Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Undersøgelse af billige metoder til måling af levetid og sundhed i Caenorhabditis elegans

Published: May 18, 2022 doi: 10.3791/64091
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Caenorhabditis elegans fungerer som et fremragende modelsystem med robuste og billige metoder til kortlægning af sundhed, levetid og modstandsdygtighed over for stress.

Abstract

Opdagelsen og udviklingen af Caenorhabditis elegans som en modelorganisme var indflydelsesrig i biologi, især inden for aldring. Mange historiske og nutidige undersøgelser har identificeret tusindvis af levetidsændrende paradigmer, herunder genetiske mutationer, transgen genekspression og hormese, en gavnlig, lavgradig eksponering for stress. Med sine mange fordele, herunder en kort levetid, nem og billig vedligeholdelse og fuldt sekventeret genom med homologi til næsten to tredjedele af alle menneskelige gener, er C. elegans hurtigt blevet vedtaget som en fremragende model for stress og aldringsbiologi. Her undersøges flere standardiserede metoder til måling af levetid og sundhed, der let kan tilpasses næsten ethvert forskningsmiljø, især dem med begrænset udstyr og midler. Den utrolige nytte af C. elegans er fremhævet, hvilket fremhæver evnen til at udføre kraftfulde genetiske analyser i aldringsbiologi uden behov for omfattende infrastruktur. Endelig diskuteres begrænsningerne for hver analyse og alternative tilgange til overvejelse.

Introduction

Siden udgivelsen af 'The genetics of Caenorhabditis elegans', en af de mest indflydelsesrige artikler af Sydney Brenner i 1974, er denne mikroskopiske orm blevet betragtet som et fremragende modelsystem til at studere biologiske mysterier1. I 1977 offentliggjorde Michael R. Klass metoden til måling af levetiden for C. elegans og etablerede dette modelsystem til at studere aldring2. Undersøgelsen for at forstå forholdet mellem stress og lang levetid er startet med identifikation af en enkelt mutation i alder-1-genet, hvilket resulterede i en levetidsforlængelse i C. elegans3. Desuden har nutidige undersøgelser identificeret andre levetidsforøgende mutationer, som afslørede langlivede mutante orme, der udviser øget modstandsdygtighed over for stress 4,5,6. Med sine mange fordele, herunder en kort levetid, nem vedligeholdelse, fuldstændigt sekventeret genom indeholdende homologi til omkring to tredjedele af alle menneskelige sygdomsfremkaldende gener, tilgængelighed og lethed ved brug af RNA-interferens (RNAi) biblioteker og fysiologisk lighed med mennesker 7,8,9, er C. elegans hurtigt blevet vedtaget som en fremragende model for stress og aldringsbiologi.

Måske er de største værktøjer til C. elegans dens ekstremt lave omkostninger til vedligeholdelse, let eksperimentering og de mange forskellige genetiske værktøjer, der er tilgængelige til undersøgelser. C. elegans dyrkes typisk på et fast agarmedium med en E. coli fødekilde. To almindeligt anvendte E. coli-stammer er standard OP50, en B-stamme, der måske er den mest almindeligt anvendte10, og HT115, en K-12-stamme, der primært bruges til RNAi-forsøg11,12. HT115 K-12-stammen bærer en deletion i RNAIII RNase, en mutation, der er afgørende for RNAi-metoder, hvor plasmider, der udtrykker dsRNA svarende til individuelle C. elegans gener, anvendes. dsRNA-fodringsvektorerne giver mulighed for robust knockdown af C. elegans gener uden behov for komplekse krydsninger eller genomredigering, da bakterier, der bærer disse plasmider, kan fodres direkte til nematoder. Tusindvis af disse bakterielle RNAi-vektorer findes i HT115-baggrunden, herunder det mest populære Vidal RNAi-bibliotek med >19.000 individuelle RNAi-konstruktioner13 og Ahringer RNAi-biblioteket med 16.757 RNAi-konstruktioner14. Op50- og HT115-bakteriediæterne har imidlertid store forskelle i metabolisk profil, herunder forskelle i vitamin B12 15,16. Derfor anbefales det at udføre alle eksperimenter på en enkelt bakteriekilde, hvis det er muligt, for at undgå gen-diætinteraktioner, der kan introducere flere forvirrende faktorer som tidligere beskrevet 17,18,19. På grund af sin lethed opretholdes dyr på OP50 for alle de eksperimentelle forhold, der er beskrevet her, men alle forsøg udføres på HT115 som tidligere beskrevet20. Kort fortalt holdes dyr ved OP50 og overføres til HT115 efter synkronisering (efter blegning) for konsistens mellem RNAi vs. ikke-RNAi-eksperimenter. Alternativt kan en RNAi-kompetent OP50-stamme, der bærer en lignende deletion af RNAIII RNase, der findes i E. coli K12 HT115-stammen, også anvendes21.

Måske er en stor begrænsning for RNAi-eksperimenter i C. elegans bekymringen for knockdown-effektivitet. Mens knockdown-effektivitet kan valideres via qPCR eller western blotting, kræver disse dyrt udstyr og reagenser og er begrænset til bulkanalyse. Dette er endnu mere bekymrende at se på specifikke celler, såsom neuroner, som er ildfaste (mindre følsomme) over for RNAi. Mens RNAi-effektiviteten i specifikke celler kan forbedres via overekspression af SID-1, det transmembranprotein, der er afgørende for dsRNA-optagelse22, er dette stadig begrænset til de celletypespecifikke ekspressionsmønstre for promotorerne, der anvendes til disse konstruktioner, og dermed er gen knockouts og mutationer det mest idiotsikre middel til at nedbryde genfunktioner. Ud over RNAi-medieret knockdown er C. elegans også meget modtagelige for genomredigering med CRISPR-baserede strategier 23,24,25 og transgen konstruktionsoverekspression gennem mikroinjektioner med mulighed for at integrere transgene konstruktioner gennem bestråling eller transposonbaseret integration 26,27,28,29 . Disse metoder kræver imidlertid dyrt mikroinjektionsudstyr, og de høje omkostninger ved guide RNA'er eller Cas9-enzym kan forbyde disse metoder i institutioner med begrænset finansiering. I stedet er tusindvis af transgene linjer og mutanter let tilgængelige for et par dollars både på Caenorhabditis Genetics Center (CGC) og National Bioresource Project (NBRP). NBRP tilbyder isolerede mutanter til et stort antal C. elegans gener, herunder offentliggjorte og derfor verificerede mutantstammer, mutanter afledt af pilotprojekter og mutanter, der endnu ikke er karakteriseret. I modsætning hertil er CGC et depot for for det meste offentliggjorte og etablerede C. elegans linjer fra forskningsmiljøet. Begge sender stammer over hele verden til meget rimelige priser og tilbyder en bred vifte af muligheder for dem med begrænset kapacitet til at syntetisere stammer internt.

Her tilbydes en kurateret metodesamling, som sandsynligvis vil være de billigste metoder til analyse af levetid og sundhed i C. elegans. Alle de metoder, der præsenteres her, kræver billigt udstyr og forsyninger og bruger kun stammer, der er let tilgængelige fra CGC. Måske mest uoverkommelige for levetid og overlevelsesassays i C. elegans er omkostningerne ved Nematode Growth Media (NGM) plader. Da C. elegans er hermafroditter og selvbefrugtede, kræver standardoverlevelsesanalyser, at voksne dyr løbende flyttes væk fra deres afkom for at undgå forurening fra afkom. Denne proces er ikke kun tidskrævende, den kan blive dyr på grund af nødvendigheden af ca. 100 plader pr. tilstand for at køre et enkelt levetidsassay. Her tilvejebringes to alternativer: udnyttelse af den temperaturfølsomme kimlinjeløse mutant, glp-4 (bn2) eller kemisk sterilisering ved anvendelse af 5-fluor-2'-deoxyuridin (FUDR). glp-4 koder for en valylaminoacyl tRNA-syntetase, og den temperaturfølsomme glp-4 (bn2) er reproduktivt mangelfuld ved restriktive temperaturer på grund af nedsat proteintransformation30,31. FUDR er en robust metode til kemisk sterilisering af C. elegans ved at forhindre DNA-replikation og dermed hæmme reproduktion32. Selvom FUDR kan være uoverkommeligt dyrt for nogle laboratorier, kræves der kun en lille mængde for kemisk sterilisering af orme, og dens stabilitet i pulverform kan gøre det muligt for de fleste grupper. Brug af den temperaturfølsomme glp-4 (bn2) mutant er bestemt den billigste løsning, da det eneste krav er en inkubator til at flytte dyrene til de restriktive 25 ° C; Det skal dog bemærkes, at vækst ved 25 °C kan forårsage mild varmestress33,34. Uanset metoden kan brug af sterile dyr betydeligt reducere omkostningerne ved forbrugsstoffer, der kræves til aldersrelaterede assays.

For at studere aldring er standard levetidsanalyser konventionelle, da paradigmer, der ændrer levetiden, har direkte indvirkning på aldring. Målinger af sundhed og stresstolerance giver dog yderligere oplysninger om organismens sundhed. Her tilbydes flere metoder til at måle sundhed: 1) fecundity som et mål for reproduktiv sundhed; 2) yngelstørrelse som et mål for udviklingsmæssig sundhed og levedygtighed af lagt afkom; og 3) lokomotorisk adfærd som et mål for muskelfunktion og bevægelighed, som begge er direkte korreleret med aldring. Derudover tilbydes assays af stresstolerance: overlevelse til ER-stress, mitokondrie / oxidativ stress og termisk stressoverlevelse. Faktisk udviser dyr med øget modstandsdygtighed over for ER-stress35,36, mitokondriestress37 og termisk stress38 øget levetid. ER-stress påføres ved at udsætte C. elegans for tunicamycin, som blokerer N-bundet glykosylering og forårsager ophobning af misfoldede proteiner39. Mitokondrie / oxidativ stress induceres ved eksponering for paraquat, hvilket inducerer superoxiddannelse specifikt i mitokondrierne40. Varmestress påføres ved inkubation af dyr ved 34-37 °C33,41. Alle de assays, der er beskrevet her, kan udføres med minimalt udstyr og midler og tilbyder en række værktøjer til at studere aldring i forskellige grupper.

Protocol

1. Vækst og vedligeholdelse af C. elegans

  1. Hældning af Nematode Growth Media (NGM) plader
    1. Dyrk C. elegans på standard 2% agarplader med Nematode Growth Media (NGM) bestående af 1 mM CaCl2, 5 μg / ml kolesterol, 25 mM KPO4 (pH 6,0), 1 mM MgSO4, 0,25% w / v Peptone og 51,3 mM NaCl.
    2. For 1 liter NGM-agarplader måles 2,5 g Peptone, 3,0 g NaCl og 20 g agar i en 1 L kolbe med en omrøringsstang.
      BEMÆRK: Det anbefales at standardisere en bestemt agarkilde, da vi har set variation i stivhed mellem mærker, hvilket kan påvirke reproducerbarheden. Her anvendes Bacto-Agar strengt. Derudover anbefales det at tilsætte agar direkte i kolben, der autoklaveres, da agar ikke opløses helt uden opvarmning, og overførsel af opløsning indeholdende agar vil resultere i tab af agar og koncentrationsfejl.
    3. Tilsæt dH2O op til 970 ml.
      BEMÆRK: 30 ml flydende additiver efter sterilisering vil bringe det endelige volumen til 1 L. I vores hænder kræves ~ 951 ml dH2O for at nå 970 ml af det endelige volumen.
    4. Steriliser NGM-agar-opløsning ved hjælp af en standard autoklave eller medierilisator til effektiv sterilisering.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt kan steril NGM-agar opbevares i flere måneder ved stuetemperatur. Hvis den opbevares, kan NGM-agar genudsættes i en mikrobølgeovn med 15-45 s impulser for at forhindre opløsningen i at koge over eller i et opvarmet vandbad.
    5. Opløsningen omrøres, indtil den er afkølet til 60-75 °C. Omrøring under afkøling er vigtig for at forhindre ujævn afkøling, hvilket kan få nogle agar til at størkne.
    6. Mens opløsningen afkøles, opvarmes et vandbad eller perlebad til 65-70 °C.
    7. Når opløsningen er afkølet til 60-75 °C, tilsættes flydende tilsætningsstoffer: 2,0 ml 0,5 M CaCl2, 1 ml 5 mg/ml kolesterol, 25 ml 1 M KPO4 (pH 6,0) og 0,5 M MgSO4 (se tabel 1 for opskrifter på alle reagenser), og opløsningen tillades at blande i ~5 min for at sikre fuldstændig blanding.
      BEMÆRK: Lægemidler kan også inkluderes i plader her (f.eks. Tilsættes 1 ml 100 mg / ml carbenicillin og 1 ml 1 M IPTG; tilsæt 10 ml 2,5 mg / ml tunicamycin; tilsæt 10 ml 400 ml paraquat).
    8. Kolbe indeholdende NGM-agar nedsænkes i et vandbad på 65-70 °C for at forhindre NGM-agar i at størkne, mens den hældes i plader.
    9. 9-11 ml opløsning pipetteres i hver 60 mm plade eller 20-30 ml opløsning i hver 100 mm plade.
      BEMÆRK: Det anbefales at bruge det mindste pipettevolumen, der er til rådighed, for at undgå NGM-lækager forårsaget af luft, der udvider sig i pipetten. Pipettering af 1-2 ml flere medier, end der vil blive tilsat til hver plade for at undgå fuldstændig tømning af pipetten, hjælper med at forhindre bobledannelse. Alternativt kan plader hældes direkte fra flasken til en plade, men pipettering anbefales stærkt for at sikre plader med samme volumen. Plader med samme volumen er vigtige for at sikre ensartede koncentrationer af opløsninger, når der anvendes metoder, hvor opløsninger påføres direkte oven på en plade (se trin 1.1.17). Lige store mængder giver også mulighed for nem mikroskopi for at opretholde et lignende brændplan på tværs af plader.
    10. Pipetten anbringes tilbage i den opvarmede opløsning for at opretholde temperaturen og forhindre NGM-agar i at størkne.
    11. Gentag ovenstående to trin for alle pladerne.
    12. Lad NGM-agarplader størkne natten over.
    13. Når pladerne er størknet, opbevares pladerne i op til 3 måneder ved 4 °C eller går videre til trin 1.1.14 for såplader med bakterier. Opbevar plader i forseglede beholdere for at hjælpe med at bevare fugt for at opretholde pladekvaliteten.
    14. Dyrk en kultur af OP50 i lysogen bouillon (LB) eller tilsvarende medier efter eget valg i 24-48 timer ved omgivelsestemperatur (~ 22-25 ° C) eller dyrk en kultur af HT115 i LB + antibiotika (ampicillin / carb + tetracyclin anbefales til HT115) med omrystning ved 37 ° C i 12-16 timer.
      BEMÆRK: Det anbefales at dyrke OP50 ved stuetemperatur, fordi der er fundet en mere aggressiv vækst af OP50 ved 37 °C, hvilket påvirker C. elegans levetid. I modsætning hertil har HT115 en langsommere vækstrate og gør mindre tætte kulturer; Det anbefales derfor at dyrke HT115 ved 37 °C ved omrystning.
    15. Frø et volumen på 100-200 μL af en mættet OP50/HT115-kultur på en 60 mm plade eller 1 ml til en 100 mm plade.
    16. Lad pladerne tørre natten over på en bordplade, og lad en ekstra dag tørre, hvis pladerne stadig er våde. Pladerne opbevares i forseglede beholdere ved 4 °C i ~2 måneder.
    17. Valgfrit: Tilsæt lægemidler direkte på podede NGM-agarplader (f.eks. 100 μL 10 mg / ml FUDR-opløsning) for kemisk at sterilisere orme.
  2. Opretholdelse af C. elegans lagre
    1. Mærk bunden af en podet NGM-agarplade korrekt. Mærk kanterne på bunden af pladen for at forhindre, at lysets passage hindres på standard dissektionsmikroskoper.
    2. Ved hjælp af et standard dissektionsmikroskop, scoop bakterier efter eget valg på C. elegans pick.
      BEMÆRK: I denne protokol blev der anvendt et valg bestående af en 90% / 10% platin / iridiumtråd fastgjort til enden af en glas Pasteur-pipette.
    3. Brug bakterierne til at samle 10-20 æg, L1, L2 eller L3 dyr og overføre dem til en nyligt mærket podet NGM-agarplade.
      BEMÆRK: Det er bedst at samle yngre dyr; Det er forfatternes erfaring, at for almindelige vilddyr vil flytning af 10-20 æg/ungdyr gøre det muligt for tallerkenen at vokse ved 15 °C uden sult. For transgene eller mutante dyr med nedsat fecundity skal flere dyr flyttes ind i pladen.
    4. For dyr med vildtypefecundity, der dyrkes ved 15 °C, gentages trin 1.2.1-1.2.3 hver 7. dag for at opretholde en ugentlig bestand. For dyr, der dyrkes ved 20 °C, gentages trin 1.2.1-1.2.3 hver 4.-5. dag for at undgå sult.
  3. Synkronisering af orme via Blegning
    BEMÆRK: En fuld NGM-agarplade på 60 mm (f.eks. 1 uge gamle lagerplader dyrket ved 15 °C) vil give et tilstrækkeligt antal dyr til de fleste beskrevne standardassays. Generelt vil en gravid voksen (voksen fuld af æg) give 10-15 æg42, og en fuld, 60 mm NGM-agar plade har alt fra 100-200 gravide voksne, der giver ~ 1000-2000 æg.
    1. Ved større forsøg, der kræver flere dyr, skal du skære en fuld 60 mm NGM-agar i fire til seks lige store stykker og klumpe dem på såede 100 mm plader til ekspansion.
      BEMÆRK: Her refererer chunking til at skære et stykke af NGM-agarpladen, der indeholder orme, og flytte hele klumpen af agar + orme på en ny plade, ormesiden nedad for at lade ormene kravle på den nye plade. Som referenceramme vil dyr med vildtype frugtbarhed producere en fuld 100 mm plade, hvis de dyrkes ved 20 ° C i 2-3 dage efter klumpning.
    2. For at begynde at samle nematoderne, hæld en lille mængde M9-opløsning (tabel 1) på plader indeholdende orme, idet du sørger for ikke at overfylde petriskålen. Hvirvl M9-opløsningen forsigtigt for at løsne orme fra bakterielle græsplæner.
    3. Saml gravide voksne orme med en serologisk pipette, og pas på ikke at gennembore agaren med pipettespidsen.
      BEMÆRK: Serologiske pipetter af glas anbefales, da C. elegans har tendens til at klæbe til plast. Hvis glaspipetter ikke er tilgængelige, anbefales det at starte med et større antal dyr end nødvendigt, da nogle vil gå tabt på grund af klæbende til plastpipetter.
    4. Pellet dyrene ved centrifugering i 30 s ved 1.100 x g. Aspirere supernatanten.
      BEMÆRK: C. elegans pellet er meget løs, så pas på ikke at ryste eller forstyrre pelleten, mens du aspirerer supernatanten.
    5. Mens dyrene centrifugerer, skal der fremstilles 5 ml blegeopløsning pr. stamme (se tabel 1 for opskriftsdetaljer); for 5 ml opløsning blandes 1,5 ml 6% natriumhypochlorit (blegemiddel), 0,75 ml 5 M NaOH eller KOH og 2,75 ml dH2O.
      FORSIGTIG: Natriumhypochlorit og højkoncentrationshydroxidopløsninger er ætsende, og det anbefales derfor at bære handsker og laboratoriefrakke ved håndtering.
    6. Der tilsættes 5 ml blegeopløsning til ormepellet/M9-blandingen.
    7. Kontroller ormene under et dissekeringsmikroskop hvert par minutter, indtil alle de voksne ormlegemer er opløst, og kun æg er tilbage i blandingen. Ryst orme-/blegemiddelblandingen kraftigt for at fremskynde blegningsprocessen.
      BEMÆRK: At efterlade æg i en blegemiddelblanding i længere perioder vil resultere i beskadigelse af æggene og vil påvirke dyrenes levedygtighed. For vilde dyr tager blegning normalt 4-6 minutter med omrystning. Det anbefales således at kontrollere dyrene under et mikroskop med 30 s intervaller startende fra 4 minutters mærket.
    8. Pellet æggene ved at spinde æg / blegemiddelblandingen ned i 30 s ved 1.100 x g.
      BEMÆRK: Nogle 15 ml koniske rør har gradientlinjer på indersiden af røret. For disse rør anbefales det at dreje æg med en højere hastighed (f.eks. 30 s ved 2.000 x g) for at sikre, at æg pelleterer til bunden af røret og ikke forbliver på gradientlinjer.
    9. Opsuge blegeopløsningen.
      BEMÆRK: En ægpellet er stivere end en ormepellet, men kan stadig let forstyrres. Så pas på ikke at ryste røret efter centrifugering.
    10. Æg vaskes ved at tilsætte M9-opløsning op til 15 ml og dreje røret fire eller fem gange for at sikre, at æggene er helt dispergeret i M9-opløsningen.
    11. Pilleæg ved centrifugering i 30 s ved 1.100 x g og opsuge M9-opløsning.
    12. Gentag ovenstående to trin i alt fire vaske for at fjerne blegemiddel fra ægblandingen.
    13. Æggene resuspenderes i 100 μL til 2 ml M9-opløsning (dvs. afhængigt af det samlede antal blegede orme) efter den sidste vask. Ryst æg grundigt for at bryde klumper op og sørg for, at pelleten er fuldt resuspended.
    14. Alternativt kan dyr L1 arresteres for en strammere tidsmæssig synkronisering; til L1-anholdelse tilsættes M9-opløsning til ægpillen til ~ 10 ml i et 15 ml konisk rør. Lad ormene dreje i en rotator i op til 24 timer ved 20 °C eller omgivelsestemperatur. L1-dyr er generelt en halv dag mindre om at blive voksne sammenlignet med tidspunktet for æg som beskrevet i trin 1.3.16.
    15. Ægkoncentrationen (eller L1-koncentrationen, se trin 1.3.14) tilnærmes ved pipettering af 4 μL æg/M9-blanding på en NGM-plade podet med bakterier. Tæl og beregn, hvor mange æg der er til stede pr. μL belagt. Gentag tællingen tre eller fire gange for at forbedre tilnærmelsen.
      BEMÆRK: Tilnærmelse af ægkoncentrationen vil sikre, at der er nok dyr til passende prøvestørrelse til forsøg uden overplating, hvilket vil forårsage sult.
    16. Baseret på tilnærmelsen, plade det passende antal æg på NGM-agar plader podet med bakterier efter eget valg. For OP50-plader skal der højst være 200 dyr på en 60 mm plade og 1.000 dyr på en 100 mm plade. For HT115-plader skal der højst være 150 dyr på en 60 mm plade og 600 dyr på en 100 mm plade.
      BEMÆRK: Disse er omtrentlige tal baseret på vores laboratorieforhold, og tallene kan ændre sig baseret på tykkelsen af bakteriel græsplæne. Æg dyrket ved 15 ° C vil tage ~ 5 dage at nå dag 1 voksenalder (~ 140 timer for at nå æglægning maksimal, gravid voksen fase). Æg dyrket ved 20 ° C vil tage ~ 4 dage at nå dag 1 voksenalder (~ 96 timer for at nå æglægning maksimal, gravid voksen fase). Æg dyrket ved 25 ° C vil tage ~ 3,5 dage at nå dag 1 voksenalder (~ 62 timer for at nå æglægning maksimal, gravid voksen fase).
  4. Æglægning som en alternativ metode til at synkronisere C. elegans populationer
    1. Hvis blegningsprotokoller ikke er mulige (f.eks. Ingen centrifuge tilgængelig), skal du som en alternativ metode til at synkronisere populationer af C. elegans udføre en æglægningsprocedure. Husk, at denne protokol er mere arbejdskrævende og vil resultere i mindre udbytter af dyr.
    2. Til æglægning skal du placere 8-12 gravide voksne på en standard NGM-agarplade podet med bakterier efter eget valg og dokumentere det nøjagtige antal dyr placeret på en plade.
      BEMÆRK: Æglægningsprocedurer skal udføres ved den temperatur, der skal bruges til forsøg.
    3. Lad dyr lægge æg i 4-8 timer.
      BEMÆRK: Den varighed, dyrene efterlades på pladen, kan justeres, når det er nødvendigt. For eksempel kan et større antal dyr sættes på en tallerken i en kortere æglægningsvarighed, når der er mindre tid til rådighed. C. elegans lægger generelt æg i udbrud, som kan anslås til en hastighed på ca. fem æg/t for dyr med vildtypefecundity43. Følg anbefalingerne i trin 1.3.16 for at undgå at overplificere dyr.
    4. Fjern alle voksne dyr fra pladen.
      BEMÆRK: Alle voksne dyr, der er tilbage på pladen, vil fortsætte med at lægge æg, hvilket resulterer i en usynkroniseret population.
    5. Anbring æg ved 15 ° C i ~ 5 dage eller 20 ° C i ~ 4 dage for at nå dag 1 voksenalderen.

2. Måling af levetid i C. elegans

  1. Standard levetid
    1. Forbered NGM-agarplader ved at så plader med 100 μL bakterier efter eget valg. For konsistens skal du sikre dig, at de samme bakterier bruges på tværs af alle replikater. Da orme flyttes hver dag i æglægningsfaserne i voksenalderen, frø fem til syv sæt NGM-agarplader i løbet af levetiden og to til fire plader pr. Stamme for at dyrke dyr til voksenalderen (dvs. hvis man bruger otte plader på 15 dyr til levetid, skal man frø 40-56 plader pr. Tilstand).
    2. Lad pladerne tørre natten over inden opbevaring.
      BEMÆRK: Det anbefales, at pladerne opbevares ved 4 °C, og at det nødvendige antal plader fjernes fra kølerummet dagligt for at forhindre bakterier i at lave tykke græsplæner, der kan gøre det vanskeligt at flytte/tælle. Sørg for, at pladerne opvarmes inden plettering af orme.
    3. Der indsamles en synkroniseret population af C. eleganer ved hjælp af et standardblegningsassay som beskrevet i trin 1.3 og 1.4.
    4. Flyt 10-15 dage 1 voksne dyr på 8-12 plader hver. For en standard levetid skal du starte med ~ 120 dyr for at sikre, at prøvestørrelsen ikke falder for langt under 100 efter censurbegivenheder (f.eks. Otte plader med 15 dyr = 120 dyr; 12 plader med 10 dyr = 120 dyr).
      BEMÆRK: I det aktuelle tilfælde er 10-15 dyr et håndterbart antal for de fleste efterforskere, selvom seks plader på 20 dyr også er mulige for at reducere omkostningerne ved forbrugsstoffer.
    5. I de første 7-8 dage eller indtil afkom ikke længere er synlige, skal du flytte voksne dyr væk fra deres afkom hver 1-2 dag.
      BEMÆRK: Dyr kan flyttes hver anden dag for at spare materialer, men man skal sørge for, at æg/larvedyr ikke overføres med den voksne for at forhindre forurening af voksne populationer med afkom. I denne undersøgelse er den enkleste metode at flytte dyr hver dag fra dag 1-3, når æglægning er maksimal, og derefter skifte til at flytte dyr hver anden dag i dag 5-8, når æglægning er minimal. Med denne metode er det ikke bydende nødvendigt at forhindre oplægning af æg/larvedyr i dag 1-3, da de voksne vil blive flyttet hver dag, og æg/larver ikke kan udvikle sig til voksenalderen på 1 dag.
    6. Når dyr er holdt op med at producere afkom, scorer levetiden hver anden dag, indtil alle dyr er blevet scoret som døde eller censureret. Fjern alle døde eller censurerede dyr fra pladen for at undgå forvirring og fortælling om det samme dyr.
      BEMÆRK: Døden scores som dyr, der ikke udviser nogen bevægelse, når de forsigtigt berøres med et valg. Censur scores som dyr, der er pakket, udviser vulva / tarmfremspring eller kravlede op til siderne af pladen, hvor de tørrer.
  2. Levetid med kemisk sterilisering ved hjælp af FUDR
    1. Forbered NGM-agarplader ved at så plader med 100 μL bakterier efter eget valg. For konsistens skal du sikre dig, at de samme bakterier bruges på tværs af alle replikater. Frø 8-12 plader pr. stamme til levetidsforsøg og to til fire plader pr. stamme for at dyrke dyr til voksenalderen. Lad plader tørre natten over.
    2. Tilsæt 100 μL 10 mg / ml FUDR på midten af bakteriel græsplæne til de 8-12 plader, der vil blive brugt til levetidsanalyse. Husk at efterlade to til fire plader uden FUDR som startplader for at give dyrene mulighed for at vokse til voksenalderen. Lad plader tørre natten over.
      FORSIGTIG: FUDR blokerer DNA-syntese, og det anbefales derfor at bære handsker ved håndtering.
    3. Der indsamles en synkroniseret population af C. eleganer ved hjælp af et standardblegningsassay som beskrevet i trin 1.3 og 1.4.
      BEMÆRK: Disse dyr skal dyrkes på plader uden FUDR, da FUDR vil få dyr til at arrestere / dø.
    4. Flyt 10-15 dag 1 voksne dyr på 8-12 plader hver, der indeholder FUDR. For en standard levetid skal du starte med ~ 120 dyr for at sikre, at prøvestørrelsen ikke falder for langt under 100 efter censurbegivenheder (f.eks. Otte plader med 15 dyr = 120 dyr; 12 plader med 10 dyr = 120 dyr).
      BEMÆRK: Dyr kan også flyttes til FUDR på L4-stadiet, hvis det er bydende nødvendigt, at afkomsdannelse helt undgås, men dyr må ikke flyttes for tidligt, da dette vil medføre, at dyr er i højere risiko for vulva / tarmfremspring og vil øge censuren.
    5. Score levetider hver anden dag, indtil alle dyr er blevet scoret som døde eller censureret. Fjern alle døde eller censurerede dyr fra pladen for at undgå forvirring og fortælling om det samme dyr.
      BEMÆRK: For FUDR-levetid kan ethvert afkom ignoreres, da de vil arrestere på L1-stadiet og til sidst dø.
  3. Levetid ved hjælp af temperaturfølsomme sterile mutanter
    1. Forbered NGM-agarplader ved at så plader med 100 μL bakterier efter eget valg. For konsistens skal du sikre dig, at de samme bakterier bruges på tværs af alle replikater. Frø 8-12 plader pr. stamme til levetidsforsøg og 2-4 plader pr. stamme for at dyrke dyr til voksenalderen. Lad plader tørre natten over.
    2. Der indsamles en synkroniseret population af C. eleganer ved hjælp af et standardblegningsassay som beskrevet i trin 1.3 og 1.4. Husk at dyrke dyr ved den restriktive temperatur på 25 °C for at sikre, at dyrene er sterile.
    3. Flyt 10-15 dage 1 voksne dyr på 8-12 plader hver. For en standard levetid skal du starte med ~ 120 dyr for at sikre, at prøvestørrelsen ikke falder for langt under 100 efter censurbegivenheder (f.eks. Otte plader med 15 dyr = 120 dyr; 12 plader med 10 dyr = 120 dyr).
    4. Score levetider hver anden dag, indtil alle dyr er blevet scoret som døde eller censureret. Fjern alle døde eller censurerede dyr fra pladen for at undgå forvirring og fortælling om det samme dyr.
      BEMÆRK: Når man beskæftiger sig med kortvarige stammer, anbefales det at score levetider hver dag, da levetiden ved 25 ° C er meget kortere, og dermed er det dynamiske område begrænset. Ifølge forfatterne kan dyr flyttes tilbage til 20 °C efter dag 2, og dyr vil forblive sterile, hvis det er at foretrække at score levetiden ved 20 °C.

3. Måling af healthspan i C. elegans

  1. Målinger af lokomotorisk adfærd via thrashing
    1. Der indsamles en synkroniseret population af C. eleganer ved hjælp af et standardblegningsassay som beskrevet i trin 1.3 og 1.4.
    2. Flyt en lille koloni af dag 1 voksne orme på en NGM-agarplade under et dissekeringsomfang på 10-20 μL M9-opløsning. 10-15 dyr anbefales som et overskueligt antal dyr at tælle.
    3. Med fokus på en orm ad gangen skal du tælle antallet af gange, prøven skifter fra en konkav til konveks dannelse i 15 s. Brug en håndtæller og en timer, så fokus kan placeres på ormen i løbet af analysen.
      BEMÆRK: En video af pladen kan optages for mere grundig / lettere analyse. For eksempel er standardmikroskop okular vedhæftede filer tilgængelige for de fleste smartphones og digitale kameraer ($ 15- $ 30), og disse er en god mulighed for video thrashing til en lav pris.
    4. Gentag trin 3.1.3 for de andre orme i væsken, i gennemsnit en samlet bevægelighed for 10-15 orme. For større prøvestørrelse gentages trin 3.1.2-3.1.4.
    5. Alder ud orme til ønsket alder. Lignende metoder til levetidsassays beskrevet i trin 2.1-2.3 kan bruges til aldring af orme. Trin 3.1.2-3.1.4 gentages for at analysere tæsk i den ønskede alder.
      BEMÆRK: En alternativ metode til trin 3.1.2 er at tilsætte ~ 30 μL eller mere M9-opløsning på en gruppe orme på en plade. Dette sparer tid fra manuelt at skulle overføre orme, men på grund af tilfældig chance for, hvor ormene er på en enkelt plade, er der ingen garanti for, at en gruppe orme forbliver på et enkelt punkt på pladen.
  2. Målinger af fecundity (ægtælling) i C. elegans
    1. Der indsamles en synkroniseret population af C. eleganer ved hjælp af et standardblegningsassay som beskrevet i trin 1.3 og 1.4. Assays for ægtælling starter ved L4-stadiet, hvilket er ~ 1 dag før dag 1 voksenalder (~ 3 dage ved 15 ° C eller ~ 2 dage ved 20 ° C efter L1-anholdelse).
    2. Udpeg L4 orme på separate NGM-agar plader podet med bakterier efter eget valg. Det anbefales, at ~ 10-15 dyr anvendes til en fecundity assay.
      BEMÆRK: Det anbefales at fortynde de valgte bakterier med 50% (dvs. ikke en mættet kultur) for at forbedre æggets synlighed i bakterieplænen.
    3. Lad dyrene vokse natten over ved 20 °C. Sørg for, at et nysået parti plader er klar til næste dag.
    4. På dag 1 i voksenalderen overføres voksne orme til friske NGM-agarplader podet med de fortyndede bakterier efter eget valg.
      BEMÆRK: Det anbefales at bruge frisksåede plader eller at opbevare plader ved 4 ° C, indtil de bruges til at forhindre tykke bakterielle græsplæner.
    5. Tæl det samlede antal æg, der er lagt på hver NGM-agarplade.
      BEMÆRK: For at hjælpe med at scanne pladen kan et gitter trækkes på låget af en plade og placeres under pladen, der scores for æg. Pladen kan derefter scannes langs gitterlinjerne for at opretholde orienteringen, når pladen flyttes og forhindre genfortælling af æg.
    6. Trin 3.2.4-3.2.5 gentages i 7-8 dage, eller indtil æggene ikke længere er synlige på tallerkenen.
      BEMÆRK: I dag 1-3, når æglægningshastighederne er høje, anbefales det at flytte dyr mindst hver 12. time og analysere ægtællinger to gange om dagen. Dette øger dog mængden af arbejde og omkostninger til forbrugsstoffer, og dermed kan flytning af dyr og målinger begrænses til en gang om dagen, men der skal sørges for, at alle æg og udklækkede dyr tælles korrekt. Alle klækkede dyr tælles som æg med henblik på denne analyse.
  3. Måling af yngelstørrelse (udvikling) af C. elegans afkom
    1. Der indsamles en synkroniseret population af C. eleganer ved hjælp af et standardblegningsassay som beskrevet i trin 1.3 og 1.4. Assays for yngelstørrelse starter ved L4-stadiet, hvilket er ~ 1 dag før dag 1 voksenalder (~ 3 dage ved 15 ° C eller ~ 2 dage ved 20 ° C efter L1 anholdelse).
    2. Udpeg L4 orme på separate NGM-agar plader podet med bakterier efter eget valg. Det anbefales, at ~ 10-15 dyr anvendes til en fecundity assay.
    3. Lad dyrene vokse natten over ved 20 °C. Sørg for, at et nysået parti plader er klar til næste dag.
    4. På dag 1 i voksenalderen overføres voksne orme til friske NGM-agarplader podet med bakterier efter eget valg.
    5. Hver 12-24 timer (2x om dagen eller 1x om dagen) overføres voksne orme til friske NGM-agarplader podet med bakterier efter eget valg i 7-8 dage, eller indtil afkom ikke længere er synligt. Alle ægpladerne opbevares ved 20 °C.
    6. Gentag trin 3.3.5 i 7-8 dage, eller indtil afkom ikke længere er synligt. Alle ægpladerne opbevares ved 20 °C.
      BEMÆRK: Afkomsplader kan også opbevares ved 15 ° C for at forlænge tiden, før de skal scores.
    7. To dage efter overførsel af orme skal du tælle det udviklede afkom på pladerne. Tæl udviklende orme på L4-stadiet (dvs. 2 dage efter udklækning ved 20 ° C) eller tidligere for at sikre, at F2-generationen (dvs. afkom af afkom) ikke forvirrer resultaterne. Tæl alle orme, der er i live.
      1. Fjern alle orme fra pladen, når de tælles. Vedligehold pladerne i yderligere 1-2 dage, før du scorer dem igen for at sikre, at eventuelle dyr med forsinket udklækning / udvikling ikke går glip af.
    8. Trin 3.3.7 gentages for hver opsamlet æglægningsplade.
      BEMÆRK: Analyseerne af yngelstørrelse kan udføres i forbindelse med ægtællingsassay (trin 3.2) for at minimere arbejdskraft og omkostninger ved forbrugsstoffer ved at indsamle to sæt data fra et eksperiment. Dette vil også give mulighed for direkte sammenligning af yngelstørrelse og ægantal inden for de samme dyr.

4. Måling af stressmodstandsdygtighed i C. elegans

  1. Målinger af ER-stressfølsomhed ved hjælp af tunicamycin
    1. NGM-agarplader fremstilles ved at pode plader indeholdende tunicamycin (se trin 1.1.7, BEMÆRK) med 100 μL bakterier efter eget valg.
      FORSIGTIG: Handsker skal bæres ved håndtering af tunicamycin.
    2. For konsistens skal du sikre dig, at de samme bakterier bruges på tværs af alle replikater. Frø 8-12 tunicamycinplader pr. stamme til overlevelsesassays og to til fire plader uden tunicamycin pr. stamme for at dyrke dyr til voksenalderen. Lad plader tørre natten over.
    3. Der indsamles en synkroniseret population af C. eleganer ved hjælp af et standardblegningsassay som beskrevet i trin 1.3 og 1.4.
      BEMÆRK: Dyr skal dyrkes på tallerkener uden tunicamycin indtil dag 1 i voksenalderen, da dyr vil arrestere / dø på tunicamycin.
    4. Flyt 10-15 dage 1 voksne dyr på 8-12 plader hver. For en standard overlevelsesassays skal du starte med ~ 120 dyr for at sikre, at prøvestørrelsen ikke falder for langt under 100 efter censurbegivenheder (f.eks. Otte plader med 15 dyr = 120 dyr; 12 plader med 10 dyr = 120 dyr).
      BEMÆRK: I lighed med FUDR-assays kan tunicamycinoverlevelsesassays udføres uden at flytte dyr, da tunicamycin forårsager død / anholdelse af L1-dyr. Ved udførelse af en DMSO-kontrol vil afkom imidlertid udvikle sig på DMSO-plader, så dyr skal flyttes dagligt, eller der kræves en steriliseringsteknik (identiske metoder, der anvendes i afsnit 2 for levetider, kan bruges til overlevelsesassays).
    5. Overlevelsesassays scores svarende til levetider. Fjern alle døde eller censurerede dyr fra pladen for at undgå forvirring og fortælling om det samme dyr.
      BEMÆRK: Selvom det er muligt at score dyr hver anden dag, da døden forekommer hurtigt på tunicamycin, anbefales det at score overlevelsesassays dagligt.
  2. Målinger af mitokondrie/oxidativ stressfølsomhed ved hjælp af paraquat
    1. NGM-agarplader fremstilles ved hjælp af podeplader indeholdende paraquat (se trin 1.1.7; BEMÆRK) med 100 μL bakterier efter eget valg.
      FORSIGTIG: Handsker skal bæres ved håndtering af paraquat, da det er en miljøfare. Tjek med institutionens miljømæssige sundhed og sikkerhed for krav til bortskaffelse, da mange forskningsinstitutioner vil kræve specifikke kasseringsinstruktioner for miljøfarer.
    2. For konsistens skal du sikre dig, at de samme bakterier bruges på tværs af alle replikater. Frø 8-12 plader pr. stamme til overlevelsesassays og to til fire plader uden paraquat pr. stamme for at dyrke dyr til voksenalderen. Lad plader tørre natten over.
    3. Der indsamles en synkroniseret population af C. eleganer ved hjælp af et standardblegningsassay som beskrevet i trin 1.3 og 1.4.
      BEMÆRK: Husk at dyrke dyr på tallerkener uden paraquat indtil dag 1 i voksenalderen; Det er dog nødvendigt at udføre en steriliseringsteknik eller flytte voksne væk fra afkom, da nogle dyr kan udvikle sig til voksenalderen på paraquatplader (se trin 2.2-2.3).
    4. Flyt 10-15 dage 1 voksne dyr på 8-12 plader hver. For et standardoverlevelsesassay skal du starte med ~ 120 dyr for at sikre, at prøvestørrelsen ikke falder for langt under 100 efter censurhændelser (f.eks. Otte plader med 15 dyr = 120 dyr; 12 plader med 10 dyr = 120 dyr).
    5. Overlevelsesassays scores svarende til levetider. Fjern alle døde eller censurerede dyr fra pladen for at undgå forvirring og fortælling om det samme dyr.
      BEMÆRK: Selvom det er muligt at score dyr hver anden dag, da døden forekommer hurtigt på paraquat, anbefales det at score overlevelsesassays dagligt. Dette gælder især ved brug af glp-4(bn2) dyr dyrket ved 25 °C, da døden vil forekomme meget hurtigt.
  3. Målinger af varmespændingsfølsomhed (termotolerance) ved hjælp af forhøjede temperaturer
    1. Der indsamles en synkroniseret population af C. eleganer ved hjælp af et standardblegningsassay som beskrevet i trin 1.3 og 1.4.
    2. Forvarm NGM-agarplader til 37 °C, inden dyrene flyttes på pladerne ved at anbringe pladerne i en kuvøse på 37 °C i mindst 1 time.
    3. Flyt 10-15 dag 1 voksne dyr på fire til seks forvarmede plader hver. For en standard termotolerance skal du starte med ~ 60 dyr (f.eks. Fire plader med 15 dyr = 60 dyr; seks plader med 10 dyr = 60 dyr)
    4. Placer dyr i en 37 ° C inkubator og score for død hver 2. time. Døden defineres som dyr, der ikke udviser nogen bevægelse, når de forsigtigt berøres med en pluk. Fjern alle døde eller censurerede dyr fra pladen for at undgå forvirring og fortælling om det samme dyr.
    5. Sørg for, at plader fjernes fra 37 ° C inkubatoren i den mindst mulige tid, da plader, der efterlades ved omgivelsestemperatur i lange varigheder, mens scoring vil ændre termotoleranceresultater.
      BEMÆRK: Det anbefales kun at trække en stamme ud ad gangen for at score, da agarens temperatur ikke bør ændre sig dramatisk i den tid, det tager at score en stamme.
    6. Median termotolerance opnås generelt i 7-9 timer; så sørg for et korrekt assay ved 7 timer, 9 timer og 11 timer.
      BEMÆRK: Mens 1-5 timer kan springes over på grund af variabilitet af inkubatorer, tykkelsen af plader og andre forvirrende faktorer i hvert laboratorium, er det vigtigt, at timing titreres omhyggeligt i hvert laboratorium, hvis tidspunkter er planlagt til at blive sprunget over. Se reference 44 for en komplet vejledning om termotolerance.
    7. Alternativt kan du udføre termotoleranceassayet ved 34 °C i stedet for 37 °C.
      BEMÆRK: Median termotolerance ved 34 ° C forekommer meget senere (10-14 timer i denne undersøgelse), hvilket gør det muligt at forberede termotoleranceassays sent om aftenen (placeret i en 34 ° C inkubator) og for scoring at begynde tidligt den næste dag. Dette giver mulighed for ~ 8 timers fortsat scoring i stedet for den typiske 12 timers periode, der kræves til et 37 ° C termotoleranceassay.

Representative Results

C. elegans er en fremragende modelorganisme til aldringsforskning på grund af et stort flertal af aldringsmekanismer, der bevares med mennesker. Det er vigtigt, at de har meget lave omkostninger i vedligeholdelse og eksperimentering med minimale krav til udstyr og forbrugsstoffer, hvilket gør dem til et eftertragtet modelsystem til institutioner med begrænsede midler. Desuden gør en overflod af enkle assays med overfladiske læringskurver dem til et fremragende system for selv den yngste efterforsker med ringe eller ingen erfaring. Alle disse faktorer kombineret med den kraftfulde genetik af C. elegans , herunder den lette genomredigering, tusindvis af tilgængelige mutanter og transgene dyr til nominelle omkostninger og tilgængelige RNAi-biblioteker til genetisk knockdown af stort set alle gen gør dem til et ideelt system til bachelorinstitutioner. Her undersøges nogle af de billigste metoder til at studere aldring i C. elegans , der primært fokuserer på assays med minimalt udstyr og forbrugsomkostninger samt overfladiske indlæringskurver. Faktisk blev hele protokollerne og dataindsamlingen skrevet / udført af juniorforskere med <5 måneders forskningserfaring, for det meste bachelorstuderende.

Levetidsundersøgelser i C. elegans er meget enkle på grund af dyrs korte levetid, der spænder fra 14-20 dage. Det er vigtigt, at levetidsassays er meget standardiserede og kun kræver en inkubator, et standard dissektionsmikroskop, en standard ormpluk og forbrugsstoffer til fremstilling af NGM-agarplader. Måske er det mest omkostningsoverkommelige aspekt af levetidsmålinger i C. elegans forbrugsstoffer, der kræves. Dette skyldes, at C. elegans er hermafroditter, der selv befrugter; derfor skal voksne, der spores for levetidsanalyser, flyttes væk fra afkom dagligt. Dyr kan dog steriliseres ved at udsætte dem for FUDR eller ved hjælp af mutanter, såsom den temperaturfølsomme kimlinjeløse glp-4 (bn2) mutant dyrket ved de uoverkommelige 25 ° C for at reducere mængden af forbrugsstoffer, der kræves 30,31,32. Her blev levetidsassays udført med FUDR eller med glp-4 (bn2) kimlinjeløse mutanter, som viser lignende resultater som standardlevetid udført på ikke-sterile dyr. Mens levetiden for vildtypen ikke er identisk på grund af virkningerne af FUDR45 eller vækst ved 25 °C på levetid2, viser det kortlivede hsf-1 knockdown-dyr pålideligt et signifikant fald i levetiden for alle forhold (figur 1). hsf-1 koder for varmechokfaktor-1 transkriptionsfaktoren, som er involveret i reguleringen af det termiske stressrespons, og dets knockdown resulterer i et signifikant fald ilevetiden 38,46.

Mens lang levetid er en vigtig faktor at overveje i aldringsbiologi, korrelerer lang levetid ofte ikke med øget sundhed, selv i C. elegans47. Som en komplementær tilgang tilbyder vi således flere metoder til måling af organismens sundhed, herunder reproduktiv sundhed, lokomotorisk adfærd og stressmodstandsdygtighed. Reproduktiv sundhed kan måles på en af to måder. For det første vil målinger af ægtælling give en direkte måling af, hvor mange æg der lægges af en enkelt selvbefrugtende hermafrodit. Men da dyr producerer flere oocytter end sædceller, lægges der også nogle ubefrugtede æg, der aldrig ville producere levedygtigt afkom48. For at få en bedre forståelse af et dyrs sande reproduktionsevne giver målinger af yngelstørrelsen derfor et mål for, hvor mange levedygtige afkom der produceres. Ofte kan øget stressmodstandsdygtighed faktisk nedsætte reproduktionsevnen, potentielt på grund af den iboende virkning af opfattet stress på reproduktion49. Tilsvarende findes et signifikant fald i både antallet af æg, der er lagt, og yngelstørrelse hos hsf-1-overekspressionsdyr sammenlignet med vildtypekontroller (figur 2A,B). Faktisk udviser nogle hsf-1 overekspressionsdyr fuld sterilitet, hvilket giver bevis for, at reproduktiv sundhed kan være omvendt korreleret med lang levetid.

Mens reproduktiv sundhed er vigtig for at forstå kimlinjesundhed, funktionel meiose og reproduktionskapacitet, er der generelt ingen direkte sammenhæng mellem lang levetid og brødstørrelse50. Som en komplementær tilgang tilbydes lokomotorisk adfærd således som en guldstandardmetode til analyse af C. elegans healthspan under aldring51. Der er mange metoder til at måle lokomotorisk adfærd, men de fleste metoder kræver sofistikerede kameraer, sporingssoftware eller dyre kemikalier. I modsætning hertil kræver thrashing-assays stort set intet udstyr ud over, hvad et standard C. elegans-laboratorium er udstyret med: dissekeringsmikroskop, ormeplukning, pipette og forbrugsstoffer til fremstilling af NGM-agarplader. Thrashing satser giver en pålidelig metode til måling af healthspan under aldring, målt ved et signifikant fald i thrashing hos gamle dyr sammenlignet med unge dyr (figur 2C).

Endelig er overlevelse til stressassays en yderligere fysiologisk måling af modstandsdygtighed. Evnen til at aktivere stressresponser falder generelt under aldringsprocessen, hvilket gør dyrene mindre modstandsdygtige og mere følsomme over for stress. Således kan stressmodstandsdygtighed bruges som en pålidelig proxy for organismens sundhed. Her tilbydes metoder til undersøgelse af følsomhed over for 1) ER-stress som reaktion på tunicamycineksponering, et kemisk middel, der blokerer N-bundet glykosylering og resulterer i ophobning af misfoldede proteiner i ER; 2) mitokondrie / oxidativ stress gennem eksponering for paraquat, et kemisk middel, der inducerer superoxiddannelse i mitokondrier; og 3) termisk belastning gennem udsættelse for forhøjede temperaturer. Til tunicamycin- og paraquatassays inkorporeres lægemidlet i NGM-agarpladen under pladeproduktionen. For høje koncentrationer af tunicamycin udvikler afkom generelt ikke, og steriliseringsteknikker behøver derfor ikke anvendes. Protokollen, der præsenteres her, anbefaler 25 ng / μL som en endelig koncentration af tunicamycin, men for dem med begrænsede midler viser 10 ng / μL også en signifikant reduktion i overlevelse (figur 3A). Begge koncentrationer begrænser afkomsudviklingen, og der er derfor ikke behov for steriliseringsmetoder, selvom DMSO-kontrollen vil kræve en steriliseringsteknik eller flytning af dyr på nye plader. Dette skyldes, at tunicamycintoksicitet forhindrer udviklingen af afkom, men DMSO er næsten ugiftigt, hvilket gør det muligt for afkom at udvikle sig fuldt ud, når det dyrkes på tunicamycin.

Til paraquat-assays kræves enten en steriliseringsteknik eller bevægelse af dyr, da paraquatbehandling ikke forhindrer afkom i at udvikle sig til voksenalderen. Høje niveauer af paraquat (4 mM) forkorter levetiden betydeligt, mens lave niveauer af paraquat (0,25 mM) øger levetiden på grund af en hormetisk effekt (figur 3B), i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater52. Endelig kræver termotoleranceassays kun en inkubator, der kan nå 30-37 ° C, og der kræves ingen yderligere reagenser. Overekspression af hsf-1 øger termotolerance ved 37 °C (figur 3C) som tidligere offentliggjort53. Men som andre har vist tidligere og ud fra de foreliggende data, er det største problem med termotoleranceassays deres variabilitet. Mange faktorer kan bidrage til variabilitet inden for termotoleranceassays, herunder forskelle mellem inkubatorer og den tid, dyr bruger uden for inkubatoren, mens de scorer termotolerance hver time. For en grundig retningslinje for termotolerance henvises til reference 41.

Figure 1
Figur 1: Sammenligning af levetidsmålinger med og uden sterilisering. (A) Levetid for vilde N2-nematoder dyrket på NGM-agarplader podet med tomme vektor (ev) eller hsf-1 RNAi-bakterier ved 20 °C. Dyr blev flyttet væk fra afkom på dag 1, 3, 5 og 7 i voksenalderen. (B) Levetid for vilde N2-nematoder dyrket på NGM-agar-FUDR-plader podet med tomme vektor (ev) eller hsf-1 RNAi-bakterier ved 20 °C. Dyr blev dyrket til voksenalderen på standard ev eller hsf-1 RNAi plader, og derefter flyttet til FUDR plader på dag 1 i voksenalderen. (C) Levetid for glp-4(bn2)- muterede dyr dyrket på NGM-agarplader podet med tom vektor (ev) eller hsf-1 RNAi ved 25 °C. For alle forhold blev dyr scoret for død hver 2. dag, indtil alle dyr blev registreret som døde eller censureret. Dyr med sække, fremspring eller eksplosion af vulvaen eller dem, der kravlede op ad pladernes sider og udtørrede, blev censureret. Alle statistikker blev udført ved hjælp af Log-Rank Mantel-Cox-test og kan findes i tabel 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Ægtælling, yngelstørrelse og tærske som målinger af healthspan. (A) Thrashing assays blev udført på glp-4 (bn2) mutante dyr dyrket på NGM-agarplader podet med tom vektor ved 25 ° C på dag 1 (blå), dag 4 (rød) og dag 9 (grøn) dyr. Thrashing blev scoret i dyr placeret i M9-opløsning på en NGM-agar-plade, video optaget ved hjælp af et standard smartphone-kamera monteret på et okular af et standard dissekeringsomfang, og thrashing scoret i slowmotion for nøjagtighed. n = 15 dyr pr. tilstand. (B) Ægtællinger blev målt i vildtype N2 (blå) og sur-5p::hsf-1 (rød) dyr. Dyrene blev dyrket ved 20 °C og flyttet på friske tallerkener, og æg blev talt hver 12. time. Det samlede antal æg, der blev lagt, blev opsummeret. n = 7 dyr for vildtype og 9 dyr for sur-5p::hsf-1. C) Der blev målt ægprøver på de samme dyr som (B), hvor æggene blev dyrket ved 20 °C i 2 dage for at muliggøre udklækning, og alle rugeæg blev talt. = p < 0,001 beregnet ved hjælp af ikke-parametrisk Mann-Whitney-test. Hver prik repræsenterer et enkelt dyr, og linjer repræsenterer median- og interkvartilområdet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Stressrobusthed som en proxy for organismens sundhed. (A) Overlevelsesassay af N2-dyr dyrket på den tomme vektor RNAi-bakterie ved 20 °C. Dyrene blev flyttet til plader indeholdende enten 1% DMSO, 10 ng/μL tunicamycin (TM) eller 25 ng/μL TM på dag 1 i voksenalderen. (B) Overlevelsesassay af N2-dyr dyrket på den tomme vektor RNAi-bakterie ved 20 °C. Dyr blev dyrket fra lugen på plader indeholdende enten vand, 0,25 mM paraquat (PQ) eller 4 mM PQ. For AB blev dyr scoret for død hver 2. dag, indtil alle dyr blev registreret som døde eller censureret. Dyr med sække, fremspring eller eksplosion af vulvaen eller dem, der kravlede op ad pladernes sider og udtørrede, blev censureret. Alle statistikker blev udført ved hjælp af Log-Rank Mantel-Cox-test (tabel 2). C) Samlede data for alle 37 °C termotoleranceassays for vildttype N2-dyr versus overekspression af hsf-1 (sur-5p::hsf-1). Data er repræsenteret som procent i live til tiden = 9 timer af et termotoleranceassay, hvor hver linje repræsenterer et matchet eksperiment udført samme dag. Dyr blev dyrket på den tomme vektor RNAi-bakterier ved 20 ° C og flyttet til 37 ° C på dag 1 i voksenalderen til assay. n = 60 dyr pr. stamme pr. replikat. Klik her for at se en større version af denne figur.

Reagens Opskrift
Blegemiddel opløsning 1,8% (v/v) natriumhypochlorit, 0,375 M KOH
Carbenicillin 100 mg/ml stamopløsning (1000x) i vand. Opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder eller -20 °C til langtidsopbevaring
FUDR 10 mg/ml opløsning i vand. Opbevares ved -20 °C.
Iptg 1 M opløsning i vand.
Lysogeni Bouillon (LB) I denne protokol blev kommerciel LB brugt (se Materialetabel), men alle standard LB hjemmelavede opskrifter ved hjælp af Bacto-tryptone, gærekstrakt og NaCl er tilstrækkelige.
M9-opløsning 22 mM KH2PO4 monobasisk, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode vækst medier (NGM) 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl
NGM RNAi plader 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml carbenicillin/ampicillin. Opbevares ved 4 ° C i mørke i op til 3 måneder
NGM RNAi DMSO 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml carbenicillin/ampicillin; 1% DMSO
(kontrol for tunicamycin)
NGM RNAi TM 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml carbenicillin/ampicillin; 1% DMSO, 25 ng/μL tunicamycin
Paraquat 400 mM opløsning i vand – skal tilberedes frisk
Tetracyklin 10 mg/ml stamopløsning (500x) i 100% ethanol. Opbevares ved -20 °C
Tunikamycin 2,5 mg/ml stamopløsning i 100 % DMSO. Opbevares ved -80 °C til langtidsopbevaring. Dette er en 100x opløsning (25 ng/μL arbejdsløsning)

Tabel 1. Opskrifter til reagenser og medier til protokoller.

Tilsvarende figurpanel Stamme, behandling Median levetid # Dødsfald /# I alt p-værdi
(Log-rang)
1A N2, vektor RNAi, 20 °C 17 74/120 --
N2, hsf-1 RNAi, 20 °C 11 65/120 <0.001
1B N2, vektor RNAi, FUDR, 20 °C 19 120/120 --
N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C 11 116/120 <0.001
1C N2, glp-4(bn2), vektor RNAi, 25 °C 13 115/121 --
N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C 4 120/120 < 0,001
2A N2, vektor RNAi, 20 °C, 1% DMSO 19 85/120 --
N2, vektor RNAi, 20 °C, 10 ng/μL tunicamycin 15 109/120 <0.001
N2, vektor RNAi, 20 °C, 25 ng/μL tunicamycin 12 117/120 <0.001
2B N2, vektor RNAi, 20 °C 19 84/120 --
N2, vektor RNAi, 20 °C, 0,25 mM paraquat 24 91/120 <0.001
N2, vektor RNAi, 20 °C, 4 mM paraquat 6 50/120 <0.001

Tabel 2. Statistik for levetid og stressmodstandsdygtighed.

Discussion

Levetid, mest enkelt defineret som livets varighed, er et klart binært fænomen i de fleste organismer - enten er en organisme levende eller ikke. Imidlertid korrelerer lang levetid ikke altid med en organismes sundhed. For eksempel er mitokondrie hormesemodeller, hvor eksponering for mitokondriestress dramatisk øger levetiden, generelt nogle af de længstlevende dyr, men udviser alligevel hæmmet vækst og nedsat metabolisk funktion37,54. Tilsvarende udviser dyr med hyperaktive endoplasmatiske retikulumstressresponser også visse adfærd og fænotyper, der kan korreleres med nedsat sundhed, på trods af at de har dramatisk forbedret proteinhomeostase og levetid36,49. Endelig er mange levetidsparadigmer i modelorganismer, herunder øget HSF-1-funktion55, øget XBP-1-funktion56 og ændret FoxO-signalering57, alle korreleret med øget kræftrisiko, og det er ubestrideligt, at forlænget levetid ikke er gavnlig, hvis en organisme er i konstant kamp med kræft og andre sundhedsmæssige sygdomme. Derfor kan lang levetid ikke være en selvstændig måling i aldringsbiologi.

Således har begrebet healthspan været et voksende felt inden for aldringsbiologi. Healthspan, løst defineret som den periode i livet, hvor man er sund, er vanskeligere at fastslå end lang levetid. I modsætning til lang levetid er begrebet "sundhed" imidlertid kompliceret, da der er mange forskellige aflæsninger til organismesundhed: på organismeniveau er der muskelfunktion / styrke, neuronal / kognitiv funktion, reproduktiv sundhed osv .; på celleniveau er der proteinhomeostase, lipidhomeostase, glucosehomeostase, metabolisme osv. I 2014 har aldrende biologer definitivt karakteriseret biologiske kendetegn ved aldring med den strukturerede definition, at det skal være noget, der naturligt nedbrydes under aldring og eksperimentelt kan ændres, så eksperimentel eksacerbation skal fremskynde aldring og eksperimentel intervention skal bremse aldring. Disse ni kendetegn ved aldring omfatter genomisk ustabilitet, telomerslidning, epigenetiske ændringer, tab af proteinhomeostase (proteostase), stamcelleudmattelse, ændret intercellulær signalering, mitokondrie dysfunktion, dereguleret næringsstofføling og cellulær ældning58. Siden da har adskillige undersøgelser argumenteret for, at andre faktorer bør medtages, herunder ekstracellulære proteiner og systemisk fysiologi såsom immunitet og betændelse59. I sidste ende kræver den komplekse definition af healthspan, at organismens sundhed måles ved hjælp af flere forskellige metoder.

Derfor præsenteres i dette manuskript flere metoder til at måle forskellige aspekter af healthspan ved hjælp af nematodemodellen, C. elegans. Vi analyserer lokomotorisk adfærd ved hjælp af thrashing assays, reproduktiv sundhed ved hjælp af ægtælling og yngelstørrelse og følsomhed over for stress. Faktisk er lokomotorisk adfærd en guldstandardmetode til måling af healthspan, da organismer udviser betydeligt tab af bevægelighed og bevægelse under aldring51. Tab af lokomotorisk adfærd kan tilskrives flere kendetegn ved aldring, da muskelfunktionen i C. elegans er afhængig af korrekt proteostase60, mitokondrie dysfunktion61 og neuron-muskel signalering62. Mens dette manuskript fokuserer på en måling af lokomotorisk adfærd, er det vigtigt at bemærke, at der findes mange andre metoder, herunder bevægelighed af dyr på en solid agarplade, respons på berøring51 og kemotaxisassays63. Disse metoder kræver dog generelt mere sofistikerede optageenheder, brug af ormesporingssoftware eller brug af dyre, farlige eller flygtige kemikalier, som alle kan være uoverkommelige i nogle forskningsmiljøer.

Derudover præsenteres assays for ægantal og yngelstørrelse som en metode til måling af reproduktiv sundhed og som den enkleste metode til måling af celledeling i voksne orme, da voksne orme er post-mitotiske, og kun kimceller og embryoner gennemgår celledeling inden for en voksen orm64. Som et mål for celledeling kan reproduktiv sundhed være relevant for aldringsmærkerne for cellulær ældning og stamcelleudmattelse. Reproduktiv sundhed kan påvirkes af mange faktorer, herunder patogen infektion65 eller eksponering for stress49, selvom der ikke er nogen direkte sammenhæng mellem reproduktiv sundhed og lang levetid. Faktisk udviser nogle langlivede dyr et signifikant fald i yngelstørrelse49, og det er endda muligt, at der findes en omvendt sammenhæng mellem levetid og yngelstørrelse50. Dette er ikke et fænomen, der er specifikt for C. elegans, da skadelige virkninger af reproduktion på lang levetid længe er blevet observeret hos mennesker66, ledsagere67 og mus68. Alligevel leverer vi ægtælling og yngelstørrelse som en pålidelig og billig metode til måling af reproduktiv sundhed med det forbehold, at reproduktiv sundhed muligvis ikke korrelerer med lang levetid eller sundhed.

Endelig tilbydes overlevelsesassays som et indirekte mål for organismens sundhed. Det er vigtigt, at cellulære stressresponser, herunder respons på termisk stress69 og ER-stress35, hurtigt falder under aldringsprocessen og har direkte relevans for aldringsmærket for proteostase70,71. I modsætning hertil kan hyperaktivering af stressresponser øge levetiden betydeligt ved at fremme modstandsdygtighed over for stress 35,37,38. Mens denne undersøgelse fokuserer på de enkleste og billigste metoder, findes der et stort antal alternative metoder til stressmodstandsdygtighedsassays for termotolerance41 og oxidativ stress66, der hver kræver et andet sæt udstyr og forbrugsstoffer. Ud over simple eksponeringsundersøgelser for stressfaktorer kan andre fysiologiske metoder udføres afhængigt af adgang til udstyr. For eksempel kan en ekstracellulær fluxanalysator overvåge mitokondriefunktion og cellulær respiration73; fluorescerende dissektionsmikroskoper vil muliggøre målinger af transkriptionelle reportere til stressresponsaktivering20; og højopløsnings sammensatte eller konfokale mikroskoper kan bruges til at måle organelmorfologi med fluorescerende sonder til mitokondrier74, det endoplasmatiske retikulum 75,76 og actincytoskelet77.

Som en sidste advarselshistorie for målinger af levetid, mens kemiske og genetiske metoder til sterilisering af orme tilbydes at reducere omkostningerne betydeligt, er det vigtigt at bemærke, at begge direkte kan påvirke levetiden. For eksempel er eksponering for FUDR tidligere blevet rapporteret at påvirke både levetid og termotolerance45. Og mens glp-4 (bn2) mutanten i sig selv ikke har nogen direkte indvirkning på levetiden, er vækst ved 25 ° C en mild varmespænding33,34 og kan således påvirke levetid2. Der findes andre metoder til sterilisering af C. elegans, herunder auxinmedieret sterilitet78 eller alternative temperaturfølsomme sædmangelmutanter79. Alle metoder har dog nogle forbehold, og man bør sørge for at udnytte det mindst skadelige assay til hvert laboratoriums videnskabelige behov. En sidste begrænsning af levetidsundersøgelser er potentiel variabilitet, der kan opstå på grund af lave prøvestørrelser eller simpelthen ved en objektiv fejl fra investigator. Dette kan omgås, da nye teknologier fødes i automatiserede levetidsteknologier80, men igen er disse systemer dyre og kræver noget ingeniør- og beregningsudstyr og færdigheder. I sidste ende er samlingen af metoder, der leveres her, et pålideligt sæt værktøjer, der hurtigt kan tilpasses og læres i næsten enhver institution og give et solidt fundament for aldringsbiologi.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

G.G. understøttes af T32AG052374 og R.H.S. understøttes af R00AG065200 fra National Institute on Aging. Vi takker CGC (finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) for stammerne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APEX IPTG Genesee 18-242 for RNAi
Bacto Agar VWR 90000-764 for NGM plates
Bacto Peptone VWR 97064-330 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin VWR 76345-522 for RNAi
Cholesterol VWR 80057-932 for NGM plates
DMSO VWR BDH1115-1LP solvent for drugs
LB Broth VWR 95020-778 for LB
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-132 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride VWR 97061-566 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
S7E Dissecting Scope Leica 10450840 Standard dissecting microscope
Sodium Chloride VWR EM-SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium hypochlorite VWR RC7495.7-32 for bleach solution
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tetracycline hydrochloride VWR 97061-638 for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing and Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  3. Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).
  4. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  5. Lithgow, G. J., White, T. M., Melov, S., Johnson, T. E. Thermotolerance and extended life-span conferred by single-gene mutations and induced by thermal stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7540-7544 (1995).
  6. Epel, E. S., Lithgow, G. J. Stress biology and aging mechanisms: toward understanding the deep connection between adaptation to stress and longevity. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 69, Suppl 1 10-16 (2014).
  7. Luo, Y. Long-lived worms and aging. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 9 (2), 65-69 (2004).
  8. Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
  9. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  12. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  13. Reboul, J., et al. Open-reading-frame sequence tags (OSTs) support the existence of at least 17,300 genes in C. elegans. Nature Genetics. 27 (3), 332-336 (2001).
  14. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).
  15. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  16. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
  17. Pang, S., Curran, S. P. Adaptive capacity to bacterial diet modulates aging in C. elegans. Cell Metabolism. 19 (2), 221-231 (2014).
  18. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLOS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
  19. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes & Development. 23 (4), 496-511 (2009).
  20. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61001 (2020).
  21. Xiao, R., et al. RNAi interrogation of dietary modulation of development, metabolism, behavior, and aging in C. elegans. Cell Reports. 11 (7), 1123-1133 (2015).
  22. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  23. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  24. Kim, H. -M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in C. elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106 (2019).
  25. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
  26. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19648/ (2006).
  27. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  28. Kaymak, E., et al. Efficient generation of transgenic reporter strains and analysis of expression patterns in Caenorhabditis elegans using Library MosSCI. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 245 (9), 925-936 (2016).
  29. Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (82), (2013).
  30. Rastogi, S., et al. Caenorhabditis elegans glp-4 encodes a valyl aminoacyl tRNA synthetase. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2719-2728 (2015).
  31. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), Cambridge, England. 755-766 (1992).
  32. Santi, D. V., McHenry, C. S. 5-Fluoro-2′-Deoxyuridylate: covalent complex with thymidylate synthetase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69 (7), 1855-1857 (1972).
  33. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), 270-276 (1994).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  35. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  36. Higuchi-Sanabria, R., et al. Divergent nodes of non-autonomous UPRER signaling through serotonergic and dopaminergic neurons. Cell Reports. 33 (10), 108489 (2020).
  37. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  38. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  39. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  40. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  41. Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  42. Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the effects of bacteria on C. Elegans behavior using an egg retention assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e51203 (2013).
  43. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a neuropeptide gene on behavioral states in Caenorhabditis elegans egg-laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  44. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), San Diego, Calif. 450-457 (2014).
  45. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset). PLOS ONE. 9 (1), 85964 (2014).
  46. Hsu, A. -L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
  47. Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 277-286 (2015).
  48. Hodgkin, J., Barnes, T. M. More is not better: brood size and population growth in a self-fertilizing nematode. Proceedings. Biological Sciences. 246 (1315), 19-24 (1991).
  49. Ozbey, N. P., et al. Tyramine Acts Downstream of Neuronal XBP-1s to coordinate inter-tissue UPRER activation and behavior in C. elegans. Developmental Cell. 55 (6), 754-770 (2020).
  50. Lee, Y., et al. Inverse correlation between longevity and developmental rate among wild C. elegans strains. Aging. 8 (5), Albany NY. 986-994 (2016).
  51. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  52. Lee, S. -J., Hwang, A. B., Kenyon, C. Inhibition of respiration extends C. elegans life span via reactive oxygen species that increase HIF-1 activity. Current Biology: CB. 20 (23), 2131-2136 (2010).
  53. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science. 346 (6207), 360-363 (2014).
  54. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  55. Carpenter, R. L., Gökmen-Polar, Y. HSF1 as a cancer biomarker and therapeutic target. Current Cancer Drug Targets. 19 (7), 515-524 (2019).
  56. Chen, S., et al. The emerging role of XBP1 in cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 127, 110069 (2020).
  57. Yadav, R. K., Chauhan, A. S., Zhuang, L., Gan, B. FoxO transcription factors in cancer metabolism. Seminars in Cancer Biology. 50, 65-76 (2018).
  58. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  59. Kennedy, B. K., et al. Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell. 159 (4), 709-713 (2014).
  60. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  61. Hewitt, J. E., et al. Muscle strength deficiency and mitochondrial dysfunction in a muscular dystrophy model of Caenorhabditis elegans and its functional response to drugs. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
  62. Gao, S., Zhen, M. Action potentials drive body wall muscle contractions in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2557-2562 (2011).
  63. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50069 (2013).
  64. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
  65. Madhu, B. J., Salazar, A. E., Gumienny, T. L. Caenorhabditis elegans egg-laying and brood-size changes upon exposure to Serratia marcescens and Staphylococcus epidermidis are independent of DBL-1 signaling. microPublication Biology. 2019, (2019).
  66. Westendorp, R. G., Kirkwood, T. B. Human longevity at the cost of reproductive success. Nature. 396 (6713), 743-746 (1998).
  67. Hoffman, J. M., Creevy, K. E., Promislow, D. E. L. Reproductive capability is associated with lifespan and cause of death in companion dogs. PLOS ONE. 8 (4), 61082 (2013).
  68. Garratt, M., Try, H., Smiley, K. O., Grattan, D. R., Brooks, R. C. Mating in the absence of fertilization promotes a growth-reproduction versus lifespan trade-off in female mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15748-15754 (2020).
  69. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the heat shock response is a programmed event at the onset of reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  70. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A futile battle? Protein quality control and the stress of aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  71. Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Hijacking cellular stress responses to promote lifespan. Frontiers in Aging. 3, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fragi.2022.860404 (2022).
  72. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring oxidative stress in Caenorhabditis elegans: paraquat and juglone sensitivity assays. Bio-protocol. 7 (1), 2086 (2017).
  73. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: mitochondrial function using the seahorse system. Methods in molecular biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).
  74. Daniele, J. R., et al. High-throughput characterization of region-specific mitochondrial function and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749 (2017).
  75. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  76. Daniele, J. R., et al. UPRER promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Science Advances. 6 (1), 1441 (2020).
  77. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).
  78. Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).
  79. Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (4), 145-156 (1994).
  80. Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).

Tags

Genetik udgave 183 C. elegans stress aldring udfoldet proteinrespons endoplasmatisk retikulum mitokondrier varmechokrespons
Undersøgelse af billige metoder til måling af levetid og sundhed i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro Torres, T., Moaddeli, D.,… More

Castro Torres, T., Moaddeli, D., Averbukh, M., Coakley, A. J., Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (183), e64091, doi:10.3791/64091 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter