Caenorhabditis elegans fungerer som et fremragende modelsystem med robuste og billige metoder til kortlægning af sundhed, levetid og modstandsdygtighed over for stress.
Opdagelsen og udviklingen af Caenorhabditis elegans som en modelorganisme var indflydelsesrig i biologi, især inden for aldring. Mange historiske og nutidige undersøgelser har identificeret tusindvis af levetidsændrende paradigmer, herunder genetiske mutationer, transgen genekspression og hormese, en gavnlig, lavgradig eksponering for stress. Med sine mange fordele, herunder en kort levetid, nem og billig vedligeholdelse og fuldt sekventeret genom med homologi til næsten to tredjedele af alle menneskelige gener, er C. elegans hurtigt blevet vedtaget som en fremragende model for stress og aldringsbiologi. Her undersøges flere standardiserede metoder til måling af levetid og sundhed, der let kan tilpasses næsten ethvert forskningsmiljø, især dem med begrænset udstyr og midler. Den utrolige nytte af C. elegans er fremhævet, hvilket fremhæver evnen til at udføre kraftfulde genetiske analyser i aldringsbiologi uden behov for omfattende infrastruktur. Endelig diskuteres begrænsningerne for hver analyse og alternative tilgange til overvejelse.
Siden udgivelsen af ‘The genetics of Caenorhabditis elegans‘, en af de mest indflydelsesrige artikler af Sydney Brenner i 1974, er denne mikroskopiske orm blevet betragtet som et fremragende modelsystem til at studere biologiske mysterier1. I 1977 offentliggjorde Michael R. Klass metoden til måling af levetiden for C. elegans og etablerede dette modelsystem til at studere aldring2. Undersøgelsen for at forstå forholdet mellem stress og lang levetid er startet med identifikation af en enkelt mutation i alder-1-genet, hvilket resulterede i en levetidsforlængelse i C. elegans3. Desuden har nutidige undersøgelser identificeret andre levetidsforøgende mutationer, som afslørede langlivede mutante orme, der udviser øget modstandsdygtighed over for stress 4,5,6. Med sine mange fordele, herunder en kort levetid, nem vedligeholdelse, fuldstændigt sekventeret genom indeholdende homologi til omkring to tredjedele af alle menneskelige sygdomsfremkaldende gener, tilgængelighed og lethed ved brug af RNA-interferens (RNAi) biblioteker og fysiologisk lighed med mennesker 7,8,9, er C. elegans hurtigt blevet vedtaget som en fremragende model for stress og aldringsbiologi.
Måske er de største værktøjer til C. elegans dens ekstremt lave omkostninger til vedligeholdelse, let eksperimentering og de mange forskellige genetiske værktøjer, der er tilgængelige til undersøgelser. C. elegans dyrkes typisk på et fast agarmedium med en E. coli fødekilde. To almindeligt anvendte E. coli-stammer er standard OP50, en B-stamme, der måske er den mest almindeligt anvendte10, og HT115, en K-12-stamme, der primært bruges til RNAi-forsøg11,12. HT115 K-12-stammen bærer en deletion i RNAIII RNase, en mutation, der er afgørende for RNAi-metoder, hvor plasmider, der udtrykker dsRNA svarende til individuelle C. elegans gener, anvendes. dsRNA-fodringsvektorerne giver mulighed for robust knockdown af C. elegans gener uden behov for komplekse krydsninger eller genomredigering, da bakterier, der bærer disse plasmider, kan fodres direkte til nematoder. Tusindvis af disse bakterielle RNAi-vektorer findes i HT115-baggrunden, herunder det mest populære Vidal RNAi-bibliotek med >19.000 individuelle RNAi-konstruktioner13 og Ahringer RNAi-biblioteket med 16.757 RNAi-konstruktioner14. Op50- og HT115-bakteriediæterne har imidlertid store forskelle i metabolisk profil, herunder forskelle i vitamin B12 15,16. Derfor anbefales det at udføre alle eksperimenter på en enkelt bakteriekilde, hvis det er muligt, for at undgå gen-diætinteraktioner, der kan introducere flere forvirrende faktorer som tidligere beskrevet 17,18,19. På grund af sin lethed opretholdes dyr på OP50 for alle de eksperimentelle forhold, der er beskrevet her, men alle forsøg udføres på HT115 som tidligere beskrevet20. Kort fortalt holdes dyr ved OP50 og overføres til HT115 efter synkronisering (efter blegning) for konsistens mellem RNAi vs. ikke-RNAi-eksperimenter. Alternativt kan en RNAi-kompetent OP50-stamme, der bærer en lignende deletion af RNAIII RNase, der findes i E. coli K12 HT115-stammen, også anvendes21.
Måske er en stor begrænsning for RNAi-eksperimenter i C. elegans bekymringen for knockdown-effektivitet. Mens knockdown-effektivitet kan valideres via qPCR eller western blotting, kræver disse dyrt udstyr og reagenser og er begrænset til bulkanalyse. Dette er endnu mere bekymrende at se på specifikke celler, såsom neuroner, som er ildfaste (mindre følsomme) over for RNAi. Mens RNAi-effektiviteten i specifikke celler kan forbedres via overekspression af SID-1, det transmembranprotein, der er afgørende for dsRNA-optagelse22, er dette stadig begrænset til de celletypespecifikke ekspressionsmønstre for promotorerne, der anvendes til disse konstruktioner, og dermed er gen knockouts og mutationer det mest idiotsikre middel til at nedbryde genfunktioner. Ud over RNAi-medieret knockdown er C. elegans også meget modtagelige for genomredigering med CRISPR-baserede strategier 23,24,25 og transgen konstruktionsoverekspression gennem mikroinjektioner med mulighed for at integrere transgene konstruktioner gennem bestråling eller transposonbaseret integration 26,27,28,29 . Disse metoder kræver imidlertid dyrt mikroinjektionsudstyr, og de høje omkostninger ved guide RNA’er eller Cas9-enzym kan forbyde disse metoder i institutioner med begrænset finansiering. I stedet er tusindvis af transgene linjer og mutanter let tilgængelige for et par dollars både på Caenorhabditis Genetics Center (CGC) og National Bioresource Project (NBRP). NBRP tilbyder isolerede mutanter til et stort antal C. elegans gener, herunder offentliggjorte og derfor verificerede mutantstammer, mutanter afledt af pilotprojekter og mutanter, der endnu ikke er karakteriseret. I modsætning hertil er CGC et depot for for det meste offentliggjorte og etablerede C. elegans linjer fra forskningsmiljøet. Begge sender stammer over hele verden til meget rimelige priser og tilbyder en bred vifte af muligheder for dem med begrænset kapacitet til at syntetisere stammer internt.
Her tilbydes en kurateret metodesamling, som sandsynligvis vil være de billigste metoder til analyse af levetid og sundhed i C. elegans. Alle de metoder, der præsenteres her, kræver billigt udstyr og forsyninger og bruger kun stammer, der er let tilgængelige fra CGC. Måske mest uoverkommelige for levetid og overlevelsesassays i C. elegans er omkostningerne ved Nematode Growth Media (NGM) plader. Da C. elegans er hermafroditter og selvbefrugtede, kræver standardoverlevelsesanalyser, at voksne dyr løbende flyttes væk fra deres afkom for at undgå forurening fra afkom. Denne proces er ikke kun tidskrævende, den kan blive dyr på grund af nødvendigheden af ca. 100 plader pr. tilstand for at køre et enkelt levetidsassay. Her tilvejebringes to alternativer: udnyttelse af den temperaturfølsomme kimlinjeløse mutant, glp-4 (bn2) eller kemisk sterilisering ved anvendelse af 5-fluor-2′-deoxyuridin (FUDR). glp-4 koder for en valylaminoacyl tRNA-syntetase, og den temperaturfølsomme glp-4 (bn2) er reproduktivt mangelfuld ved restriktive temperaturer på grund af nedsat proteintransformation30,31. FUDR er en robust metode til kemisk sterilisering af C. elegans ved at forhindre DNA-replikation og dermed hæmme reproduktion32. Selvom FUDR kan være uoverkommeligt dyrt for nogle laboratorier, kræves der kun en lille mængde for kemisk sterilisering af orme, og dens stabilitet i pulverform kan gøre det muligt for de fleste grupper. Brug af den temperaturfølsomme glp-4 (bn2) mutant er bestemt den billigste løsning, da det eneste krav er en inkubator til at flytte dyrene til de restriktive 25 ° C; Det skal dog bemærkes, at vækst ved 25 °C kan forårsage mild varmestress33,34. Uanset metoden kan brug af sterile dyr betydeligt reducere omkostningerne ved forbrugsstoffer, der kræves til aldersrelaterede assays.
For at studere aldring er standard levetidsanalyser konventionelle, da paradigmer, der ændrer levetiden, har direkte indvirkning på aldring. Målinger af sundhed og stresstolerance giver dog yderligere oplysninger om organismens sundhed. Her tilbydes flere metoder til at måle sundhed: 1) fecundity som et mål for reproduktiv sundhed; 2) yngelstørrelse som et mål for udviklingsmæssig sundhed og levedygtighed af lagt afkom; og 3) lokomotorisk adfærd som et mål for muskelfunktion og bevægelighed, som begge er direkte korreleret med aldring. Derudover tilbydes assays af stresstolerance: overlevelse til ER-stress, mitokondrie / oxidativ stress og termisk stressoverlevelse. Faktisk udviser dyr med øget modstandsdygtighed over for ER-stress35,36, mitokondriestress37 og termisk stress38 øget levetid. ER-stress påføres ved at udsætte C. elegans for tunicamycin, som blokerer N-bundet glykosylering og forårsager ophobning af misfoldede proteiner39. Mitokondrie / oxidativ stress induceres ved eksponering for paraquat, hvilket inducerer superoxiddannelse specifikt i mitokondrierne40. Varmestress påføres ved inkubation af dyr ved 34-37 °C33,41. Alle de assays, der er beskrevet her, kan udføres med minimalt udstyr og midler og tilbyder en række værktøjer til at studere aldring i forskellige grupper.
Levetid, mest enkelt defineret som livets varighed, er et klart binært fænomen i de fleste organismer – enten er en organisme levende eller ikke. Imidlertid korrelerer lang levetid ikke altid med en organismes sundhed. For eksempel er mitokondrie hormesemodeller, hvor eksponering for mitokondriestress dramatisk øger levetiden, generelt nogle af de længstlevende dyr, men udviser alligevel hæmmet vækst og nedsat metabolisk funktion37,54. Tilsvarende udviser dyr med hyperaktive endoplasmatiske retikulumstressresponser også visse adfærd og fænotyper, der kan korreleres med nedsat sundhed, på trods af at de har dramatisk forbedret proteinhomeostase og levetid36,49. Endelig er mange levetidsparadigmer i modelorganismer, herunder øget HSF-1-funktion55, øget XBP-1-funktion56 og ændret FoxO-signalering57, alle korreleret med øget kræftrisiko, og det er ubestrideligt, at forlænget levetid ikke er gavnlig, hvis en organisme er i konstant kamp med kræft og andre sundhedsmæssige sygdomme. Derfor kan lang levetid ikke være en selvstændig måling i aldringsbiologi.
Således har begrebet healthspan været et voksende felt inden for aldringsbiologi. Healthspan, løst defineret som den periode i livet, hvor man er sund, er vanskeligere at fastslå end lang levetid. I modsætning til lang levetid er begrebet “sundhed” imidlertid kompliceret, da der er mange forskellige aflæsninger til organismesundhed: på organismeniveau er der muskelfunktion / styrke, neuronal / kognitiv funktion, reproduktiv sundhed osv .; på celleniveau er der proteinhomeostase, lipidhomeostase, glucosehomeostase, metabolisme osv. I 2014 har aldrende biologer definitivt karakteriseret biologiske kendetegn ved aldring med den strukturerede definition, at det skal være noget, der naturligt nedbrydes under aldring og eksperimentelt kan ændres, så eksperimentel eksacerbation skal fremskynde aldring og eksperimentel intervention skal bremse aldring. Disse ni kendetegn ved aldring omfatter genomisk ustabilitet, telomerslidning, epigenetiske ændringer, tab af proteinhomeostase (proteostase), stamcelleudmattelse, ændret intercellulær signalering, mitokondrie dysfunktion, dereguleret næringsstofføling og cellulær ældning58. Siden da har adskillige undersøgelser argumenteret for, at andre faktorer bør medtages, herunder ekstracellulære proteiner og systemisk fysiologi såsom immunitet og betændelse59. I sidste ende kræver den komplekse definition af healthspan, at organismens sundhed måles ved hjælp af flere forskellige metoder.
Derfor præsenteres i dette manuskript flere metoder til at måle forskellige aspekter af healthspan ved hjælp af nematodemodellen, C. elegans. Vi analyserer lokomotorisk adfærd ved hjælp af thrashing assays, reproduktiv sundhed ved hjælp af ægtælling og yngelstørrelse og følsomhed over for stress. Faktisk er lokomotorisk adfærd en guldstandardmetode til måling af healthspan, da organismer udviser betydeligt tab af bevægelighed og bevægelse under aldring51. Tab af lokomotorisk adfærd kan tilskrives flere kendetegn ved aldring, da muskelfunktionen i C. elegans er afhængig af korrekt proteostase60, mitokondrie dysfunktion61 og neuron-muskel signalering62. Mens dette manuskript fokuserer på en måling af lokomotorisk adfærd, er det vigtigt at bemærke, at der findes mange andre metoder, herunder bevægelighed af dyr på en solid agarplade, respons på berøring51 og kemotaxisassays63. Disse metoder kræver dog generelt mere sofistikerede optageenheder, brug af ormesporingssoftware eller brug af dyre, farlige eller flygtige kemikalier, som alle kan være uoverkommelige i nogle forskningsmiljøer.
Derudover præsenteres assays for ægantal og yngelstørrelse som en metode til måling af reproduktiv sundhed og som den enkleste metode til måling af celledeling i voksne orme, da voksne orme er post-mitotiske, og kun kimceller og embryoner gennemgår celledeling inden for en voksen orm64. Som et mål for celledeling kan reproduktiv sundhed være relevant for aldringsmærkerne for cellulær ældning og stamcelleudmattelse. Reproduktiv sundhed kan påvirkes af mange faktorer, herunder patogen infektion65 eller eksponering for stress49, selvom der ikke er nogen direkte sammenhæng mellem reproduktiv sundhed og lang levetid. Faktisk udviser nogle langlivede dyr et signifikant fald i yngelstørrelse49, og det er endda muligt, at der findes en omvendt sammenhæng mellem levetid og yngelstørrelse50. Dette er ikke et fænomen, der er specifikt for C. elegans, da skadelige virkninger af reproduktion på lang levetid længe er blevet observeret hos mennesker66, ledsagere67 og mus68. Alligevel leverer vi ægtælling og yngelstørrelse som en pålidelig og billig metode til måling af reproduktiv sundhed med det forbehold, at reproduktiv sundhed muligvis ikke korrelerer med lang levetid eller sundhed.
Endelig tilbydes overlevelsesassays som et indirekte mål for organismens sundhed. Det er vigtigt, at cellulære stressresponser, herunder respons på termisk stress69 og ER-stress35, hurtigt falder under aldringsprocessen og har direkte relevans for aldringsmærket for proteostase70,71. I modsætning hertil kan hyperaktivering af stressresponser øge levetiden betydeligt ved at fremme modstandsdygtighed over for stress 35,37,38. Mens denne undersøgelse fokuserer på de enkleste og billigste metoder, findes der et stort antal alternative metoder til stressmodstandsdygtighedsassays for termotolerance41 og oxidativ stress66, der hver kræver et andet sæt udstyr og forbrugsstoffer. Ud over simple eksponeringsundersøgelser for stressfaktorer kan andre fysiologiske metoder udføres afhængigt af adgang til udstyr. For eksempel kan en ekstracellulær fluxanalysator overvåge mitokondriefunktion og cellulær respiration73; fluorescerende dissektionsmikroskoper vil muliggøre målinger af transkriptionelle reportere til stressresponsaktivering20; og højopløsnings sammensatte eller konfokale mikroskoper kan bruges til at måle organelmorfologi med fluorescerende sonder til mitokondrier74, det endoplasmatiske retikulum 75,76 og actincytoskelet77.
Som en sidste advarselshistorie for målinger af levetid, mens kemiske og genetiske metoder til sterilisering af orme tilbydes at reducere omkostningerne betydeligt, er det vigtigt at bemærke, at begge direkte kan påvirke levetiden. For eksempel er eksponering for FUDR tidligere blevet rapporteret at påvirke både levetid og termotolerance45. Og mens glp-4 (bn2) mutanten i sig selv ikke har nogen direkte indvirkning på levetiden, er vækst ved 25 ° C en mild varmespænding33,34 og kan således påvirke levetid2. Der findes andre metoder til sterilisering af C. elegans, herunder auxinmedieret sterilitet78 eller alternative temperaturfølsomme sædmangelmutanter79. Alle metoder har dog nogle forbehold, og man bør sørge for at udnytte det mindst skadelige assay til hvert laboratoriums videnskabelige behov. En sidste begrænsning af levetidsundersøgelser er potentiel variabilitet, der kan opstå på grund af lave prøvestørrelser eller simpelthen ved en objektiv fejl fra investigator. Dette kan omgås, da nye teknologier fødes i automatiserede levetidsteknologier80, men igen er disse systemer dyre og kræver noget ingeniør- og beregningsudstyr og færdigheder. I sidste ende er samlingen af metoder, der leveres her, et pålideligt sæt værktøjer, der hurtigt kan tilpasses og læres i næsten enhver institution og give et solidt fundament for aldringsbiologi.
The authors have nothing to disclose.
G.G. understøttes af T32AG052374 og R.H.S. understøttes af R00AG065200 fra National Institute on Aging. Vi takker CGC (finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) for stammerne.
APEX IPTG | Genesee | 18-242 | for RNAi |
Bacto Agar | VWR | 90000-764 | for NGM plates |
Bacto Peptone | VWR | 97064-330 | for NGM plates |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | for NGM plates |
Carbenicillin | VWR | 76345-522 | for RNAi |
Cholesterol | VWR | 80057-932 | for NGM plates |
DMSO | VWR | BDH1115-1LP | solvent for drugs |
LB Broth | VWR | 95020-778 | for LB |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | 97062-132 | for NGM plates, M9 |
Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | for oxidative/mitochondrial stress |
Potassium Chloride | VWR | 97061-566 | for bleach soluton |
Potassium phosphate dibasic | VWR | EM-PX1570-2 | for NGM plates |
Potassium phosphate monobasic | VWR | EM-PX1565-5 | for M9 |
S7E Dissecting Scope | Leica | 10450840 | Standard dissecting microscope |
Sodium Chloride | VWR | EM-SX0420-5 | for NGM plates, M9 |
Sodium hypochlorite | VWR | RC7495.7-32 | for bleach solution |
Sodium phosphate dibasic | VWR | 71003-472 | for M9 |
Tetracycline hydrochloride | VWR | 97061-638 | for RNAi |
Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | for ER stress |