Summary
Протокол описывает пошаговый метод создания модели поврежденной овец ex vivo , инфицированной золотистым стафилококком. Эта высокопроизводительная модель лучше имитирует инфекции in vivo по сравнению с обычными методами микробиологии и предоставляет исследователям физиологически значимую платформу для проверки эффективности новых противомикробных препаратов.
Abstract
Разработка противомикробных препаратов является дорогостоящим процессом со все более низкими показателями успеха, что делает дальнейшие инвестиции в исследования по обнаружению противомикробных препаратов менее привлекательными. Открытие противомикробных препаратов и последующая коммерциализация могут стать более прибыльными, если подход «быстро и безотказно дешево» может быть реализован на этапах оптимизации лидов, где исследователи имеют больший контроль над дизайном и формулированием лекарств. В этой статье описана установка модели поврежденной овец ex vivo , инфицированной золотистым стафилококком, которая является простой, экономически эффективной, высокопроизводительной и воспроизводимой. Бактериальная физиология в модели имитирует, что во время инфекции бактериальная пролиферация зависит от способности патогена повреждать ткани. Установление раневой инфекции подтверждается увеличением жизнеспособного количества бактерий по сравнению с инокулятом. Эта модель может быть использована в качестве платформы для проверки эффективности новых противомикробных препаратов на этапе оптимизации лидов. Можно утверждать, что доступность этой модели предоставит исследователям, разрабатывающим противомикробные препараты, модель «быстро и без сбоев», которая поможет повысить показатели успеха в последующих испытаниях на животных. Модель также будет способствовать сокращению и совершенствованию использования животных для исследований и в конечном итоге позволит быстрее и экономичнее переводить новые противомикробные препараты для инфекций кожи и мягких тканей в клинику.
Introduction
Кожные инфекции являются важной глобальной проблемой, с большими экономическими издержками для поставщиков медицинских услуг во всем мире. Развитие множественной лекарственной устойчивости и образование биопленки патогенами играет ключевую роль в распространенности незаживающих ран 1,2,3,4. В результате этого инфекции кожи и мягких тканей являются одной из наиболее распространенных причин длительной госпитализации и последующей реадмиссии5. Задержки в заживлении ран являются дорогостоящими как для пациента, так и для медицинских работников, причем, по некоторым оценкам, около 6,5 миллионов пациентов ежегодно страдают в США. В Великобритании кожные инфекции и связанные с ними осложнения приводят к примерно 75 000 смертей ежегодно 2,4,6.
Золотистый стафилококк (S. aureus) является грозным раневым возбудителем, часто выделяемым из ран пациента 2,7. Скорость появления множественной лекарственной устойчивости резко возросла в 2000-х годах. В течение этого времени около 60% острых бактериальных инфекций кожи и структуры кожи были положительными для метициллин-резистентного S. aureus1. Растущее число штаммов с множественной лекарственной устойчивостью среди стафилококков, да и других патогенов, в течение последних 2 десятилетий указывает на острую необходимость быстрой разработки антибиотиков с новыми способами действия, которые могут преодолеть резистентность.
Тем не менее, с начала 2000-х годов в программах открытия антибиотиков доминировало более длительное время разработки и низкие показатели успеха, и только 17% новых антибиотиков, поступающих в клинические испытания в США, достигли одобрения рынка8. Это говорит о несоответствии между результатами тестирования in vitro новых антибиотиков и их клиническими результатами. Можно утверждать, что это несоответствие во многом связано с различиями в физиологии бактерий во время инфекций in vivo и во время обычных микробиологических методов при тестировании эффективности антибиотиков на доклинических стадиях in vitro . Поэтому новые лабораторные методы, которые более репрезентативны для бактериальной физиологии во время инфекции, необходимы для улучшения показателей успеха в программах открытия антибиотиков.
Современные методы изучения кожных инфекций включают исследования на живых животных (например, мышах), моделях кожи ex vivo (например, свиней) и 3D-тканеинженерных моделях кожи (например, человека)9,10,11,12. Исследования на живых животных строго регламентированы и имеют относительно низкую пропускную способность. На животных моделях раны и инфекции вызывают значительные страдания у животных и вызывают этические проблемы. Модели кожи человека, ex vivo или тканевые, требуют этического одобрения, соблюдения местного и глобального законодательства (Закон о тканях человека, Хельсинкская декларация), и существуют трудности с приобретением тканей, причем для выполнения некоторых запросов требуются годы для выполнения13,14. Оба типа моделей являются трудоемкими и требуют значительных знаний для обеспечения успеха экспериментов. Некоторые современные модели инфекции кожи ex vivo требуют предварительно инокулированных дисков и добавок для раневого ложа, чтобы обеспечить инфекцию; хотя эти модели невероятно полезны, существуют ограничения в процессе заражения, поскольку добавки ограничивают использование раневого ложа в качестве источника питательных веществ 10,15,16,17. Модель, описанная в этом исследовании, не использует никаких добавок к раневому слою, что гарантирует, что патология инфекции и количество жизнеспособных клеток являются результатом прямого использования раневого ложа в качестве единственного источника питательных веществ.
Учитывая необходимость новых лабораторных методов, была разработана новая высокопроизводительная модель овец ex vivo для использования при оценке эффективности новых антибиотиков. Исследования кожных инфекций сталкиваются со многими проблемами - высокими затратами, этическими проблемами и моделями, которые не показывают полной картины20,21. Модели ex vivo и 3D-модели эксплантата позволяют лучше визуализировать процесс заболевания и влияние, которое лечение может оказать от более клинически значимой модели. Здесь описана установка новой модели овечьей кожи, которая проста, воспроизводима и клинически значима и имеет высокую пропускную способность. Овечья кожа была выбрана, поскольку овцы являются одним из крупных млекопитающих, обычно используемых для моделирования реакций на инфекции in vivo. Кроме того, они легко доступны со скотобоен, обеспечивая постоянный запас кожи для исследований, а их туши не ошпариваются, обеспечивая хорошее качество тканей. В этом исследовании в качестве примера патогена использовался S. aureus; однако модель хорошо работает с другими микроорганизмами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Головы ягнят из скотобойни R.B Elliott и Son Abattoir были использованы в качестве источника образцов кожи в этом проекте. Всех ягнят забивали для потребления в пищу. Вместо того, чтобы отбрасывать головы, они были перепрофилированы для исследований. Этическое одобрение не требовалось, поскольку ткань была получена из отходов, выброшенных со скотобоен.
1. Стерилизация
- Дезинфицируйте щипцы перед сбором головок, взяв чистые щипцы и выполнив сухую тепловую стерилизацию в духовке при 200 °C в течение 1 ч. Автоклав всей стеклянной посуды при 121 °C в течение 15 мин перед использованием.
- Выполняйте все описанные работы в микробиологическом кабинете класса 2. Подготовьте все реагенты в соответствии с инструкциями производителя.
2. Сбор образцов
- На скотобойне ягнят Swaledale забивали с помощью электричества или пистолета с затвором в неволе и экссангировали. Собирайте головки ягнят не более 4 ч после убоя.
3. Подготовка руководителей
- Продезинфицируйте участок лба баранины, вылив примерно 100 мл раствора диоксида хлора 200 ppm на область образца. Сбрить лоб головы с помощью электрических клиперов и промыть участок 200 мл раствора диоксида хлора 200 ppm.
- Протрите область этанолом и синим рулетом и накройте область образца кремом для удаления волос в течение 35 минут. Аккуратно соскоблите крем для удаления волос с помощью инструмента для соскабливания и оцените площадь образца. Если осталось значительное количество волос, повторите процесс удаления волос.
- Используйте еще 200 мл раствора диоксида хлора, чтобы промыть область, а затем промыть этанолом и протереть синим рулоном.
- Используя стерильный 8-мм биопсийный перфоратор, вырежьте образцы кожи диаметром 8 мм из подготовленного участка. Удалите образцы с помощью стерильных щипцов и скальпеля с 15 лезвиями, гарантируя, что весь кожный жир удален.
- Поместите образцы в стерильную банку объемом 0,5 л, заполненную стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), а затем переложите их в стерильные пробирки объемом 50 мл с 50 мл раствором диоксида хлора 200 ppm, дважды инвертируйте и оставьте стерилизовать в течение 30 мин.
- Извлеките образцы из раствора диоксида хлора и промыть их, поместив их в 50 мл пробирку, заполненную 40 мл стерильного PBS. После мытья поместите каждый отдельный образец кожи в отдельный колодец из 24-луночной пластины.
- Добавьте 350 мкл предварительно нагретой среды, сохраняя образец на границе раздела воздух-жидкость. Состав среды следующий: MK media (Medium 199 с солями Хэнкса, L-глутаматом и 1,75 мг/мл бикарбоната натрия) и Ham's F12 в соотношении 1:1, с добавлением FBS (10% v/v), EGF (10 нг/мл), инсулина (5 мкг/мл), пенициллина-стрептомицина (100 Ед/мл) и амфотерицина B (2,5 мкг/мл).
- Запечатайте пластины из 24 скважин газопроницаемой пластиной и инкубируйте при 37 °C в увлажненном 5% CO2 тканевом инкубаторе на срок до 24 ч.
4. Уход за образцами кожи
- После инкубации удаляют питательную среду и промывают образцы в 500 мкл стерильного PBS. Добавляют среду без антибиотиков в каждый образец и инкубируют при 37 °C в увлажненном 5% тканевом инкубатореCO2 в течение 24 ч для удаления остаточных антибиотиков в образце.
- Если мутность или грибковая инфекция развиваются в среде без антибиотиков через 24 ч, то выбросьте образец.
5. Приготовление инокулята
- Приготовьте пробирку объемом 50 мл с 10 мл стерильного триптического соевого бульона. Возьмите свежую агаровую тарелку S. aureus и используйте тампон для переноса нескольких колоний в бульон. Инкубировать в течение 18 ч при 37 °C при 150 об/мин.
- Центрифуга при 4 000 х г в течение 3 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл стерильного PBS. Повторите дважды, чтобы обеспечить адекватное промывание клеток.
- Отрегулируйте инокулятор до 0,6 OD600 в стерильном PBS. Подтвердите нагрузку инокулята, выполнив ручной подсчет жизнеспособных пластин.
6. Инфицирование образцов кожи
- Приготовьте свежую 24-луночную пластину с 400 мкл предварительно нагретой среды, не содержащей антибиотиков, и добавьте в 24-луночные вставки с помощью стерильных щипцов.
- Извлеките носитель из образцов кожи, промойте 500 мкл стерильного PBS и удалите стирку. Используйте стерильные щипцы, чтобы аккуратно удерживать образец на дне колодца.
- Используйте 4-миллиметровую пункционную биопсию, чтобы сделать центральный раневой лоскут, прокалывающий на грубую глубину 1-2 мм. Затем используйте скальпель с 15 лезвиями и стерильные зубчатые щипцы для удаления верхнего слоя раневого лоскута. Изменчивость размеров раны может повлиять на исход инфекции и конечную точку колониеобразующих единиц (КОЕ).
- После того, как все образцы будут ранены, переложите их на 24-луночные вставки с помощью стерильных щипцов. Пипетка 15 мкл бактериального инокулята в раневое ложе. Затем инкубируют в течение 24 ч при 37 °C в увлажненном 5%CO2 тканевом инкубаторе.
- Если необходимы более длительные инкубационные периоды, удалите среду и замените ее свежей средой каждые 24 ч и инкубируйте в тех же условиях.
7. Определение бактериальной нагрузки
- Удалите носитель со дна скважин. С помощью стерильных щипцов переложите каждый образец в отдельную трубку объемом 50 мл, заполненную 1 мл стерильного PBS.
- Используйте гомогенизатор с тонким наконечником для гомогенизации поверхности образца. Позаботьтесь о том, чтобы раневое ложе находилось в непосредственном контакте с кончиком гомогенизатора.
- Гомогенизируйте каждый образец в течение 35 с на среднем/высоком уровне. Гомогенизатор отделяет бактерии от поверхности раневого ложа, чтобы обеспечить перечисление бактериальной нагрузки.
- После того, как все образцы обработаны, вихрь каждого образца, в свою очередь, перед пипеткой. Это делается для того, чтобы бактериальный гомогенат был смешан.
- Пипетка 20 мкл вихревого гомогената в соответствующую скважину 96-луночной пластины, содержащей 180 мкл стерильного PBS.
- Последовательно разбавляйте каждый образец гомогената до 1 х 10−7 и пипетки 10 мкл разбавленного гомогената на триптическую соевую агаровую пластину в трех экземплярах.
- Инкубировать агаровую пластину в течение 18 ч при температуре 37 °C. Затем подсчитайте количество колоний, чтобы определить КОЕ для каждого образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Определение пути стерилизации кожи перед созданием модели раневой инфекции было сложной задачей. Задача заключалась в стерилизации кожи без повреждения различных слоев кожи, что затем может иметь непреднамеренные последствия в результате инфекции. Чтобы определить подходящий режим стерилизации, были опробованы различные методы лечения в течение различных периодов времени, как показано в таблице 1. Загрязнение регистрировалось как развитие мутности через 48 ч в среде МК, используемой для поддержания образцов кожи. Целостность тканей контролировали с помощью гистологии с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E) сразу после лечения (рисунок 1). 30-минутная обработка диоксидом хлора оказалась наиболее эффективной при воспроизводимой стерилизации тканей кожи при сохранении целостности тканей.
В экспериментальной установке раненую стерильную ткань помещают в апикальную камеру 24-луночной вставки на границе раздела воздух-жидкость (рисунок 2А). Были предприняты две различные техники ранения - техника удаления лоскута, при которой ткань раняется инструментом пунш-биопсии, а верхний слой раненой ткани удаляется с использованием комбинации скальпеля с 15 лезвиями и стерильных зубчатых щипцов ткани аллиса, и техника царапин, в которой ткань раняется только инструментом для пункционной биопсии. Хотя скретч-модель содержала более высокое среднее количество КОЕ через 24 часа, результаты были переменными. Метод удаления лоскута дал более последовательные результаты (рисунок 2C). Через 48 ч из раненой ткани было извлечено примерно в 100 раз больше бактериальных КОЕ по сравнению с инокулятом (рисунок 2D). Это было сочтено признаком успешной инфекции. Белая пленка в раневом ложе была очевидна на ткани через 48 ч после заражения (рисунок 2B). Окрашенные по Граму гистологические участки инфицированной ткани указывали на наличие клеток S. aureus в раневом ложе (рисунок 2E,F). Окрашенные по Грам гистологические участки неинфицированной ткани представлены в качестве компаратора (рисунок 2G,H).
Из головы одного ягненка можно реально получить доступ к секции размером 100см2 (10 см х 10 см). Учитывая, что каждый участок кожи выбивается из лба с помощью круговой пунш-биопсии диаметром 8 мм, примерно 100 кожных пятен можно получить со лба одного ягненка в неделю. Дальнейшее приобретение голов ягнят пропорционально увеличивает количество образцов кожи, которые можно получить в неделю. Следовательно, утверждается, что процедура имеет относительно высокую пропускную способность. Для этого исследования регулярно получали 24 образца кожи в неделю. Кожа из голов различных ягнят была обработана как биологические реплики, чтобы учесть потенциальную изменчивость донора к донору. Во время приготовления кожных пластырей (этапы 3.1-3.8) основной затратой времени является 30-минутная инкубация образцов кожи в растворе диоксида хлора и 2 х 35 минут ожидания крема для удаления волос. Использование пункционной биопсии для создания 24 кожных пятен занимает около 15 минут. Именно на этот раз масштабировался бы линейно, если бы количество кожных пятен было увеличено.
| Дезинфицирующее средство | 10 мин | 30 мин | 60 мин |
| 1% дезинфицирующее средство для медицинских поверхностей высокого уровня | F | P | P |
| 1% многоцелевое дезинфицирующее средство | F | F | P |
| 3% повидон | F | F | F |
| 5% повидон | F | P | P |
| 10% повидон | F | P | P |
| 70% этанол | F | P | P |
| УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫЙ | F | F | F |
| 0,55% гипохлорит | F | P | P |
| 200 ppm диоксид хлора | F | P | P |
Таблица 1: Стерилизация свежей бараньей кожицы. Каждый образец кожи оставляли в дезинфицирующем средстве на указанное время. F обозначает неспособность стерилизовать ткань с бактериальным загрязнением, присутствующим в среде. P обозначает прохождение, без бактериального загрязнения, присутствующего в среде.
Рисунок 1: Гистология неинфицированной овечьей кожи ex vivo , обработанной дезинфицирующими средствами (окрашивание H&E) при 100-кратном увеличении. (A) Контрольный образец кожи с помощью 30-минутной процедуры в PBS. Можно увидеть некоторую эпидермальную линьку, но эпидермис не нарушается. (B) Овечья кожа, обработанная 1% дезинфицирующим средством для медицинских поверхностей высокого уровня в течение 30 мин. Эпидермальная линька (черная стрелка) вместе с некоторым нарушением гранулезного слоя (синяя стрелка). (C) Овечья кожа, обработанная 5% повидоном в течение 30 мин. Здесь можно увидеть умеренное повреждение тканей, при эпидермальном линьке рогового слоя (черная стрелка). Происходит минимальное нарушение в нижележащих эпидермальных слоях. (D) Овечья кожа, обработанная 10% повидоном в течение 30 мин. Верхние слои эпидермиса были повреждены, с признаками линьки (черная стрелка) и истончения (зеленая стрелка). (E) Овечья кожа, обработанная 2% многоцелевым дезинфицирующим средством в течение 30 мин. Может наблюдаться тяжелое повреждение образца, со значительным эпидермальным линькой (черная стрелка) и полным искоренением рогового слоя (красная стрелка). (F) Овечья кожа, обработанная 200 ppm диоксидом хлора в течение 30 мин. Можно увидеть некоторую эпидермальную линьку, но эпидермис неповрежден. (G) Овечья кожа, обработанная 0,6% гипохлоритом в течение 30 мин. Присутствует тяжелое повреждение эпидермиса, с высоким уровнем эпидермальной линьки (черная стрелка) и искоренением эпидермиса местами (красная стрелка). (H) Овечья кожа, обработанная 70% этанолом в течение 30 мин. Повреждение эпидермиса можно увидеть, со значительным эпидермальным линькой (черная стрелка). Шкала составляет 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Ex vivo овечья кожа, инфицированная S. aureus. (A) Схема экспериментальной установки. (B) Фотографии овечьей кожи ex vivo до заражения (левое изображение) и инфекции после 48 ч (изображение справа). Обратите внимание на белую пленку, присутствующую после 48-часовой инкубации в инфицированной ткани, которая отсутствует в неинфицированной ткани. (C) Тестирование влияния различных методов нанесения ран на конечную колониеобразующую единицу (КОЕ) после гомогенизации. Удаление лоскута (n = 6) и царапины (n = 9) заражено S. aureus в течение 24 ч. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. указывает p-значение < 0,0001. D) Проверка влияния инкубационного времени на количество КОЕ после гомогенизации. Инкубация 24 ч (n = 6) и инкубация 48 ч (n = 12). Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. указывает p-значение < 0,0001. (Э,Ф) Репрезентативные изображения гистопатологического анализа инфицированной овечьей кожи после 48 ч инфекции с модифицированным окрашиванием по Граму (Е) при 100-кратном увеличении (шкала бар 200 мкм). Поле указывает площадь, увеличенную в (F) при 1000-кратном увеличении (шкала 50 мкм). Черные стрелки указывают на бактерии. (Г,Ч) Репрезентативные изображения гистопатологического анализа неинфицированной овечьей кожи после 48-часового периода (контроль) с модифицированным пятном gGram (G) при 100-кратном увеличении (шкала бара 200 мкм). Поле указывает площадь, увеличенную в (H) при 1000-кратном увеличении (шкала 50 мкм). Статистический анализ проводился в виде одностороннего ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Разработка противомикробных препаратов является важным, но дорогостоящим предприятием, которое, по оценкам, стоит около 1 миллиарда долларов и занимает около 15 лет. Более 90% открытий противомикробных препаратов и доклинических исследований эффективности противомикробных препаратов проводятся академическими исследователями и малыми и средними компаниями с обычно менее чем 50 сотрудниками22. Эти команды очень финансово ограничены, что делает провал молекул свинца на более поздних стадиях трансляционных исследований катастрофическим. Рост устойчивости к противомикробным препаратам опережает разработку новых противомикробных препаратов, что еще больше усиливает необходимость ответственного управления и без того ограниченными инвестициями в исследования противомикробныхпрепаратов23.
Несоответствие в бактериальной физиологии между инфекциями in vivo и лабораторными культурами in vitro имеет тенденцию вызывать переоценку антимикробной эффективности попаданий на этапе идентификации свинца. Такое завышение способствует высоким показателям выбытия, наблюдаемым на последующих этапах перевода. Наличие платформ для тестирования эффективности противомикробных препаратов in vitro , которые включают бактерии с физиологией, которая лучше имитирует обнаруженные во время инфекций in vivo , позволит более точно оценить антимикробную эффективность и предоставит исследователям больший контроль над оптимизацией свинца без опоры на дорогостоящие и жестко регулируемые испытания на животных. Такие модели также уменьшат коэффициенты выбытия на последующих этапах трансляции и могут сделать открытие противомикробных препаратов более привлекательным для инвестиций.
Эта модель инфекции овечьей кожи, описанная здесь, является полезным инструментом, который предоставит исследователям физиологически значимую модель инфицированной раны in vitro для проверки эффективности новых актуальных антимикробных составов на доклинических стадиях. В отличие от большинства моделей инфекции ex vivo, описанных в научнойлитературе 10,15,24,25,26,27,28, в этой модели возбудители, подвергшиеся воздействию ткани ex vivo, не дополняются питательными средами во время инфекции. Пролиферация возбудителя и последующее заражение зависят от способности организма повреждать ткани. Поэтому физиология возбудителя в этой модели более тесно связана с физиологией во время инфекций in vivo по сравнению с обычными микробиологическими культурами. Из этой модели получается высоковоспроизводимая инфекция, о чем судят по количеству КОЕ, извлеченных из ткани после инкубации.
С обилием эквивалентов кожи человека и моделей ран ex vivo человека и свиней использование овечьей ткани в этой модели можно поверхностно считать ограничением. Тем не менее, овцы относятся к группе крупных животных, используемых в качестве моделей инфекций in vivo 29,30,31. Кроме того, овцы использовались в качестве суррогатов для людей в иммунологических исследованиях и разработке вакцин, что указывает на то, что их иммунные реакции аналогичны иммунным реакциям людей32. Процесс восстановления тканей во время заживления ран аналогичен у крупных млекопитающих, включая овец и людей 33,34, а вмешательства по улучшению заживления ран, которые были успешно продемонстрированы на овцах, были предложены для перевода людям 35,36,37. Поэтому использование ex vivo овечьей кожи в этой модели раны не является ограничением. Кроме того, эту модель овец можно считать надежной альтернативой моделям, включающим кожу человека или свиньи по следующим причинам. Доступность кожи человека ограничена и имеет переменное качество при наличии38. Тканеинженерный эпидермис человека и живые кожные эквиваленты требуют уточнения условий культивирования для обеспечения воспроизводимости в физиологиитканей 39. Хотя свиная кожа более доступна, чем человеческая, широко доступная свиная кожа ошпаривается как часть обработки туши на скотобойне, которая удаляет эпидермис10. По опыту, немасштабированная свиная кожа менее доступна на скотобойнях.
Во всем протоколе, описанном здесь, есть критические шаги, которые обеспечивают успех модели. Наиболее важный этап включает в себя стерилизацию ткани после сбора. Раствор диоксида хлора должен быть смешан с образцами тканей, и время контакта 30 мин должно быть предоставлено для достаточной дезинфекции ткани и удаления загрязнений. Кроме того, при проведении этого эксперимента может возникнуть мутность или грибковое загрязнение из-за неправильного обращения или неэффективной обработки дезинфицирующими средствами и антибиотическими средами. В таком случае образцы, у которых развивается мутность, должны быть выброшены. Чтобы уменьшить развитие мутности и загрязнения, лабораторную среду следует содержать в чистоте, с частой стерилизацией инкубатора, использованием фильтрующих наконечников и обеспечением полной стерилизации инструментов и контейнеров, используемых с образцами. Другим важным шагом в протоколе является использование 4-миллиметрового биопсийного пунша для ранения ткани. Использование этого инструмента позволяет использовать раневые пласты аналогичного размера для обеспечения повторяемости и воспроизводимости протокола. Изменчивость размера раневого ложа влияет на КОЕ конечной точки. Когда происходит адекватное удаление тканевого лоскута, результаты оказываются гораздо более последовательными. Еще одним важным шагом, связанным с целостностью количества КОЕ конечных точек, является использование гомогенизатора с тонкой опрокидкой для высвобождения бактериальных клеток. Было отмечено, что положение наконечника гомогенизатора влияет на количество КОЕ от образца к образцу; когда наконечник был правильно размещен непосредственно на раневом слое, наблюдалась гораздо меньшая изменчивость от образца к образцу.
Тем не менее, предлагаемая здесь модель не лишена ограничений. Эта модель имеет ограничения, присущие всем исследованиям ex vivo (например, отсутствие активного сосудистого потока, отсутствие комменсальной микробиоты, которая может модулировать прогресс инфекции, и отсутствие иммунных клеток). Можно утверждать, что, поскольку раневая модель ex vivo не включает активные иммунные клетки, прогрессирование инфекции in vivo в присутствии этих клеток может отличаться от того, что наблюдается в моделях ex vivo . Несмотря на это, модели ex vivo обеспечивают поверхность ткани для прикрепления и источник питательных веществ для бактерий и представляют собой 3D-диффузионный барьер для составов, что позволяет более точно оценивать антимикробную эффективность, чем обычные методы микробиологических культур.
Ключевым преимуществом модели является то, что ткань получена из ягнят, которые выращиваются для потребления человеком. В частности, модель перепрофилирует кожу с голов ягнят, которые обычно выбрасываются. Кроме того, модель имеет высокую пропускную способность и позволяет проводить экономически эффективные, быстрые и воспроизводимые сравнительные исследования. Можно утверждать, что наличие этой модели уменьшит и уточнит потребность в животных, специально выведенных для трансляционных исследований в соответствии с принципами трех R, что способствует более гуманной исследовательской практике. Хотя модель, описанная здесь, включает S. aureus в качестве примера патогена, модель может быть использована с другими микроорганизмами, включая другие бактерии, грибы и вирусы, тем самым расширяя сферу разработки лекарств, которую позволяет модель. Можно предположить, что использование этой модели позволит быстро трансформировать столь необходимые антибиотики при кожных инфекциях, предоставляя исследователям больший контроль над дизайном и формулированием лекарств на доклинических стадиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить EPSRC (EP/R513313/1) за финансирование. Авторы хотели бы также поблагодарить R.B Elliot и Son Abattoir в Калоу, Честерфилд, за предоставление голов ягнят и за то, что они были так любезны на ранних стадиях проекта, Касию Эмери за ее поддержку на протяжении всего развития этого протокола и Фиону Райт из Департамента инфекций, иммунитета и сердечно-сосудистых заболеваний в Университете Шеффилда за обработку образцов гистологии и невероятное содействие на протяжении всего этого проекта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al.
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
