Summary
プロトコルは、黄色ブドウ球菌に感染したex vivoヒツジ創傷皮膚モデルをセットアップするための段階的な方法を説明しています。このハイスループットモデルは、従来の微生物学技術と比較してin vivoでの感染をよりよくシミュレートし、新しい抗菌薬の有効性をテストするための生理学的に関連するプラットフォームを研究者に提供します。
Abstract
抗菌薬の開発は費用のかかるプロセスであり、成功率はますます低くなっているため、抗菌薬発見研究へのさらなる投資はそれほど魅力的ではありません。抗菌薬の発見とその後の商品化は、研究者が医薬品の設計と処方をより細かく制御できるリード最適化段階でフェイルファストアンドフェイルチープアプローチを実装できれば、より収益性の高いものにすることができます。この記事では、黄色ブドウ球菌に感染したex vivoヒツジ創傷皮膚モデルのセットアップについて説明しますが、これはシンプルで費用効果が高く、スループットが高く、再現性があります。モデルの細菌生理機能は、感染中の細菌増殖が病原体の組織を損傷する能力に依存することを模倣しています。創傷感染の確立は、接種材料と比較して生存細菌数の増加によって検証される。このモデルは、リード最適化段階で新しい抗菌薬の有効性をテストするためのプラットフォームとして使用できます。このモデルの利用可能性は、抗菌薬を開発する研究者にフェイルファストアンドフェイルチープモデルを提供し、その後の動物試験の成功率を高めるのに役立つと主張することができます。このモデルはまた、研究のための動物使用の削減と改良を促進し、最終的には皮膚および軟部組織感染症に対する新規抗菌剤の臨床へのより迅速かつ費用効果の高い翻訳を可能にします。
Introduction
皮膚感染症は重要な地球規模の問題であり、世界中の医療提供者に大きな経済的コストがかかります。病原体による多剤耐性およびバイオフィルム形成の発達は、非治癒性創傷の有病率において重要な役割を果たす1,2,3,4。この結果、皮膚軟部組織の感染症は、長期入院とその後の再入院の最も一般的な理由の1つです5。創傷治癒の遅れは、患者と医療提供者の両方にとってコストがかかり、米国では年間約650万人の患者が罹患していることを示唆する推定もあります。英国では、皮膚感染症とそれに関連する合併症により、年間約75,000人が死亡しています2,4,6。
黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)は、患者の創傷から頻繁に単離される手ごわい創傷病原体である2、7。多剤耐性の出現率は2000年代に劇的に増加しました。この間、急性細菌性皮膚および皮膚構造感染症の約60%がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌1の培養陽性でした。ブドウ球菌、そして実際に他の病原体の間で過去20年以内に多剤耐性株の数が増加していることは、耐性を克服することができる新しい作用機序を備えた抗生物質の迅速な開発の緊急の必要性を示しています。
しかし、2000年代初頭以降、抗菌薬探索プログラムは、より長い開発期間と低い成功率によって支配されており、米国で臨床試験に入った新規抗菌薬のわずか17%が市場承認を達成しています8。これは、新興抗生物質のin vitro試験の結果とそれらの臨床転帰との間に格差があることを示唆しています。この格差は、in vitroの前臨床段階で抗生物質の有効性をテストする際のin vivo感染中および従来の微生物学的方法中の細菌生理機能の違いに大きく起因していると主張することができます。したがって、抗生物質発見プログラムの成功率を向上させるためには、感染中の細菌生理学をより代表する新しい実験室方法が必要です。
皮膚感染症を研究するための現在の方法には、生きた動物(マウスなど)、ex vivo皮膚モデル(ブタなど)、および3D組織工学皮膚モデル(ヒトなど)での研究が含まれます9,10,11,12。生きた動物での研究は厳しく規制されており、スループットは比較的低いです。動物モデルでは、創傷と感染は動物に重大な苦痛を引き起こし、倫理的懸念を引き起こします。ex vivoまたは組織工学によるヒト皮膚モデルは、倫理的承認、国内および世界の法律(ヒト組織法、ヘルシンキ宣言)の遵守が必要であり、組織の取得が困難であり、一部の要求を満たすのに数年かかる場合があります13,14。どちらのモデルタイプも労働集約的であり、実験を成功させるにはかなりの専門知識が必要です。現在のex vivo皮膚感染モデルの中には、感染を可能にするために創傷床に事前に接種された椎間板と添加剤を必要とするものがあります。これらのモデルは非常に有用であるが、添加剤が栄養源としての創傷床の利用を制限するため、感染プロセスには制限がある10、15、16、17。この研究で説明されているモデルは、創傷床に添加物を使用していないため、感染の病理と生細胞数は、唯一の栄養源としての創傷床の直接利用の結果であることを保証します。
新しい実験室法の必要性を考慮して、新しい抗生物質の有効性を評価するために使用するための皮膚感染症の新しいハイスループットex vivoヒツジモデルが開発されました。皮膚感染症の研究は、高コスト、倫理的懸念、全体像を示さないモデルなど、多くの課題に直面しています20,21。生体外モデルと3D外植片モデルにより、疾患プロセスをより適切に視覚化でき、より臨床的に関連性のあるモデルから治療がもたらす影響が可能になります。ここでは、単純で再現性があり、臨床的に関連性があり、高いスループットを有する新しいヒツジ皮膚モデルのセットアップについて説明する。ヒツジがin vivoでの感染に対する応答をモデル化するために一般的に使用される大型哺乳類の1つとして選択されたヒツジの皮膚。さらに、それらは食肉処理場から容易に入手でき、研究用の皮膚の安定した供給を保証し、それらの死体はやけどを負わず、良好な組織品質を保証します。この研究では、黄色ブドウ球菌を模範的な病原体として使用しました。ただし、このモデルは他の微生物でもうまく機能します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
R.Bエリオットとサンアモントワールの子羊の頭は、このプロジェクトの皮膚サンプルのソースとして使用されました。すべての子羊は食物として消費するために屠殺されました。頭を捨てる代わりに、これらは研究のために再利用されました。組織は食肉処理場から廃棄された廃棄物から供給されたため、倫理的承認は必要ありませんでした。
1.滅菌
- ヘッドを採取する前に、清潔な鉗子を取り、200°Cのオーブンで1時間の乾熱処理を行うことにより、鉗子を消毒します。使用前に、すべてのガラス製品を121°Cで15分間オートクレーブします。
- 記載されているすべての作業を微生物学クラス2キャビネット内で実行します。製造元の指示に従ってすべての試薬を準備します。
2. サンプル収集
- 食肉処理場では、スワレデールの子羊は電気またはキャプティブボルトピストルを使用して見事な方法で屠殺され、放血されました。屠殺後4時間以内に子羊の頭を集めてください。
3.ヘッドの準備
- サンプルエリアに約100 mLの200 ppm二酸化塩素溶液を注ぎ、子羊の額部分を消毒します。電気バリカンを使用して頭の額部分を剃り、200 mLの200 ppm二酸化塩素溶液でその領域を洗います。
- エタノールとブルーロールで領域を拭き、サンプル領域を脱毛クリームで35分間覆います。掻き取りツールを使用して脱毛クリームをそっとこすり落とし、サンプル領域を評価します。かなりの量の髪が残っている場合は、脱毛プロセスを繰り返します。
- さらに200 mLの二酸化塩素溶液を使用して領域をすすぎ、エタノールですすぎ、青いロールで拭きます。
- 滅菌した8 mm生検パンチを使用して、準備した領域から8 mmの皮膚サンプルを切り取ります。滅菌鉗子と15枚羽根メスを使用してサンプルを取り除き、すべての皮膚脂肪が確実に除去されるようにします。
- サンプルを滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされた滅菌0.5 Lジャーに入れ、50 mLの200 ppm二酸化塩素溶液を含む滅菌50 mLチューブに移し、2回反転させ、30分間滅菌します。
- 二酸化塩素溶液からサンプルを取り出し、40 mLの滅菌PBSで満たされた50 mLチューブに入れて洗浄します。洗浄したら、個々の皮膚サンプルを24ウェルプレートの別々のウェルに入れます。
- サンプルを気液界面に維持しながら、350 μLの予熱培地を追加します。培地の組成は、MK培地(ハンクス塩、L-グルタミン酸塩、1.75 mg/mL重炭酸ナトリウムを含む培地199)とハムのF12を1:1の比率で、FBS(10%v/v)、EGF(10 ng/mL)、インスリン(5 μg/mL)、ペニシリン-ストレプトマイシン(100 U/mL)、アムホテリシンB(2.5 μg/mL)を加えたものです。
- 24ウェルプレートを気体透過性プレートシールで密封し、加湿した5%CO2 組織インキュベーター内で37°Cで最大24時間インキュベートします。
4.皮膚サンプルのメンテナンス
- インキュベーション後、培養液を取り出し、500 μLの滅菌PBSでサンプルをすすぎます。抗生物質を含まない培地を各サンプルに加え、加湿した5%CO2 組織インキュベーターで37°Cで24時間インキュベートして、サンプル中の残留抗生物質を除去します。
- 24時間後に抗生物質を含まない培地で濁りまたは真菌感染症が発生した場合は、サンプルを廃棄してください。
5.接種材料の準備
- 10 mLの滅菌トリプシン大豆ブロスを含む50 mLチューブを準備します。 黄色ブドウ 球菌の新鮮な寒天プレートを取り、綿棒を使用していくつかのコロニーをブロスに移します。37°C、150rpmで18時間インキュベートします。
- 4,000 x g で3分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを10 mLの滅菌PBSに再懸濁します。細胞の適切な洗浄を確実にするために2回繰り返します。
- 接種材料を滅菌PBSで0.6 OD600 に調整します。手動で実行可能なプレートカウントを行うことにより、接種材料の負荷を確認します。
6.皮膚サンプルの感染
- 400 μLの予熱した抗生物質フリー培地を含む新しい24ウェルプレートを準備し、滅菌鉗子を使用して24ウェルインサートを追加します。
- 皮膚サンプルから培地を取り除き、500 μLの滅菌PBSで洗浄し、洗浄液を除去します。滅菌鉗子を使用して、サンプルをウェルの底にそっと保持します。
- 4mmのパンチ生検を使用して中央の創傷フラップを作り、1〜2mmの大まかな深さまで突き刺します。次に、15枚羽根メスと滅菌歯付きアリス組織鉗子を使用して、創傷フラップの最上層を取り除きます。創傷寸法の変動性は、感染の結果およびエンドポイントコロニー形成単位(CFU)に影響を与える可能性があります。
- すべてのサンプルが傷ついたら、滅菌鉗子を使用して24ウェルインサートに移します。15μLの細菌接種材料を創傷床にピペットで入れます。次いで、加湿した5%CO2 組織インキュベーター内で37°Cで24時間インキュベートする。
- より長いインキュベーション期間が必要な場合は、培地を取り出し、24時間ごとに新しい培地と交換し、同じ条件でインキュベートします。
7.細菌量の決定
- ウェルの底からメディアを取り除きます。滅菌鉗子を使用して、各サンプルを1 mLの滅菌PBSで満たされた個別の50 mLチューブに移します。
- 先端の細かいホモジナイザーを使用して、サンプルの表面を均質化します。創傷床がホモジナイザーの先端に直接接触していることを確認するように注意してください。
- 各サンプルを中/高で35秒間均質化します。ホモジナイザーは、細菌負荷の列挙を可能にするために、創傷床の表面から細菌を剥離する。
- すべてのサンプルが処理されたら、ピペッティングの前に各サンプルを順番にボルテックスします。これは、細菌ホモジネートが確実に混合されるようにするためです。
- 20 μLのボルテックスホモジネートを、180 μLの滅菌PBSを含む96ウェルプレートの対応するウェルにピペットで入れます。
- 各サンプルホモジネートを1 x 10−7 に連続希釈し、希釈したホモジネート10 μLをトリプシン大豆寒天プレートに3回ピペットでピペットします。
- 寒天プレートを37°Cで18時間インキュベートします。 次に、コロニー数をカウントし、各サンプルについてCFUを決定した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
創傷感染モデルを設定する前に皮膚を滅菌する経路を特定することは困難でした。課題は、さまざまな皮膚層に損傷を与えることなく皮膚を滅菌することにあり、感染の結果に意図しない結果をもたらす可能性があります。適切な滅菌レジームを特定するために、 表1に概説されているように、さまざまな治療をさまざまな長さで試行しました。汚染は、皮膚サンプルを維持するために使用されたMK培地における48時間後の濁りの発生として記録された。組織の完全性を組織学でモニタリングし、治療直後にヘマトキシリンとエオジン(H&E)で染色しました(図1)。二酸化塩素による30分間の治療は、組織の完全性を維持しながら皮膚組織を再現的に滅菌するのに最も効果的であることが証明されました。
実験セットアップでは、傷ついた無菌組織は、気液界面にある24ウェルインサートの頂端チャンバーに配置されます(図2A)。パンチ生検ツールで組織を創傷し、15枚羽根メスと滅菌歯付きアリス組織鉗子を組み合わせて創傷組織の最上層を除去するフラップ除去技術と、パンチ生検ツールのみで組織を創傷するスクラッチ技術という2つの異なる創傷技術が試みられた。スクラッチモデルでは、24時間後にCFUの平均数が多かったが、結果はばらつきがあった。フラップ除去技術は、より一貫した結果を生み出しました(図2C)。48時間後、接種材料と比較して約100倍多くの細菌CFUが創傷組織から回収されました(図2D)。これは感染が成功したことを示していると見なされました。創傷床の白いフィルムは、感染後48時間で組織上に明らかでした(図2B)。感染組織のグラム染色組織切片は、創傷床における 黄色ブドウ球菌 細胞の存在を示した(図2E、F)。感染していない組織のグラム染色組織学切片がコンパレータとして提供されます(図2G、H)。
1匹の子羊の頭から、100 cm2 のセクション(10 cm x 10 cm)にリアルにアクセスできます。直径8mmの円形パンチ生検を使用して額から皮膚の各パッチを打ち抜くと、1週間に100個の子羊の額から約100個の皮膚パッチを取得できます。さらに子羊の頭を調達すると、それに比例して週に入手できる皮膚サンプルの数が増えます。したがって、この手順は比較的高いスループットであると主張されています。この研究では、週に24の皮膚サンプルが定期的に取得されました。さまざまな子羊の頭の皮膚を生物学的複製として処理し、潜在的なドナー間の変動性を説明しました。皮膚パッチの調製中(ステップ3.1〜3.8)、主な時間の消費は、二酸化塩素溶液中の皮膚サンプルの30分のインキュベーションと、脱毛クリーム治療の2 x 35分の待機です。パンチ生検を使用して24個の皮膚パッチを生成するには、約15分かかります。皮膚パッチの数を増やすと直線的にスケーリングするのはこの時間です。
| 消毒剤 | 10 ミン | 30分 | 60分 |
| 1%の高レベルの医療用表面消毒剤 | F | P | P |
| 1%多目的消毒剤 | F | F | P |
| 3%ポビドン | F | F | F |
| 5%ポビドン | F | P | P |
| 10%ポビドン | F | P | P |
| 70%エタノール | F | P | P |
| 紫外線 | F | F | F |
| 0.55%次亜塩素酸塩 | F | P | P |
| 200 ppmの二酸化塩素 | F | P | P |
表1:新鮮な子羊の皮の殺菌。 各皮膚サンプルは、指定された時間消毒剤中に放置された。Fは、培地中に細菌汚染が存在する組織を滅菌できなかったことを示します。Pは合格を示し、培地に細菌汚染は存在しません。
図1:消毒剤(H&E染色)で処理した非感染のe x vivo ヒツジ皮膚の組織像を100倍の倍率で。 (A)PBSで30分間の治療で皮膚サンプルを制御します。いくらかの表皮脱落が見られますが、表皮は破壊されません。(B)1%の高レベルの医療用表面消毒剤で30分間処理されたヒツジの皮膚。表皮の脱落(黒い矢印)と層顆粒へのいくつかの破壊(青い矢印)。(C)5%ポビドンで30分間処理したヒツジの皮膚。組織への中程度の損傷がここで見られ、角質層の表皮脱落があります(黒い矢印)。下にある表皮層への破壊は最小限です。(D)10%ポビドンで30分間処理したヒツジの皮膚。表皮の最上層は損傷を受けており、脱落(黒い矢印)と薄くなっている(緑の矢印)の証拠があります。(E)2%多目的消毒剤で30分間処理したヒツジの皮膚。サンプルへの深刻な損傷が観察され、著しい表皮の脱落(黒い矢印)と角質層の完全な根絶(赤い矢印)があります。(F)200ppmの二酸化塩素で30分間処理したヒツジの皮膚。いくつかの表皮脱落が見られますが、表皮は無傷です。(G)ヒツジの皮膚を0.6%次亜塩素酸塩で30分間処理します。表皮への重度の損傷が存在し、高レベルの表皮脱落(黒い矢印)と場所によっては表皮の根絶(赤い矢印)があります。(H)70%エタノールで30分間処理したヒツジの皮膚。表皮の損傷が見られ、表皮の著しい脱落があります(黒い矢印)。スケールバーは200μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:黄色ブドウ球菌に感染した生体外ヒツジの皮膚。 (A)実験セットアップの概略図。(B)感染前(左の画像)と48時間後の感染後(右の画像)のex vivoヒツジ皮膚の写真。感染組織における48時間のインキュベーション後に存在する白色フィルムは、非感染組織には存在しないことに留意されたい。(C)ホモジナイズ後の最終コロニー形成単位(CFU)カウントに対するさまざまな創傷方法の影響をテストします。フラップ除去(n = 6)および引っかき傷(n = 9)を黄色ブドウ球菌に24時間感染させた。エラーバーは標準偏差を示します。0.0001
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
抗菌薬の開発は重要だが費用のかかるベンチャーであり、約10億ドルの費用がかかり、完了するまでに約15年かかると推定されています。抗菌薬の発見と抗菌薬の有効性の前臨床試験の90%以上は、学術研究者や通常50人未満の中小企業によって実施されています22。これらのチームは非常に財政的に制約されており、トランスレーショナルリサーチの後期段階での鉛分子の失敗を悲惨なものにします。抗菌薬耐性の上昇は、新規抗菌薬の開発を上回っており、責任を持って抗菌薬研究へのすでに限られた投資を管理する必要性をさらに強めています23。
in vivoおよびin vitroの実験室培養における感染の間の細菌生理機能の不一致は、鉛同定段階でヒットの抗菌効果の過大評価を引き起こす傾向があります。このような過大評価は、翻訳の後続の段階で見られる高い離職率の一因となります。in vivoでの感染中に見られる生理機能をよりよく模倣する細菌を組み込んだin vitro抗菌効果試験プラットフォームが利用可能になることで、抗菌効果のより正確な推定が可能になり、研究者は高価で厳しく規制された動物試験に依存することなく、鉛の最適化をより細かく制御できるようになります。このようなモデルはまた、翻訳の次の段階で離職率を低下させ、抗菌薬発見を投資にとってより魅力的なものにする可能性があります。
ここで説明するこのヒツジ皮膚感染モデルは、前臨床段階で新しい局所抗菌製剤の有効性をテストするために、感染した創傷の生理学的に関連するin vitroモデルを研究者に提供する有用なツールです。科学文献10、15、24、25、26、27、28に記載されているex vivo感染モデルの大部分とは対照的に、このモデルでは、ex vivo組織に曝露された病原体は、感染中に培養培地で補充されない。病原体の増殖およびそれに続く感染は、生物が組織を損傷する能力に依存する。したがって、このモデルの病原体生理機能は、従来の微生物学的培養と比較して、in vivo感染中の生理機能とより密接に関連しています。インキュベーション後に組織から回収されたCFUの数によって判断されるように、このモデルから再現性の高い感染が得られます。
ヒトの皮膚等価物およびヒトおよびブタのex vivo創傷モデルが多数あるため、このモデルでのヒツジ組織の使用は、表面的には制限であると主張できます。しかしながら、ヒツジは、インビボ29、30、31における感染のモデルとして使用される大型動物の群の一つである。さらに、ヒツジは免疫学の研究やワクチン開発においてヒトの代用物として使用されており、その免疫応答がヒトの免疫応答と類似していることを示しています32。創傷治癒中の組織修復プロセスは、ヒツジおよびヒトを含む大型哺乳類においても類似しており33,34、およびヒツジにおいて首尾よく実証された創傷治癒を改善するための介入がヒトへの翻訳のために示唆されている35,36,37。したがって、この創傷モデルにおけるエキソビボヒツジ皮膚の使用は制限されない。さらに、このヒツジモデルは、以下の理由から、ヒトやブタの皮膚を組み込んだモデルに代わる信頼できるものと判断できます。人間の皮膚の入手可能性は限られており、利用可能な場合は品質が変動します38。組織工学的ヒト表皮および生体皮膚同等物は、組織生理学における再現性を確保するために、それらの培養条件の改良を必要とする39。ブタの皮膚は人間の皮膚よりもアクセスしやすいが、広く入手可能なブタの皮膚は、食肉処理場での枝肉処理の一部としてやけどし、表皮10を除去する。経験から、やけどを負っていないブタの皮は食肉処理場から入手しにくいです。
ここで説明するプロトコル全体を通して、モデルの成功を保証する重要な手順があります。最も重要なステップは、収穫後の組織の滅菌です。二酸化塩素溶液を組織サンプルと混合し、組織を十分に消毒して汚染物質を除去するために30分の接触時間を確保する必要があります。さらに、この実験を設定すると、不適切な取り扱いや消毒剤や抗生物質培地による効果のない処理により、濁りや真菌汚染が発生する可能性があります。このような場合、濁りを発症したサンプルは廃棄する必要があります。濁度や汚染の発生を減らすために、インキュベーターの頻繁な滅菌、フィルターチップの使用、およびサンプルで使用されるツールと容器の完全な滅菌を確実にして、実験室環境を清潔に保つ必要があります。プロトコルのもう1つの重要なステップは、4mmの生検パンチを使用して組織を創傷する場合です。このツールを使用すると、同様のサイズの創傷床が可能になり、プロトコルの再現性と再現性が保証されます。創傷床サイズの変動性は、エンドポイントCFUに影響を与えます。組織フラップの適切な除去がある場合、結果ははるかに一貫しています。エンドポイントCFU数の完全性に関連するさらなる重要なステップは、細菌細胞を遊離させるための先端の細かいホモジナイザーの使用です。ホモジナイザーチップの位置は、サンプルからサンプルへのCFUカウントに影響を与えることが見られました。先端が創傷床に直接正しく置かれた場合、サンプル間で見られる変動ははるかに少なかった。
それにもかかわらず、ここで提案されているモデルには制限がないわけではありません。このモデルには、すべてのex vivo研究に固有の制限があります(すなわち、.、活発な血管流の欠如、感染の進行を調節する可能性のある共生微生物叢の欠如、および免疫細胞の欠如)。ex vivo創傷モデルは活性免疫細胞を組み込まないので、これらの細胞の存在下でのin vivoでの感染進行はex vivoモデルで観察されたものとは異なる可能性があると主張することができる。いずれにしても、ex vivoモデルは、付着のための組織表面と細菌の栄養源を提供し、製剤に対する3D拡散障壁を提示し、従来の微生物培養技術よりも抗菌効果のより正確な評価を可能にします。
このモデルの主な利点は、組織が人間が消費するために育てられた子羊から供給されることです。より具体的には、モデルは、通常は廃棄される子羊の頭の皮膚を再利用します。さらに、このモデルは高いスループットを備えており、費用対効果が高く、迅速で再現性のある比較研究を可能にします。このモデルの利用可能性は、より人道的な研究慣行を促進する3つのRの原則に沿って、トランスレーショナルリサーチのために飼育された動物の必要性を減らし、洗練すると主張することができます。ここで説明するモデルは、例示的な病原体として 黄色ブドウ球菌 を組み込んでいますが、このモデルは、他の細菌、真菌、およびウイルスを含む他の微生物とともに使用できるため、モデルが可能にする医薬品開発の範囲を広げることができます。このモデルを使用することで、研究者が前臨床段階での薬剤の設計と処方をより細かく制御できるようにすることで、皮膚感染症に切望されている抗生物質の迅速な翻訳が可能になることが想像できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もありません
Acknowledgments
著者らは、EPSRC(EP/R513313/1)の資金提供に感謝する。著者らはまた、チェスターフィールドのカローにあるR.Bエリオットとサンアバトワールに子羊の頭を提供し、プロジェクトの初期段階で非常に親切にしてくれたこと、このプロトコルの開発を通じてサポートしてくれたカシアエメリー、シェフィールド大学の感染、免疫、心血管疾患学部のフィオナライトに組織学サンプルを処理し、このプロジェクト全体で非常に役立ったことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al.
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
