Summary
يصف البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لإعداد نموذج جلدي مصاب خارج الجسم الحي مصاب بالمكورات العنقودية الذهبية. يحاكي هذا النموذج عالي الإنتاجية العدوى في الجسم الحي بشكل أفضل مقارنة بتقنيات علم الأحياء الدقيقة التقليدية ويقدم للباحثين منصة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لاختبار فعالية مضادات الميكروبات الناشئة.
Abstract
يعد تطوير مضادات الميكروبات عملية مكلفة مع معدلات نجاح منخفضة بشكل متزايد ، مما يجعل المزيد من الاستثمار في أبحاث اكتشاف مضادات الميكروبات أقل جاذبية. يمكن جعل اكتشاف الأدوية المضادة للميكروبات وتسويقها لاحقا أكثر ربحا إذا كان من الممكن تنفيذ نهج الفشل السريع والرخيص في مراحل تحسين الرصاص حيث يتمتع الباحثون بسيطرة أكبر على تصميم الأدوية وصياغتها. في هذه المقالة ، تم وصف إعداد نموذج جلد مصاب بالغنام خارج الجسم الحي مصاب بالمكورات العنقودية الذهبية ، وهو بسيط وفعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية وقابل للتكرار. تحاكي الفسيولوجيا البكتيرية في النموذج أنه أثناء العدوى يعتمد الانتشار البكتيري على قدرة العامل الممرض على إتلاف الأنسجة. يتم التحقق من إنشاء عدوى الجرح من خلال زيادة في عدد البكتيريا القابلة للحياة مقارنة باللقاح. يمكن استخدام هذا النموذج كمنصة لاختبار فعالية مضادات الميكروبات الناشئة في مرحلة تحسين الرصاص. يمكن القول إن توافر هذا النموذج سيوفر للباحثين الذين يطورون مضادات الميكروبات نموذجا سريعا ورخيصا ، مما سيساعد على زيادة معدلات النجاح في التجارب اللاحقة على الحيوانات. وسيسهل النموذج أيضا الحد من استخدام الحيوانات وتحسينه لأغراض البحوث، وفي نهاية المطاف يمكن من ترجمة أسرع وأكثر فعالية من حيث التكلفة لمضادات الميكروبات الجديدة لالتهابات الجلد والأنسجة الرخوة إلى العيادة.
Introduction
تعد الالتهابات الجلدية قضية عالمية مهمة ، مع تكاليف اقتصادية كبيرة لمقدمي الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم. يلعب تطور مقاومة الأدوية المتعددة وتكوين الأغشية الحيوية بواسطة مسببات الأمراض دورا رئيسيا في انتشار الجروح غير الملتئمة1،2،3،4. نتيجة لذلك ، تعد التهابات الجلد والأنسجة الرخوة أحد الأسباب الأكثر شيوعا لتمديد فترة الاستشفاء وإعادة القبول اللاحقة5. التأخير في التئام الجروح مكلف لكل من المرضى ومقدمي الرعاية الصحية ، حيث تشير بعض التقديرات إلى أن حوالي 6.5 مليون مريض يتأثرون سنويا في الولايات المتحدة. في المملكة المتحدة ، تؤدي الالتهابات الجلدية والمضاعفات المرتبطة بها إلى ما يقرب من 75000 حالة وفاة سنويا2،4،6.
المكورات العنقودية الذهبية (S. aureus) هي ممرض هائل للجرح يتم عزله بشكل متكرر عن جروح المرضى 2,7. زاد معدل ظهور مقاومة الأدوية المتعددة بشكل كبير في 2000s. خلال هذا الوقت ، كان حوالي 60٪ من التهابات الجلد البكتيرية الحادة والتهابات بنية الجلد إيجابية للثقافة لمقاومة الميثيسيلين 1. يشير العدد المتزايد من السلالات المقاومة للأدوية المتعددة بين المكورات العنقودية ، وفي الواقع مسببات الأمراض الأخرى ، خلال العقود الماضية 2 إلى الحاجة الملحة للتطوير السريع للمضادات الحيوية مع طرق جديدة للعمل يمكنها التغلب على المقاومة.
ومع ذلك ، منذ أوائل عام 2000 ، سيطرت على برامج اكتشاف المضادات الحيوية أوقات نمو أطول ومعدلات نجاح منخفضة ، حيث دخلت 17٪ فقط من المضادات الحيوية الجديدة التجارب السريرية في الولايات المتحدة على موافقة السوق8. يشير هذا إلى وجود تباين بين نتائج الاختبارات المختبرية للمضادات الحيوية الناشئة ونتائجها السريرية . يمكن القول أن هذا التباين يرجع إلى حد كبير إلى الاختلافات في فسيولوجيا البكتيريا أثناء العدوى في الجسم الحي وخلال الطرق الميكروبيولوجية التقليدية عند اختبار فعالية المضادات الحيوية في المراحل قبل السريرية في المختبر . لذلك ، هناك حاجة إلى طرق معملية جديدة أكثر تمثيلا لعلم وظائف الأعضاء البكتيرية أثناء العدوى لتحسين معدلات النجاح في برامج اكتشاف المضادات الحيوية.
تشمل الطرق الحالية لدراسة الالتهابات الجلدية دراسات على الحيوانات الحية (مثل الفئران) ، ونماذج الجلد خارج الجسم الحي (مثل الخنازير) ، ونماذج الجلد المهندسة بالأنسجة ثلاثية الأبعاد (مثل الإنسان) 9،10،11،12. يتم تنظيم الدراسات في الحيوانات الحية بشكل صارم ولها إنتاجية منخفضة نسبيا. في النماذج الحيوانية ، تسبب الجروح والعدوى ضائقة كبيرة للحيوانات وتثير مخاوف أخلاقية. تتطلب نماذج الجلد البشري ، خارج الجسم الحي أو الأنسجة المهندسة ، موافقة أخلاقية ، والامتثال للتشريعات المحلية والعالمية (قانون الأنسجة البشرية ، إعلان هلسنكي) ، وهناك صعوبة في الحصول على الأنسجة ، مع بعض الطلبات التي تستغرق سنوات للوفاءبها 13,14. كلا النوعين من النماذج كثيفة العمالة ويتطلبان خبرة كبيرة لضمان النجاح التجريبي. تتطلب بعض نماذج عدوى الجلد خارج الجسم الحي الحالية أقراصا وإضافات ملقحة مسبقا لسرير الجرح لتمكين العدوى. على الرغم من أن هذه النماذج مفيدة بشكل لا يصدق ، إلا أن هناك قيودا في عملية العدوى حيث تحد المواد المضافة من استخدام سرير الجرح كمصدر للمغذيات10،15،16،17. لا يستخدم النموذج الموصوف في هذه الدراسة أي إضافات إلى سرير الجرح ، مما يضمن أن أمراض العدوى وعدد الخلايا القابلة للحياة هي نتيجة للاستخدام المباشر لسرير الجرح كمصدر وحيد للمغذيات.
نظرا للحاجة إلى طرق مختبرية جديدة ، تم تطوير نموذج جديد عالي الإنتاجية خارج الجسم الحي للعدوى الجلدية لاستخدامه في تقييم فعالية المضادات الحيوية الناشئة. تواجه دراسات عدوى الجلد العديد من التحديات - التكاليف المرتفعة ، والمخاوف الأخلاقية ، والنماذج التي لا تظهر صورة كاملة20,21. تسمح نماذج Ex vivo ونماذج 3D explant بتصور أفضل لعملية المرض ويمكن أن يكون للعلاجات تأثير من نموذج أكثر صلة سريريا. هنا ، يتم وصف إعداد نموذج جديد لجلد الأغنام ، وهو بسيط وقابل للتكرار وذو صلة سريريا وله إنتاجية عالية. تم اختيار جلد الأغنام لأن الأغنام هي واحدة من الثدييات الكبيرة التي يشيع استخدامها لنمذجة الاستجابات للعدوى في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، فهي متاحة بسهولة من المسالخ ، مما يضمن إمدادا ثابتا بالجلد للبحث ، ولا يتم حرق جثثها ، مما يضمن جودة الأنسجة الجيدة. استخدمت هذه الدراسة S. aureus كممرض نموذجي. ومع ذلك ، فإن النموذج يعمل بشكل جيد مع الكائنات الحية الدقيقة الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استخدام رؤوس الحملان من مسلخ R.B Elliott و Son كمصدر لعينات الجلد في هذا المشروع. تم ذبح جميع الحملان للاستهلاك كغذاء. بدلا من التخلص من الرؤوس ، تم إعادة توجيهها للبحث. لم تكن الموافقة الأخلاقية مطلوبة حيث تم الحصول على الأنسجة من النفايات التي تم التخلص منها من المسالخ.
1. التعقيم
- تطهير الملقط قبل جمع الرؤوس عن طريق أخذ ملقط نظيف وإجراء التعقيم بالحرارة الجافة في فرن على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. الأوتوكلاف جميع الأواني الزجاجية على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
- تنفيذ جميع الأعمال الموصوفة داخل خزانة فئة علم الأحياء الدقيقة 2. تحضير جميع الكواشف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. جمع العينات
- في المسلخ ، تم ذبح حملان Swaledale عن طريق الصعق باستخدام الكهرباء أو مسدس الترباس الأسير وطردها. جمع رؤوس الضأن لا يزيد عن 4 ساعات بعد الذبح.
3. تحضير الرؤوس
- قم بتطهير قسم الجبهة من الحمل عن طريق سكب ما يقرب من 100 مل من محلول ثاني أكسيد الكلور 200 جزء في المليون على منطقة العينة. احلق قسم الجبهة من الرأس باستخدام كليبرز كهربائي واغسل المنطقة ب 200 مل من محلول ثاني أكسيد الكلور 200 جزء في المليون.
- امسح المنطقة بالإيثانول واللفائف الزرقاء وقم بتغطية منطقة العينة بكريم إزالة الشعر لمدة 35 دقيقة. اكشط كريم إزالة الشعر برفق باستخدام أداة كشط وقم بتقييم منطقة العينة. إذا بقيت كمية كبيرة من الشعر ، كرر عملية إزالة الشعر.
- استخدم 200 مل أخرى من محلول ثاني أكسيد الكلور لشطف المنطقة ، ثم اشطفها بالإيثانول وامسحها بلفافة زرقاء.
- باستخدام لكمة خزعة معقمة 8 مم ، قم بقطع عينات الجلد 8 مم من المنطقة المعدة. قم بإزالة العينات باستخدام ملقط معقم ومشرط مكون من 15 شفرة ، مما يضمن إزالة جميع الدهون الجلدية.
- ضع العينات في وعاء معقم سعة 0.5 لتر مملوء بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم انقلها إلى أنابيب معقمة سعة 50 مل مع 50 مل من محلول ثاني أكسيد الكلور 200 جزء في المليون ، واقلبها مرتين ، واتركها للتعقيم لمدة 30 دقيقة.
- أخرج العينات من محلول ثاني أكسيد الكلور واغسلها بوضعها في أنبوب سعة 50 مل مملوء ب 40 مل من PBS المعقم. بمجرد غسلها ، ضع كل عينة جلد فردية في بئر منفصل من لوحة 24 بئر.
- أضف 350 ميكرولتر من الوسط الدافئ مسبقا مع الحفاظ على العينة في واجهة الهواء والسائل. تكوين الوسائط على النحو التالي: وسائط MK (متوسطة 199 مع أملاح هانكس ، L-glutamate ، و 1.75 مجم / مل بيكربونات الصوديوم) و Ham's F12 بنسبة 1: 1 ، مع FBS مضاف (10٪ v / v) ، EGF (10 نانوغرام / مل) ، الأنسولين (5 ميكروغرام / مل) ، البنسلين الستربتومايسين (100 وحدة / مل) ، والأمفوتريسين B (2.5 ميكروغرام / مل).
- أغلق الألواح المكونة من 24 بئرا بختم لوحة منفذة للغاز واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة أنسجة CO2 مرطبة بنسبة 5٪ لمدة تصل إلى 24 ساعة.
4. صيانة عينات الجلد
- بعد الحضانة ، قم بإزالة وسط الثقافة وشطف العينات في 500 ميكرولتر من PBS المعقمة. أضف وسائط خالية من المضادات الحيوية إلى كل عينة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة أنسجة CO2 مرطبة بنسبة 5٪ لمدة 24 ساعة لإزالة المضادات الحيوية المتبقية في العينة.
- إذا ظهرت عكارة أو عدوى فطرية في الوسائط الخالية من المضادات الحيوية بعد 24 ساعة ، فتخلص من العينة.
5. تحضير اللقاح
- تحضير أنبوب 50 مل مع 10 مل من مرق الصويا tryptic معقمة. خذ صفيحة أجار طازجة من S. aureus واستخدم مسحة لنقل عدة مستعمرات إلى المرق. احتضان لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة.
- جهاز طرد مركزي بسرعة 4000 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من PBS المعقم. كرر مرتين لضمان الغسيل الكافي للخلايا.
- اضبط اللقاح على 0.6 OD600 في PBS المعقم. قم بتأكيد حمل اللقاح عن طريق إجراء عدد يدوي قابل للتطبيق.
6. إصابة عينات الجلد
- قم بإعداد صفيحة جديدة من 24 بئرا مع 400 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المضادات الحيوية التي تم تسخينها مسبقا وأضف إدخالات 24 بئرا باستخدام ملقط معقم.
- قم بإزالة الوسائط من عينات الجلد ، واغسلها ب 500 ميكرولتر من PBS المعقم ، وقم بإزالة الغسيل. استخدم ملقط معقم لتثبيت العينة برفق في قاع البئر.
- استخدم خزعة مثقوبة 4 مم لعمل رفرف جرح مركزي ، يخترق إلى عمق تقريبي من 1-2 مم. بعد ذلك ، استخدم مشرطا مكونا من 15 شفرة وملقط أنسجة معقم مسنن لإزالة الطبقة العليا من رفرف الجرح. قد يؤثر التباين في أبعاد الجرح على نتيجة العدوى ووحدات تشكيل مستعمرة نقطة النهاية (CFU).
- بمجرد إصابة جميع العينات ، قم بنقلها إلى إدخالات 24 بئرا باستخدام ملقط معقم. ماصة 15 ميكرولتر من اللقاح البكتيري في سرير الجرح. ثم احتضنها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة أنسجة CO2 مرطبة بنسبة 5٪.
- إذا كانت فترات الحضانة الأطول ضرورية ، فقم بإزالة الوسائط واستبدالها بوسائط جديدة كل 24 ساعة واحتضانها في نفس الظروف.
7. تحديد الحمل البكتيري
- قم بإزالة الوسائط من قاع الآبار. باستخدام ملقط معقم ، انقل كل عينة إلى أنبوب منفصل سعة 50 مل مملوء ب 1 مل من PBS المعقم.
- استخدم خالطا ذو رأس رفيع لتجانس سطح العينة. احرص على التأكد من أن سرير الجرح على اتصال مباشر بطرف الخالط.
- تجانس كل عينة لمدة 35 ثانية على متوسط / مرتفع. يقوم الخالط بفصل البكتيريا عن سطح سرير الجرح للسماح بتعداد الحمل البكتيري.
- بمجرد معالجة جميع العينات ، دوامة كل عينة ، بدورها ، قبل سحب العينات. هذا لضمان خلط التجانس البكتيري.
- ماصة 20 ميكرولتر من التجانس الدوامي في البئر المقابل للوحة 96 بئرا تحتوي على 180 ميكرولتر من PBS المعقمة.
- قم بتخفيف كل عينة متجانسة بشكل تسلسلي إلى 1 × 10−7 وماصة 10 ميكرولتر من التجانس المخفف على صفيحة أجار الصويا التربتيك في ثلاث نسخ.
- احتضان صفيحة الآجار لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم احسب عدد المستعمرات لتحديد CFU لكل عينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان تحديد طريق لتعقيم الجلد قبل إعداد نموذج عدوى الجرح أمرا صعبا. يكمن التحدي في تعقيم الجلد دون الإضرار بطبقات الجلد المختلفة ، والتي قد يكون لها عواقب غير مقصودة في نتيجة العدوى. لتحديد نظام تعقيم مناسب ، تمت تجربة علاجات مختلفة لفترات زمنية متفاوتة ، كما هو موضح في الجدول 1. تم تسجيل التلوث على أنه تطور التعكر بعد 48 ساعة في وسط MK المستخدم للحفاظ على عينات الجلد. تمت مراقبة سلامة الأنسجة عن طريق الأنسجة متبوعة بالتلوين بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) مباشرة بعد العلاج (الشكل 1). أثبت العلاج لمدة 30 دقيقة بثاني أكسيد الكلور أنه الأكثر فعالية في تعقيم أنسجة الجلد بشكل متكرر مع الحفاظ على سلامة الأنسجة.
في الإعداد التجريبي ، يتم وضع الأنسجة المعقمة المصابة في الغرفة القمية لإدخال 24 بئرا في واجهة الهواء السائل (الشكل 2 أ). تمت محاولة تقنيتين مختلفتين للجرح - تقنية إزالة السديلة ، حيث يتم جرح الأنسجة بواسطة أداة خزعة مثقوبة ويتم إزالة الطبقة العليا من الأنسجة المصابة باستخدام مزيج من مشرط ذو 15 شفرة وملقط أنسجة allis معقم ذو أسنان ، وتقنية خدش ، حيث يتم جرح الأنسجة بواسطة أداة خزعة مثقوبة وحدها. على الرغم من أن نموذج الصفر كان يحتوي على متوسط أعلى لعدد وحدات CFU بعد 24 ساعة ، إلا أن النتائج كانت متغيرة. أنتجت تقنية إزالة السديلة نتائج أكثر اتساقا (الشكل 2C). بعد 48 ساعة ، تم استرداد ما يقرب من 100 مرة من CFUs البكتيرية من الأنسجة المصابة مقارنة باللقاح (الشكل 2D). واعتبر هذا مؤشرا على نجاح الإصابة. كان هناك فيلم أبيض في سرير الجرح واضحا على الأنسجة بعد 48 ساعة من الإصابة (الشكل 2 ب). أشارت أقسام الأنسجة الملطخة بالجرام من الأنسجة المصابة إلى وجود خلايا S. aureus في سرير الجرح (الشكل 2E ، F). يتم توفير أقسام الأنسجة الملطخة بالجرام للأنسجة غير المصابة كمقارن (الشكل 2G ، H).
من رأس خروف واحد ، يمكن الوصول إلى قسم 100 سم2 (10 سم × 10 سم) بشكل واقعي. بالنظر إلى أن كل رقعة من الجلد يتم ثقبها من الجبهة باستخدام خزعة دائرية قطرها 8 مم ، يمكن الحصول على ما يقرب من 100 بقعة جلدية من جبين خروف واحد في الأسبوع. إن شراء المزيد من رؤوس الحملان يزيد بشكل متناسب من عدد عينات الجلد التي يمكن الحصول عليها في الأسبوع. ومن ثم ، يزعم أن الإجراء ذو إنتاجية عالية نسبيا. لهذه الدراسة ، تم الحصول على 24 عينة من الجلد بشكل روتيني في الأسبوع. تمت معالجة الجلد من رؤوس الحملان المختلفة كنسخ بيولوجية مكررة لحساب التباين المحتمل بين المتبرع والمتبرع. أثناء تحضير بقع الجلد (الخطوات 3.1-3.8) ، يكون استهلاك الوقت الرئيسي هو حضانة عينات الجلد لمدة 30 دقيقة في محلول ثاني أكسيد الكلور وانتظار 2 × 35 دقيقة لعلاج كريم إزالة الشعر. يستغرق استخدام الخزعة المثقوبة لتوليد 24 رقعة جلدية حوالي 15 دقيقة. هذه هي المرة التي من شأنها أن تتدرج خطيا إذا تم زيادة عدد بقع الجلد.
| مطهر | 10 دقائق | 30 دقيقة | 60 دقيقة |
| 1٪ مطهر سطح طبي عالي المستوى | F | P | P |
| مطهر متعدد الأغراض 1٪ | F | F | P |
| 3٪ بوفيدون | F | F | F |
| 5٪ بوفيدون | F | P | P |
| 10٪ بوفيدون | F | P | P |
| 70٪ إيثانول | F | P | P |
| الاشعه فوق البنفسجيه | F | F | F |
| 0.55٪ هيبوكلوريت | F | P | P |
| 200 جزء في المليون من ثاني أكسيد الكلور | F | P | P |
الجدول 1: تعقيم جلد الضأن الطازج. تم ترك كل عينة جلد في المطهر للوقت المحدد. F يدل على الفشل في تعقيم الأنسجة ، مع وجود تلوث بكتيري في وسائل الإعلام. P يدل على المرور ، مع عدم وجود تلوث بكتيري في وسائل الإعلام.
الشكل 1: علم الأنسجة لجلد الأغنام غير المصابة ex vivo المعالج بالمطهرات (صبغة H&E) عند تكبير 100x. (أ) التحكم في عينة الجلد مع العلاج لمدة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني. يمكن رؤية بعض سفك البشرة ، لكن البشرة لا تتعطل. (ب) جلد الأغنام المعالج بمطهر سطح طبي عالي المستوى بنسبة 1٪ لمدة 30 دقيقة. سفك البشرة (السهم الأسود) جنبا إلى جنب مع بعض الاضطراب في الطبقة الحبيبية (السهم الأزرق). (ج) جلد الأغنام المعالج ب 5٪ بوفيدون لمدة 30 دقيقة. يمكن رؤية تلف معتدل للأنسجة هنا ، مع تساقط البشرة في الطبقة القرنية (السهم الأسود). هناك الحد الأدنى من الاضطراب في طبقات البشرة الأساسية. (د) جلد الأغنام المعالج ب 10٪ بوفيدون لمدة 30 دقيقة. تضررت الطبقات العليا من البشرة ، مع وجود دليل على سفك (السهم الأسود) والتخفيف (السهم الأخضر). (ه) جلد الأغنام المعالج بمطهر متعدد الأغراض بنسبة 2٪ لمدة 30 دقيقة. يمكن ملاحظة أضرار جسيمة في العينة ، مع سفك البشرة بشكل كبير (السهم الأسود) والقضاء التام على الطبقة القرنية (السهم الأحمر). (و) جلد الأغنام المعالج ب 200 جزء في المليون من ثاني أكسيد الكلور لمدة 30 دقيقة. يمكن رؤية بعض سفك البشرة ، لكن البشرة سليمة. (ز) جلد الأغنام المعالج ب 0.6٪ هيبوكلوريت لمدة 30 دقيقة. يوجد تلف شديد في البشرة ، مع ارتفاع مستوى سفك البشرة (السهم الأسود) والقضاء على البشرة في الأماكن (السهم الأحمر). (ح) جلد الأغنام المعالج بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة. يمكن رؤية الأضرار التي لحقت البشرة ، مع سفك البشرة بشكل كبير (السهم الأسود). شريط المقياس هو 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: جلد الأغنام خارج الجسم الحي المصاب بالعقدية الذهبية. (أ) رسم تخطيطي للإعداد التجريبي. (ب) صور لجلد الأغنام خارج الجسم الحي قبل الإصابة (الصورة اليسرى) وبعد الإصابة بعد 48 ساعة (الصورة اليمنى). لاحظ الفيلم الأبيض الموجود بعد حضانة 48 ساعة في الأنسجة المصابة ، وهو غائب في الأنسجة غير المصابة. (ج) اختبار تأثير طرق الجرح المختلفة على عدد وحدات تشكيل المستعمرة النهائية (CFU) بعد التجانس. إزالة رفرف (ن = 6) وخدش (ن = 9) مصاب بالعقدية الذهبية لمدة 24 ساعة. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. يشير إلى قيمة p < 0.0001. (د) اختبار تأثير أوقات الحضانة على عدد CFU بعد التجانس. حضانة 24 ساعة (ن = 6) و 48 ساعة حضانة (ن = 12). تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. يشير إلى قيمة p < 0.0001. (ه، واو) صور تمثيلية للتحليل النسيجي المرضي لجلد الأغنام المصاب بعد 48 ساعة من العدوى بصبغة جرام معدلة (E) عند تكبير 100x (شريط مقياس 200 ميكرومتر). يشير المربع إلى المساحة المكبرة في (F) عند تكبير 1000x (شريط مقياس 50 ميكرومتر). الأسهم السوداء تشير إلى البكتيريا. (ز، ح) صور تمثيلية للتحليل النسيجي المرضي لجلد الأغنام غير المصاب بعد فترة 48 ساعة (تحكم) مع صبغة gGram معدلة (G) عند تكبير 100x (شريط مقياس 200 ميكرومتر). يشير المربع إلى المساحة المكبرة في (H) عند تكبير 1000x (شريط مقياس 50 ميكرومتر). تم إجراء التحليل الإحصائي باعتباره ANOVA أحادي الاتجاه. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد تطوير مضادات الميكروبات مشروعا مهما ولكنه مكلف وتقدر تكلفته بحوالي مليار دولار ويستغرق حوالي 15 عاما لإكماله. يتم إجراء أكثر من 90٪ من اكتشاف الأدوية المضادة للميكروبات والدراسات قبل السريرية لفعالية الأدوية المضادة للميكروبات من قبل باحثين أكاديميين وشركات صغيرة إلى متوسطة تضم عادة أقل من 50 موظفا22. هذه الفرق مقيدة ماليا للغاية ، مما يجعل فشل جزيئات الرصاص في المراحل اللاحقة من البحث الانتقالي كارثيا. إن الزيادة في مقاومة مضادات الميكروبات تفوق تطوير مضادات الميكروبات الجديدة ، مما يزيد من تكثيف الحاجة إلى الإشراف على الاستثمار المحدود بالفعل في أبحاث مضادات الميكروبات بشكل مسؤول23.
يميل التباين في فسيولوجيا البكتيريا بين العدوى في الجسم الحي والثقافات المختبرية في المختبر إلى المبالغة في تقدير فعالية مضادات الميكروبات للضربات خلال مرحلة تحديد الرصاص. وتسهم هذه المبالغة في التقدير في ارتفاع معدلات الاستنزاف التي شوهدت خلال المراحل اللاحقة من الترجمة. إن توفر منصات اختبار فعالية مضادات الميكروبات في المختبر التي تدمج البكتيريا مع علم وظائف الأعضاء الذي يحاكي بشكل أفضل تلك الموجودة أثناء العدوى في الجسم الحي سيمكن من تقدير أكثر دقة لفعالية مضادات الميكروبات وتزويد الباحثين بتحكم أكبر في تحسين الرصاص دون الاعتماد على تجارب حيوانية باهظة الثمن ومنظمة بإحكام. كما ستقلل هذه النماذج من معدلات الاستنزاف خلال المراحل اللاحقة من الترجمة وقد تجعل اكتشاف الأدوية المضادة للميكروبات أكثر جاذبية للاستثمار.
يعد نموذج عدوى جلد الأغنام الموصوف هنا أداة مفيدة ستزود الباحثين بنموذج ذي صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر لجرح مصاب لاختبار فعالية التركيبات الموضعية المضادة للميكروبات الناشئة في المراحل قبل السريرية. على عكس غالبية نماذج العدوى خارج الجسم الحي الموصوفة في الأدبيات العلمية10،15،24،25،26،27،28 ، في هذا النموذج ، لا يتم استكمال مسببات الأمراض المعرضة للأنسجة خارج الجسم الحي بوسائط الثقافة أثناء العدوى. يعتمد انتشار مسببات الأمراض والعدوى اللاحقة على قدرة الكائن الحي على إتلاف الأنسجة. لذلك ، فإن فسيولوجيا مسببات الأمراض في هذا النموذج ترتبط ارتباطا وثيقا بتلك الموجودة أثناء العدوى في الجسم الحي مقارنة بالثقافات الميكروبيولوجية التقليدية. يتم الحصول على عدوى قابلة للتكاثر بدرجة عالية من هذا النموذج ، كما تم الحكم عليها من خلال عدد وحدات CFU المستردة من الأنسجة بعد الحضانة.
مع وجود عدد كبير من مكافئات الجلد البشري ونماذج الجروح البشرية والخنازير خارج الجسم الحي ، يمكن القول بشكل سطحي أن استخدام أنسجة الأغنام في هذا النموذج يمثل قيدا. ومع ذلك ، فإن الأغنام هي من بين مجموعة الحيوانات الكبيرة المستخدمة كنماذج للعدوى في الجسم الحي29،30،31. علاوة على ذلك ، تم استخدام الأغنام كبدائل للبشر في أبحاث المناعة وتطوير اللقاحات ، مما يشير إلى أن استجاباتهم المناعية مماثلة لتلك الخاصة بالبشر32. تتشابه عملية إصلاح الأنسجة أثناء التئام الجروح في الثدييات الكبيرة ، بما في ذلك الأغنام والبشر33،34 ، وقد تم اقتراح التدخلات لتحسين التئام الجروح التي تم إثباتها بنجاح في الأغنام للترجمة إلى البشر 35،36،37. لذلك ، فإن استخدام جلد الأغنام خارج الجسم الحي في نموذج الجرح هذا ليس قيدا. علاوة على ذلك ، يمكن الحكم على نموذج الأغنام هذا ليكون بديلا موثوقا به للنماذج التي تتضمن جلد الإنسان أو الخنزير للأسباب التالية. توافر الجلد البشري محدود وذو جودة متغيرة عند توفره38. تتطلب البشرة البشرية المهندسة بالأنسجة ومكافئات الجلد الحية تحسينات في ظروف زراعتها لضمان التكاثر في فسيولوجيا الأنسجة39. على الرغم من أن جلد الخنزير يمكن الوصول إليه أكثر من جلد الإنسان ، إلا أن جلد الخنزير المتاح على نطاق واسع يتم حرقه كجزء من معالجة الذبيحة في المسلخ ، مما يزيل البشرة10. من التجربة ، فإن جلد الخنزير غير المحروق أقل توفرا بسهولة من المسالخ.
في جميع أنحاء البروتوكول الموصوف هنا ، هناك خطوات حاسمة تضمن نجاح النموذج. تتضمن الخطوة الأكثر أهمية تعقيم الأنسجة بعد الحصاد. يجب خلط محلول ثاني أكسيد الكلور مع عينات الأنسجة ، ويجب السماح بوقت تلامس مدته 30 دقيقة لتطهير الأنسجة بشكل كاف وإزالة الملوثات. علاوة على ذلك ، عند إعداد هذه التجربة ، قد يحدث تعكر أو تلوث فطري بسبب التعامل غير السليم أو العلاج غير الفعال بالمطهرات ووسائط المضادات الحيوية. في مثل هذه الحالة ، يجب التخلص من العينات التي تصاب بالتعكر. للحد من تطور التعكر والتلوث ، يجب الحفاظ على بيئة المختبر نظيفة ، مع التعقيم المتكرر للحاضنة ، واستخدام أطراف المرشح ، وضمان التعقيم الكامل للأدوات والحاويات المستخدمة مع العينات. خطوة أخرى حاسمة في البروتوكول هي عندما يتم استخدام لكمة الخزعة 4 مم لجرح الأنسجة. يسمح استخدام هذه الأداة بأسرة جرح متشابهة الحجم لضمان تكرار البروتوكول واستنساخه. يؤثر التباين في حجم سرير الجرح على CFU نقطة النهاية. عندما يكون هناك إزالة كافية لرفرف الأنسجة ، تكون النتائج أكثر اتساقا. هناك خطوة حاسمة أخرى مرتبطة بسلامة عدد CFU في نقطة النهاية وهي استخدام الخالط ذي الرؤوس الدقيقة لتحرير الخلايا البكتيرية. ولوحظ أن موضع طرف الخالط له تأثير على عدد وحدات CFU من عينة إلى أخرى. عندما تم وضع الطرف بشكل صحيح مباشرة على سرير الجرح ، كان هناك تباين أقل بكثير من عينة إلى أخرى.
ومع ذلك ، فإن النموذج المقترح هنا لا يخلو من القيود. هذا النموذج له قيود متأصلة في جميع الدراسات خارج الجسم الحي (أي نقص تدفق الأوعية الدموية النشط ، وغياب الجراثيم المتعايشة ، والتي قد تعدل تقدم العدوى ، وغياب الخلايا المناعية). يمكن القول أنه نظرا لأن نموذج الجرح خارج الجسم الحي لا يتضمن خلايا مناعية نشطة ، فإن تطور العدوى في الجسم الحي في وجود هذه الخلايا يمكن أن يكون مختلفا عن ذلك الذي لوحظ في النماذج خارج الجسم الحي. بغض النظر ، توفر النماذج خارج الجسم الحي سطحا للأنسجة للتعلق ومصدرا للمغذيات للبكتيريا وتقدم حاجزا لنشر 3D للتركيبات ، مما يتيح تقييما أكثر دقة لفعالية مضادات الميكروبات من تقنيات زراعة الأحياء الدقيقة التقليدية.
الميزة الرئيسية للنموذج هي أن الأنسجة يتم الحصول عليها من الحملان التي تزرع للاستهلاك البشري. وبشكل أكثر تحديدا ، يعيد النموذج استخدام الجلد من رؤوس الحملان ، والتي عادة ما يتم التخلص منها. علاوة على ذلك ، يتمتع النموذج بإنتاجية عالية ويتيح دراسات مقارنة فعالة من حيث التكلفة وسريعة وقابلة للتكرار. يمكن القول إن توفر هذا النموذج سيقلل ويصقل الحاجة إلى الحيوانات التي يتم تربيتها لغرض البحث الانتقالي بما يتماشى مع مبادئ Rs الثلاثة ، والتي تسهل ممارسات البحث الأكثر إنسانية. على الرغم من أن النموذج الموصوف هنا يتضمن S. aureus كممرض نموذجي ، يمكن استخدام النموذج مع الكائنات الحية الدقيقة الأخرى بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات الأخرى ، وبالتالي توسيع نطاق تطوير الأدوية التي يتيحها النموذج. يمكن تصور أن استخدام هذا النموذج سيمكن من الترجمة السريعة للمضادات الحيوية التي تشتد الحاجة إليها للعدوى الجلدية من خلال تزويد الباحثين بتحكم أكبر في تصميم الأدوية وصياغتها في المراحل قبل السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا EPSRC (EP / R513313 / 1) على التمويل. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا R.B Elliot and Son Abattoir في كالو ، تشيسترفيلد ، على توفير رؤوس الحملان ولكونها ملائمة للغاية في المراحل الأولى من المشروع ، وكاسيا إيمري لدعمها طوال تطوير هذا البروتوكول ، وفيونا رايت من قسم العدوى والمناعة وأمراض القلب والأوعية الدموية في جامعة شيفيلد لمعالجة عينات الأنسجة وكونها مفيدة بشكل لا يصدق طوال هذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al.
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
