Summary
Het protocol beschrijft een stapsgewijze methode om een ex vivo schapen gewonde huidmodel op te zetten dat geïnfecteerd is met Staphylococcus aureus. Dit high-throughput model simuleert infecties beter in vivo in vergelijking met conventionele microbiologische technieken en biedt onderzoekers een fysiologisch relevant platform om de werkzaamheid van opkomende antimicrobiële stoffen te testen.
Abstract
De ontwikkeling van antimicrobiële stoffen is een duur proces met steeds lagere slagingspercentages, wat verdere investeringen in antimicrobieel ontdekkingsonderzoek minder aantrekkelijk maakt. Antimicrobiële geneesmiddelenontdekking en daaropvolgende commercialisering kunnen lucratiever worden gemaakt als een fail-fast-and-fail-cheap-benadering kan worden geïmplementeerd binnen de leidende optimalisatiefasen waar onderzoekers meer controle hebben over het ontwerp en de formulering van geneesmiddelen. In dit artikel wordt de opstelling beschreven van een ex vivo schapenwond huidmodel geïnfecteerd met Staphylococcus aureus, dat eenvoudig, kosteneffectief, hoge doorvoer en reproduceerbaar is. De bacteriële fysiologie in het model bootst na dat tijdens infectie als bacteriële proliferatie afhankelijk is van het vermogen van de ziekteverwekker om het weefsel te beschadigen. De vaststelling van wondinfectie wordt geverifieerd door een toename van het aantal levensvatbare bacteriën in vergelijking met het entmateriaal. Dit model kan worden gebruikt als een platform om de werkzaamheid van opkomende antimicrobiële stoffen in de leadoptimalisatiefase te testen. Er kan worden gesteld dat de beschikbaarheid van dit model onderzoekers die antimicrobiële stoffen ontwikkelen een fail-fast-and-fail-cheap model zal bieden, wat zal helpen de slagingspercentages in volgende dierproeven te verhogen. Het model zal ook de vermindering en verfijning van het gebruik van dieren voor onderzoek vergemakkelijken en uiteindelijk een snellere en kosteneffectievere vertaling van nieuwe antimicrobiële stoffen voor huid- en wekedeleninfecties naar de kliniek mogelijk maken.
Introduction
Huidinfecties zijn een belangrijk wereldwijd probleem, met grote economische kosten voor zorgverleners over de hele wereld. De ontwikkeling van multidrugresistentie en biofilmvorming door pathogenen speelt een sleutelrol in de prevalentie van niet-genezende wonden 1,2,3,4. Als gevolg hiervan zijn huid- en wekedeleninfecties een van de meest voorkomende redenen voor langdurige ziekenhuisopname en daaropvolgende heropname5. Vertragingen in wondgenezing zijn kostbaar voor zowel de patiënt als zorgverleners, met sommige schattingen die suggereren dat jaarlijks ongeveer 6,5 miljoen patiënten in de VS worden getroffen. In het Verenigd Koninkrijk resulteren huidinfecties en bijbehorende complicaties in ongeveer 75.000 sterfgevallen per jaar 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) is een formidabele wondpathogeen die vaak wordt geïsoleerd uit patiëntenwonden 2,7. De snelheid van opkomst van multidrugresistentie nam drastisch toe in de jaren 2000. Gedurende deze tijd was ongeveer 60% van de acute bacteriële huid- en huidstructuurinfecties cultuurpositief voor methicilline-resistente S. aureus1. Het toenemende aantal multiresistente stammen onder stafylokokken, en inderdaad andere pathogenen, in de afgelopen 2 decennia duidt op een dringende behoefte aan de snelle ontwikkeling van antibiotica met nieuwe werkingsmechanismen die resistentie kunnen overwinnen.
Sinds de vroege jaren 2000 worden antibiotica-ontdekkingsprogramma's echter gedomineerd door langere ontwikkelingstijden en lage slagingspercentages, waarbij slechts 17% van de nieuwe antibiotica die klinische proeven in de VS binnenkomen, marktgoedkeuring hebben verkregen8. Dit suggereert een verschil tussen de resultaten van in vitro testen van opkomende antibiotica en hun klinische uitkomsten. Er kan worden gesteld dat deze ongelijkheid grotendeels te wijten is aan verschillen in bacteriële fysiologie tijdens infecties in vivo en tijdens conventionele microbiologische methoden bij het testen van de werkzaamheid van antibiotica in de in vitro preklinische stadia. Daarom zijn nieuwe laboratoriummethoden nodig die meer representatief zijn voor bacteriële fysiologie tijdens infectie om de slagingspercentages in antibiotica-ontdekkingsprogramma's te verbeteren.
Huidige methoden voor het bestuderen van huidinfecties omvatten studies bij levende dieren (bijv. Muizen), ex vivo huidmodellen (bijv. Varkens) en 3D-weefselmanipulatie huidmodellen (bijv. Menselijk)9,10,11,12. Studies bij levende dieren zijn strikt gereguleerd en hebben een relatief lage doorvoer. In diermodellen veroorzaken verwonding en infectie aanzienlijk leed voor de dieren en roepen ze ethische zorgen op. Menselijke huidmodellen, ex vivo of tissue-engineered, vereisen ethische goedkeuring, naleving van lokale en wereldwijde wetgeving (de Human Tissue Act, de Verklaring van Helsinki), en er is moeite met het verkrijgen van weefsels, waarbij sommige verzoeken jaren duren om aan13,14 te voldoen. Beide modeltypen zijn arbeidsintensief en vereisen aanzienlijke expertise om experimenteel succes te garanderen. Sommige huidige ex vivo huidinfectiemodellen vereisen vooraf geënte schijven en additieven voor het wondbed om infectie mogelijk te maken; hoewel deze modellen ongelooflijk nuttig zijn, zijn er beperkingen in het infectieproces omdat additieven het gebruik van het wondbed als voedingsbron beperken 10,15,16,17. Het model dat in deze studie wordt beschreven, gebruikt geen additieven voor het wondbed, wat ervoor zorgt dat de pathologie van infectie en levensvatbare celtellingen het resultaat zijn van direct gebruik van het wondbed als de enige voedingsbron.
Gezien de behoefte aan nieuwe laboratoriummethoden, is een nieuw high-throughput ex vivo schapenmodel van huidinfecties ontwikkeld voor gebruik bij het evalueren van de werkzaamheid van opkomende antibiotica. Huidinfectiestudies worden geconfronteerd met vele uitdagingen - hoge kosten, ethische zorgen en modellen die geen volledig beeld laten zien 20,21. Ex vivo modellen en 3D explant modellen zorgen voor een betere visualisatie van het ziekteproces en de impact die behandelingen kunnen hebben vanuit een meer klinisch relevant model. Hier wordt de opzet van een nieuw schapenhuidmodel beschreven, dat eenvoudig, reproduceerbaar en klinisch relevant is en een hoge doorvoer heeft. Schapenhuid werd gekozen omdat schapen een van de grote zoogdieren zijn die vaak worden gebruikt om reacties op infecties in vivo te modelleren. Bovendien zijn ze gemakkelijk verkrijgbaar bij slachthuizen, wat zorgt voor een constante aanvoer van huid voor onderzoek, en hun karkassen zijn niet verbrand, wat een goede weefselkwaliteit garandeert. Deze studie gebruikte S. aureus als de voorbeeldpathogeen; het model werkt echter goed met andere micro-organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lammerenkoppen van het R.B Elliott and Son Abattoir werden in dit project gebruikt als bron van huidmonsters. Alle lammeren werden geslacht voor consumptie als voedsel. In plaats van de hoofden weg te gooien, werden deze hergebruikt voor onderzoek. Ethische goedkeuring was niet vereist omdat het weefsel afkomstig was van afval dat uit slachthuizen werd weggegooid.
1. Sterilisatie
- Desinfecteer de tang voorafgaand aan het verzamelen van de koppen door een schone tang te nemen en gedurende 1 uur droge warmtesterilisatie uit te voeren in een oven bij 200 °C. Autoclaaf al het glaswerk bij 121 °C gedurende 15 minuten voor gebruik.
- Voer alle beschreven werkzaamheden uit binnen een kast van microbiologie klasse 2. Bereid alle reagentia voor volgens de instructies van de fabrikant.
2. Monsterverzameling
- In het slachthuis werden Swaledale-lammeren geslacht door bedwelming met behulp van elektriciteit of een pistool met bouten en geëxsanguineerd. Verzamel lamskoppen niet meer dan 4 uur na het slachten.
3. Voorbereiding van de hoofden
- Desinfecteer het voorhoofdsgedeelte van het lam door ongeveer 100 ml chloordioxide-oplossing van 200 ppm op het monstergebied te gieten. Scheer het voorhoofdsgedeelte van het hoofd met behulp van elektrische tondeuses en was het gebied met 200 ml chloordioxideoplossing van 200 ppm.
- Veeg het gebied af met ethanol en blauwe rol en bedek het monstergebied met ontharingscrème gedurende 35 minuten. Schraap de ontharingscrème voorzichtig af met behulp van een schraapgereedschap en beoordeel het monstergebied. Als er een aanzienlijke hoeveelheid haar overblijft, herhaal dan het ontharingsproces.
- Gebruik nog eens 200 ml chloordioxide-oplossing om het gebied te spoelen en spoel vervolgens met ethanol en veeg af met een blauwe rol.
- Snijd met behulp van een steriele biopsiepunch van 8 mm 8 mm huidmonsters uit het voorbereide gebied. Verwijder de monsters met een steriele tang en een scalpel met 15 messen, zodat al het huidvet wordt verwijderd.
- Plaats de monsters in een steriele pot van 0,5 L gevuld met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en breng ze vervolgens over in steriele buizen van 50 ml met 50 ml chloordioxide-oplossing van 200 ppm, keer twee keer om en laat ze gedurende 30 minuten steriliseren.
- Verwijder de monsters uit de chloordioxide-oplossing en was ze door ze in een buis van 50 ml gevuld met 40 ml steriel PBS te plaatsen. Eenmaal gewassen, plaats elk individueel huidmonster in een aparte put van een 24-well plaat.
- Voeg 350 μL voorverwarmd medium toe terwijl het monster op de lucht-vloeistofinterface blijft. De samenstelling van de media is als volgt: MK media (Medium 199 met Hanks' zouten, L-glutamaat en 1,75 mg/ml natriumbicarbonaat) en Ham's F12 in een verhouding van 1:1, met toegevoegde FBS (10% v/v), EGF (10 ng/ml), insuline (5 μg/ml), penicilline-streptomycine (100 U/ml) en amfotericine B (2,5 μg/ml).
- Sluit de 24-wells platen af met een gasdoorlatende plaatafdichting en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2 weefselincubator gedurende maximaal 24 uur.
4. Onderhoud van huidmonsters
- Verwijder na incubatie het kweekmedium en spoel de monsters in 500 μL steriel PBS. Voeg antibioticavrije media toe aan elk monster en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO 2-weefselincubator gedurende 24 uur om resterende antibiotica in het monster te verwijderen.
- Als troebelheid of schimmelinfectie zich na 24 uur in de antibioticavrije media ontwikkelt, gooi het monster dan weg.
5. Bereiding van het entmateriaal
- Bereid een buis van 50 ml met 10 ml steriele tryptische sojabouillon. Neem een verse agarplaat van S. aureus en gebruik een wattenstaafje om verschillende kolonies in de bouillon over te brengen. Incubeer gedurende 18 uur bij 37 °C bij 150 tpm.
- Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml steriel PBS. Herhaal dit twee keer om ervoor te zorgen dat de cellen voldoende worden gewassen.
- Stel het entmateriaal in steriel PBS in op0,6 OD 600 . Bevestig de entbelasting door een handmatige haalbare plaattelling uit te voeren.
6. Infectie van huidmonsters
- Bereid een verse 24-wells plaat met 400 μL voorverwarmde antibioticavrije media en voeg de 24-well inserts toe met behulp van een steriele tang.
- Verwijder de media uit de huidmonsters, was met 500 μL steriel PBS en verwijder de was. Gebruik een steriele tang om het monster voorzichtig op de bodem van de put te houden.
- Gebruik een ponsbiopsie van 4 mm om een centrale wondflap te maken, die doordringt tot een ruwe diepte van 1-2 mm. Gebruik vervolgens een scalpel met 15 messen en een steriele tand-allisweefseltang om de bovenste laag van de wondflap te verwijderen. Variabiliteit in de wondafmetingen kan van invloed zijn op de uitkomst van de infectie en de eindpuntkolonievormende eenheden (CFU).
- Zodra alle monsters zijn verwond, brengt u ze met een steriele tang over naar de 24-putjes. Pipetteer 15 μL van het bacteriële entmateriaal in het wondbed. Incubeer vervolgens gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2 weefselincubator.
- Als langere incubatietijden nodig zijn, verwijder dan de media en vervang deze om de 24 uur door verse media en incubeer in dezelfde omstandigheden.
7. Bepaling van de bacteriële belasting
- Verwijder de media van de bodem van de putjes. Breng met een steriele tang elk monster over in een afzonderlijke buis van 50 ml gevuld met 1 ml steriel PBS.
- Gebruik een fijnpunthomogenisator om het oppervlak van het monster te homogeniseren. Zorg ervoor dat het wondbed in direct contact staat met de punt van de homogenisator.
- Homogeniseer elk monster gedurende 35 s op medium/hoog. De homogenisator maakt de bacteriën los van het oppervlak van het wondbed om de bacteriële belasting te kunnen inventariseren.
- Zodra alle monsters zijn verwerkt, vortex elk monster, op zijn beurt, voorafgaand aan het pipetteren. Dit om ervoor te zorgen dat het bacteriële homogenaat wordt gemengd.
- Pipet 20 μL vortex homogenaat in de overeenkomstige put van een 96-well plaat met 180 μL steriel PBS.
- Verdun elk monster homogenaat serieel tot 1 x 10−7 en pipetteer 10 μL van het verdunde homogenaat op een tryptische soja-agarplaat in drievoud.
- Incubeer de agarplaat gedurende 18 uur bij 37 °C. Tel vervolgens het aantal kolonies om de CFU voor elk monster te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het identificeren van een route om de huid te steriliseren voordat het wondinfectiemodel werd opgezet, was een uitdaging. De uitdaging lag in het steriliseren van de huid zonder de verschillende huidlagen te beschadigen, wat vervolgens onbedoelde gevolgen kan hebben in de uitkomst van de infectie. Om een geschikt sterilisatieregime te identificeren, werden verschillende behandelingen geprobeerd voor verschillende tijdsduur, zoals beschreven in tabel 1. Besmetting werd geregistreerd als de ontwikkeling van troebelheid na 48 uur in het MK-medium dat werd gebruikt om de huidmonsters te onderhouden. De weefselintegriteit werd gecontroleerd door histologie gevolgd door kleuring met hematoxyline en eosine (H&E) onmiddellijk na de behandeling (figuur 1). Een behandeling van 30 minuten met chloordioxide bleek het meest effectief in het reproduceerbaar steriliseren van het huidweefsel met behoud van de weefselintegriteit.
In de experimentele opstelling wordt het gewonde steriele weefsel in de apicale kamer van een 24-well insert op de lucht-vloeistof interface geplaatst (figuur 2A). Twee verschillende verwondingstechnieken werden geprobeerd - een flapverwijderingstechniek, waarbij het weefsel wordt verwond door een ponsbiopsietool en de bovenste laag van het gewonde weefsel wordt verwijderd met behulp van een combinatie van een scalpel met 15 messen en een steriele tand allis-weefseltang, en een krastechniek, waarbij het weefsel alleen door een ponsbiopsietool wordt verwond. Hoewel het krasmodel na 24 uur een hoger gemiddeld aantal CFU's herbergde, waren de resultaten variabel. De flapverwijderingstechniek leverde consistentere resultaten op (figuur 2C). Na 48 uur werden ongeveer 100 keer meer bacteriële CFU's uit het gewonde weefsel hersteld in vergelijking met het entmateriaal (figuur 2D). Dit werd geacht te wijzen op een succesvolle infectie. Een witte film in het wondbed was zichtbaar op het weefsel 48 uur na infectie (figuur 2B). Gram-gekleurde histologiesecties van geïnfecteerd weefsel wezen op de aanwezigheid van S. aureus-cellen in het wondbed (figuur 2E, F). Gram-gekleurde histologiesecties van niet-geïnfecteerd weefsel worden verstrekt als een comparator (figuur 2G, H).
Vanaf één lamskop is een 100 cm2 sectie (10 cm x 10 cm) realistisch toegankelijk. Aangezien elk stukje huid uit het voorhoofd wordt geslagen met behulp van een cirkelvormige ponsbiopsie met een diameter van 8 mm, kunnen ongeveer 100 huidpleisters per week worden verkregen van het voorhoofd van één lam. Het verkrijgen van verdere lammerenkoppen verhoogt evenredig het aantal huidmonsters dat per week kan worden verkregen. Daarom wordt beweerd dat de procedure een relatief hoge doorvoersnelheid heeft. Voor deze studie werden routinematig 24 huidmonsters per week verkregen. Huid van verschillende lammerenkoppen werd verwerkt als biologische replicaties om rekening te houden met de variabiliteit van de potentiële donor tot donor. Tijdens de bereiding van de huidpleisters (stappen 3.1-3.8) is het belangrijkste tijdsverbruik de 30 minuten incubatie van de huidmonsters in de chloordioxide-oplossing en de 2 x 35 minuten wachten op de ontharingscrèmebehandeling. Het gebruik van ponsbiopsie om de 24 huidpleisters te genereren duurt ongeveer 15 minuten. Het is deze tijd die lineair zou schalen als het aantal huidpleisters zou worden verhoogd.
| Ontsmettingsmiddel | 10 min. | 30 min. | 60 min. |
| 1% hoog niveau medisch oppervlaktedesinfectiemiddel | F | P | P |
| 1% multifunctioneel desinfectiemiddel | F | F | P |
| 3% povidon | F | F | F |
| 5% povidon | F | P | P |
| 10% povidon | F | P | P |
| 70% ethanol | F | P | P |
| UV | F | F | F |
| 0,55% hypochloriet | F | P | P |
| 200 ppm chloordioxide | F | P | P |
Tabel 1: Sterilisatie van verse lamshuid. Elk huidmonster werd gedurende de aangegeven tijd in het ontsmettingsmiddel achtergelaten. F duidt op het niet steriliseren van het weefsel, met bacteriële besmetting aanwezig in de media. P duidt op voorbijgaan, zonder bacteriële besmetting aanwezig in de media.
Figuur 1: Histologie van niet-geïnfecteerde ex vivo schapenhuid behandeld met ontsmettingsmiddelen (H&E-vlek) bij 100x vergroting. (A) Controleer het huidmonster met een behandeling van 30 minuten in PBS. Er is enige epidermale uitscheiding te zien, maar de opperhuid is niet verstoord. (B) Schapenhuid behandeld met 1% hoog niveau medisch oppervlaktedesinfectiemiddel gedurende 30 minuten. Epidermale uitscheiding (zwarte pijl) samen met enige verstoring van het stratum granulosum (blauwe pijl). (C) Schapenhuid behandeld met 5% povidon gedurende 30 min. Matige schade aan het weefsel is hier te zien, met epidermale afstoting van het stratum corneum (zwarte pijl). Er is minimale verstoring van de onderliggende epidermale lagen. (D) Schapenhuid behandeld met 10% povidon gedurende 30 min. De bovenste lagen van de opperhuid zijn beschadigd, met bewijs van verharing (zwarte pijl) en verdunning (groene pijl). (E) Schapenhuid behandeld met 2% multifunctioneel ontsmettingsmiddel gedurende 30 minuten. Ernstige schade aan het monster kan worden waargenomen, met aanzienlijke epidermale uitscheiding (zwarte pijl) en volledige uitroeiing van het stratum corneum (rode pijl). (F) Schapenhuid behandeld in 200 ppm chloordioxide gedurende 30 minuten. Er is wat epidermale uitscheiding te zien, maar de opperhuid is intact. (G) Schapenhuid behandeld met 0,6% hypochloriet gedurende 30 min. Ernstige schade aan de epidermis is aanwezig, met een hoog niveau van epidermale afstoting (zwarte pijl) en uitroeiing van de epidermis op plaatsen (rode pijl). (H) Schapenhuid behandeld met 70% ethanol gedurende 30 min. Schade aan de opperhuid kan worden gezien, met aanzienlijke epidermale uitscheiding (zwarte pijl). Schaalbalk is 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Ex vivo schapenhuid geïnfecteerd met S. aureus. (A) Schematische weergave van de experimentele opstelling. (B) Foto's van ex vivo schapenhuid voorafgaand aan infectie (linker afbeelding) en post 48 h infectie (rechter afbeelding). Let op de witte film die aanwezig is na 48 uur incubatie in geïnfecteerd weefsel, dat afwezig is in niet-geïnfecteerd weefsel. (C) Het testen van het effect van verschillende verwondingsmethoden op de uiteindelijke kolonievormende eenheid (CFU) telt na homogenisatie. Flap verwijdering (n = 6) en kras (n = 9) geïnfecteerd met S. aureus gedurende 24 uur. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. geeft een p-waarde aan < 0,0001. (D) Het testen van het effect van incubatietijden op CFU-tellingen na homogenisatie. 24 uur incubatie (n = 6) en 48 h incubatie (n = 12). Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. geeft een p-waarde aan < 0,0001. (E,F) Representatieve beelden van histopathologische analyse van geïnfecteerde schapenhuid na 48 h infectie met een gemodificeerde Gram vlek (E) bij 100x vergroting (schaalbalk van 200 μm). Het vak geeft het gebied aan dat is vergroot in (F) bij een vergroting van 1.000x (schaalbalk van 50 μm). Zwarte pijlen duiden op bacteriën. (G,H) Representatieve beelden van histopathologische analyse van niet-geïnfecteerde schapenhuid na een periode van 48 uur (controle) met een gemodificeerde gGram-vlek (G) bij 100x vergroting (schaalbalk van 200 μm). Het vak geeft het gebied aan dat is vergroot in (H) bij een vergroting van 1.000x (schaalbalk van 50 μm). Statistische analyse werd uitgevoerd als een one-way ANOVA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van antimicrobiële stoffen is een belangrijke maar dure onderneming die naar schatting ongeveer $ 1 miljard kost en ongeveer 15 jaar in beslag neemt. Meer dan 90% van de ontdekking van antimicrobiële geneesmiddelen en preklinische studies naar de werkzaamheid van antimicrobiële geneesmiddelen worden uitgevoerd door academische onderzoekers en kleine tot middelgrote bedrijven met doorgaans minder dan 50 werknemers22. Deze teams zijn zeer financieel beperkt, wat het falen van loodmoleculen in latere stadia van translationeel onderzoek rampzalig maakt. De toename van antimicrobiële resistentie overtreft de ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële stoffen, wat de noodzaak om de toch al beperkte investeringen in antimicrobieel onderzoek op verantwoorde wijze te beheren nog versterkt23.
Het verschil in bacteriële fysiologie tussen infecties in in vivo en in vitro laboratoriumculturen heeft de neiging om een overschatting van de antimicrobiële werkzaamheid van de treffers tijdens de loodidentificatiefase te veroorzaken. Een dergelijke overschatting draagt bij aan het hoge verlooppercentage dat wordt gezien tijdens de volgende stadia van de vertaling. De beschikbaarheid van in vitro antimicrobiële werkzaamheidstestplatforms die bacteriën bevatten met een fysiologie die beter nabootst dan die gevonden tijdens infecties in vivo , zal een nauwkeurigere schatting van antimicrobiële werkzaamheid mogelijk maken en onderzoekers meer controle bieden over loodoptimalisatie zonder afhankelijk te zijn van dure en strak gereguleerde dierproeven. Dergelijke modellen zullen ook het verloop tijdens de volgende stadia van vertaling verminderen en kunnen de ontdekking van antimicrobiële geneesmiddelen aantrekkelijker maken voor investeringen.
Dit hier beschreven huidinfectiemodel voor schapen is een nuttig hulpmiddel dat onderzoekers een fysiologisch relevant in vitro model van een geïnfecteerde wond zal bieden om de werkzaamheid van opkomende actuele antimicrobiële formuleringen in de preklinische stadia te testen. In tegenstelling tot de meerderheid van de ex vivo infectiemodellen beschreven in de wetenschappelijke literatuur 10,15,24,25,26,27,28, worden in dit model de pathogenen die worden blootgesteld aan het ex vivo weefsel niet aangevuld met kweekmedia tijdens infectie. Pathogene proliferatie en daaropvolgende infectie zijn afhankelijk van het vermogen van het organisme om het weefsel te beschadigen. Daarom is de pathogene fysiologie in dit model nauwer verwant aan die tijdens in vivo infecties in vergelijking met conventionele microbiologische culturen. Een zeer reproduceerbare infectie wordt verkregen uit dit model, zoals beoordeeld door het aantal CFU's dat na incubatie uit het weefsel wordt gehaald.
Met de overvloed aan menselijke huidequivalenten en ex vivo wondmodellen voor mensen en varkens, kan het gebruik van schapenweefsel in dit model oppervlakkig als een beperking worden beschouwd. Schapen behoren echter tot de groep grote dieren die worden gebruikt als modellen van infecties in vivo 29,30,31. Bovendien zijn schapen gebruikt als surrogaten voor mensen in immunologisch onderzoek en vaccinontwikkeling, wat aangeeft dat hun immuunresponsen vergelijkbaar zijn met die van mensen32. Het weefselherstelproces tijdens wondgenezing is vergelijkbaar bij grote zoogdieren, waaronder schapen en mensen33,34, en interventies om wondgenezing te verbeteren die met succes zijn aangetoond bij schapen zijn voorgesteld voor vertaling naar mensen 35,36,37. Daarom is het gebruik van ex vivo schapenhuid in dit wondmodel geen beperking. Bovendien kan dit schapenmodel om de volgende redenen worden beschouwd als een betrouwbaar alternatief voor modellen met menselijke of varkenshuid. De beschikbaarheid van de menselijke huid is beperkt en van variabele kwaliteit indien beschikbaar38. Weefselmanipulatie van de menselijke epidermis en levende huidequivalenten vereisen verfijningen in hun kweekomstandigheden om de reproduceerbaarheid in de weefselfysiologie te waarborgen39. Hoewel varkenshuid toegankelijker is dan de menselijke huid, wordt de algemeen beschikbare varkenshuid verbrand als onderdeel van de karkasverwerking in het slachthuis, waardoor de opperhuidwordt verwijderd 10. Uit ervaring blijkt dat ongekalkte varkenshuid minder gemakkelijk verkrijgbaar is bij slachthuizen.
In het protocol dat hier wordt beschreven, zijn er kritieke stappen die het succes van het model garanderen. De meest kritieke stap is de sterilisatie van het weefsel na het oogsten. Chloordioxide-oplossing moet worden gemengd met de weefselmonsters en er moet een contacttijd van 30 minuten worden toegestaan om het weefsel voldoende te desinfecteren en verontreinigingen te verwijderen. Bovendien kan bij het opzetten van dit experiment troebelheid of schimmelbesmetting optreden als gevolg van onjuiste behandeling of ineffectieve behandeling met ontsmettingsmiddelen en antibiotische media. In een dergelijk geval moeten monsters die troebelheid ontwikkelen, worden weggegooid. Om de ontwikkeling van troebelheid en besmetting te verminderen, moet de laboratoriumomgeving schoon worden gehouden, met frequente sterilisatie van de incubator, het gebruik van filtertips en het waarborgen van volledige sterilisatie van de gereedschappen en containers die bij de monsters worden gebruikt. Een andere cruciale stap in het protocol is wanneer de 4 mm biopsiepunch wordt gebruikt om het weefsel te verwonden. Het gebruik van deze tool maakt wondbedden van vergelijkbare grootte mogelijk om de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van het protocol te garanderen. Variabiliteit in de grootte van het wondbed heeft invloed op het eindpunt CFU. Wanneer er voldoende verwijdering van de weefselflap is, zijn de resultaten veel consistenter. Een andere kritieke stap in verband met de integriteit van het aantal CFU-eindpunten is het gebruik van de fijnpunthomogenisator om bacteriële cellen vrij te maken. De positie van de homogenisatorpunt bleek van invloed te zijn op de CFU-telling van monster tot monster; wanneer de punt correct direct op het wondbed werd geplaatst, was er veel minder variabiliteit te zien van monster tot monster.
Toch is het hier voorgestelde model niet zonder beperkingen. Dit model heeft beperkingen die inherent zijn aan alle ex vivo studies (d.w.z. het ontbreken van actieve vasculaire stroom, de afwezigheid van commensale microbiota, die de voortgang van infecties kan moduleren, en de afwezigheid van immuuncellen). Er kan worden gesteld dat, aangezien het ex vivo wondmodel geen actieve immuuncellen bevat, de infectieprogressie in vivo in aanwezigheid van deze cellen kan verschillen van die waargenomen in ex vivo modellen. Hoe dan ook, ex vivo modellen bieden een weefseloppervlak voor hechting en een voedingsbron voor bacteriën en vormen een 3D-diffusiebarrière voor formuleringen, wat een nauwkeurigere beoordeling van antimicrobiële werkzaamheid mogelijk maakt dan conventionele microbiologische kweektechnieken.
Een belangrijk voordeel van het model is dat het weefsel afkomstig is van lammeren die worden gekweekt voor menselijke consumptie. Meer in het bijzonder hergebruikt het model huid van lammerenkoppen, die meestal worden weggegooid. Bovendien heeft het model een hoge doorvoersnelheid en maakt het kosteneffectieve, snelle en reproduceerbare vergelijkende studies mogelijk. Er kan worden gesteld dat de beschikbaarheid van dit model de behoefte aan speciaal gefokte dieren voor translationeel onderzoek zal verminderen en verfijnen in overeenstemming met de principes van de drie V's, die meer humane onderzoekspraktijken mogelijk maken. Hoewel het hier beschreven model S. aureus als de voorbeeldpathogeen bevat, kan het model worden gebruikt met andere micro-organismen, waaronder andere bacteriën, schimmels en virussen, waardoor de reikwijdte van de ontwikkeling van geneesmiddelen die het model mogelijk maakt, wordt verbreed. Men kan zich voorstellen dat het gebruik van dit model de snelle vertaling van de broodnodige antibiotica voor huidinfecties mogelijk zal maken door onderzoekers meer controle te geven over het ontwerp en de formulering van geneesmiddelen in de preklinische stadia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
De auteurs willen EPSRC (EP/R513313/1) bedanken voor de financiering. De auteurs willen ook R.B Elliot en Son Abattoir in Calow, Chesterfield, bedanken voor het verstrekken van lammerenkoppen en voor het feit dat ze zo meegaand zijn in de vroege stadia van het project, Kasia Emery voor haar steun tijdens de ontwikkeling van dit protocol, en Fiona Wright van de afdeling Infectie, Immuniteit en Hart- en Vaatziekten aan de Universiteit van Sheffield voor het verwerken van de histologiemonsters en zo ongelooflijk behulpzaam zijn tijdens dit project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al.
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
