिंग के लिए सेक्शनिंग करें।
    3. कैंची से त्वचा ग्राफ्ट को छोटा करें और रात भर सेल कल्चर मीडिया में 250 आईयू / एमएल कोलेजनेज IV और 0.02 मिलीग्राम / एमएल डीनेस के साथ एंजाइमेटिक रूप से पचाएं। पहले वर्णित प्रक्रिया14 के बाद सतह और इंट्रासेल्युलर मार्करों के लिए कोशिकाओं को दाग दें।

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Representative Results

एक सुपर-बैरियर पशु सुविधा के अंदर एनएसजी चूहों पर मानव त्वचा जेनोग्राफ्ट्स किए गए थे। सफलता को प्रत्यारोपण के बाद चूहों के लंबे समय तक ग्राफ्ट और माउस अस्तित्व और व्यवहार स्वास्थ्य द्वारा परिभाषित किया गया था। सर्जरी के बाद सप्ताह के दौरान खराब अस्तित्व को शुरू में प्रयोगात्मक सफलता के लिए सबसे बड़ी बाधा के रूप में देखा गया था, जिसमें 50% चूहों को इच्छामृत्यु की आवश्यकता थी। बाँझ तकनीक में सुधार और सर्जरी के दौरान और तुरंत बाद माउस शरीर के तापमान के बेहतर समर्थन ने सर्जिकल अस्तित्व को लगातार 80% से अधिक और अक्सर 90% -100% अस्तित्व तक बढ़ा दिया। जबकि माउस पीने के पानी में एंटीबायोटिक दवाओं के अतिरिक्त परीक्षण किया गया था, यह परिणामों में सुधार के लिए निर्धारित नहीं किया गया था और परिणामों के संभावित तत्व के रूप में बंद कर दिया गया था। प्रत्यारोपण के बाद के दिनों में सफलतापूर्वक ग्राफ्टेड चूहों को सक्रिय और स्वस्थ दिखाई देना चाहिए। चूहे अपने पिंजरे के चारों ओर घूम रहे थे, खोज कर रहे थे, घोंसले बना रहे थे, और हमेशा की तरह खा-पी रहे थे। एक अस्वस्थ माउस आलसी, गैर-प्रतिक्रियाशील लग सकता है, और अपने वजन को बनाए रखने के लिए पर्याप्त खाने या पीने वाला नहीं हो सकता है। नरम-फ़ीड और मौखिक जलयोजन विकल्पों के साथ सुस्त चूहों के पूरक शल्य चिकित्सा के बाद की वसूली में सहायता कर सकते हैं।

एक जेनोग्राफ्ट जो सही ढंग से ठीक हो रहा है, पहले स्कैब करेगा और फिर सर्जरी के लगभग 50 दिनों के भीतर ठीक हो जाएगा। ग्राफ्ट समय के साथ सिकुड़ सकते हैं लेकिन किनारों के आसपास बने रहते हैं जहां दाता त्वचा माउस की त्वचा से मिलती है (चित्रा 2)। जबकि ग्राफ्ट स्कैबिंग कम हो जानी चाहिए, ग्राफ्ट स्वस्थ मानव त्वचा की तुलना में मोटा और अधिक सूजन वाला रहेगा (चित्र 2)। ग्राफ्ट का अत्यधिक संकुचन हो सकता है, जिससे समापन बिंदु विश्लेषण के लिए उपलब्ध ऊतक कम हो सकता है। लगातार आकार के ग्राफ्ट के उपयोग और उचित ग्राफ्ट प्लेसमेंट से ऐसे मुद्दों को कम करने की उम्मीद है। पांच स्वतंत्र प्रयोगों में सभी ग्राफ्ट फसल के समय तक जीवित रहे, प्रत्यारोपण के बाद 50 दिनों तक।

ऊतक विश्लेषण में एंजाइमेटिक पाचन के बाद इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और एकल-कोशिका विश्लेषण शामिल हो सकते हैं। त्वचा के एक हिस्से को सेल कल्चर मीडिया में कोलेजनेज टाइप IV के 250 आईयू / एमएल और डीनेस के 0.02 मिलीग्राम / एमएल में रात भर पाचन द्वारा संसाधित किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें), और सतह और इंट्रासेल्युलर मार्करों के लिए दाग दिया गया था जैसा कि पहले वर्णित14 है। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण से अधिकांश ग्राफ्ट के भीतर मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं की निरंतर उपस्थिति का पता चला, लेकिन जेनोग्राफ्ट्स (चित्रा 3 ए) के बीच गिनती भिन्न होती है। चित्रा 3 बी एक सफल ग्राफ्ट (बाएं) से प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है और एक जो मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं (दाएं) को बनाए रखने में विफल रहा है। ग्राफ्ट के केंद्र से लिए गए हेमटोक्सिलिन और ईओसिन-दाग (एच एंड ई) वर्गों के विश्लेषण से 35 और 50 दिन के समय बिंदुओं (चित्रा 4) दोनों के लिए मानव डर्मिस और एपिडर्मिस से बनी बरकरार, गैर-विकृत त्वचा का पता चला।

Figure 1
चित्र 1: सर्जरी के बाद माउस को बैंड करने की विधि। एनेस्थीसिया के तहत माउस को पेट्रोलाटम धुंध और पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग में कसकर लपेटा जाता है। (ए) पेट्रोलाटम धुंध को सर्जिकल घाव से थोड़ा बड़ा क्षेत्र पर रखा जाता है। (बी) पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग तैयार की जाती है: एक लंबी पट्टी को पेट्रोलाटम धुंध की तुलना में थोड़ा चौड़ा काटा जाता है। पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के चिपकने वाले पक्ष को कवर करने वाला बैकिंग आंशिक रूप से हटा दिया जाता है। (सी) फिल्म के चिपकने वाले पक्ष को माउस के पीछे मजबूती से दबाया जाता है, जिससे फिल्म के सामने के छोर पर एक इंच जगह बच जाती है। (D) माउस को उसकी पीठ पर चालू किया जाता है। फिल्म के ओवरहैंगिंग फ्रंट हिस्से को माउस पर दबाया जाता है, और बैकिंग को हटा दिया जाता है। (ई) माउस को फिल्म में कसकर लपेटा जाता है, और शेष समर्थन को हटा दिया जाता है क्योंकि माउस लपेटा जाता है। (एफ) माउस को ड्रेसिंग में सफलतापूर्वक लपेटा जाता है, और इसके हाथ और पैर असीमित होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: प्रत्यारोपण के बाद 10 से 21 वें दिन तक प्रत्यारोपित जानवरों से प्रतिनिधि छवियां। (ए-सी) 10 वें दिन इष्टतम प्रत्यारोपण के साथ तीन अलग-अलग चूहे। (डी-ई) 21 वें दिन प्रत्यारोपण के साथ दो अलग-अलग चूहे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ग्राफ्टेड त्वचा में प्रतिरक्षा कोशिका चिमेरिज्म। जेनोग्राफ्ट्स से मानव प्रतिरक्षा कोशिका वसूली का फ्लो साइटोमेट्री डेटा। डेटा को सिंगलेट, लाइव, मानव सीडी 45 + माउस सीडी 45 की घटनाओं पर गेट किया जाता है। (ए) दो स्वतंत्र प्रयोगों से बरामद कोशिकाओं की संख्या (लाइव ह्यूमन सीडी 45 + इवेंट्स)। (बी) मानव प्रतिरक्षा डिब्बे (दाएं) के असफल रखरखाव के साथ ग्राफ्ट की तुलना में एक सफल ग्राफ्ट (बाएं) में मानव और माउस सीडी 45 + प्रतिरक्षा कोशिका धुंधला होने के प्रतिनिधि भूखंड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: 35 और 50 दिन में ग्राफ्टेड मानव त्वचा की हिस्टोलॉजी। ग्राफ्टेड त्वचा को 35 (ए) या 50 (बी) दिन चूहों से काटा गया था, जो 10% फॉर्मलिन में संरक्षित था, और पैराफिन-एम्बेडेड और हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के लिए सना हुआ था। (ए) एपिडर्मिस मध्यम हाइपरप्लासिया (एकैंथोसिस), मामूली हाइपर-ग्रैनुलोसिस और कॉम्पैक्ट ऑर्थोकेराटोसिस दिखाता है। पैपिलरी डर्मिस में, कभी-कभी पतला और भीड़भाड़ वाला केशिकाएं होती हैं। मेलानोसाइट्स और मेलेनिन वर्णक एपिडर्मिस की बेसल परत में मौजूद हैं। डर्मिस मध्यम सेलुलर है और यह मोटे अंडाकार फाइब्रोब्लास्ट से बना होता है जिसमें पीला सिंकेटियल साइटोप्लाज्म और बिखरे हुए लिम्फोसाइट्स होते हैं। (बी) एपिडर्मिस में कॉर्निफाइड परत में स्तरीकृत स्क्वैमस एपिथेलियम, बास्केट-बुनाई ऑर्थोकेराटोसिस शामिल है, और यह सामान्य मोटाई का है। मेलानोसाइट्स और मेलेनिन वर्णक एपिडर्मिस की बेसल परत में मौजूद हैं। डर्मिस अंडाकार फाइब्रोब्लास्ट और थोड़ा बढ़ा हुआ बाह्य मैट्रिक्स जमाव दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: जेनोग्राफ्ट अध्ययन के लिए अपनाए गए प्रोटोकॉल की समयरेखा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

माउस जेनोग्राफ्ट त्वचा प्रत्यारोपण मॉडल विवो सेटिंग14 में मानव त्वचा प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को यंत्रवत रूप से विच्छेदित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। सफल त्वचा जेनोग्राफ्ट प्रत्यारोपण चूहों और त्वचा के नमूनों और चूहों की उचित तैयारी और सड़न रोकनेवाला कृंतक सर्जरी विधियों के पालन पर निर्भर करताहै। प्रत्यारोपण से पहले निरंतर ऊतक स्वास्थ्य सुनिश्चित करने के लिए मीडिया (जैसे बाँझ खारा) में ठंडे तापमान पर त्वचा के नमूनों का तेजी से ठंडा होना और उचित भंडारण महत्वपूर्ण है। डर्माटोम जैसे उपकरण का उपयोग करके विभाजित मोटाई वाले नमूनों का संग्रह, चूहों के बीच नमूना गहराई में स्थिरता की अनुमति देता है और ग्राफ्ट अस्तित्व में सुधार के लिए मेजबान से पोषक तत्वों के प्रावधान कोबढ़ाता है। एपिडर्मल स्लॉइंग के साथ ग्राफ्ट अखंडता का नुकसान देखा जा सकताहै, विशेष रूप से बाधित रक्त आपूर्ति के साथ पूर्ण मोटाई वाले ग्राफ्ट में। सर्जरी के माध्यम से और बाद में माउस के अस्तित्व को बाँझ तकनीक, सर्जरी के दौरान और बाद में गर्मी का प्रावधान, और सर्जिकल समय को कम करने वाली तकनीकों द्वारा सहायता प्राप्त होती है, जैसे कि सर्जिकल गोंद15 का उपयोग करना। प्रत्यारोपण के बाद एंटी-जीआर 1 का प्रशासनग्राफ्ट सर्वाइवल को बढ़ावा देने के लिए इम्यूनोडेफिशिएंसी मेजबान में शेष माउस प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के दमन की अनुमति देता है। ये विधियां जेनोग्राफ्ट प्रत्यारोपण मॉडल के दौरान माउस और ग्राफ्ट अस्तित्व की संभावना को बढ़ाती हैं और एक प्रयोग से दूसरे प्रयोग तक प्रयोगात्मक संख्या और प्रजनन क्षमता में सुधार करती हैं।

हालांकि बेहद उपयोगी, जेनोग्राफ्ट त्वचा प्रत्यारोपण मॉडल के लिए कुछ प्रमुख सीमाएं हैं, जैसा कि प्रदर्शित किया गया है। सबसे पहले, ग्राफ्ट एक भड़काऊ वातावरण में मौजूद है, सबसे अधिक संभावना क्षणिक इस्किमिया और म्यूरिन माइलॉयड कोशिकाओं के साथ मानव ग्राफ्टेड ऊतक की घुसपैठ के लिए द्वितीयक है। इस प्रकार, यह एक स्थिर अवस्था में मानव त्वचा को प्रतिबिंबित नहीं करता है और सभी मानव भड़काऊ त्वचा रोगों को पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं कर सकता है। घाव वाली त्वचा से नैदानिक बायोप्सी ग्राफ्टिंग करके मानव भड़काऊ विकारों का अध्ययन करना एक वैकल्पिक रणनीति है, लेकिन उपलब्ध बायोप्सी की संख्या में सीमाएं और ग्राफ्टिंग गहराई का असंगत नियंत्रण इस विकल्प को कम अनुकूल बनाता है। इसके अतिरिक्त, जेनोग्राफ्ट प्रत्यारोपण मानव परिधीय प्रतिरक्षा वास्तुकला को पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं। मानव कोशिकाओं के साथ माउस परिधि का पुनर्गठन भी चेतावनी दे सकता है, क्योंकि एनएसजी माउस लिम्फोइड संरचना मानव कोशिका एनग्राफमेंट से पहले एट्रोफिक है; इससे कुछ सेटिंग्स10,17 में अधिमान्य सेल चयन हो सकता है। इसके अतिरिक्त, त्वचा के नमूनों से त्वचा के एनग्राफमेंट और प्रतिरक्षा कोशिका वसूली माउस से माउस में भिन्न हो सकती है, यहां तक कि उपचार की अनुपस्थिति में भी। समूहों के बीच लगातार अंतर का निरीक्षण करने के लिए इस मॉडल के लिए प्रति स्थिति कम से कम 10 प्रतिकृतियों की सिफारिश की जाती है। परख की उचित अवधि को प्रयोगात्मक प्रश्न के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि प्रत्यारोपण के बाद शुरुआती हफ्तों में ग्राफ्ट उपचार और पुन: वैस्कुलराइजेशन होता है, और हस्तक्षेप का प्रभाव एनग्राफमेंट के चरण पर निर्भर हो सकता है।

इन कमियों के बावजूद, मानव जेनोग्राफ्ट त्वचा प्रत्यारोपण मॉडल विवो में बरकरार अंग में मानव त्वचा प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कुछ परखों में से एक बना हुआ है। जबकि ट्रांसजेनिक माउस मॉडल यंत्रवत मार्ग विच्छेदन की अनुमति दे सकते हैं, शरीर रचना विज्ञान, प्रतिरक्षा कोशिका संरचना और प्रमुख प्रतिरक्षा मार्गों में अंतर मानव रोग1 में अनुवाद को सीमित करता है। मानव-व्युत्पन्न कोशिकाओं, त्वचा ऑर्गेनॉइड मॉडल और मानव ऊतक खोज अध्ययनों की पूर्व विवो संस्कृति का वैकल्पिक रूप से उपयोग किया जा सकता है, लेकिन सीमाओं के अधीन भी हैं, जिसमें प्रतिरक्षा कोशिका नेटवर्क का विघटन और बरकरार ऊतक18,19 से प्रतिरक्षा कोशिकाओं का प्रवेश शामिल है। इसलिए, जेनोग्राफ्ट त्वचा प्रत्यारोपण मॉडल विवो सेटिंग में प्रीक्लिनिकल में सूजन के लिए चिकित्सीय उम्मीदवारों और मानव त्वचा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण विधि बनी हुई है।

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Disclosures

एमडीआर TRex Bio और Sitryx के संस्थापक हैं। एमडीआर और एमएमएल को सिट्रिक्स, क्यू 32 और टीआरईएक्स बायो से अनुसंधान वित्त पोषण प्राप्त होता है।

Acknowledgments

इस काम को TRex Bio से प्रायोजित अनुसंधान समझौतों और एनआईएच (1R01AR075864-01A1) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जेएमएम कैंसर रिसर्च सोसाइटी (अनुदान 26005) द्वारा समर्थित है। हम एनआईएच पी 30 डीके063720, एस 10 1 एस 10 ओडी021822-01, और एस 10 1 एस 10 ओडी018040-01 अनुदान द्वारा समर्थित पार्नासस फ्लो साइटोमेट्री कोर को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Buffered Formalin Fisher SF100-20 Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) Thermo Fischer 56-0451-82 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5 BioXcell BE0075 Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3) BD Biosciences 340939 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) eBioscience 47-9956-42 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches VWR  89140-800 For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 Biolegend 317438 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) Biolegend 301042 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) Biolegend 317328 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL Covetrus 059122 Analgesia
Carprofen 50 mg/mL Zoetis NADA # 141-199 Analgesia
Collagenase Type IV Worthington 4188 Skin digestion
D42 Dermatome blade Humeca 5.D42BL10 dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42 Humeca 4.D42 dermatome
Disposable Scalpel Bard-Parker 371610 skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 Cole-Parmer UX-10915-03 To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors medicon 02.04.10 sample preparation and mouse dissection
DNAse Sigma-Aldrich DN25-1G Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent eBioscience 00-5521-00 Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) eBioscience 48-4776-42 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers Kent CL8787-KIT hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin Fisher Scientific 6765040 H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin Fisher Scientific 6765015 H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30) Tonbo Biosciences 35-0459-T100 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps  medicon 07.60.07 sample preparation and mouse dissection
Gauze Fisherbrand 22-362-178 Sample preparation
Heating lamp Morganville Scientific HL0100 Post-surgical care
Heating pads 4" x 10" Pristech 20415 Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes BD 329410 drug administration
Isoflurane United States Pharmacopeia (USP)  NDC 66794-013-25 Anesthesia 
Isoflurane machine VetEquip 911103 Anesthesia
Nair for Men Nair ‎ 10022600588556 hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment Dechra  NDC 17478-235-35 eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 Mice
Paper towels Kleenex 100848 May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12 Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) BD Biosciences 557938 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) BD Biosciences 561283 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) eBioscience 46-1529-42 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x eBioscience 00-8333-56 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm Corning 430597 Sample storage
Plastic Wrap Fisherbrand 22-305-654 Site preparation
Providone-Iodine Swab stick PDI S41350 Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) Se Lab Group Inc NC9066511  For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups Fisher Scientific 22-150-266 sample storage
Sterile alcohol prep pad Fisherbrand 22-363-750 skin preparation
Sterile PBS Gibco 14190-144 Media for sample storage
Sterile saline Hospira NDC 0409-4888-02 For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”  3M 1626 transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”  Kendall 414600 wound dressing
Violet 510 Ghost Dye  Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Flow cytometry analysis: Viability dye

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 184
<em>विवो में</em> मानव प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में हेरफेर करने के लिए जेनोग्राफ्ट स्किन मॉडल
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Moss, M. I., Pauli, M., Moreau, J.… More

Moss, M. I., Pauli, M., Moreau, J. M., Cohen, J. N., Rosenblum, M. D., Lowe, M. M. Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo. J. Vis. Exp. (184), e64040, doi:10.3791/64040 (2022).

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