Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

Published: May 18, 2022 doi: 10.3791/64091
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Caenorhabditis elegans משמשים כמערכת מודל מצוינת עם שיטות חזקות ובעלות נמוכה לסקר את תוחלת החיים, תוחלת החיים והחוסן ללחץ.

Abstract

הגילוי וההתפתחות של Caenorhabditis elegans כאורגניזם מודל השפיעו על הביולוגיה, במיוחד בתחום ההזדקנות. מחקרים היסטוריים ועכשוויים רבים זיהו אלפי פרדיגמות משנות תוחלת חיים, כולל מוטציות גנטיות, ביטוי גנים מהונדס והורמסיס, חשיפה מועילה בדרגה נמוכה ללחץ. עם יתרונותיו הרבים, כולל תוחלת חיים קצרה, תחזוקה קלה וזולה, וגנום ברצף מלא עם הומולוגיה לכמעט שני שלישים מכלל הגנים האנושיים, C. elegans אומץ במהירות כמודל יוצא מן הכלל לביולוגיה של סטרס והזדקנות. כאן, מספר שיטות סטנדרטיות נסקרו למדידת תוחלת חיים ותוחלת בריאות שניתן להתאים בקלות כמעט לכל סביבת מחקר, במיוחד אלה עם ציוד וכספים מוגבלים. התועלת המדהימה של C. elegans מוצגת, המדגישה את היכולת לבצע ניתוחים גנטיים רבי עוצמה בביולוגיה של ההזדקנות ללא צורך בתשתית נרחבת. לבסוף, המגבלות של כל ניתוח וגישות חלופיות נדונות לשיקול דעת.

Introduction

מאז פרסום 'הגנטיקה של Caenorhabditis elegans', אחד המאמרים המשפיעים ביותר של סידני ברנר בשנת 1974, תולעת מיקרוסקופית זו נחשבה למערכת מודל יוצאת דופן לחקר תעלומות ביולוגיות1. בשנת 1977 פרסם מייקל ר. קלאס את השיטה למדידת תוחלת החיים של C. elegans והקים מערכת מודל זו כדי לחקור הזדקנות2. החקירה להבנת הקשר בין לחץ לאריכות ימים החלה בזיהוי מוטציה בודדת בגן age-1, שהביאה להארכת תוחלת החיים ב-C. elegans3. יתר על כן, מחקרים עכשוויים זיהו מוטציות אחרות שהולכות וגדלות בתוחלת החיים, שחשפו תולעים מוטנטיות בעלות תוחלת חיים ארוכה שמפגינות עמידות מוגברת ללחץשל 4,5,6. עם יתרונותיו הרבים, כולל תוחלת חיים קצרה, תחזוקה קלה, גנום ברצף מלא המכיל הומולוגיה לכ-2 שלישים מכל הגנים הגורמים למחלות אנושיות, זמינות וקלות השימוש בספריות הפרעות RNA (RNAi), ודמיון פיזיולוגי עם בני אדם 7,8,9, C. elegans אומץ במהירות כמודל יוצא מן הכלל לביולוגיה של עקה והזדקנות.

אולי היתרונות הגדולים ביותר של C. elegans הם עלות התחזוקה הנמוכה ביותר שלה, קלות הניסויים ומגוון הכלים הגנטיים הזמינים למחקרים. C. elegans גדלים בדרך כלל על מדיום אגר מוצק עם מקור מזון E. coli. שני זני E. coli הנפוצים הם OP50 סטנדרטי, זן B שהוא אולי הנפוץ ביותר10, ו-HT115, זן K-12 המשמש בעיקר לניסויים של RNAi11,12. זן HT115 K-12 נושא מחיקה ב-RNAIII RNase, מוטציה החיונית לשיטות RNAi, שבהן נעשה שימוש בפלסמידים המבטאים dsRNA המתאימים לגנים בודדים של C. elegans. וקטורי ההזנה של dsRNA מאפשרים פגיעה חזקה בגנים של C. elegans ללא צורך בצלבים מורכבים או בעריכת גנום, מכיוון שחיידקים הנושאים את הפלסמידים האלה יכולים להיות מוזנים ישירות לנמטודות. אלפי וקטורי RNAi חיידקיים אלה קיימים ברקע HT115, כולל ספריית Vidal RNAi הפופולרית ביותר עם >19,000 מבני RNAi בודדים13 וספריית Ahringer RNAi עם 16,757 RNAi בונה14. עם זאת, לדיאטות החיידקים OP50 ו-HT115 יש הבדלים משמעותיים בפרופיל המטבולי, כולל הבדלים בוויטמין B1215,16. לכן, מומלץ לבצע את כל הניסויים על מקור חיידקי יחיד, במידת האפשר, כדי להימנע מאינטראקציות בין גנים לתזונה שעשויים להציג מספר גורמים מבלבלים כפי שתואר קודם לכן 17,18,19. בשל הקלות שלו, בעלי חיים נשמרים על OP50 עבור כל תנאי הניסוי המתוארים כאן, אבל כל הניסויים מבוצעים על HT115 כפי שתואר קודם לכן20. בקצרה, בעלי חיים נשמרים ב-OP50 ומועברים ל-HT115 לאחר הסנכרון (לאחר ההלבנה) לצורך עקביות בין ניסויי RNAi לעומת ניסויים שאינם RNAi. לחלופין, ניתן להשתמש בזן OP50 בעל יכולת RNAi הנושא מחיקה דומה של RNAIII RNase שנמצא בזן E. coli K12 HT115גם הוא 21.

אולי מגבלה מרכזית אחת לניסויי RNAi ב- C. elegans היא החשש מיעילות ההדחה. בעוד שניתן לאמת את יעילות ההדחה באמצעות qPCR או כתם מערבי, אלה דורשים ציוד וריאגנטים יקרים ומוגבלים לניתוח בתפזורת. זה אפילו יותר מדאיג בהסתכלות על תאים ספציפיים, כגון נוירונים, שהם עקשנים (פחות רגישים) ל-RNAi. בעוד שניתן לשפר את יעילות ה-RNAi בתאים ספציפיים באמצעות ביטוי יתר של SID-1, חלבון הטרנס-ממברנה החיוני לקליטת dsRNA22, זה עדיין מוגבל לדפוסי הביטוי הספציפיים לסוג התא של המקדמים המשמשים למבנים אלה, ולכן נוקאאוטים של גנים ומוטציות הם האמצעי המטופש ביותר לדלדול תפקודי גנים. מעבר להדחה בתיווך RNAi, C. elegans גם נוחים מאוד לעריכת גנום עם אסטרטגיות מבוססות קריספר 23,24,25 ובנייה מהונדסת ביטוי יתר באמצעות מיקרו-אינטגרציות, עם אפשרות לשלב מבנים מהונדסים באמצעות הקרנה או אינטגרציה מבוססת טרנספוזון 26,27,28,29 . עם זאת, שיטות אלה דורשות ציוד מיקרו-איניג'קציה יקר, והעלות הגבוהה של רנ"א מנחה או אנזים Cas9 עשויה לאסור שיטות אלה במוסדות עם מימון מוגבל. במקום זאת, אלפי קווים ומוטנטים מהונדסים זמינים בקלות תמורת דולרים בודדים הן במרכז הגנטיקה של Caenorhabditis (CGC) והן בפרויקט הלאומי של Bioresource (NBRP). ה-NBRP מציע מוטנטים מבודדים עבור מספר רב של גנים של C. elegans, כולל זנים מוטנטיים שפורסמו ולכן אומתו, מוטנטים שמקורם בפרויקטי פיילוט ומוטנטים שטרם אופיינו. לעומת זאת, CGC הוא מאגר של קווי C. elegans שפורסמו והתבססו ברובם מקהילת המחקר. שניהם שולחים זנים ברחבי העולם במחירים סבירים מאוד ומציעים מגוון רחב של אפשרויות לבעלי יכולת מוגבלת לסנתז זנים בתוך החברה.

כאן מוצע אוסף שיטות, אשר צפויות להיות השיטות בעלות הנמוכה ביותר לבדיקת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב- C. elegans. כל השיטות המוצגות כאן דורשות ציוד ואספקה בעלות נמוכה, ומשתמשות רק בזנים הזמינים בקלות מה-CGC. אולי הדבר העיקרי למבחני אריכות ימים והישרדות ב- C. elegans הוא העלות של לוחות נמטודה צמיחה מדיה (NGM). מאחר ש-C. elegans הם הרמפרודיטים ומפרים את עצמם, מבחני הישרדות סטנדרטיים דורשים שבעלי חיים בוגרים יתרחקו ללא הרף מצאצאיהם כדי למנוע זיהום מצד הצאצאים. לא רק שתהליך זה גוזל זמן רב, הוא עלול להפוך ליקר בשל הצורך בכ-100 צלחות לכל תנאי כדי להפעיל מבחן תוחלת חיים יחיד. כאן מסופקות שתי חלופות: ניצול של המוטציה הרגישה לטמפרטורה ללא חיידקים, glp-4(bn2), או עיקור כימי באמצעות 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR). glp-4 מקודד סינתזת tRNA של valyl aminoacyl, וה-glp-4(bn2) הרגיש לטמפרטורה סובלים ממחסור רבייתי בטמפרטורות מגבילות עקב ירידה בתרגום חלבוניםשל 30,31. FUDR היא שיטה חזקה לעיקור כימי של C. elegans על ידי מניעת שכפול DNA, ובכך לעכב רבייה32. למרות ש-FUDR יכול להיות יקר מאוד עבור מעבדות מסוימות, נדרשת רק כמות קטנה כדי לעקר תולעים כימית, ויציבותו בצורת אבקה עשויה להפוך אותו לאפשרי עבור רוב הקבוצות. שימוש במוטציה glp-4(bn2) הרגישה לטמפרטורה היא ללא ספק האפשרות הזולה ביותר, שכן הדרישה היחידה היא אינקובטור להעברת בעלי החיים ל-25 מעלות צלזיוס המגבילות; עם זאת, יש לציין כי צמיחה ב 25 °C (76 °F) עלול לגרום ללחץ חום קל33,34. ללא קשר לשיטה, שימוש בבעלי חיים סטריליים יכול להפחית באופן משמעותי את העלויות של חומרים מתכלים הנדרשים לבדיקות הקשורות לגיל.

כדי לחקור את ההזדקנות, מבחני תוחלת החיים הסטנדרטית הם קונבנציונליים מכיוון שלפרדיגמות שמשנות את תוחלת החיים יש השפעות ישירות על ההזדקנות. עם זאת, מדידות של תוחלת בריאות ועמידות ללחץ מציגות מידע נוסף על בריאות האורגניזם. כאן, מספר שיטות מוצעות למדידת תוחלת הבריאות: 1) fecundity כמדד לבריאות הרבייה; 2) גודל גזע כמדד לבריאות התפתחותית וכדאיות של צאצאים מפוטרים; ו-3) התנהגות תנועתית כמדד לתפקוד השרירים ולתנועתיות, שניהם מתואמים ישירות עם הזדקנות. בנוסף, מוצעים מבחנים של עמידות לעקה: הישרדות לעקה במיון, עקה מיטוכונדריאלית/חמצונית והישרדות בעקה תרמית. ואכן, בעלי חיים עם עמידות מוגברת ללחץבמיון 35,36, עקה מיטוכונדריאלית37 ומתח תרמי38 מפגינים תוחלת חיים מוגברת. עקת ER מופעלת על ידי חשיפת C. elegans לטוניקמיצין, אשר חוסם את הגליקוזילציה המקושרת ל-N וגורמת להצטברות של חלבונים מקופלים בצורה שגויה39. עקה מיטוכונדריאלית/חמצונית נגרמת על ידי חשיפה לפראקוואט, מה שגורם להיווצרות סופראוקסיד במיוחד במיטוכונדריה40. עקת חום מוחלת באמצעות דגירה של בעלי חיים ב 34-37 °C33,41. ניתן לבצע את כל הבדיקות המתוארות כאן בציוד ובכספים מינימליים, ולהציע מגוון כלים לחקר ההזדקנות בקבוצות מגוונות.

Protocol

1. צמיחה ותחזוקה של C. elegans

  1. מזיגת לוחות מדיית גדילה של נמטודה (NGM)
    1. לגדל C. elegans על צלחות אגר סטנדרטיות 2% עם נמטודה צמיחה מדיה (NGM) המורכבת 1 mM CaCl2, 5 מיקרוגרם / מ"ל כולסטרול, 25 mM KPO4 (pH 6.0), 1 mM MgSO4, 0.25% w / v Peptone, ו 51.3 mM NaCl.
    2. עבור 1 ליטר של לוחות NGM-agar, יש למדוד 2.5 גרם של פפטון, 3.0 גרם של NaCl ו-20 גרם של אגר לתוך בקבוקון 1 ליטר עם מוט ערבוב.
      הערה: מומלץ לתקנן מקור אגר ספציפי, מכיוון שראינו שונות בנוקשות בין מותגים, מה שעלול להשפיע על יכולת השכפול. כאן, Bacto-Agar משמש בקפדנות. בנוסף, מומלץ להוסיף אגר ישירות לבקבוקון האוטוקלב, שכן אגר לא יתמוסס לחלוטין ללא חימום, והעברת תמיסה המכילה אגר תגרום לאובדן אגר ולטעויות בריכוז.
    3. הוסף dH2O עד 970 מ"ל.
      הערה: 30 מ"ל של תוספים נוזליים לאחר העיקור יביאו את הנפח הסופי ל-1 ליטר. בידינו, ~ 951 מ"ל של dH2O יידרשו להגיע ל -970 מ"ל של הנפח הסופי.
    4. לעקר את תמיסת NGM-agar באמצעות אוטוקלאב סטנדרטי או מעקר מדיה לעיקור יעיל.
      הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן NGM-agar סטרילי במשך מספר חודשים בטמפרטורת החדר. אם מאוחסן, NGM-agar ניתן לדחוס מחדש במיקרוגל עם פולסים של 15-45 שניות כדי למנוע מהתמיסה לרתוח, או באמבט מים מחומם.
    5. תנו לתמיסה לערבב עד שהיא מתקררת ל-60-75 מעלות צלזיוס. ערבוב בזמן הקירור חשוב כדי למנוע קירור לא אחיד, מה שעלול לגרום לחלק מהאגר להתמצק.
    6. בזמן שהפתרון מתקרר, מחממים אמבט מים או אמבט חרוזים ל-65-70 מעלות צלזיוס.
    7. לאחר שהתמיסה מתקררת ל-60-75 מעלות צלזיוס, הוסיפו תוספים נוזליים: 2.0 מ"ל של 0.5 M CaCl2, 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול, 25 מ"ל של 1 M KPO4 (pH 6.0) ו-0.5 M MgSO4 (ראו טבלה 1 למתכונים לכל הריאגנטים), ואפשרו לתמיסה לערבב במשך כ-5 דקות כדי להבטיח ערבוב מלא.
      הערה: ניתן לכלול כאן גם תרופות בצלחות (למשל, להוסיף 1 מ"ל של 100 מ"ג/מ"ל קרבניצילין ו-1 מ"ל של 1 M IPTG; להוסיף 10 מ"ל של 2.5 מ"ג/מ"ל טוניקומיצין; להוסיף 10 מ"ל של 400 mM paraquat).
    8. שקעו בקבוקון המכיל NGM-agar באמבט מים של 65-70 מעלות צלזיוס כדי למנוע מ-NGM-agar להתמצק תוך כדי שפיכה לתוך צלחות.
    9. פיפט 9-11 מ"ל של פתרון לתוך כל לוח 60 מ"מ, או 20-30 מ"ל של פתרון לתוך כל לוח 100 מ"מ.
      הערה: מומלץ להשתמש בנפח הפיפטה הקטן ביותר שקיים כדי למנוע דליפות NGM הנגרמות על ידי התרחבות אוויר בפיפטה. צנרת של 1-2 מ"ל יותר מדיה ממה שיתווסף לכל צלחת כדי למנוע ריקון מוחלט של הפיפטה תסייע במניעת היווצרות בועות. לחלופין, ניתן לשפוך צלחות ביד ישירות מהבקבוק לתוך צלחת, אך מומלץ מאוד לטפטוף כדי להבטיח צלחות בנפח שווה. לוחות בנפח שווה חשובים כדי להבטיח ריכוזים דומים של תמיסות בעת שימוש בשיטות שבהן תמיסות מיושמות ישירות על גבי צלחת (ראה שלב 1.1.17). נפחים שווים מאפשרים גם מיקרוסקופיה קלה לשמירה על מישור מוקד דומה על פני לוחות.
    10. מניחים את הפיפטה בחזרה בתמיסה המחוממת כדי לשמור על הטמפרטורה ולמנוע מ-NGM-agar להתמצק.
    11. חזור על שני השלבים לעיל עבור כל הלוחות.
    12. אפשרו לצלחות NGM-agar להתמצק בן לילה.
    13. לאחר שהצלחות התמצקו, אחסנו צלחות עד 3 חודשים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או עברו לשלב 1.1.14 לזריעת צלחות עם חיידקים. אחסנו צלחות במיכלים אטומים כדי לסייע בשמירה על לחות כדי לשמור על איכות הצלחת.
    14. לגדל תרבית של OP50 בציר ליסוגניה (LB) או מדיה מקבילה לבחירה במשך 24-48 שעות בטמפרטורת הסביבה (~ 22-25 מעלות צלזיוס) או לגדל תרבית של HT115 ב- LB + אנטיביוטיקה (אמפיצילין / פחמימות + טטרציקלין מומלץ עבור HT115) עם טלטול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
      הערה: מומלץ לגדל את OP50 בטמפרטורת החדר מכיוון שצמיחה אגרסיבית יותר של OP50 נמצאה ב-37 מעלות צלזיוס, מה שמשפיע על תוחלת החיים של C. elegans . לעומת זאת, ל-HT115 יש קצב צמיחה איטי יותר והוא יוצר תרבויות פחות צפופות; לכן, מומלץ לגדל HT115 ב 37 °C עם רעידות.
    15. זרעו נפח של 100-200 μL של תרבית OP50/HT115 רוויה על לוחית 60 מ"מ, או 1 מ"ל עבור צלחת של 100 מ"מ.
    16. תנו לצלחות להתייבש למשך הלילה על ספסל ואפשרו ליום נוסף להתייבש אם הצלחות עדיין רטובות. יש לאחסן צלחות במיכלים אטומים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך כחודשיים.
    17. אופציונלי: הוסיפו תרופות ישירות לצלחות NGM-agar שנזרעו (למשל, 100 μL של תמיסת FUDR של 10 מ"ג/מ"ל) כדי לעקר תולעים כימית.
  2. שמירה על מניות C. elegans
    1. סמן כראוי את החלק התחתון של צלחת NGM-agar שנזרעה. סמן את הקצוות בתחתית הלוח כדי למנוע חסימת מעבר האור במיקרוסקופי דיסקציה סטנדרטיים.
    2. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה סטנדרטי, סקופ חיידקים בחירה על C. elegans לבחור.
      הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש בבחירה המורכבת מחוט פלטינה/אירידיום 90%/10% המחובר לקצה פיפטה של פסטר זכוכית.
    3. באמצעות החיידקים, אספו 10-20 ביצים, L1, L2 או L3 בעלי חיים, והעבירו אותן לצלחת NGM-agar שסומנה לאחרונה.
      הערה: עדיף לאסוף בעלי חיים צעירים יותר; מניסיונם של המחברים, עבור בעלי חיים סטנדרטיים מסוג בר, הזזת 10-20 ביצים / חיה צעירה תאפשר לצלחת לגדול בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס ללא רעב. עבור בעלי חיים מהונדסים או מוטנטיים עם ירידה בצואה, יש להעביר יותר בעלי חיים לצלחת.
    4. עבור בעלי חיים עם צואה מסוג בר וגדלים בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס, חזור על שלבים 1.2.1-1.2.3 כל 7 ימים כדי לשמור על מלאי שבועי. עבור בעלי חיים הגדלים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, חזור על שלבים 1.2.1-1.2.3 כל 4-5 ימים כדי למנוע רעב.
  3. סנכרון תולעים via הלבנת
    הערה: צלחת NGM-agar מלאה של 60 מ"מ (למשל, צלחות מלאי בנות שבוע שגדלו בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס) תספק מספר מספיק של בעלי חיים עבור רוב המבחנים הסטנדרטיים המתוארים. באופן כללי, מבוגר גרבידי אחד (בוגר מלא ביצים) יספק 10-15 ביצים42וצלחת NGM-agar מלאה, בקוטר 60 מ"מ, כוללת בין 100-200 מבוגרים גרבידיים, המספקת כ-1000-2000 ביצים.,
    1. לניסויים בקנה מידה גדול יותר הדורשים יותר בעלי חיים, חתכו אגר NGM מלא בקוטר 60 מ"מ לארבעה עד שישה חלקים שווים וחתכו אותם על לוחות 100 מ"מ שנזרעו לצורך הרחבה.
      הערה: כאן, קיבוץ מתייחס לחיתוך חתיכה מלוח NGM-agar המכילה תולעים ולהזיז את כל גוש האגר + התולעים על צלחת חדשה, בצד התולעת למטה כדי לאפשר לתולעים לזחול על הצלחת החדשה. כמסגרת ייחוס, בעלי חיים עם נקבה מסוג בר ייצרו צלחת מלאה של 100 מ"מ אם יגדלו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים לאחר החתירה.
    2. כדי להתחיל לאסוף את הנמטודות, שפכו כמות קטנה של תמיסת M9 (טבלה 1) על צלחות המכילות תולעים, תוך הקפדה שלא למלא יתר על המידה את צלחת הפטרי. סובבו את תמיסת ה-M9 בעדינות כדי לשחרר את התולעים ממדשאות החיידקים.
    3. לאסוף תולעים בוגרות gravid עם פיפטה סרולוגית, תוך הקפדה לא לנקב את האגר עם קצה פיפטה.
      הערה: פיפטות סרולוגיות מזכוכית מומלצות, שכן C. elegans נוטים להידבק לפלסטיק. אם פיפטות זכוכית אינן זמינות, מומלץ להתחיל עם מספר גדול יותר של בעלי חיים מהנדרש, שכן חלקם יאבדו עקב היצמדות לפיפטות פלסטיק.
    4. גלול את החיות על ידי צנטריפוגה במשך 30 שניות ב 1,100 x g. לשאוף את הסופרנאטנט.
      הערה: גלולת C. elegans רופפת מאוד, לכן הקפידו לא לנער או לשבש את הכדור תוך כדי שאיפת הסופרנאטנט.
    5. בזמן שבעלי חיים עושים צנטריפוגות, הכינו 5 מ"ל של תמיסת הלבנה לכל זן (ראו טבלה 1 לפרטי מתכונים); עבור 5 מ"ל של תמיסה, לערבב 1.5 מ"ל של 6% נתרן היפוכלוריט (אקונומיקה), 0.75 מ"ל של 5 M NaOH או KOH, ו 2.75 מ"ל של dH2O.
      אזהרה: נתרן היפוכלוריט ותמיסות הידרוקסיד בריכוז גבוה הן קורוזיביות, ולכן מומלץ ללבוש כפפות ומעיל מעבדה בעת הטיפול.
    6. הוסיפו 5 מ"ל של תמיסת הלבנה לתערובת כדור התולעת/M9.
    7. בדקו את התולעים תחת מיקרוסקופ ניתוח כל כמה דקות עד שכל גופי התולעים הבוגרים הומסו ונשארו רק ביצים בתערובת. יש לנער את תערובת התולעת/אקונומיקה במרץ כדי להאיץ את תהליך ההלבנה.
      הערה: השארת ביצים בתוך תערובת אקונומיקה לפרקי זמן ממושכים תגרום לפגיעה בביצים ותשפיע על הכדאיות של בעלי החיים. עבור בעלי חיים מסוג בר, הלבנה בדרך כלל לוקחת 4-6 דקות עם רעידות. לכן, מומלץ לבדוק את בעלי החיים תחת מיקרוסקופ במרווחים של 30 שניות החל מסימן 4 דקות.
    8. גלול את הביצים על ידי סיבוב תערובת הביצים / אקונומיקה במשך 30 שניות ב 1,100 x גרם.
      הערה: כ-15 מ"ל צינורות חרוטיים כוללים קווי שיפוע בחלק הפנימי של הצינור. עבור צינורות אלה, מומלץ לטוות ביצים במהירות גבוהה יותר (למשל, 30 שניות ב-2,000 x גרם) כדי להבטיח שהביצים יתפשטו לתחתית הצינור ולא יישארו על קווי שיפוע.
    9. שאפו את תמיסת ההלבנה.
      הערה: כדור ביצה נוקשה יותר מכדור תולעת, אך עדיין ניתן לשבש אותו בקלות. לכן, היזהרו לא לנער את הצינור לאחר צנטריפוגה.
    10. שטפו ביצים על ידי הוספת תמיסת M9 עד 15 מ"ל והיפוך הצינור ארבע או חמש פעמים כדי להבטיח שהביצים יתפזרו במלואן בתמיסת M9.
    11. ביצים כדוריות על ידי צנטריפוגה במשך 30 שניות ב 1,100 x g ולשאוף החוצה פתרון M9.
    12. חזור על שני השלבים הנ"ל במשך ארבע שטיפות בסך הכל כדי לסלק כל אקונומיקה מתערובת הביצים.
    13. יש להחיות את הביצים ב-100 μL עד 2 מ"ל של תמיסת M9 (כלומר, בהתאם למספר הכולל של התולעים שהלבינו) לאחר הכביסה הסופית. יש לנער את הביצים ביסודיות כדי לפרק גושים ולוודא שהכדור עובר החייאה מלאה.
    14. לחלופין, בעלי חיים יכולים להיעצר L1 בגין סנכרון זמני הדוק יותר; עבור עצירת L1, הוסף תמיסת M9 לכדור הביצה לכ-10 מ"ל בצינור חרוטי של 15 מ"ל. תנו לתולעים להסתובב ברוטטור עד 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס או טמפרטורת סביבה. לבעלי חיים מסוג L1 לוקח בדרך כלל חצי יום פחות להגיע לבגרות בהשוואה לתזמון הביצים המתואר בשלב 1.3.16.
    15. הערך את ריכוז הביציות (או ריכוז L1; ראו שלב 1.3.14) על ידי צנרת של 4 μL של תערובת ביצים/M9 על צלחת NGM הזורעת בחיידקים. ספרו וחשבו כמה ביצים קיימות לכל μL מצופות. חזור על הספירה שלוש או ארבע פעמים כדי לשפר את הקירוב.
      הערה: קירוב ריכוז הביציות יבטיח כי מספיק בעלי חיים מצופים לגודל מדגם מתאים לניסויים ללא ציפוי יתר, מה שיגרום לרעב.
    16. בהתבסס על הקירוב, צלחת את מספר הביצים המתאים על צלחות NGM-agar שנזרעו עם חיידקים מבחירה. עבור לוחות OP50, צלחת מקסימום של 200 בעלי חיים על צלחת 60 מ"מ ו -1,000 בעלי חיים על צלחת 100 מ"מ. עבור צלחות HT115, צלחת מקסימום של 150 בעלי חיים על צלחת 60 מ"מ ו 600 בעלי חיים על צלחת 100 מ"מ.
      הערה: אלה הם מספרים משוערים המבוססים על תנאי המעבדה שלנו, והמספרים עשויים להשתנות בהתאם לעובי מדשאת החיידקים. ביצים שגדלות בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס ייקחו כ-5 ימים להגיע לבגרות של היום הראשון (כ-140 שעות כדי להגיע לשלב בוגר מקסימלי של הטלת ביצים). לביצים הגדלות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס ייקח כ-4 ימים להגיע לבגרות של היום הראשון (כ-96 שעות כדי להגיע לשלב הבוגרים המקסימלי של הטלת הביצים). לביצים שגדלות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ייקחו כ-3.5 ימים להגיע לבגרות של היום הראשון (כ-62 שעות כדי להגיע לשלב הבוגרים המקסימלי של הטלת הביצים).
  4. הטלת ביצים כשיטה חלופית לסנכרון אוכלוסיות C. elegans
    1. אם פרוטוקולי הלבנה אינם אפשריים (למשל, אין צנטריפוגה זמינה), כשיטה חלופית לסנכרון אוכלוסיות של C. elegans, לבצע הליך הטלת ביצים. זכור כי פרוטוקול זה הוא עתיר עבודה יותר ויביא לתפוקות קטנות יותר של בעלי חיים.
    2. להטלת ביצים, הניחו 8-12 בוגרים גרבידיים על צלחת NGM-agar סטנדרטית עם זרעים עם חיידקים בעלי בחירה ותעדו את המספר המדויק של בעלי החיים שהונחו על צלחת.
      הערה: יש לבצע פרוצדורות של הטלת ביצים בטמפרטורה שתשמש לניסויים.
    3. אפשר לבעלי חיים להטיל ביצים במשך 4-8 שעות.
      הערה: ניתן לכוונן את משך הזמן שבו בעלי החיים נשארים על הצלחת בעת הצורך. לדוגמה, ניתן לשים מספר גדול יותר של בעלי חיים על צלחת למשך הטלת ביצים קצר יותר כאשר יש פחות זמן פנוי. C. elegans בדרך כלל מטילים ביצים בהתפרצויות, אשר ניתן להעריך בקצב של כחמש ביצים / שעה עבור בעלי חיים עם fecundity מסוג בר43. עקוב אחר ההמלצות בשלב 1.3.16 כדי למנוע הצבת יתר של בעלי חיים.
    4. הסר את כל בעלי החיים הבוגרים מהצלחת.
      הערה: כל בעלי החיים הבוגרים שנותרו על הצלחת ימשיכו להטיל ביצים, וכתוצאה מכך תהיה אוכלוסייה לא מסונכרנת.
    5. הניחו ביצים בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך כ-5 ימים או 20 מעלות צלזיוס למשך כ-4 ימים כדי להגיע ליום הראשון של הבגרות.

2. מדידת אריכות ימים ב- C. elegans

  1. תוחלת חיים סטנדרטית
    1. הכינו צלחות NGM-agar על ידי זריעת צלחות עם 100 μL של חיידקים לפי בחירה. לצורך עקביות, ודאו שאותם חיידקים נמצאים בשימוש בכל השכפולים. מכיוון שתולעים מועברות מדי יום בשלבי הטלת הביצים של הבגרות, זרעו חמש עד שבע קבוצות של צלחות NGM-agar למשך תוחלת החיים, ושתיים עד ארבע צלחות לכל זן כדי לגדל בעלי חיים לבגרות (כלומר, אם משתמשים בשמונה צלחות של 15 בעלי חיים לתוחלת חיים, יש לזרוע 40-56 צלחות לכל תנאי).
    2. אפשרו לצלחות להתייבש למשך הלילה לפני האחסון.
      הערה: מומלץ לאחסן את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולהסיר את מספר הצלחות הנדרש מאחסון קר מדי יום כדי למנוע מחיידקים ליצור מדשאות עבות שעלולות להקשות על תוחלת החיים של הזזה/ספירה. יש לוודא שהצלחות מחוממות לפני ציפוי התולעים.
    3. אסוף אוכלוסייה מסונכרנת של C. elegans באמצעות בדיקת הלבנה סטנדרטית כמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4.
    4. העבירו 10-15 יום אחד של בעלי חיים בוגרים ל-8-12 צלחות כל אחד. עבור תוחלת חיים סטנדרטית, התחילו עם כ-120 בעלי חיים כדי להבטיח שגודל המדגם לא יירד יותר מדי מתחת ל-100 לאחר אירועי צנזורה (למשל, שמונה צלחות של 15 בעלי חיים = 120 בעלי חיים; 12 צלחות של 10 בעלי חיים = 120 בעלי חיים).
      הערה: במקרה הנוכחי, 10-15 בעלי חיים הם מספר הניתן לניהול עבור רוב החוקרים, אם כי שש צלחות של 20 בעלי חיים אפשריות גם כדי להפחית את עלות החומרים המתכלים.
    5. במשך 7-8 הימים הראשונים או עד שהצאצאים כבר לא נראים לעין, הרחיקו בעלי חיים בוגרים מצאצאיהם כל 1-2 ימים.
      הערה: ניתן להזיז בעלי חיים אחת ליומיים כדי לחסוך בחומרים, אך יש להקפיד על כך שביצים/זחלים לא יועברו עם הבוגר כדי למנוע זיהום של אוכלוסיות בוגרות עם צאצאים. במחקר זה, השיטה הפשוטה ביותר היא להזיז בעלי חיים כל יום מימים 1-3 כאשר הטלת הביצים היא מקסימלית, ולאחר מכן לעבור להזזת בעלי חיים כל יומיים במשך ימים 5-8 כאשר הטלת הביצים היא מינימלית. בשיטה זו, אין זה הכרחי למנוע העברה של ביציות/בעלי חיים זחלים בימים 1-3 מכיוון שהבוגרים יועברו מדי יום, וביצים/זחלים לא יוכלו להתפתח לבגרות ביום אחד.
    6. לאחר שבעלי חיים הפסיקו לייצר צאצאים, נקבו את תוחלת החיים אחת ליומיים עד שכל בעלי החיים הוכתרו כמתים או מצונזרים. הסר את כל החיות המתות או המצונזרות מהצלחת כדי למנוע בלבול ולספר על אותה חיה.
      הערה: המוות הוא ניקוד כמו בעלי חיים שאינם מפגינים שום תנועה כאשר נוגעים בעדינות עם פיק. הצנזורה מקבלת ניקוד כבעלי חיים שנתקעים בשקיות, מפגינים בליטות פות/מעיים, או זוחלים עד לצידי הצלחת, שם הם מתייבשים.
  2. תוחלת חיים עם עיקור כימי באמצעות FUDR
    1. הכינו צלחות NGM-agar על ידי זריעת צלחות עם 100 μL של חיידקים לפי בחירה. לצורך עקביות, ודאו שאותם חיידקים נמצאים בשימוש בכל השכפולים. זרעו 8-12 צלחות לכל זן לניסויים תוחלת חיים, ושתיים עד ארבע צלחות לכל זן כדי לגדל בעלי חיים לבגרות. אפשרו לצלחות להתייבש למשך הלילה.
    2. הוסיפו 100 μL של 10 מ"ג/מ"ל FUDR לאמצע מדשאת החיידקים עבור 8-12 הצלחות שישמשו לבדיקת תוחלת החיים. זכרו להשאיר שתיים עד ארבע צלחות ללא FUDR כצלחות ראשונות כדי לאפשר לבעלי חיים לגדול לבגרות. תנו לצלחות להתייבש למשך הלילה.
      אזהרה: FUDR חוסם סינתזת DNA, ולכן מומלץ ללבוש כפפות בעת הטיפול.
    3. אסוף אוכלוסייה מסונכרנת של C. elegans באמצעות בדיקת הלבנה סטנדרטית כמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4.
      הערה: יש לגדל בעלי חיים אלה על צלחות ללא FUDR, מכיוון ש- FUDR יגרום לבעלי חיים לעצור / למות.
    4. העבירו 10-15 יום אחד של בעלי חיים בוגרים ל-8-12 צלחות כל אחת, המכילות FUDR. עבור תוחלת חיים סטנדרטית, התחילו עם כ-120 בעלי חיים כדי להבטיח שגודל המדגם לא יירד יותר מדי מתחת ל-100 לאחר אירועי צנזורה (למשל, שמונה צלחות של 15 בעלי חיים = 120 בעלי חיים; 12 צלחות של 10 בעלי חיים = 120 בעלי חיים).
      הערה: ניתן גם להעביר בעלי חיים ל- FUDR בשלב L4 אם זה הכרחי כי היווצרות צאצאים תימנע לחלוטין, אך אין להזיז בעלי חיים מוקדם מדי מכיוון שהדבר יגרום לבעלי חיים להיות בסיכון גבוה יותר לבליטות פות / מעיים ויגביר את הצנזורה.
    5. ציון תוחלת חיים אחת ליומיים עד שכל בעלי החיים הובקעו כמתים או מצונזרים. הסר את כל החיות המתות או המצונזרות מהצלחת כדי למנוע בלבול ולספר על אותה חיה.
      הערה: עבור תוחלת החיים של FUDR, ניתן להתעלם מכל צאצא מכיוון שהם יעצרו בשלב L1 ובסופו של דבר ימותו.
  3. תוחלת חיים באמצעות מוטנטים סטריליים רגישים לטמפרטורה
    1. הכינו צלחות NGM-agar על ידי זריעת צלחות עם 100 μL של חיידקים לפי בחירה. לצורך עקביות, ודאו שאותם חיידקים נמצאים בשימוש בכל השכפולים. זרע 8-12 צלחות לכל זן לניסויים תוחלת חיים, ו-2-4 צלחות לכל זן כדי לגדל בעלי חיים לבגרות. תנו לצלחות להתייבש למשך הלילה.
    2. אסוף אוכלוסייה מסונכרנת של C. elegans באמצעות בדיקת הלבנה סטנדרטית כמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4. זכרו לגדל בעלי חיים בטמפרטורה מגבילה של 25 מעלות צלזיוס כדי להבטיח שבעלי חיים יהיו סטריליים.
    3. העבירו 10-15 יום אחד של בעלי חיים בוגרים ל-8-12 צלחות כל אחד. עבור תוחלת חיים סטנדרטית, התחילו עם כ-120 בעלי חיים כדי להבטיח שגודל המדגם לא יירד יותר מדי מתחת ל-100 לאחר אירועי צנזורה (למשל, שמונה צלחות של 15 בעלי חיים = 120 בעלי חיים; 12 צלחות של 10 בעלי חיים = 120 בעלי חיים).
    4. ציון תוחלת חיים אחת ליומיים עד שכל בעלי החיים הובקעו כמתים או מצונזרים. הסר את כל החיות המתות או המצונזרות מהצלחת כדי למנוע בלבול ולספר על אותה חיה.
      הערה: כאשר מתמודדים עם זנים קצרי מועד, מומלץ להבקיע תוחלת חיים מדי יום מכיוון שתוחלת החיים ב -25 מעלות צלזיוס קצרה בהרבה ולכן הטווח הדינמי מוגבל. מניסיונם של המחברים, בעלי חיים יכולים להיות מועברים בחזרה ל -20 מעלות צלזיוס לאחר היום השני, ובעלי חיים יישארו סטריליים אם עדיף לצבור תוחלת חיים ב -20 מעלות צלזיוס.

3. מדידת תוחלת הבריאות ב- C. elegans

  1. מדידות של התנהגות התנועה באמצעות ת'ראש
    1. אסוף אוכלוסייה מסונכרנת של C. elegans באמצעות בדיקת הלבנה סטנדרטית כמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4.
    2. העבירו מושבה קטנה של תולעים בוגרות ביום הראשון על צלחת NGM-agar תחת היקף ניתוח על 10-20 μL של תמיסת M9. 10-15 בעלי חיים מומלצים כמספר ניתן לניהול של בעלי חיים לספירה.
    3. תוך התמקדות בתולעת אחת בכל פעם, ספרו את מספר הפעמים שהדגימה עוברת מהתהוות קעורה להיווצרות קמורה ב-15 שניות. השתמש במונה ידני וטיימר כדי שניתן יהיה לשים את המיקוד על התולעת למשך הבדיקה.
      הערה: ניתן להקליט סרטון של הצלחת לניתוח יסודי/קל יותר. לדוגמה, חיבורים סטנדרטיים של עינית מיקרוסקופ זמינים עבור רוב הסמארטפונים והמצלמות הדיגיטליות ($15-$30), ואלה אופציה נהדרת ל-video thrashing בעלות נמוכה.
    4. חזור על שלב 3.1.3 עבור התולעים האחרות בנוזל, תוך ציון ממוצע של שיעור תנועתיות כולל עבור 10-15 תולעים. עבור גודל מדגם גבוה יותר, חזור על שלבים 3.1.2-3.1.4.
    5. להזדקן את התולעים לגיל הרצוי. שיטות דומות לבדיקות תוחלת חיים המתוארות בשלבים 2.1-2.3 יכולות לשמש להזדקנות התולעים. חזור על שלבים 3.1.2-3.1.4 כדי לבחון ת'ראש בגילים הרצויים.
      הערה: שיטה חלופית לשלב 3.1.2 היא להוסיף ~ 30 μL או יותר של תמיסת M9 על קבוצת תולעים על צלחת. זה יחסוך זמן מהצורך להעביר תולעים באופן ידני, אם כי בשל סיכוי אקראי היכן התולעים נמצאות על צלחת אחת, אין ערובה לכך שקבוצת תולעים תישאר בנקודה אחת על הצלחת.
  2. מדידות של נקבות (ספירת ביצים) ב - C. elegans
    1. אסוף אוכלוסייה מסונכרנת של C. elegans באמצעות בדיקת הלבנה סטנדרטית כמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4. בדיקות לספירת ביצים מתחילות בשלב L4, שהוא ~ יום אחד לפני יום 1 לבגרות (~ 3 ימים ב 15 °C או ~ 2 ימים ב 20 °C (74 °F) לאחר מעצר L1).
    2. בודדו את תולעי L4 על צלחות NGM-agar נפרדות שנזרעו בחיידקים בעלי בחירה. מומלץ להשתמש בכ-10-15 בעלי חיים לצורך בדיקת נקבות.
      הערה: מומלץ לדלל את החיידקים הנבחרים ב-50% (כלומר, לא בתרבית רוויה) כדי לשפר את נראות הביצים במדשאת החיידקים.
    3. אפשרו לבעלי חיים לגדול למשך הלילה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. ודא שקבוצת צלחות שנזרעה לאחרונה מוכנה ליום המחרת.
    4. ביום הראשון לבגרות, העבירו תולעים בוגרות לצלחות NGM-agar טריות שנזרעו עם החיידקים המדוללים המועדפים.
      הערה: מומלץ להשתמש בצלחות שנזרעו זה עתה, או לאחסן צלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש כדי למנוע מדשאות חיידקים עבות.
    5. ספרו את המספר הכולל של הביצים שהוטלו על כל צלחת NGM-agar.
      הערה: כדי לסייע בסריקת הצלחת, ניתן לצייר רשת על מכסה של צלחת ולהניח אותה מתחת לצלחת המבקיעה לביצים. לאחר מכן ניתן לסרוק את הצלחת לאורך קווי הרשת כדי לשמור על כיוון תוך כדי הזזת הצלחת ולמנוע ספירה חוזרת של ביצים כלשהן.
    6. חזור על שלבים 3.2.4-3.2.5 במשך 7-8 ימים או עד שהביצים כבר לא נראות על הצלחת.
      הערה: בימים 1-3 כאשר שיעורי הטלת הביצים גבוהים, מומלץ להזיז בעלי חיים לפחות כל 12 שעות ולבדוק ספירת ביצים פעמיים ביום. עם זאת, זה מגדיל את כמות העבודה ואת העלויות של חומרים מתכלים, ולכן העברת בעלי חיים ומדידות יכול להיות מוגבל לפעם ביום, אבל יש להיזהר כדי להבטיח שכל הביצים ובעלי החיים בקעו נספרים כראוי. כל בעלי החיים שנבקעו נספרים כביצים לצורך בדיקה זו.
  3. מדידת גודל גזע (פיתוח) של צאצאי C. elegans
    1. אסוף אוכלוסייה מסונכרנת של C. elegans באמצעות בדיקת הלבנה סטנדרטית כמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4. מבחני גודל brood מתחילים בשלב L4, שהוא ~ יום אחד לפני יום 1 לבגרות (~ 3 ימים ב 15 °C או ~ 2 ימים ב 20 ° C לאחר מעצר L1).
    2. בודדו את תולעי L4 על צלחות NGM-agar נפרדות שנזרעו בחיידקים בעלי בחירה. מומלץ להשתמש בכ-10-15 בעלי חיים לצורך בדיקת נקבות.
    3. אפשרו לבעלי חיים לגדול למשך הלילה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. ודא שקבוצת צלחות שנזרעה לאחרונה מוכנה ליום המחרת.
    4. ביום הראשון לבגרות, העבירו תולעים בוגרות לצלחות NGM-agar טריות שנזרעו בחיידקים בעלי בחירה.
    5. כל 12-24 שעות (2 פעמים ביום או פי 1 ביום), מעבירים תולעים בוגרות על צלחות NGM-agar טריות שנזרעו בחיידקים בחירה במשך 7-8 ימים או עד שהצאצאים כבר לא נראים לעין. שמור את כל הצלחות המכילות ביצים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
    6. חזור על שלב 3.3.5 במשך 7-8 ימים או עד שהצאצאים אינם נראים עוד. שמור את כל הצלחות המכילות ביצים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן גם לאחסן צלחות פרוגניות בטמפרטורה של 15 °C (75 °F) כדי להאריך את הזמן לפני שיהיה צורך להבקיע אותן.
    7. יומיים לאחר העברת התולעים, ספרו את הצאצאים המפותחים על הלוחות. ספרו את התולעים המתפתחות בשלב L4 (כלומר, יומיים לאחר הבקיעה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס) או מוקדם יותר כדי להבטיח שדור ה-F2 (כלומר, צאצאי הצאצאים) לא יבלבל את התוצאות. ספרו את כל התולעים החיות.
      1. הסר את כל התולעים מהצלחת בזמן שהן נספרות. שמרו על הצלחות במשך 1-2 ימים נוספים לפני שאתם מבקיעים אותן שוב כדי להבטיח שכל בעלי החיים עם בקיעה/התפתחות מאוחרת לא יפספסו.
    8. חזור על שלב 3.3.7 עבור כל צלחת הטלת ביצים שנאספה.
      הערה: ניתן לערוך את מבחני גודל ה-brood בשילוב עם בדיקת ספירת הביצים (שלב 3.2) כדי למזער את העבודה והעלויות של חומרים מתכלים על ידי איסוף שתי קבוצות של נתונים מניסוי אחד. זה יאפשר גם השוואה ישירה של גודל הגזע וספירת הביצים בתוך אותם בעלי חיים.

4. מדידת עמידות הלחץ ב- C. elegans

  1. מדידות של רגישות ללחץ במיון באמצעות טוניקמיצין
    1. הכינו צלחות NGM-agar על ידי זריעת צלחות המכילות טוניקמיצין (ראו שלב 1.1.7, הערה) עם 100 μL של חיידקים מועדפים.
      אזהרה: יש ללבוש כפפות בעת הטיפול בטוניקמיצין.
    2. לצורך עקביות, ודאו שאותם חיידקים נמצאים בשימוש בכל השכפולים. זרע 8-12 צלחות טוניקמיצין לכל זן לצורך מבחני הישרדות, ושתיים עד ארבע צלחות ללא טוניקמיצין לכל זן כדי לגדל בעלי חיים לבגרות. תנו לצלחות להתייבש למשך הלילה.
    3. אסוף אוכלוסייה מסונכרנת של C. elegans באמצעות בדיקת הלבנה סטנדרטית כמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4.
      הערה: יש לגדל בעלי חיים על צלחות ללא טוניקמיצין עד יום 1 לבגרות, מכיוון שבעלי חיים יעצרו / ימותו על טוניקמיצין.
    4. העבירו 10-15 יום אחד של בעלי חיים בוגרים ל-8-12 צלחות כל אחד. עבור מבחני הישרדות סטנדרטיים, התחילו עם כ-120 בעלי חיים כדי להבטיח שגודל המדגם לא יירד יותר מדי מתחת ל-100 לאחר אירועי צנזורה (למשל, שמונה צלחות של 15 בעלי חיים = 120 בעלי חיים; 12 לוחות של 10 בעלי חיים = 120 בעלי חיים).
      הערה: בדומה למבחני FUDR, ניתן לבצע מבחני הישרדות של טוניקמיצין ללא הנעת בעלי חיים, שכן טוניקמיצין גורם למוות/מעצר של בעלי חיים מסוג L1. עם זאת, בעת ביצוע בקרת DMSO, צאצאים יתפתחו על צלחות DMSO, כך שיש להזיז בעלי חיים מדי יום או שתידרש טכניקת עיקור (שיטות זהות המשמשות בסעיף 2 לתוחלת חיים יכולות לשמש לבדיקות הישרדות).
    5. מבחני הישרדות מקבלים ציון דומה לתוחלת החיים. הסר את כל החיות המתות או המצונזרות מהצלחת כדי למנוע בלבול ולספר על אותה חיה.
      הערה: למרות שניתן להבקיע בעלי חיים כל יומיים, מכיוון שהמוות מתרחש במהירות על טוניקומיצין, מומלץ להבקיע מבחני הישרדות מדי יום.
  2. מדידות של רגישות לעקה מיטוכונדריאלית/חמצונית באמצעות paraquat
    1. הכן צלחות NGM-agar על ידי זריעת צלחות המכילות פרקוואט (ראה שלב 1.1.7; הערה) עם 100 μL של חיידקים מועדפים.
      אזהרה: יש ללבוש כפפות בעת הטיפול בפרקוואט מכיוון שהוא מהווה סכנה סביבתית. בדוק עם הבריאות והבטיחות הסביבתית של המוסד את דרישות ההשלכה, שכן מוסדות מחקר רבים ידרשו הוראות השלכה ספציפיות למפגעים סביבתיים.
    2. לצורך עקביות, ודאו שאותם חיידקים נמצאים בשימוש בכל השכפולים. זרע 8-12 צלחות לכל זן למבחני הישרדות, ושתיים עד ארבע צלחות ללא פרקוואט לכל זן כדי לגדל בעלי חיים לבגרות. אפשרו לצלחות להתייבש למשך הלילה.
    3. אסוף אוכלוסייה מסונכרנת של C. elegans באמצעות בדיקת הלבנה סטנדרטית כמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4.
      הערה: זכור לגדל בעלי חיים על צלחות ללא פרקוואט עד יום 1 לבגרות; עם זאת, יש צורך לבצע טכניקת עיקור או להרחיק בוגרים מן הצאצאים, שכן בעלי חיים מסוימים יכולים להתפתח לבגרות על צלחות paraquat (ראה שלבים 2.2-2.3).
    4. העבירו 10-15 יום אחד של בעלי חיים בוגרים ל-8-12 צלחות כל אחד. לצורך בדיקת הישרדות סטנדרטית, התחילו עם כ-120 בעלי חיים כדי להבטיח שגודל המדגם לא יירד יותר מדי מתחת ל-100 לאחר אירועי צנזורה (למשל, שמונה צלחות של 15 בעלי חיים = 120 בעלי חיים; 12 צלחות של 10 בעלי חיים = 120 בעלי חיים).
    5. מבחני הישרדות מקבלים ציון דומה לתוחלת החיים. הסר את כל החיות המתות או המצונזרות מהצלחת כדי למנוע בלבול ולספר על אותה חיה.
      הערה: למרות שניתן להבקיע בעלי חיים כל יומיים, מכיוון שהמוות מתרחש במהירות על פרקואט, מומלץ להבקיע מבחני הישרדות מדי יום. זה נכון במיוחד בעת שימוש בבעלי חיים glp-4(bn2) הגדלים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס מכיוון שהמוות יתרחש במהירות רבה.
  3. מדידות של רגישות ללחץ חום (thermotolerance) באמצעות טמפרטורות גבוהות
    1. אסוף אוכלוסייה מסונכרנת של C. elegans באמצעות בדיקת הלבנה סטנדרטית כמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4.
    2. לוחות NGM-agar טרום חמה ל -37 מעלות צלזיוס לפני העברת בעלי חיים על צלחות על ידי הנחת צלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות.
    3. העבירו 10-15 יום אחד של בעלי חיים בוגרים לארבע עד שש צלחות שחוממו מראש כל אחת. עבור תרמוטולרנס סטנדרטי, התחל עם ~ 60 בעלי חיים (למשל, ארבע צלחות של 15 בעלי חיים = 60 בעלי חיים; שש צלחות של 10 בעלי חיים = 60 בעלי חיים)
    4. מכניסים בעלי חיים לחממה של 37 מעלות צלזיוס ומבקיעים למוות כל שעתיים. מוות מוגדר כבעלי חיים שאינם מפגינים שום תנועה כאשר נוגעים בהם בעדינות עם פיק. הסר את כל החיות המתות או המצונזרות מהצלחת כדי למנוע בלבול ולספר על אותה חיה.
    5. ודא כי לוחות מוסרים מהאינקובטור של 37 °C למשך פרק הזמן המינימלי האפשרי, שכן לוחות שנותרים בטמפרטורת הסביבה לפרקי זמן ארוכים בזמן הניקוד ישנו את תוצאות התרמוטולרנס.
      הערה: מומלץ לשלוף רק זן אחד בכל פעם כדי להבקיע, שכן הטמפרטורה של האגר לא אמורה להשתנות באופן דרמטי בזמן שלוקח להבקיע זן אחד.
    6. התרמוטולרנסציה החציונית מושגת בדרך כלל ב-7-9 שעות; לכן, הקפידו על בדיקה נאותה ב-7 שעות, 9 שעות ו-11 שעות.
      הערה: בעוד שניתן לדלג על 1-5 שעות, בשל השתנות האינקובטורים, עובי הצלחות וגורמים מבלבלים אחרים בכל מעבדה, חשוב שהתזמון יתוזמן בקפידה בכל מעבדה אם מתוכננים לדלג על נקודות זמן. ראה הפניה 44 למדריך מלא על תרמוטולרנס.
    7. לחלופין, בצעו את בדיקת התרמוטולרנס ב-34 מעלות צלזיוס במקום ב-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: תרמוטולרנסציה חציונית בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס מתרחשת הרבה יותר מאוחר (10-14 שעות במחקר זה), מה שמאפשר להכין מבחני תרמוטולרנס בשעת לילה מאוחרת (ממוקם באינקובטור של 34 מעלות צלזיוס), ולניקוד להתחיל מוקדם למחרת. זה מאפשר ~ 8 שעות של ניקוד מתמשך במקום התקופה האופיינית של 12 שעות הנדרשת לבדיקה תרמוטולרנסית של 37 מעלות צלזיוס.

Representative Results

C. elegans הם אורגניזם מודל מצוין לחקר ההזדקנות בשל רוב גדול של מנגנוני ההזדקנות שנשמרים עם בני אדם. חשוב לציין, יש להם עלות נמוכה מאוד בתחזוקה ובניסויים עם דרישות מינימליות לציוד וחומרים מתכלים, מה שהופך אותם למערכת מודל נחשקת למוסדות עם מימון מוגבל. יתר על כן, שפע של מבחנים פשוטים עם עקומות למידה רדודות הופכים אותם למערכת מצוינת אפילו עבור החוקר הצעיר ביותר עם מעט מאוד ניסיון. כל הגורמים הללו בשילוב עם הגנטיקה החזקה של C. elegans , כולל קלות עריכת הגנום, אלפי מוטנטים זמינים ובעלי חיים מהונדסים בעלויות נומינליות, וספריות RNAi זמינות להפלה גנטית של כמעט כל גן הופכים אותם למערכת אידיאלית עבור מוסדות לתואר ראשון. כאן נסקרות כמה משיטות העלות הנמוכה ביותר לחקר ההזדקנות ב - C. elegans , המתמקדות בעיקר בבדיקות עם ציוד מינימלי ועלות מתכלה, כמו גם עקומות למידה רדודות. למעשה, כל הפרוטוקולים ואיסוף הנתונים נכתבו/בוצעו על ידי חוקרים זוטרים בעלי ניסיון מחקרי <5 חודשים, רובם סטודנטים לתואר ראשון.

מחקרי אריכות ימים ב- C. elegans הם פשוטים מאוד בשל תוחלת החיים הקצרה של בעלי חיים, הנעה בין 14-20 יום. חשוב לציין כי מבחני תוחלת החיים הם סטנדרטיים מאוד ודורשים רק אינקובטור, מיקרוסקופ דיסקציה סטנדרטי, קטיף תולעים סטנדרטי וחומרים מתכלים להכנת צלחות NGM-agar. אולי ההיבט המחוספס ביותר של מדידות תוחלת החיים ב- C. elegans הוא חומרים מתכלים נדרשים. הסיבה לכך היא ש- C. elegans הם הרמפרודיטים המפרים את עצמם; לכן, מבוגרים שנמצאים במעקב אחר מבחני אריכות ימים צריכים להתרחק מהצאצאים מדי יום. עם זאת, ניתן לעקר בעלי חיים על ידי חשיפתם ל-FUDR או שימוש במוטאנטים, כגון המוטציה glp-4(bn2) הרגישה לטמפרטורה ללא חיידקים שגדלה ב-25 מעלות צלזיוס כדי להפחית את כמות החומרים המתכלים הנדרשתל-30,31,32. כאן בוצעו מבחני תוחלת חיים עם FUDR או עם מוטציות נטולות חיידקים glp-4(bn2), אשר מראות תוצאות דומות לתוחלת החיים הסטנדרטית שבוצעה על בעלי חיים שאינם סטריליים. בעוד שתוחלת החיים של סוגי הבר אינה זהה בשל ההשפעות של FUDR45 או צמיחה של 25 מעלות צלזיוס על תוחלת החיים2, החיה הקצרה hsf-1 מראה באופן מהימן ירידה משמעותית בתוחלת החיים של כל התנאים (איור 1). hsf-1 מקודד את גורם השעתוק של גורם הלם החום-1, המעורב בוויסות תגובת הלחץ התרמי, וההתמוטטות שלו גורמת לירידה משמעותית בתוחלת החייםשל 38,46.

בעוד אריכות ימים היא גורם חשוב שיש לקחת בחשבון בביולוגיה של ההזדקנות, לעתים קרובות, אריכות ימים אינה מתואמת עם בריאות מוגברת, אפילו ב- C. elegans47. לפיכך, כגישה משלימה, אנו מציעים מספר שיטות למדידת בריאות האורגניזם, כולל בריאות הרבייה, התנהגות התנועה וחוסן הלחץ. ניתן למדוד את בריאות הרבייה באחת משתי דרכים. ראשית, מדידות של ספירת ביציות יתנו מדידה ישירה של מספר הביצים שמוטלות על ידי הרמפרודיט יחיד המפרה את עצמו. עם זאת, מכיוון שבעלי חיים מייצרים יותר ביציות מאשר זרע, כמה ביציות לא מופרות שלעולם לא ייצרו צאצאים בני קיימא מוטלות גםהן 48. לכן, כדי להבין טוב יותר את יכולת הרבייה האמיתית של בעל חיים, מדידות של גודל הגזע מספקות מדידה של כמה צאצאים בני קיימא מיוצרים. לעתים קרובות, עמידות מוגברת של סטרס יכולה למעשה להפחית את יכולת הרבייה, אולי בשל ההשפעה האינהרנטית של לחץ נתפס על רבייה49. באופן דומה, ירידה משמעותית הן במספר הביצים שהוטלו והן בגודל הציד נמצאה בחיות ביטוי יתר של hsf-1 בהשוואה לבקרות מסוג בר (איור 2A,B). למעשה, חלק מחיות ביטוי היתר hsf-1 מפגינות סטריליות מלאה, ומספקות ראיות לכך שבריאות הרבייה יכולה להיות מתואמת באופן הפוך עם אריכות ימים.

בעוד שבריאות הרבייה חשובה להבנת בריאות החיידקים, המיוזה התפקודית ויכולת הרבייה, באופן כללי, אין קשר ישיר בין אריכות ימים לבין גודל50. לפיכך, כגישה משלימה, התנהגות תנועתית מוצעת כשיטה סטנדרטית זהב לבדיקת תוחלת הבריאות של C. elegans במהלך הזדקנות51. ישנן שיטות רבות למדידת התנהגות תנועתית, אך רוב השיטות דורשות מצלמות מתוחכמות, תוכנת מעקב או כימיקלים יקרים. לעומת זאת, מבחני ת'ראש אינם דורשים כמעט שום ציוד מעבר למה שמעבדת C. elegans סטנדרטית מצוידת בו: מיקרוסקופ ניתוח, קטיף תולעים, פיפטה וחומרים מתכלים להכנת צלחות NGM-agar. שיעורי הת'ראש מספקים שיטה אמינה למדידת תוחלת החיים במהלך ההזדקנות, כפי שהיא נמדדת על ידי ירידה משמעותית בת'ראש אצל בעלי חיים זקנים בהשוואה לבעלי חיים צעירים (איור 2C).

לבסוף, הישרדות למבחני לחץ היא מדידה פיזיולוגית נוספת של חוסן. היכולת להפעיל תגובות עקה בדרך כלל יורדת במהלך תהליך ההזדקנות, מה שהופך את בעלי החיים לפחות גמישים ורגישים יותר ללחץ. לפיכך, חוסן מתח יכול לשמש כמיופה כוח אמין לבריאות האורגניזם. כאן מוצעות שיטות לבדיקת רגישות ל-1) סטרס ER בתגובה לחשיפה לטוניקמיצין, חומר כימי שחוסם גליקוזילציה המקושרת ל-N ומביא להצטברות של חלבונים מקופלים בצורה שגויה במיון; 2) עקה מיטוכונדריאלית/חמצונית באמצעות חשיפה לפראקוואט, חומר כימי הגורם להיווצרות סופראוקסיד במיטוכונדריה; ו-3) מתח תרמי באמצעות חשיפה לטמפרטורות גבוהות. עבור מבחני טוניקמיצין ופראקוואט, התרופה משולבת בצלחת NGM-agar במהלך ייצור הצלחת. עבור ריכוזים גבוהים של טוניקמיצין, צאצאים בדרך כלל אינם מתפתחים, ולכן אין צורך להשתמש בטכניקות עיקור. הפרוטוקול שהוצג כאן ממליץ על 25 ng/μL כריכוז סופי של טוניקמיצין, אך עבור בעלי תקציב מוגבל, 10 ng/μL מראה גם ירידה משמעותית בהישרדות (איור 3A). שני הריכוזים מגבילים את התפתחות הצאצאים, ולכן אין צורך בשיטות עיקור, אם כי בקרת DMSO תדרוש טכניקת עיקור או תנועה של בעלי חיים על צלחות חדשות. הסיבה לכך היא כי רעילות tunicamycin מונעת את התפתחות של צאצאים, אבל DMSO הוא כמעט לא רעיל, אשר מאפשר צאצאים להתפתח באופן מלא כאשר גדל על tunicamycin.

עבור מבחני paraquat, או טכניקת עיקור או תנועה של בעלי חיים נדרשת כמו טיפול paraquat אינו מונע צאצאים להתפתח לבגרות. רמות גבוהות של פרקוואט (4 mM) מקצרות באופן משמעותי את תוחלת החיים, בעוד שרמות נמוכות של פרקוואט (0.25 mM) מאריכות את תוחלת החיים עקב אפקט הורמוטי (איור 3B), בהתאם לתוצאות שפורסמו בעבר52. לבסוף, מבחני תרמוטולרנס דורשים רק אינקובטור שיכול להגיע ל-30-37 מעלות צלזיוס, ואין צורך בריאגנטים נוספים. ביטוי יתר של hsf-1 מגביר את התרמוטולרנסיות ב-37 מעלות צלזיוס (איור 3C) כפי שפורסם בעברב-53 מעלות צלזיוס. עם זאת, כפי שאחרים הראו בעבר ומהנתונים הנוכחיים, הבעיה העיקרית עם מבחני תרמוטולרנס היא השונות שלהם. גורמים רבים יכולים לתרום לשונות במבחני התרמוטולרנס, כולל הבדלים בין אינקובטורים לבין הזמן שבעלי חיים מבלים מחוץ לחממה תוך ניקוד תרמוטולרנס בכל שעה. לקבלת הנחיה יסודית של תרמוטולרנס, עיין בהפניה 41.

Figure 1
איור 1: השוואה של מדידות תוחלת חיים עם ובלי עיקור. (A) תוחלת חיים של נמטודות מסוג N2 מסוג בר שגדלו על צלחות NGM-agar שנזרעו עם וקטור ריק (ev) או hsf-1 חיידקי RNAi בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. בעלי חיים הורחקו מהצאצאים בימים 1, 3, 5 ו-7 של הבגרות. (B) תוחלת חיים של נמטודות מסוג N2 מסוג בר שגדלו על צלחות NGM-agar-FUDR שנזרעו עם וקטור ריק (ev) או חיידקי hsf-1 RNAi בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. בעלי חיים גדלו לבגרות על צלחות RNAi סטנדרטיות של ev או hsf-1 , ולאחר מכן עברו לצלחות FUDR ביום הראשון לבגרות. (C) תוחלת חיים של בעלי חיים מוטנטיים glp-4(bn2) הגדלים על צלחות NGM-agar שנזרעו עם וקטור ריק (ev) או hsf-1 RNAi בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. עבור כל התנאים, בעלי חיים קיבלו ציון למוות כל יומיים עד שכל בעלי החיים תועדו כמתים או מצונזרים. בעלי חיים עם טבילה, בליטה או פיצוץ של הפות, או כאלה שזחלו במעלה צידי הלוחות והתייבשו צונזרו. כל הנתונים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות בדיקות Log-Rank Mantel-Cox וניתן למצוא אותם בטבלה 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ספירת ביצים, גודל גזע ות'ראש כמדידות של תוחלת בריאות. (A) מבחני ת'ראש בוצעו על בעלי חיים מוטנטיים מסוג glp-4(bn2) שגודלו על צלחות NGM-agar שנזרעו עם וקטור ריק בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ביום 1 (כחול), יום 4 (אדום) ויום 9 (ירוק). ת'ראש הוקלט בבעלי חיים שהוכנסו לפתרון M9 על צלחת NGM-agar, וידאו שהוקלט באמצעות מצלמת סמארטפון סטנדרטית המותקנת על עינית בעלת היקף ניתוח סטנדרטי, ות'ראשים הובקעו בהילוך איטי למען הדיוק. n = 15 בעלי חיים לכל מצב. (B) ספירת הביצים נמדדה בבעלי חיים מסוג N2 (כחול) ו-sur-5p::hsf-1 (אדום). בעלי חיים גודלו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס והועברו לצלחות טריות, וביצים נספרו כל 12 שעות. המספר הכולל של הביצים שהוטלו סוכם. n = 7 בעלי חיים עבור wildtype ו-9 בעלי חיים עבור sur-5p::hsf-1. (C) מבחני Brood נמדדו על אותם בעלי חיים כמו (B) שם מגדלים ביצים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במשך יומיים כדי לאפשר בקיעה, וכל הביצים שבקעו נספרו. = p < 0.001 מחושב באמצעות בדיקות מאן-וויטני לא פרמטריות. כל נקודה מייצגת חיה אחת, והקווים מייצגים את הטווח החציוני והבין-קווי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: עמידות בפני סטרס כמתאימה לבריאות האורגניזם. בעלי חיים הועברו לצלחות המכילות 1% DMSO, 10 ng/μL tunicamycin (TM), או 25 ng/μL TM ביום הראשון לבגרות. (B) בדיקת הישרדות של חיות N2 שגדלו על חיידקי RNAi הווקטוריים הריקים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. בעלי חיים גודלו מהבקיעה על צלחות המכילות מים, 0.25 mM paraquat (PQ), או 4 mM PQ. עבור א'-ב', בעלי חיים הובקעו למוות כל יומיים עד שכל בעלי החיים תועדו כמתים או מצונזרים. בעלי חיים עם טבילה, בליטה או פיצוץ של הפות, או כאלה שזחלו במעלה צידי הלוחות והתייבשו צונזרו. כל הנתונים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות בדיקות Log-Rank Mantel-Cox (טבלה 2). (C) נתונים מקובצים של כל מבחני התרמוטולרנס של 37 °C עבור בעלי חיים מסוג N2 מסוג בר לעומת ביטוי יתר של hsf-1 (sur-5p::hsf-1). הנתונים מיוצגים כאחוזי חיים בזמן = 9 שעות של בדיקת תרמוטולרנס, כאשר כל שורה מייצגת ניסוי תואם שנערך באותו יום. בעלי חיים גודלו על חיידקי RNAi הווקטוריים הריקים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס והועברו ל-37 מעלות צלזיוס ביום הראשון לבגרות לצורך בדיקה. n = 60 בעלי חיים לכל זן לכל שכפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מגיב מתכון
תמיסת אקונומיקה 1.8% (v/v) נתרן היפוכלוריט, 0.375 M KOH
קרבניצילין תמיסת מלאי של 100 מ"ג/מ"ל (1000x) במים. אחסן בטמפרטורה של 4 °C למשך עד 6 חודשים או -20 °C לאחסון לטווח ארוך
FUDR תמיסת 10 מ"ג/מ"ל במים. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
IPTG תמיסת 1 M במים.
מרק ליסוגני (LB) בפרוטוקול זה נעשה שימוש ב-LB מסחרי (ראו טבלת חומרים), אך כל המתכונים הסטנדרטיים של LB תוצרת בית באמצעות Bacto-triptone, תמצית שמרים ו-NaCl מספיקים.
פתרון M9 22 mM KH2PO4 מונובסי, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
מדיית צמיחת נמטודה (NGM) 1 mM CaCl2, 5 מיקרוגרם/מ"ל כולסטרול, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) אגר, 0.25% (w/v) Bacto-Peptone, 51.3 mM NaCl
צלחות NGM RNAi 1 mM CaCl2, 5 מיקרוגרם/מ"ל כולסטרול, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) אגר, 0.25% (w/v) Bacto-Peptone, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין/אמפיצילין. יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס בחושך למשך עד 3 חודשים
NGM RNAi DMSO 1 mM CaCl2, 5 מיקרוגרם /מ"ל כולסטרול, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) אגר, 0.25% (w/v) Bacto-Peptone, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין/אמפיצילין; 1% DMSO
(שליטה עבור טוניקמיצין)
NGM RNAi TM 1 mM CaCl2, 5 מיקרוגרם /מ"ל כולסטרול, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) אגר, 0.25% (w/v) Bacto-Peptone, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין/אמפיצילין; 1% DMSO, 25 ננוגרם/μL טוניקמיצין
פרקוואט תמיסת 400 mM במים – יש להכין תמיסה טרייה
טטרציקלין תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל (500x) ב-100% אתנול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 °C (75 °F)
טוניקמיצין תמיסת מלאי של 2.5 מ"ג/מ"ל ב-100% DMSO. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. זהו פתרון של 100x (פתרון עבודה של 25 ננוגרם/μL)

טבלה 1. מתכונים לריאגנטים ומדיה לפרוטוקולים.

חלונית איורים מתאימה זן, טיפול תוחלת החיים החציונית # מקרי מוות/# סה"כ ערך p
(לוג-דרגה)
1א N2, וקטור RNAi, 20 °C 17 74/120 --
N2, hsf-1 RNAi, 20 °C 11 65/120 <0.001
1ב N2, וקטור RNAi, FUDR, 20 °C 19 120/120 --
N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C 11 116/120 <0.001
1ג N2, glp-4(bn2), וקטור RNAi, 25 °C 13 115/121 --
N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C 4 120/120 < 0.001
2א N2, וקטור RNAi, 20 °C, 1% DMSO 19 85/120 --
N2, וקטור RNAi, 20 °C, 10 ng/μL tunicamycin 15 109/120 <0.001
N2, וקטור RNAi, 20 °C, 25 ng/μL טוניקמיצין 12 117/120 <0.001
2ב N2, וקטור RNAi, 20 °C 19 84/120 --
N2, וקטור RNAi, 20 °C, 0.25 mM paraquat 24 91/120 <0.001
N2, וקטור RNAi, 20 °C, 4 mM paraquat 6 50/120 <0.001

טבלה 2. סטטיסטיקה של תוחלת חיים וחוסן ללחץ.

Discussion

תוחלת החיים, המוגדרת בפשטות כמשך החיים, היא תופעה בינארית ברורה ברוב האורגניזמים – או שאורגניזם חי או שאינו חי. עם זאת, אריכות ימים לא תמיד מתואמת עם בריאות האורגניזם. לדוגמה, מודלים של הורמזיס מיטוכונדריאלי שבו חשיפה ללחץ מיטוכונדריאלי מגדילה באופן דרמטי את תוחלת החיים הם בדרך כלל חלק מבעלי החיים בעלי תוחלת החיים הארוכה ביותר, אך מפגינים צמיחה מעוותת וירידה בתפקוד המטבולי37,54. באופן דומה, גם בעלי חיים עם תגובות עקה אנדופלסמיות אנדופלזמיות היפראקטיביות מפגינים התנהגויות ופנוטיפים מסוימים שניתן לתאם עם בריאות מופחתת, למרות שיש להם הומאוסטזיס חלבוני משופר באופן דרמטי ותוחלת חייםשל 36,49. לבסוף, פרדיגמות רבות של אריכות ימים באורגניזמי מודל, כולל תפקוד מוגבר של HSF-155, תפקוד XBP-1 מוגבר56, ואיתות FoxO שונה57 מתואמים כולם עם סיכון מוגבר לסרטן, ולא ניתן לערער על כך שתוחלת חיים ממושכת אינה מועילה אם אורגניזם נמצא במאבק מתמיד עם סרטן ומחלות בריאותיות אחרות. לכן, אריכות ימים אינה יכולה להיות מדידה עצמאית בביולוגיה של ההזדקנות.

לפיכך, הרעיון של healthspan היה תחום הולך וגדל בביולוגיה של ההזדקנות. תוחלת החיים, המוגדרת באופן רופף כתקופת החיים שאדם בריא, קשה יותר לברר מאשר אריכות ימים. עם זאת, בניגוד לאריכות ימים, המושג "בריאות" הוא מסובך, שכן ישנן קריאות רבות ושונות לבריאות האורגניזם: ברמה האורגניזמית, יש תפקוד שרירים / כוח, תפקוד עצבי / קוגניטיבי, בריאות הרבייה וכו '; ברמה התאית יש הומאוסטזיס של חלבונים, הומאוסטזיס שומנים, הומאוסטזיס של גלוקוז, חילוף חומרים וכו '. בשנת 2014, ביולוגים של הזדקנות אפיינו באופן סופי את סימני ההיכר הביולוגיים של ההזדקנות עם ההגדרה המובנית שזה חייב להיות משהו שמתפרק באופן טבעי במהלך ההזדקנות וניתן לשנותו בניסוי כך שהחמרה ניסיונית אמורה להאיץ את ההזדקנות והתערבות ניסיונית צריכה להאט את ההזדקנות. תשעת סימני ההיכר האלה של הזדקנות כוללים חוסר יציבות גנומית, התשה של טלומרים, שינויים אפיגנטיים, אובדן הומאוסטזיס של חלבונים (פרוטאוסטזיס), תשישות תאי גזע, איתות בין-תאי שונה, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, חישה של חומרים מזינים שאינם מווסתים וסנסנציה תאית58. מאז, מחקרים רבים טוענים שיש לכלול גורמים אחרים, כולל חלבונים חוץ-תאיים ופיזיולוגיה מערכתית כמו חסינות ודלקת59. בסופו של דבר, ההגדרה המורכבת של תוחלת החיים מחייבת למדוד את בריאות האורגניזם בשיטות רבות ושונות.

לכן, בכתב יד זה, מוצגות שיטות מרובות למדידת היבטים שונים של תוחלת הבריאות באמצעות מודל הנמטודה, C. elegans. אנו בודקים את התנהגות התנועה באמצעות מבחני ת'ראש, בריאות הרבייה באמצעות ספירת ביציות וגודל גזע, ורגישות ללחץ. ואכן, התנהגות תנועתית היא שיטה סטנדרטית למדידת תוחלת החיים, שכן אורגניזמים מפגינים אובדן משמעותי של תנועתיות ותנועה במהלך הזדקנות51. ניתן לייחס את אובדן התנהגות התנועה לסימני היכר מרובים של הזדקנות, שכן תפקוד השרירים ב- C. elegans תלוי בפרוטאוסטזיס תקין60, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה61, ואיתות נוירון-שריר62. בעוד שכתב יד זה מתמקד במדידה אחת של התנהגות תנועתית, חשוב לציין כי קיימות שיטות רבות אחרות, כולל תנועתיות של בעלי חיים על לוח אגר מוצק, תגובה למגע51, ומבחני כימוטקסיס63. עם זאת, שיטות אלה דורשות בדרך כלל התקני הקלטה מתוחכמים יותר, שימוש בתוכנות מעקב אחר תולעים או שימוש בכימיקלים יקרים, מסוכנים או נדיפים, כל אלה עשויים להיות אסורים במסגרות מחקר מסוימות.

בנוסף, מבחנים לספירת ביציות וגודל גזע מוצגים כשיטה למדידת בריאות הרבייה וכשיטה הפשוטה ביותר למדידת חלוקת תאים בתולעים בוגרות, שכן תולעים בוגרות הן פוסט-מיטוטיות ורק תאי נבט ועוברים עוברים חלוקת תאים בתוך תולעת בוגרת64. כמדד לחלוקת התאים, בריאות הרבייה יכולה להיות רלוונטית לסימני ההיכר המזדקנים של סנסנציה תאית ותשישות תאיים. בריאות הרבייה יכולה להיות מושפעת מגורמים רבים, כולל זיהום פתוגני65 או חשיפה ללחץ49, אם כי אין קשר ישיר בין בריאות הרבייה לאריכות ימים. למעשה, כמה בעלי חיים בעלי חיים בעלי תוחלת חיים ארוכה מציגים ירידה משמעותית בגודל49 של גזע, וייתכן אפילו שקיים מתאם הפוך בין אריכות ימים לבין גודלbrood 50. זו אינה תופעה ספציפית ל-C. elegans, שכן השפעות מזיקות של רבייה על אריכות ימים נצפו זה מכבר בבני אדםבני 66, בכלבי לוויה67 ובעכברים68. ובכל זאת, אנו מספקים ספירת ביציות וגודל גזע כשיטה אמינה ובעלות נמוכה למדידת בריאות הרבייה עם האזהרה שבריאות הרבייה עשויה שלא להיות מתואמת עם אריכות ימים או תוחלת בריאות.

לבסוף, מבחני הישרדות מוצעים כמדד עקיף לבריאות האורגניזם. חשוב לציין שתגובות העקה התאית, כולל תגובה ללחץ תרמי69 ולחץ ER35, יורדות במהירות במהלך תהליך ההזדקנות ויש להן רלוונטיות ישירה לסימן ההיכר המזדקן של פרוטאוסטזיס70,71. לעומת זאת, תגובת עקה היפראקטיבית יכולה להאריך באופן משמעותי את תוחלת החיים על ידי קידום עמידות ללחץ 35,37,38. בעוד שמחקר זה מתמקד בשיטות הפשוטות ביותר ובעלות הנמוכה ביותר, קיימות מספר רב של שיטות חלופיות לבדיקות עמידות בפני עקה עבור תרמוטולרנס41 ועקה חמצונית66, שכל אחת מהן דורשת מערך שונה של ציוד וחומרים מתכלים. מעבר למחקרי חשיפה פשוטים לגורמי לחץ, ניתן לבצע שיטות פיזיולוגיות אחרות בהתאם לגישה לציוד. לדוגמה, מנתח שטף חוץ-תאי יכול לנטר את תפקוד המיטוכונדריה ואת הנשימה התאית73; מיקרוסקופי דיסקציה פלואורסצנטיים יאפשרו מדידות של כתבים שעתוק להפעלת תגובת לחץ20; ומיקרוסקופים מורכבים או קונפוקליים ברזולוציה גבוהה יכולים לשמש למדידת מורפולוגיה אברונית באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות למיטוכונדריה74, הרשתית האנדופלסמית 75,76, ואקטין ציטוסקלטון77.

כסיפור אזהרה אחרון למדידות של אריכות ימים, בעוד ששיטות כימיות וגנטיות לעיקור תולעים מוצעות כדי להפחית משמעותית את העלות, חשוב לציין כי שתיהן יכולות להשפיע ישירות על תוחלת החיים. לדוגמה, חשיפה ל-FUDR דווחה בעבר כמשפיעה הן על תוחלת החיים והן עלהתרמוטולרנס 45. ובעוד שלמוטציה glp-4(bn2) עצמה אין השפעות ישירות על תוחלת החיים, צמיחה ב-25 מעלות צלזיוס היא עקת חום קלה33,34 ולכן יכולה להשפיע על תוחלת החיים2. קיימות שיטות אחרות לעיקור C. elegans, כולל סטריליות בתיווך אוקסין78 או מוטנטים חלופיים רגישים לטמפרטורה של מחסור בזרע79. עם זאת, לכל השיטות יש כמה אזהרות, ויש להקפיד על שימוש בבדיקה הכי פחות מזיקה לצרכים המדעיים של כל מעבדה. מגבלה אחת אחרונה של מחקרי אריכות ימים היא שונות פוטנציאלית שיכולה להתרחש עקב גודל מדגם נמוך או פשוט על ידי טעות אובייקטיבית של החוקר. ניתן לעקוף זאת מכיוון שטכנולוגיות חדשות נולדות בטכנולוגיות אוטומטיות של תוחלת חיים80, אך שוב מערכות אלה יקרות ודורשות ציוד וכישורים הנדסיים וחישוביים מסוימים. בסופו של דבר, אוסף השיטות המסופקות כאן הוא סט אמין של כלים שניתן להתאים וללמוד במהירות כמעט בכל מוסד ולספק בסיס מוצק לביולוגיה של ההזדקנות.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

G.G. נתמך על ידי T32AG052374 ו- R.H.S. נתמך על ידי R00AG065200 מהמכון הלאומי להזדקנות. אנו מודים ל- CGC (במימון תוכנית תשתיות המחקר של משרד NIH P40 OD010440) על הזנים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APEX IPTG Genesee 18-242 for RNAi
Bacto Agar VWR 90000-764 for NGM plates
Bacto Peptone VWR 97064-330 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin VWR 76345-522 for RNAi
Cholesterol VWR 80057-932 for NGM plates
DMSO VWR BDH1115-1LP solvent for drugs
LB Broth VWR 95020-778 for LB
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-132 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride VWR 97061-566 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
S7E Dissecting Scope Leica 10450840 Standard dissecting microscope
Sodium Chloride VWR EM-SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium hypochlorite VWR RC7495.7-32 for bleach solution
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tetracycline hydrochloride VWR 97061-638 for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing and Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  3. Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).
  4. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  5. Lithgow, G. J., White, T. M., Melov, S., Johnson, T. E. Thermotolerance and extended life-span conferred by single-gene mutations and induced by thermal stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7540-7544 (1995).
  6. Epel, E. S., Lithgow, G. J. Stress biology and aging mechanisms: toward understanding the deep connection between adaptation to stress and longevity. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 69, Suppl 1 10-16 (2014).
  7. Luo, Y. Long-lived worms and aging. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 9 (2), 65-69 (2004).
  8. Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
  9. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  12. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  13. Reboul, J., et al. Open-reading-frame sequence tags (OSTs) support the existence of at least 17,300 genes in C. elegans. Nature Genetics. 27 (3), 332-336 (2001).
  14. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).
  15. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  16. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
  17. Pang, S., Curran, S. P. Adaptive capacity to bacterial diet modulates aging in C. elegans. Cell Metabolism. 19 (2), 221-231 (2014).
  18. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLOS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
  19. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes & Development. 23 (4), 496-511 (2009).
  20. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61001 (2020).
  21. Xiao, R., et al. RNAi interrogation of dietary modulation of development, metabolism, behavior, and aging in C. elegans. Cell Reports. 11 (7), 1123-1133 (2015).
  22. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  23. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  24. Kim, H. -M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in C. elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106 (2019).
  25. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
  26. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19648/ (2006).
  27. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  28. Kaymak, E., et al. Efficient generation of transgenic reporter strains and analysis of expression patterns in Caenorhabditis elegans using Library MosSCI. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 245 (9), 925-936 (2016).
  29. Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (82), (2013).
  30. Rastogi, S., et al. Caenorhabditis elegans glp-4 encodes a valyl aminoacyl tRNA synthetase. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2719-2728 (2015).
  31. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), Cambridge, England. 755-766 (1992).
  32. Santi, D. V., McHenry, C. S. 5-Fluoro-2′-Deoxyuridylate: covalent complex with thymidylate synthetase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69 (7), 1855-1857 (1972).
  33. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), 270-276 (1994).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  35. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  36. Higuchi-Sanabria, R., et al. Divergent nodes of non-autonomous UPRER signaling through serotonergic and dopaminergic neurons. Cell Reports. 33 (10), 108489 (2020).
  37. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  38. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  39. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  40. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  41. Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  42. Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the effects of bacteria on C. Elegans behavior using an egg retention assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e51203 (2013).
  43. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a neuropeptide gene on behavioral states in Caenorhabditis elegans egg-laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  44. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), San Diego, Calif. 450-457 (2014).
  45. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset). PLOS ONE. 9 (1), 85964 (2014).
  46. Hsu, A. -L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
  47. Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 277-286 (2015).
  48. Hodgkin, J., Barnes, T. M. More is not better: brood size and population growth in a self-fertilizing nematode. Proceedings. Biological Sciences. 246 (1315), 19-24 (1991).
  49. Ozbey, N. P., et al. Tyramine Acts Downstream of Neuronal XBP-1s to coordinate inter-tissue UPRER activation and behavior in C. elegans. Developmental Cell. 55 (6), 754-770 (2020).
  50. Lee, Y., et al. Inverse correlation between longevity and developmental rate among wild C. elegans strains. Aging. 8 (5), Albany NY. 986-994 (2016).
  51. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  52. Lee, S. -J., Hwang, A. B., Kenyon, C. Inhibition of respiration extends C. elegans life span via reactive oxygen species that increase HIF-1 activity. Current Biology: CB. 20 (23), 2131-2136 (2010).
  53. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science. 346 (6207), 360-363 (2014).
  54. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  55. Carpenter, R. L., Gökmen-Polar, Y. HSF1 as a cancer biomarker and therapeutic target. Current Cancer Drug Targets. 19 (7), 515-524 (2019).
  56. Chen, S., et al. The emerging role of XBP1 in cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 127, 110069 (2020).
  57. Yadav, R. K., Chauhan, A. S., Zhuang, L., Gan, B. FoxO transcription factors in cancer metabolism. Seminars in Cancer Biology. 50, 65-76 (2018).
  58. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  59. Kennedy, B. K., et al. Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell. 159 (4), 709-713 (2014).
  60. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  61. Hewitt, J. E., et al. Muscle strength deficiency and mitochondrial dysfunction in a muscular dystrophy model of Caenorhabditis elegans and its functional response to drugs. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
  62. Gao, S., Zhen, M. Action potentials drive body wall muscle contractions in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2557-2562 (2011).
  63. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50069 (2013).
  64. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
  65. Madhu, B. J., Salazar, A. E., Gumienny, T. L. Caenorhabditis elegans egg-laying and brood-size changes upon exposure to Serratia marcescens and Staphylococcus epidermidis are independent of DBL-1 signaling. microPublication Biology. 2019, (2019).
  66. Westendorp, R. G., Kirkwood, T. B. Human longevity at the cost of reproductive success. Nature. 396 (6713), 743-746 (1998).
  67. Hoffman, J. M., Creevy, K. E., Promislow, D. E. L. Reproductive capability is associated with lifespan and cause of death in companion dogs. PLOS ONE. 8 (4), 61082 (2013).
  68. Garratt, M., Try, H., Smiley, K. O., Grattan, D. R., Brooks, R. C. Mating in the absence of fertilization promotes a growth-reproduction versus lifespan trade-off in female mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15748-15754 (2020).
  69. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the heat shock response is a programmed event at the onset of reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  70. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A futile battle? Protein quality control and the stress of aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  71. Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Hijacking cellular stress responses to promote lifespan. Frontiers in Aging. 3, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fragi.2022.860404 (2022).
  72. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring oxidative stress in Caenorhabditis elegans: paraquat and juglone sensitivity assays. Bio-protocol. 7 (1), 2086 (2017).
  73. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: mitochondrial function using the seahorse system. Methods in molecular biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).
  74. Daniele, J. R., et al. High-throughput characterization of region-specific mitochondrial function and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749 (2017).
  75. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  76. Daniele, J. R., et al. UPRER promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Science Advances. 6 (1), 1441 (2020).
  77. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).
  78. Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).
  79. Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (4), 145-156 (1994).
  80. Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).

Tags

גנטיקה גיליון 183 C. elegans מתח הזדקנות תגובת חלבון נפרשת רשתית אנדופלסמית מיטוכונדריה תגובת הלם חום
סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב <em>- Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro Torres, T., Moaddeli, D.,… More

Castro Torres, T., Moaddeli, D., Averbukh, M., Coakley, A. J., Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (183), e64091, doi:10.3791/64091 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter