Summary
Le protocole décrit une méthode étape par étape pour mettre en place un modèle ex vivo de peau blessée ovine infectée par Staphylococcus aureus. Ce modèle à haut débit simule mieux les infections in vivo par rapport aux techniques de microbiologie conventionnelles et offre aux chercheurs une plateforme physiologiquement pertinente pour tester l’efficacité des antimicrobiens émergents.
Abstract
Le développement d’antimicrobiens est un processus coûteux avec des taux de réussite de plus en plus faibles, ce qui rend les investissements supplémentaires dans la recherche sur la découverte d’antimicrobiens moins attrayants. La découverte de médicaments antimicrobiens et leur commercialisation subséquente peuvent être rendues plus lucratives si une approche rapide et peu coûteuse peut être mise en œuvre au cours des étapes d’optimisation des pistes où les chercheurs ont un plus grand contrôle sur la conception et la formulation des médicaments. Dans cet article, la configuration d’un modèle ex vivo de peau blessée ovine infectée par Staphylococcus aureus est décrite, ce qui est simple, rentable, à haut débit et reproductible. La physiologie bactérienne dans le modèle imite que pendant l’infection, la prolifération bactérienne dépend de la capacité de l’agent pathogène à endommager le tissu. L’établissement de l’infection de la plaie est vérifié par une augmentation du nombre de bactéries viables par rapport à l’inoculum. Ce modèle peut être utilisé comme plateforme pour tester l’efficacité des antimicrobiens émergents à l’étape de l’optimisation des prospects. On peut soutenir que la disponibilité de ce modèle fournira aux chercheurs qui développent des antimicrobiens un modèle d’échec rapide et bon marché, ce qui contribuera à augmenter les taux de réussite dans les essais ultérieurs sur les animaux. Le modèle facilitera également la réduction et le perfectionnement de l’utilisation des animaux pour la recherche et, en fin de compte, permettra une application plus rapide et plus rentable de nouveaux antimicrobiens pour les infections de la peau et des tissus mous à la clinique.
Introduction
Les infections cutanées sont un problème mondial important, avec des coûts économiques importants pour les prestataires de soins de santé du monde entier. Le développement de la multirésistance aux médicaments et la formation de biofilms par des agents pathogènes jouent un rôle clé dans la prévalence des plaies non cicatrisantes 1,2,3,4. En conséquence, les infections de la peau et des tissus mous sont l’une des raisons les plus courantes d’hospitalisation prolongée et de réadmission ultérieure5. Les retards dans la cicatrisation des plaies sont coûteux pour le patient et les prestataires de soins de santé, certaines estimations suggérant qu’environ 6,5 millions de patients sont touchés chaque année aux États-Unis. Au Royaume-Uni, les infections cutanées et les complications associées entraînent environ 75 000 décès par an 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) est un pathogène redoutable des plaies fréquemment isolé des plaies des patients 2,7. Le taux d’émergence de la multirésistance a considérablement augmenté dans les années 2000. Pendant ce temps, environ 60% des infections bactériennes aiguës de la peau et de la structure de la peau étaient positives à la culture pour S. aureus1 résistant à la méthicilline. Le nombre croissant de souches multirésistantes parmi les staphylocoques, et même d’autres agents pathogènes, au cours des 2 dernières décennies indique un besoin urgent de développement rapide d’antibiotiques avec de nouveaux modes d’action capables de surmonter la résistance.
Cependant, depuis le début des années 2000, les programmes de découverte d’antibiotiques ont été dominés par des temps de développement plus longs et de faibles taux de réussite, avec seulement 17% des nouveaux antibiotiques entrant dans les essais cliniques aux États-Unis obtenant l’approbation de mise sur le marché8. Cela suggère une disparité entre les résultats des tests in vitro d’antibiotiques émergents et leurs résultats cliniques. On peut soutenir que cette disparité est en grande partie due aux différences de physiologie bactérienne au cours des infections in vivo et au cours des méthodes microbiologiques conventionnelles lors de l’essai de l’efficacité des antibiotiques aux stades précliniques in vitro . Par conséquent, de nouvelles méthodes de laboratoire plus représentatives de la physiologie bactérienne pendant l’infection sont nécessaires pour améliorer les taux de réussite des programmes de découverte d’antibiotiques.
Les méthodes actuelles d’étude des infections cutanées comprennent des études sur des animaux vivants (p. ex. souris), des modèles cutanés ex vivo (p. ex. porcins) et des modèles cutanés issus de l’ingénierie tissulaire 3D (p. ex. humains)9,10,11,12. Les études sur des animaux vivants sont strictement réglementées et ont un débit relativement faible. Dans les modèles animaux, les blessures et les infections causent une détresse importante aux animaux et soulèvent des préoccupations éthiques. Les modèles de peau humaine, ex vivo ou tissulaires, nécessitent une approbation éthique, le respect de la législation locale et mondiale (la loi sur les tissus humains, la déclaration d’Helsinki), et il est difficile d’acquérir des tissus, certaines demandes prenant des années à satisfaire13,14. Les deux types de modèles exigent beaucoup de main-d’œuvre et nécessitent une expertise importante pour assurer le succès expérimental. Certains modèles actuels d’infection cutanée ex vivo nécessitent des disques pré-inoculés et des additifs pour le lit de la plaie afin de permettre l’infection; Bien que ces modèles soient incroyablement utiles, il existe des limites dans le processus d’infection car les additifs limitent l’utilisation du lit de la plaie comme source de nutriments10,15,16,17. Le modèle décrit dans cette étude n’utilise aucun additif au lit de la plaie, ce qui garantit que la pathologie de l’infection et le nombre de cellules viables sont le résultat de l’utilisation directe du lit de la plaie comme seule source de nutriments.
Compte tenu de la nécessité de nouvelles méthodes de laboratoire, un nouveau modèle ovin ex vivo à haut débit d’infections cutanées a été mis au point pour évaluer l’efficacité des antibiotiques émergents. Les études sur les infections cutanées font face à de nombreux défis - coûts élevés, préoccupations éthiques et modèles qui ne donnent pas une image complète20,21. Les modèles ex vivo et les modèles 3D explant permettent une meilleure visualisation du processus de la maladie et de l’impact que les traitements peuvent avoir à partir d’un modèle plus pertinent sur le plan clinique. Ici, la configuration d’un nouveau modèle de peau ovine est décrite, qui est simple, reproductible et cliniquement pertinente et a un débit élevé. La peau d’ovins a été choisie car les moutons sont l’un des grands mammifères couramment utilisés pour modéliser les réponses aux infections in vivo. De plus, ils sont facilement disponibles dans les abattoirs, ce qui assure un approvisionnement régulier en peau pour la recherche, et leurs carcasses ne sont pas ébouillantées, ce qui garantit une bonne qualité des tissus. Cette étude a utilisé S. aureus comme agent pathogène exemplaire; Cependant, le modèle fonctionne bien avec d’autres micro-organismes.
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Protocol
Les têtes d’agneau de l’abattoir R.B Elliott and Son ont été utilisées comme source d’échantillons de peau dans le cadre de ce projet. Tous les agneaux ont été abattus pour être consommés comme aliments. Au lieu de jeter les têtes, celles-ci ont été réutilisées pour la recherche. L’approbation éthique n’était pas requise puisque les tissus provenaient de déchets jetés dans les abattoirs.
1. Stérilisation
- Désinfecter les pinces avant la collecte des têtes en prenant des pinces propres et en effectuant une stérilisation à la chaleur sèche dans une étuve à 200 °C pendant 1 h. Autoclaver toute la verrerie à 121 °C pendant 15 min avant utilisation.
- Effectuer tous les travaux décrits dans une armoire de classe de microbiologie 2. Préparez tous les réactifs conformément aux instructions du fabricant.
2. Prélèvement d’échantillons
- Dans l’abattoir, les agneaux de Swaledale étaient abattus par étourdissement à l’aide d’électricité ou d’un pistolet à tige captive et exsanguinés. Collecter les têtes d’agneau au plus tard 4 heures après l’abattage.
3. Préparation des têtes
- Désinfecter la section frontale de l’agneau en versant environ 100 mL de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm sur la zone d’échantillonnage. Raser la section frontale de la tête à l’aide d’une tondeuse électrique et laver la zone avec 200 ml de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm.
- Essuyez la zone avec de l’éthanol et un rouleau bleu et couvrez la zone d’échantillon avec de la crème dépilatoire pendant 35 min. Grattez délicatement la crème dépilatoire à l’aide d’un outil de grattage et évaluez la zone d’échantillonnage. S’il reste une quantité importante de poils, répétez le processus d’épilation.
- Utilisez 200 mL supplémentaires de solution de dioxyde de chlore pour rincer la zone, puis rincez à l’éthanol et essuyez avec un rouleau bleu.
- À l’aide d’un poinçon de biopsie stérile de 8 mm, découper des échantillons de peau de 8 mm dans la zone préparée. Retirez les échantillons à l’aide d’une pince stérile et d’un scalpel à 15 lames, en veillant à ce que toute la graisse cutanée soit éliminée.
- Placer les échantillons dans un pot stérile de 0,5 L rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, puis les transférer dans des tubes stériles de 50 mL avec 50 mL de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm, inverser deux fois, et laisser stériliser pendant 30 minutes.
- Retirez les échantillons de la solution de dioxyde de chlore et lavez-les en les plaçant dans un tube de 50 mL rempli de 40 mL de PBS stérile. Une fois lavé, placez chaque échantillon de peau dans un puits séparé d’une assiette de 24 puits.
- Ajouter 350 μL de milieu préchauffé tout en maintenant l’échantillon à l’interface air-liquide. La composition du milieu est la suivante : milieu MK (milieu 199 avec sels de Hanks, L-glutamate et 1,75 mg/mL de bicarbonate de sodium) et F12 de Ham dans un rapport de 1:1, avec ajout de FBS (10 % v/v), EGF (10 ng/mL), insuline (5 μg/mL), pénicilline-streptomycine (100 U/mL) et amphotéricine B (2,5 μg/mL).
- Sceller les plaques à 24 puits avec un joint de plaque perméable aux gaz et incuber à 37 °C dans un incubateur de tissus humidifié à 5% de CO2 pendant 24 heures maximum.
4. Conservation des échantillons de peau
- Après l’incubation, retirer le milieu de culture et rincer les échantillons dans 500 μL de PBS stérile. Ajouter un milieu sans antibiotique à chaque échantillon et incuber à 37 °C dans un incubateur tissulaire humidifié à 5 % de CO2 pendant 24 h pour éliminer les antibiotiques résiduels dans l’échantillon.
- Si une turbidité ou une infection fongique se développe dans le milieu sans antibiotique après 24 heures, jetez l’échantillon.
5. Préparation de l’inoculum
- Préparez un tube de 50 ml avec 10 ml de bouillon de soya tryptique stérile. Prenez une plaque de gélose fraîche de S. aureus et utilisez un écouvillon pour transférer plusieurs colonies dans le bouillon. Incuber pendant 18 h à 37 °C à 150 tr/min.
- Centrifuger à 4 000 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de PBS stérile. Répétez deux fois pour assurer un lavage adéquat des cellules.
- Ajuster l’inoculum à 0,6 OD600 dans du PBS stérile. Confirmer la charge d’inoculum en effectuant une numération manuelle viable sur la plaque.
6. Infection des échantillons de peau
- Préparez une nouvelle assiette de 24 puits avec 400 μL de milieu préchauffé sans antibiotique et ajoutez les inserts de 24 puits à l’aide de pinces stériles.
- Retirez le média des échantillons de peau, lavez avec 500 μL de PBS stérile et retirez le lavage. Utilisez des pinces stériles pour maintenir doucement l’échantillon au fond du puits.
- Utilisez une biopsie à l’emporte-pièce de 4 mm pour faire un lambeau central de la plaie, perçant à une profondeur approximative de 1-2 mm. Ensuite, utilisez un scalpel à 15 lames et une pince à tissus allis à dents stériles pour enlever la couche supérieure du lambeau de la plaie. La variabilité des dimensions de la plaie peut affecter l’issue de l’infection et les unités formant colonies (UFC).
- Une fois que tous les échantillons ont été blessés, transférez-les dans les inserts de 24 puits à l’aide de pinces stériles. Pipeter 15 μL de l’inoculum bactérien dans le lit de la plaie. Ensuite, incuber pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur tissulaire humidifié à 5% de CO2 .
- Si des périodes d’incubation plus longues sont nécessaires, retirez le média et remplacez-le par un média frais toutes les 24 heures et incuber dans les mêmes conditions.
7. Détermination de la charge bactérienne
- Retirez le média du fond des puits. À l’aide d’une pince stérile, transférer chaque échantillon dans un tube séparé de 50 mL rempli de 1 mL de PBS stérile.
- Utilisez un homogénéisateur à pointe fine pour homogénéiser la surface de l’échantillon. Veillez à ce que le lit de la plaie soit en contact direct avec l’extrémité de l’homogénéisateur.
- Homogénéiser chaque échantillon pendant 35 s à moyen/vif. L’homogénéisateur détache les bactéries de la surface du lit de la plaie pour permettre le dénombrement de la charge bactérienne.
- Une fois tous les échantillons traités, vortex chaque échantillon, à tour de rôle, avant le pipetage. Ceci afin de s’assurer que l’homogénat bactérien est mélangé.
- Pipeter 20 μL d’homogénat vortex dans le puits correspondant d’une plaque de 96 puits contenant 180 μL de PBS stérile.
- Diluer en série chaque homogénat d’échantillon à 1 x 10−7 et pipeter 10 μL de l’homogénat dilué sur une plaque de gélose au soja tryptique en trois exemplaires.
- Incuber la gélose pendant 18 h à 37 °C. Ensuite, comptez le nombre de colonies pour déterminer l’UFC pour chaque échantillon.
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Representative Results
L’identification d’une voie de stérilisation de la peau avant la mise en place du modèle d’infection de la plaie a été difficile. Le défi consistait à stériliser la peau sans endommager les différentes couches de la peau, ce qui peut avoir des conséquences imprévues sur l’issue de l’infection. Pour identifier un régime de stérilisation approprié, différents traitements ont été essayés pour des durées variables, comme indiqué dans le tableau 1. La contamination a été enregistrée comme le développement de la turbidité après 48 heures dans le milieu MK utilisé pour maintenir les échantillons de peau. L’intégrité des tissus a été surveillée par histologie suivie d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) immédiatement après le traitement (Figure 1). Un traitement de 30 minutes au dioxyde de chlore s’est avéré le plus efficace pour stériliser de manière reproductible le tissu cutané tout en préservant l’intégrité des tissus.
Dans la configuration expérimentale, le tissu stérile blessé est placé dans la chambre apicale d’un insert de 24 puits à l’interface air-liquide (Figure 2A). Deux techniques de blessure différentes ont été tentées - une technique d’enlèvement de lambeau, dans laquelle le tissu est blessé par un outil de biopsie à l’emporte-pièce et la couche supérieure du tissu blessé est retirée à l’aide d’une combinaison d’un scalpel à 15 lames et d’une pince à tissus allis à dents stériles, et une technique de grattage, dans laquelle le tissu est blessé par un outil de biopsie à l’emporte-pièce seul. Bien que le modèle scratch abritait un nombre moyen plus élevé d’UFC après 24 h, les résultats étaient variables. La technique d’enlèvement des volets a donné des résultats plus cohérents (figure 2C). Après 48 h, environ 100 fois plus d’UFC bactériennes ont été récupérées dans le tissu blessé par rapport à l’inoculum (Figure 2D). Cela a été considéré comme indiquant une infection réussie. Une pellicule blanche dans le lit de la plaie était visible sur le tissu 48 heures après l’infection (figure 2B). Des coupes histologiques de tissu infecté colorées à Gram ont indiqué la présence de cellules de S. aureus dans le lit de la plaie (figure 2E,F). Des coupes histologiques colorées à Gram de tissus non infectés sont fournies à titre de comparateur (figure 2G,H).
À partir d’une tête d’agneau, une section de 100 cm2 (10 cm x 10 cm) est accessible de manière réaliste. Étant donné que chaque parcelle de peau est perforée sur le front à l’aide d’une biopsie circulaire à l’emporte-pièce de 8 mm de diamètre, environ 100 plaques cutanées peuvent être obtenues à partir du front d’un agneau par semaine. L’achat de têtes d’agneau supplémentaires augmente proportionnellement le nombre d’échantillons de peau pouvant être obtenus par semaine. Par conséquent, il est affirmé que la procédure est relativement à haut débit. Pour cette étude, 24 échantillons de peau ont été prélevés systématiquement par semaine. La peau de diverses têtes d’agneau a été traitée comme des répliques biologiques pour tenir compte de la variabilité potentielle du donneur au donneur. Lors de la préparation des patchs cutanés (étapes 3.1-3.8), la principale consommation de temps est l’incubation de 30 min des échantillons de peau dans la solution de dioxyde de chlore et l’attente de 2 x 35 min pour le traitement de la crème dépilatoire. L’utilisation de la biopsie à l’emporte-pièce pour générer les 24 patchs cutanés prend environ 15 min. C’est cette fois qui évoluerait linéairement si le nombre de plaques cutanées était augmenté.
| Désinfectant | 10 min | 30 min | 60 min |
| 1 % de désinfectant médical de surface de haut niveau | F | P | P |
| 1 % désinfectant polyvalent | F | F | P |
| 3% povidone | F | F | F |
| 5% povidone | F | P | P |
| 10% povidone | F | P | P |
| 70% d’éthanol | F | P | P |
| UV | F | F | F |
| Hypochlorite à 0,55 % | F | P | P |
| 200 ppm de dioxyde de chlore | F | P | P |
Tableau 1 : Stérilisation de la peau fraîche de l’agneau. Chaque échantillon de peau a été laissé dans le désinfectant pendant la durée spécifiée. F indique l’échec de la stérilisation du tissu, avec une contamination bactérienne présente dans le milieu. P indique un passage, sans contamination bactérienne présente dans le milieu.
Figure 1 : Histologie de la peau ovine ex vivo non infectée traitée avec des désinfectants (coloration H&E) à un grossissement de 100x. (A) Échantillon de peau témoin avec un traitement de 30 minutes dans PBS. Une certaine excrétion épidermique peut être observée, mais l’épiderme n’est pas perturbé. (B) Peau d’ovins traitée avec 1 % de désinfectant médical de surface de haute intensité pendant 30 min. Excrétion épidermique (flèche noire) accompagnée d’une certaine perturbation de la couche granulosum (flèche bleue). (C) Peau ovine traitée avec 5% de povidone pendant 30 min. Des dommages modérés au tissu peuvent être observés ici, avec une perte épidermique de la couche cornée (flèche noire). Il y a une perturbation minimale des couches épidermiques sous-jacentes. (D) Peau ovine traitée avec 10% de povidone pendant 30 min. Les couches supérieures de l’épiderme ont été endommagées, avec des signes d’excrétion (flèche noire) et d’amincissement (flèche verte). E) Peau d’ovins traitée avec un désinfectant polyvalent à 2 % pendant 30 min. De graves dommages à l’échantillon peuvent être observés, avec une excrétion épidermique importante (flèche noire) et une éradication complète de la couche cornée (flèche rouge). F) Peau d’ovins traitée dans 200 ppm de dioxyde de chlore pendant 30 min. Une certaine excrétion épidermique peut être observée, mais l’épiderme est intact. G) Peau d’ovins traitée avec de l’hypochlorite à 0,6 % pendant 30 min. De graves dommages à l’épiderme sont présents, avec un niveau élevé d’excrétion épidermique (flèche noire) et l’éradication de l’épiderme par endroits (flèche rouge). H) Peau d’ovins traitée à l’éthanol à 70 % pendant 30 min. Des dommages à l’épiderme peuvent être observés, avec une excrétion épidermique importante (flèche noire). La barre d’échelle est de 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Peau ovine ex vivo infectée par S. aureus. (A) Schéma de la configuration expérimentale. (B) Photos de peau ovine ex vivo avant l’infection (image de gauche) et après 48 heures d’infection (image de droite). Notez le film blanc présent après 48 h d’incubation dans les tissus infectés, qui est absent dans les tissus non infectés. (C) Tester l’effet de différentes méthodes de blessure sur le dénombrement final des unités formant colonie (UFC) après homogénéisation. Enlèvement du lambeau (n = 6) et égratignure (n = 9) infectés par S. aureus pendant 24 h. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. indique une valeur de p < 0,0001. (D) Tester l’effet des temps d’incubation sur le nombre d’UFC après homogénéisation. Incubation de 24 h (n = 6) et incubation de 48 h (n = 12). Les barres d’erreur indiquent l’écart type. indique une valeur de p < 0,0001. (E,F) Images représentatives de l’analyse histopathologique de la peau d’ovins infectés après 48 h d’infection avec une coloration de Gram modifiée (E) à un grossissement de 100x (barre d’échelle de 200 μm). La case indique la surface agrandie en (F) à un grossissement de 1 000x (barre d’échelle de 50 μm). Les flèches noires indiquent des bactéries. (G,H) Images représentatives de l’analyse histopathologique de la peau ovine non infectée après une période de 48 heures (témoin) avec une coloration gGram modifiée (G) à un grossissement de 100x (barre d’échelle de 200 μm). La case indique la surface agrandie en (H) à un grossissement de 1 000x (barre d’échelle de 50 μm). L’analyse statistique a été réalisée sous la forme d’une ANOVA unidirectionnelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le développement d’antimicrobiens est une entreprise importante mais coûteuse qui devrait coûter environ 1 milliard de dollars et prendre environ 15 ans. Plus de 90 % des découvertes de médicaments antimicrobiens et des études précliniques sur l’efficacité des médicaments antimicrobiens sont réalisées par des chercheurs universitaires et des petites et moyennes entreprises comptant généralement moins de 50 employés22. Ces équipes sont très contraintes financièrement, ce qui rend catastrophique l’échec des molécules de plomb dans les étapes ultérieures de la recherche translationnelle. L’augmentation de la résistance aux antimicrobiens dépasse le développement de nouveaux antimicrobiens, ce qui intensifie encore la nécessité de gérer de manière responsable l’investissement déjà limité dans la recherche antimicrobienne23.
La disparité de physiologie bactérienne entre les infections in vivo et in vitro en laboratoire tend à provoquer une surestimation de l’efficacité antimicrobienne des résultats positifs au cours de la phase d’identification du plomb. Cette surestimation contribue aux taux d’attrition élevés observés au cours des étapes ultérieures de la traduction. La disponibilité de plateformes de tests d’efficacité antimicrobienne in vitro qui intègrent des bactéries dont la physiologie imite mieux celle trouvée lors d’infections in vivo permettra une estimation plus précise de l’efficacité antimicrobienne et fournira aux chercheurs un meilleur contrôle de l’optimisation du plomb sans dépendre d’essais coûteux et étroitement réglementés sur des animaux. De tels modèles réduiront également les taux d’attrition au cours des étapes ultérieures de la traduction et pourraient rendre la découverte de médicaments antimicrobiens plus attrayante pour les investissements.
Ce modèle d’infection cutanée ovine décrit ici est un outil utile qui fournira aux chercheurs un modèle in vitro physiologiquement pertinent d’une plaie infectée pour tester l’efficacité des formulations antimicrobiennes topiques émergentes aux stades précliniques. Contrairement à la majorité des modèles d’infection ex vivo décrits dans la littérature scientifique 10,15,24,25,26,27,28, dans ce modèle, les agents pathogènes exposés au tissu ex vivo ne sont pas complétés par des milieux de culture pendant l’infection. La prolifération des agents pathogènes et l’infection subséquente dépendent de la capacité de l’organisme à endommager les tissus. Par conséquent, la physiologie pathogène dans ce modèle est plus étroitement liée à celle des infections in vivo par rapport aux cultures microbiologiques conventionnelles. Une infection hautement reproductible est obtenue à partir de ce modèle, à en juger par le nombre d’UFC prélevées dans le tissu après incubation.
Avec la pléthore d’équivalents de peau humaine et de modèles de plaies ex vivo humaines et porcines, l’utilisation de tissus ovins dans ce modèle pourrait être superficiellement considérée comme une limitation. Cependant, les moutons font partie du groupe de grands animaux utilisés comme modèles d’infections in vivo 29,30,31. De plus, les moutons ont été utilisés comme substituts pour les humains dans la recherche en immunologie et le développement de vaccins, ce qui indique que leurs réponses immunitaires sont similaires à celles des humains32. Le processus de réparation tissulaire pendant la cicatrisation des plaies est similaire chez les grands mammifères, y compris les moutons et les humains33,34, et des interventions visant à améliorer la cicatrisation des plaies qui ont été démontrées avec succès chez les moutons ont été suggérées pour application à l’homme35,36,37. Par conséquent, l’utilisation de peau ovine ex vivo dans ce modèle de plaie n’est pas une limitation. En outre, ce modèle ovin peut être considéré comme une alternative fiable aux modèles incorporant de la peau humaine ou porcine pour les raisons suivantes. La disponibilité de la peau humaine est limitée et de qualité variable lorsqu’elle est disponible38. L’épiderme humain issu du génie tissulaire et les équivalents cutanés vivants nécessitent des améliorations dans leurs conditions de culture pour assurer la reproductibilité dans la physiologie tissulaire39. Bien que la peau de porc soit plus accessible que la peau humaine, la peau de porc largement disponible est ébouillantée dans le cadre du traitement de la carcasse dans l’abattoir, ce qui enlève l’épiderme10. Par expérience, la peau de porc non ébouillantée est moins facilement disponible dans les abattoirs.
Tout au long du protocole décrit ici, il y a des étapes critiques qui assurent le succès du modèle. L’étape la plus critique implique la stérilisation du tissu après le prélèvement. La solution de dioxyde de chlore doit être mélangée aux échantillons de tissus et un temps de contact de 30 minutes doit être prévu pour désinfecter suffisamment les tissus et éliminer les contaminants. De plus, lors de la mise en place de cette expérience, la turbidité ou la contamination fongique peut survenir en raison d’une mauvaise manipulation ou d’un traitement inefficace avec des désinfectants et des milieux antibiotiques. Dans un tel cas, les échantillons qui développent une turbidité doivent être jetés. Pour réduire le développement de turbidité et de contamination, l’environnement du laboratoire doit être maintenu propre, avec une stérilisation fréquente de l’incubateur, l’utilisation d’embouts filtrants et la stérilisation complète des outils et des contenants utilisés avec les échantillons. Une autre étape critique du protocole est lorsque le poinçon de biopsie de 4 mm est utilisé pour enrouler le tissu. L’utilisation de cet outil permet d’obtenir des lits de plaies de taille similaire pour assurer la répétabilité et la reproductibilité du protocole. La variabilité de la taille du lit de la plaie a un impact sur le critère d’évaluation de l’UFC. Lorsqu’il y a un retrait adéquat du lambeau tissulaire, les résultats sont beaucoup plus cohérents. Une autre étape critique associée à l’intégrité du nombre d’UFC est l’utilisation de l’homogénéisateur à pointe fine pour libérer les cellules bactériennes. La position de l’embout de l’homogénéisateur a eu une incidence sur le nombre d’UFC d’un échantillon à l’autre; Lorsque la pointe était correctement placée directement sur le lit de la plaie, il y avait beaucoup moins de variabilité observée d’un échantillon à l’autre.
Néanmoins, le modèle proposé ici n’est pas sans limites. Ce modèle présente des limites inhérentes à toutes les études ex vivo (c.-à-d. l’absence de flux vasculaire actif, l’absence de microbiote commensal, qui peut moduler la progression de l’infection, et l’absence de cellules immunitaires). On peut soutenir que, puisque le modèle de plaie ex vivo n’intègre pas de cellules immunitaires actives, la progression de l’infection in vivo en présence de ces cellules pourrait être différente de celle observée dans les modèles ex vivo. Quoi qu’il en soit, les modèles ex vivo fournissent une surface tissulaire pour la fixation et une source de nutriments pour les bactéries et présentent une barrière de diffusion 3D aux formulations, ce qui permet une évaluation plus précise de l’efficacité antimicrobienne que les techniques de culture microbiologique conventionnelles.
Un avantage clé du modèle est que le tissu provient d’agneaux élevés pour la consommation humaine. Plus particulièrement, le modèle réutilise la peau des têtes d’agneau, qui sont généralement jetées. De plus, le modèle a un débit élevé et permet des études comparatives rentables, rapides et reproductibles. On peut soutenir que la disponibilité de ce modèle réduira et affinera le besoin d’animaux élevés à des fins de recherche translationnelle conformément aux principes des trois R, qui facilitent des pratiques de recherche plus humaines. Bien que le modèle décrit ici incorpore S. aureus comme agent pathogène exemplaire, le modèle peut être utilisé avec d’autres micro-organismes, y compris d’autres bactéries, champignons et virus, élargissant ainsi la portée du développement de médicaments que le modèle permet. On peut imaginer que l’utilisation de ce modèle permettra la traduction rapide d’antibiotiques indispensables pour les infections cutanées en offrant aux chercheurs un meilleur contrôle sur la conception et la formulation des médicaments aux stades précliniques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier EPSRC (EP/R513313/1) pour son financement. Les auteurs aimeraient également remercier R.B Elliot and Son Abattoir à Calow, Chesterfield, pour avoir fourni des têtes d’agneau et pour avoir été si accommodantes dans les premières étapes du projet, Kasia Emery pour son soutien tout au long de l’élaboration de ce protocole, et Fiona Wright du Département des infections, de l’immunité et des maladies cardiovasculaires de l’Université de Sheffield pour le traitement des échantillons histologiques et leur aide incroyable tout au long de ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
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