Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Published: May 18, 2022 doi: 10.3791/64091
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Abstract

De ontdekking en ontwikkeling van Caenorhabditis elegans als modelorganisme was invloedrijk in de biologie, met name op het gebied van veroudering. Veel historische en hedendaagse studies hebben duizenden levensduurveranderende paradigma's geïdentificeerd, waaronder genetische mutaties, transgene genexpressie en hormese, een gunstige, laaggradige blootstelling aan stress. Met zijn vele voordelen, waaronder een korte levensduur, eenvoudig en goedkoop onderhoud en een volledig gesequenced genoom met homologie aan bijna tweederde van alle menselijke genen, is C. elegans snel aangenomen als een uitstekend model voor stress en verouderingsbiologie. Hier worden verschillende gestandaardiseerde methoden onderzocht voor het meten van levensduur en gezondheidsspanne die gemakkelijk kunnen worden aangepast aan bijna elke onderzoeksomgeving, vooral die met beperkte apparatuur en fondsen. Het ongelooflijke nut van C. elegans wordt gekenmerkt, wat het vermogen benadrukt om krachtige genetische analyses uit te voeren in de verouderingsbiologie zonder de noodzaak van uitgebreide infrastructuur. Ten slotte worden de beperkingen van elke analyse en alternatieve benaderingen besproken voor overweging.

Introduction

Sinds de publicatie van 'The genetics of Caenorhabditis elegans', een van de meest invloedrijke artikelen van Sydney Brenner in 1974, wordt deze microscopische worm beschouwd als een uitstekend modelsysteem om biologische mysteries te bestuderen1. In 1977 publiceerde Michael R. Klass de methode voor het meten van de levensduur van C. elegans en stelde dit modelsysteem op om veroudering te bestuderen2. Het onderzoek om de relatie tussen stress en levensduur te begrijpen is begonnen met de identificatie van een enkele mutatie in het leeftijd-1 gen, wat resulteerde in een levensduurverlenging in C. elegans3. Bovendien hebben hedendaagse studies andere levensduurverhogende mutaties geïdentificeerd, die langlevende mutante wormen onthulden die een verhoogde weerstand tegen stress vertonen 4,5,6. Met zijn vele voordelen, waaronder een korte levensduur, eenvoudig onderhoud, volledig gesequenced genoom dat homologie bevat aan ongeveer tweederde van alle menselijke ziekteverwekkende genen, beschikbaarheid en gemak van het gebruik van RNA-interferentie (RNAi) bibliotheken, en fysiologische gelijkenis met mensen 7,8,9, is C. elegans snel aangenomen als een uitstekend model voor stress en verouderingsbiologie.

Misschien wel de grootste nutsvoorzieningen van C. elegans zijn de extreem lage onderhoudskosten, het gemak van experimenteren en de verscheidenheid aan genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor studies. C. elegans worden meestal gekweekt op een vast agarmedium met een E. coli-voedselbron. Twee veelgebruikte E. coli-stammen zijn standaard OP50, een B-stam die misschien wel de meest gebruikte10 is, en HT115, een K-12-stam die voornamelijk wordt gebruikt voor RNAi-experimenten11,12. De HT115 K-12 stam draagt een deletie in RNAIII RNase, een mutatie die essentieel is voor RNAi-methoden, waarbij plasmiden die dsRNA tot expressie brengen dat overeenkomt met individuele C. elegans-genen worden gebruikt. De dsRNA-voedingsvectoren zorgen voor een robuuste knockdown van C. elegans-genen zonder de noodzaak van complexe kruisingen of genoombewerking, omdat bacteriën die deze plasmiden dragen rechtstreeks aan nematoden kunnen worden gevoerd. Duizenden van deze bacteriële RNAi-vectoren bestaan op de HT115-achtergrond, waaronder de meest populaire Vidal RNAi-bibliotheek met >19.000 individuele RNAi-constructies13 en de Ahringer RNAi-bibliotheek met 16.757 RNAi-constructies14. De bacteriële diëten OP50 en HT115 hebben echter grote verschillen in metabolisch profiel, waaronder verschillen in vitamine B1215,16. Daarom wordt aanbevolen om alle experimenten uit te voeren op een enkele bacteriebron, indien mogelijk, om gen-dieetinteracties te vermijden die meerdere verstorende factoren kunnen introduceren zoals eerder beschreven 17,18,19. Vanwege het gemak worden dieren op OP50 gehouden voor alle hier beschreven experimentele omstandigheden, maar alle experimenten worden uitgevoerd op HT115 zoals eerder beschreven20. Kortom, dieren worden op OP50 gehouden en na synchronisatie (na bleken) overgebracht naar HT115 voor consistentie tussen RNAi versus niet-RNAi-experimenten. Als alternatief kan ook een RNAi-competente OP50-stam worden gebruikt met een vergelijkbare deletie van RNAIII RNase in de E. coli K12 HT115-stam21.

Misschien is een belangrijke beperking van RNAi-experimenten in C. elegans de zorg voor knockdown-efficiëntie. Hoewel knockdown-efficiëntie kan worden gevalideerd via qPCR of western blotting, vereisen deze dure apparatuur en reagentia en zijn ze beperkt tot bulkanalyse. Dit is nog meer een zorg als we kijken naar specifieke cellen, zoals neuronen, die refractair (minder gevoelig) zijn voor RNAi. Hoewel de RNAi-efficiëntie in specifieke cellen kan worden verbeterd door overexpressie van SID-1, het transmembraaneiwit dat essentieel is voor dsRNA-opname22, is dit nog steeds beperkt tot de celtypespecifieke expressiepatronen van de promotors die voor deze constructen worden gebruikt, en dus zijn gen knock-outs en mutaties de meest waterdichte manier om genfuncties uit te putten. Naast RNAi-gemedieerde knockdown zijn C. elegans ook zeer vatbaar voor genoombewerking met CRISPR-gebaseerde strategieën 23,24,25 en transgene constructoverexpressie door micro-injecties, met de optie om transgene constructen te integreren door bestraling of transposon-gebaseerde integratie 26,27,28,29 . Deze methoden vereisen echter dure micro-injectieapparatuur en de hoge kosten van gids-RNA's of Cas9-enzym kunnen deze methoden verbieden in instellingen met beperkte financiering. In plaats daarvan zijn duizenden transgene lijnen en mutanten direct beschikbaar voor een paar dollar, zowel bij het Caenorhabditis Genetics Center (CGC) als het National Bioresource Project (NBRP). De NBRP biedt geïsoleerde mutanten voor een groot aantal C. elegans-genen, waaronder gepubliceerde en daarom geverifieerde mutante stammen, mutanten afgeleid van proefprojecten en mutanten die nog moeten worden gekarakteriseerd. CGC daarentegen is een bewaarplaats van meestal gepubliceerde en gevestigde C. elegans-lijnen uit de onderzoeksgemeenschap. Beide verzenden soorten wereldwijd tegen zeer redelijke tarieven en bieden een breed scala aan opties voor mensen met een beperkte capaciteit om stammen in eigen huis te synthetiseren.

Hier wordt een samengestelde methodencollectie aangeboden, die waarschijnlijk de goedkoopste methoden zijn voor het testen van de levensduur en de gezondheidsspanne in C. elegans. Alle hier gepresenteerde methoden vereisen goedkope apparatuur en benodigdheden en gebruiken alleen stammen die direct beschikbaar zijn bij de CGC. Misschien wel het meest onbetaalbaar voor levensduur- en overlevingstests in C. elegans zijn de kosten van Nematode Growth Media (NGM) -platen. Aangezien C. elegans hermafrodieten zijn en zichzelf bevruchten, vereisen standaard overlevingstests dat volwassen dieren voortdurend van hun nageslacht worden verwijderd om besmetting door nakomelingen te voorkomen. Dit proces is niet alleen tijdrovend, het kan ook duur worden vanwege de noodzaak van ongeveer 100 platen per conditie om een enkele levensduurtest uit te voeren. Hier worden twee alternatieven geboden: gebruik van de temperatuurgevoelige kiembaanloze mutant, glp-4 (bn2) of chemische sterilisatie met behulp van 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR). glp-4 codeert voor een valyl aminoacyl tRNA synthetase, en de temperatuurgevoelige glp-4(bn2) zijn reproductief deficiënt bij beperkende temperaturen als gevolg van verminderde eiwittransformatie30,31. FUDR is een robuuste methode om C. elegans chemisch te steriliseren door DNA-replicatie te voorkomen, waardoor de voortplanting wordt geremd32. Hoewel FUDR voor sommige laboratoria onbetaalbaar kan zijn, is slechts een kleine hoeveelheid nodig om wormen chemisch te steriliseren, en de stabiliteit in poedervorm kan het voor de meeste groepen haalbaar maken. Het gebruik van de temperatuurgevoelige glp-4 (bn2) mutant is zeker de goedkoopste optie, omdat de enige vereiste een incubator is om de dieren naar de beperkende 25 ° C te verplaatsen; er moet echter worden opgemerkt dat groei bij 25 °C milde hittestress33,34 kan veroorzaken. Ongeacht de methode kan het gebruik van steriele dieren de kosten van verbruiksartikelen die nodig zijn voor leeftijdsgebonden testen aanzienlijk verlagen.

Om veroudering te bestuderen, zijn standaard levensduurtests conventioneel omdat paradigma's die de levensduur veranderen directe gevolgen hebben voor veroudering. Metingen van de gezondheidsspanne en stresstolerantie bieden echter aanvullende informatie over de gezondheid van het organisme. Hier worden verschillende methoden aangeboden om de gezondheid te meten: 1) vruchtbaarheid als een maat voor reproductieve gezondheid; 2) broedgrootte als maat voor de ontwikkeling van de gezondheid en levensvatbaarheid van gelegde nakomelingen; en 3) locomotorisch gedrag als een maat voor spierfunctie en beweeglijkheid, die beide direct gecorreleerd zijn met veroudering. Daarnaast worden testen van stresstolerantie aangeboden: overleving tot ER-stress, mitochondriale / oxidatieve stress en thermische stressoverleving. Inderdaad, dieren met verhoogde weerstand tegen ER-stress35,36, mitochondriale stress37 en thermische stress38 vertonen een langere levensduur. ER-stress wordt toegepast door C. elegans bloot te stellen aan tunicamycine, dat N-gebonden glycosylatie blokkeert en de accumulatie van verkeerd gevouwen eiwitten veroorzaakt39. Mitochondriale / oxidatieve stress wordt geïnduceerd door blootstelling aan paraquat, die superoxidevorming induceert, specifiek in de mitochondriën40. Hittestress wordt toegepast door de incubatie van dieren bij 34-37 °C33,41. Alle hier beschreven testen kunnen worden uitgevoerd met minimale apparatuur en fondsen en bieden een verscheidenheid aan hulpmiddelen om veroudering in diverse groepen te bestuderen.

Protocol

1. Groei en onderhoud van C. elegans

  1. Nematode Growth Media (NGM) platen gieten
    1. Kweek C. elegans op standaard 2% agarplaten met Nematode Growth Media (NGM) bestaande uit 1 mM CaCl2, 5 μg/ml cholesterol, 25 mM KPO4 (pH 6,0), 1 mM MgSO4, 0,25% w/v Peptone en 51,3 mM NaCl.
    2. Meet voor 1 L NGM-agarplaten 2,5 g Peptone, 3,0 g NaCl en 20 g agar in een kolf van 1 L met een roerstaaf.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een specifieke agarbron te standaardiseren, omdat we variabiliteit in stijfheid tussen merken hebben gezien, wat de reproduceerbaarheid kan beïnvloeden. Hier wordt Bacto-Agar strikt gebruikt. Bovendien wordt aanbevolen om agar rechtstreeks toe te voegen aan de kolf die wordt geautoclaveerd, omdat agar niet volledig zal oplossen zonder verhitting, en het overbrengen van een oplossing die agar bevat, zal resulteren in verlies van agar en concentratiefouten.
    3. Voeg dH2O toe tot 970 ml.
      OPMERKING: 30 ml vloeibare additieven na sterilisatie brengt het uiteindelijke volume op 1 l. In onze handen is ~ 951 ml dH2O vereist om 970 ml van het uiteindelijke volume te bereiken.
    4. Steriliseer NGM-agar-oplossing met behulp van een standaard autoclaaf of mediasterilisator voor efficiënte sterilisatie.
      OPMERKING: Op dit punt kan steriele NGM-agar enkele maanden bij kamertemperatuur worden bewaard. Indien bewaard, kan NGM-agar worden gereliquefieerd in een magnetron met 15-45 s pulsen om te voorkomen dat de oplossing overkookt, of in een verwarmd waterbad.
    5. Laat de oplossing roeren tot hij is afgekoeld tot 60-75 °C. Roeren tijdens het afkoelen is belangrijk om ongelijkmatige afkoeling te voorkomen, waardoor sommige agar kan stollen.
    6. Terwijl de oplossing afkoelt, verwarmt u een waterbad of kralenbad tot 65-70 °C.
    7. Zodra de oplossing is afgekoeld tot 60-75 °C, voegt u vloeibare additieven toe: 2,0 ml 0,5 M CaCl2, 1 ml 5 mg/ml cholesterol, 25 ml 1 M KPO4 (pH 6,0) en 0,5 M MgSO4 (zie tabel 1 voor recepten voor alle reagentia) en laat de oplossing gedurende ~ 5 minuten mengen om volledige menging te garanderen.
      OPMERKING: Geneesmiddelen kunnen hier ook in platen worden opgenomen (voeg bijvoorbeeld 1 ml 1 ml 100 mg / ml carbenicilline en 1 ml 1 M IPTG toe; voeg 10 ml 2,5 mg / ml tunicamycine toe; voeg 10 ml 400 mM paraquat toe).
    8. Dompel de kolf met NGM-agar onder in een waterbad van 65-70 °C om te voorkomen dat NGM-agar stolt tijdens het gieten in platen.
    9. Pipetteer 9-11 ml oplossing in elke plaat van 60 mm, of 20-30 ml oplossing in elke plaat van 100 mm.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het kleinste pipetvolume te gebruiken dat beschikbaar is om NGM-lekken te voorkomen die worden veroorzaakt door lucht die uitzet in de pipet. Door 1-2 ml meer media op te pipetteren dan aan elke plaat wordt toegevoegd om te voorkomen dat de pipet volledig wordt geleegd, wordt bellenvorming voorkomen. Als alternatief kunnen platen met de hand rechtstreeks uit de fles in een bord worden gegoten, maar pipetteren wordt ten zeerste aanbevolen om platen met hetzelfde volume te garanderen. Platen met een gelijk volume zijn belangrijk om vergelijkbare concentraties van oplossingen te garanderen bij het gebruik van methoden waarbij oplossingen direct op een plaat worden aangebracht (zie stap 1.1.17). Gelijke volumes maken ook eenvoudige microscopie mogelijk om een vergelijkbaar brandpuntsvlak over platen te behouden.
    10. Plaats de pipet terug in de verwarmde oplossing om de temperatuur te handhaven en te voorkomen dat NGM-agar stolt.
    11. Herhaal de bovenstaande twee stappen voor alle platen.
    12. Laat NGM-agarplaten 's nachts stollen.
    13. Nadat de platen zijn gestold, bewaart u platen gedurende maximaal 3 maanden bij 4 °C of gaat u verder met stap 1.1.14 voor het zaaien van platen met bacteriën. Bewaar platen in verzegelde containers om vocht vast te houden om de plaatkwaliteit te behouden.
    14. Kweek een kweek van OP50 in lysogene bouillon (LB) of gelijkwaardige media naar keuze gedurende 24-48 uur bij omgevingstemperatuur (~ 22-25 °C) of kweek een cultuur van HT115 in LB + antibiotica (ampicilline / carb + tetracycline wordt aanbevolen voor HT115) met schudden bij 37 ° C gedurende 12-16 uur.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om OP50 bij kamertemperatuur te laten groeien omdat een agressievere groei van OP50 is gevonden bij 37 °C, wat de levensduur van C. elegans beïnvloedt. HT115 daarentegen heeft een langzamere groeisnelheid en maakt minder dichte culturen; daarom wordt aanbevolen om HT115 bij 37 °C te laten groeien met schudden.
    15. Zaai een volume van 100-200 μL van een verzadigde OP50/HT115-cultuur op een plaat van 60 mm, of 1 ml voor een plaat van 100 mm.
    16. Laat platen een nacht drogen op een benchtop en laat een extra dag drogen als de platen nog nat zijn. Bewaar platen in verzegelde containers bij 4 °C gedurende ~2 maanden.
    17. Optioneel: Voeg geneesmiddelen rechtstreeks toe aan gezaaide NGM-agarplaten (bijv. 100 μL 10 mg / ml FUDR-oplossing) om wormen chemisch te steriliseren.
  2. Instandhouding van de voorraden van C. elegans
    1. Label de bodem van een gezaaide NGM-agarplaat op de juiste manier. Label de randen aan de onderkant van de plaat om te voorkomen dat de doorgang van licht op standaard dissectiemicroscopen wordt belemmerd.
    2. Met behulp van een standaard dissectiemicroscoop schept u bacteriën naar keuze op C. elegans pick.
      OPMERKING: In dit protocol werd een plectrum gebruikt die bestond uit een 90% / 10% platina / iridiumdraad bevestigd aan het uiteinde van een glazen Pasteur-pipet.
    3. Verzamel met behulp van de bacteriën 10-20 eieren, L1-, L2- of L3-dieren en breng ze over op een nieuw gelabelde gezaaide NGM-agarplaat.
      OPMERKING: Het is het beste om jongere dieren te verzamelen; in de ervaring van de auteurs, voor standaard wilde dieren, zal het verplaatsen van 10-20 eieren / jong dier de plaat in staat stellen om bij 15 ° C te groeien zonder uithongering. Voor transgene of gemuteerde dieren met verminderde vruchtbaarheid moeten meer dieren in de plaat worden verplaatst.
    4. Voor dieren met een vruchtbaarheid van het wilde type en gekweekt bij 15 °C, herhaalt u stap 1.2.1-1.2.3 om de 7 dagen om een wekelijks bestand aan te houden. Voor dieren die bij 20 °C zijn gekweekt, herhaalt u stap 1.2.1-1.2.3 om de 4-5 dagen om uithongering te voorkomen.
  3. Wormen synchroniseren via Bleken
    OPMERKING: Een volledige NGM-agarplaat van 60 mm (bijv. 1 week oude voorraadplaten gekweekt bij 15 °C) levert een voldoende aantal dieren op voor de meeste beschreven standaardtests. Over het algemeen zal één gravid volwassene (volwassene vol eieren) 10-15 eieren leveren42, en een volledige, 60 mm NGM-agar plaat heeft overal van 100-200 gravid volwassenen, het verstrekken van ~ 1000-2000 eieren.
    1. Voor grootschalige experimenten waarbij meer dieren nodig zijn, snijdt u een volledige 60 mm NGM-agar in vier tot zes gelijke stukken en snijdt u ze op gezaaide 100 mm-platen voor uitbreiding.
      OPMERKING: Hier verwijst chunking naar het snijden van een stuk van de NGM-agar-plaat met wormen en het verplaatsen van het hele stuk agar + wormen op een nieuwe plaat, worm-side naar beneden om de wormen op de nieuwe plaat te laten kruipen. Als referentiekader zullen dieren met wilde vruchtbaarheid een volledige plaat van 100 mm produceren als ze gedurende 2-3 dagen na het brokken bij 20 °C worden gekweekt.
    2. Om te beginnen met het verzamelen van de nematoden, giet u een kleine hoeveelheid M9-oplossing (tabel 1) op platen met wormen en zorg ervoor dat u de petrischaal niet te veel vult. Draai de M9-oplossing voorzichtig rond om wormen los te maken van bacteriële gazons.
    3. Verzamel gravid volwassen wormen met een serologische pipet en zorg ervoor dat u de agar niet doorboort met de pipetpunt.
      OPMERKING: Glazen serologische pipetten worden aanbevolen, omdat C. elegans de neiging hebben om aan plastic te kleven. Als er geen glazen pipetten beschikbaar zijn, wordt aanbevolen om met een groter aantal dieren te beginnen dan nodig is, omdat sommige verloren gaan door het vasthouden aan plastic pipetten.
    4. Pelleteer de dieren door centrifugeren gedurende 30 s bij 1.100 x g. Aspirateer het supernatant.
      OPMERKING: De C. elegans pellet is erg los, dus zorg ervoor dat u de pellet niet schudt of verstoort tijdens het aanzuigen van het supernatant.
    5. Terwijl dieren centrifugeren, bereidt u 5 ml bleekoplossing per stam (zie tabel 1 voor receptdetails); meng voor 5 ml oplossing 1,5 ml 6% natriumhypochloriet (bleekmiddel), 0,75 ml 5 M NaOH of KOH en 2,75 ml dH2O.
      LET OP: Natriumhypochloriet en hoge concentratiehydroxideoplossingen zijn corrosief en daarom wordt aanbevolen om handschoenen en een laboratoriumjas te dragen tijdens het hanteren.
    6. Voeg 5 ml bleekoplossing toe aan het mengsel van de wormpellet/M9.
    7. Controleer de wormen om de paar minuten onder een ontleedmicroscoop totdat alle volwassen wormlichamen zijn opgelost en alleen eieren in de mix zijn achtergebleven. Schud de worm/bleekmiddelmix krachtig om het bleekproces te versnellen.
      OPMERKING: Het gedurende langere tijd in een bleekmiddelmengsel laten zitten, zal resulteren in het beschadigen van de eieren en zal de levensvatbaarheid van de dieren beïnvloeden. Voor wilde dieren duurt het bleken meestal 4-6 minuten met schudden. Het wordt dus aanbevolen om de dieren onder een microscoop te controleren met intervallen van 30 s vanaf het 4 minuten-teken.
    8. Pelleteer de eieren door het ei/bleekmiddelmengsel gedurende 30 s op 1.100 x g te draaien.
      OPMERKING: Sommige conische buizen van 15 ml hebben gradiëntlijnen aan de binnenkant van de buis. Voor deze buizen wordt aanbevolen om eieren met een hogere snelheid te spinnen (bijvoorbeeld 30 s bij 2.000 x g) om ervoor te zorgen dat eieren naar de bodem van de buis pelleteren en niet op gradiëntlijnen blijven.
    9. Adem de bleekoplossing uit.
      OPMERKING: Een eikorrel is stijver dan een wormkorrel, maar kan nog steeds gemakkelijk worden verstoord. Zorg er dus voor dat u de buis niet schudt na het centrifugeren.
    10. Was eieren door M9-oplossing tot 15 ml toe te voegen en de buis vier of vijf keer om te keren om ervoor te zorgen dat de eieren volledig in de M9-oplossing worden verspreid.
    11. Pellet eieren door centrifugeren gedurende 30 s bij 1.100 x g en aspirate out M9-oplossing.
    12. Herhaal de bovenstaande twee stappen voor een totaal van vier wasbeurten om bleekmiddel uit de eimix te verwijderen.
    13. Resuspenseer de eieren in 100 μL tot 2 ml M9-oplossing (d.w.z. afhankelijk van het totale aantal gebleekte wormen) na de laatste wasbeurt. Schud eieren grondig om klonten te breken en zorg ervoor dat de pellet volledig geresuspendeerd is.
    14. Als alternatief kunnen dieren L1 worden gearresteerd voor een nauwere temporele synchronisatie; voeg voor L1-arrestering de M9-oplossing toe aan de eikorrel tot ~ 10 ml in een conische buis van 15 ml. Laat de wormen tot 24 uur draaien in een rotator bij 20 °C of omgevingstemperatuur. L1-dieren hebben over het algemeen een halve dag minder nodig om volwassen te worden in vergelijking met de timing van eieren beschreven in stap 1.3.16.
    15. Benader de eiconcentratie (of L1-concentratie; zie stap 1.3.14) door 4 μL ei/M9-mengsel te pipetteren op een NGM-plaat bezaaid met bacteriën. Tel en bereken hoeveel eieren er per μL verguld zijn. Herhaal de telling drie of vier keer om de benadering te verbeteren.
      OPMERKING: Het benaderen van de eiconcentratie zorgt ervoor dat voldoende dieren worden verguld voor de juiste monstergrootte voor experimenten zonder overspatting, wat honger zal veroorzaken.
    16. Op basis van de benadering, plaat het juiste aantal eieren op NGM-agar platen bezaaid met bacteriën naar keuze. Voor OP50-platen, plaat maximaal 200 dieren op een plaat van 60 mm en 1.000 dieren op een plaat van 100 mm. Voor HT115-platen, plaat maximaal 150 dieren op een plaat van 60 mm en 600 dieren op een plaat van 100 mm.
      OPMERKING: Dit zijn geschatte cijfers op basis van onze laboratoriumomstandigheden en cijfers kunnen veranderen op basis van de dikte van het bacteriële gazon. Eieren gekweekt bij 15 ° C zullen ~ 5 dagen nodig hebben om dag 1 volwassenheid te bereiken (~ 140 uur om het maximale, gravid volwassen stadium van het leggen van eieren te bereiken). Eieren gekweekt bij 20 ° C zullen ~ 4 dagen duren om dag 1 volwassenheid te bereiken (~ 96 uur om het maximale, gravid volwassen stadium van het leggen van eieren te bereiken). Eieren gekweekt bij 25 ° C zullen ~ 3,5 dagen nodig hebben om dag 1 volwassenheid te bereiken (~ 62 uur om het maximale, gravid volwassen stadium van het leggen van eieren te bereiken).
  4. Eierleggen als alternatieve methode om C. elegans populaties te synchroniseren
    1. Als bleekprotocollen niet haalbaar zijn (bijvoorbeeld geen centrifuge beschikbaar), voer dan als alternatieve methode om populaties van C. elegans te synchroniseren een eierlegprocedure uit. Houd er rekening mee dat dit protocol arbeidsintensiever is en zal resulteren in kleinere opbrengsten van dieren.
    2. Plaats voor het leggen van eieren 8-12 gravid volwassenen op een standaard NGM-agarplaat bezaaid met bacteriën naar keuze en documenteer het exacte aantal dieren dat op een bord is geplaatst.
      OPMERKING: Eierlegprocedures moeten worden uitgevoerd bij de temperatuur die zal worden gebruikt voor experimenten.
    3. Laat dieren 4-8 uur eieren leggen.
      OPMERKING: De duur die dieren op het bord laten liggen, kan indien nodig worden aangepast. Een groter aantal dieren kan bijvoorbeeld op een bord worden gelegd voor een kortere legduur wanneer er minder tijd beschikbaar is. C. elegans leggen over het algemeen eieren in uitbarstingen, die kunnen worden geschat op een snelheid van ongeveer vijf eieren / h voor dieren met wilde vruchtbaarheid43. Volg de aanbevelingen in stap 1.3.16 om overspoeling van dieren te voorkomen.
    4. Verwijder alle volwassen dieren van het bord.
      OPMERKING: Alle volwassen dieren die op het bord achterblijven, blijven eieren leggen, wat resulteert in een niet-gesynchroniseerde populatie.
    5. Leg eieren op 15 °C gedurende ~ 5 dagen of 20 ° C gedurende ~ 4 dagen om dag 1 volwassen te bereiken.

2. Het meten van de levensduur in C. elegans

  1. Standaard levensduur
    1. Bereid NGM-agar platen voor door platen te zaaien met 100 μL bacteriën naar keuze. Zorg er voor consistentie voor dat dezelfde bacteriën in alle replicaties worden gebruikt. Omdat wormen elke dag worden verplaatst tijdens de eierlegfasen van de volwassenheid, zaait u vijf tot zeven sets NGM-agar-platen voor de duur van de levensduur en twee tot vier platen per stam om dieren tot volwassenheid te laten groeien (d.w.z. als u acht platen van 15 dieren gebruikt voor de levensduur, moet men 40-56 platen per aandoening zaaien).
    2. Laat de platen een nacht drogen voordat ze worden bewaard.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de platen bij 4 °C te bewaren en het vereiste aantal platen dagelijks uit de koude opslag te verwijderen om te voorkomen dat bacteriën dikke gazons maken die de levensduur van het verplaatsen / tellen moeilijk kunnen maken. Zorg ervoor dat platen worden opgewarmd voordat u wormen platt.
    3. Verzamel een gesynchroniseerde populatie van C. elegans met behulp van een standaard bleektest zoals beschreven in stap 1.3 en 1.4.
    4. Verplaats 10-15 dag 1 volwassen dieren op 8-12 borden elk. Begin voor een standaardlevensduur met ~ 120 dieren om ervoor te zorgen dat de steekproefgrootte niet te ver onder de 100 daalt na censuurgebeurtenissen (bijv. Acht platen van 15 dieren = 120 dieren; 12 platen van 10 dieren = 120 dieren).
      OPMERKING: In het huidige geval zijn 10-15 dieren een beheersbaar aantal voor de meeste onderzoekers, hoewel zes platen van 20 dieren ook haalbaar is om de kosten van verbruiksartikelen te verlagen.
    5. Gedurende de eerste 7-8 dagen of totdat nakomelingen niet langer zichtbaar zijn, verplaats volwassen dieren elke 1-2 dagen weg van hun nageslacht.
      OPMERKING: Dieren kunnen om de andere dag worden verplaatst om materialen te besparen, maar er moet voor worden gezorgd dat eieren / larvale dieren niet met de volwassene worden overgedragen om besmetting van volwassen populaties met nakomelingen te voorkomen. In deze studie is de eenvoudigste methode om dieren elke dag te verplaatsen van dag 1-3 wanneer het leggen van eieren maximaal is, en vervolgens over te schakelen op het verplaatsen van dieren om de andere dag gedurende dagen 5-8 wanneer het leggen van eieren minimaal is. Met deze methode is het niet noodzakelijk om overdracht van eieren / larvale dieren gedurende dag 1-3 te voorkomen, omdat de volwassenen elke dag worden verplaatst en eieren / larven zich niet binnen 1 dag tot volwassenheid kunnen ontwikkelen.
    6. Nadat dieren zijn gestopt met het produceren van nakomelingen, scoor je om de dag de levensduur totdat alle dieren zijn gescoord als dood of gecensureerd. Verwijder alle dode of gecensureerde dieren van het bord om verwarring te voorkomen en hetzelfde dier te vertellen.
      OPMERKING: De dood wordt gescoord als dieren die geen beweging vertonen wanneer ze zachtjes worden aangeraakt met een plectrum. Censuur wordt gescoord als dieren die in zakken zijn gestopt, vulva / intestinale uitsteeksels vertonen of naar de zijkanten van de plaat zijn gekropen waar ze uitdrogen.
  2. Levensduur met chemische sterilisatie met FUDR
    1. Bereid NGM-agar platen voor door platen te zaaien met 100 μL bacteriën naar keuze. Zorg er voor consistentie voor dat dezelfde bacteriën in alle replicaties worden gebruikt. Zaai 8-12 platen per stam voor levensduurexperimenten en twee tot vier platen per stam om dieren volwassen te maken. Laat de borden een nacht drogen.
    2. Voeg 100 μL 10 mg / ml FUDR toe aan het midden van bacterieel gazon voor de 8-12 platen die zullen worden gebruikt voor levensduurtest. Vergeet niet om twee tot vier platen zonder FUDR te laten als startplaten om dieren volwassen te laten worden. Laat de borden een nacht drogen.
      LET OP: FUDR blokkeert de DNA-synthese en daarom wordt aanbevolen om handschoenen te dragen bij het hanteren.
    3. Verzamel een gesynchroniseerde populatie van C. elegans met behulp van een standaard bleektest zoals beschreven in stap 1.3 en 1.4.
      OPMERKING: Deze dieren moeten worden gekweekt op platen zonder FUDR, omdat FUDR ervoor zorgt dat dieren stoppen / sterven.
    4. Verplaats 10-15 dag 1 volwassen dieren op 8-12 platen elk, die FUDR bevatten. Begin voor een standaardlevensduur met ~ 120 dieren om ervoor te zorgen dat de steekproefgrootte niet te ver onder de 100 daalt na censuurgebeurtenissen (bijv. Acht platen van 15 dieren = 120 dieren; 12 platen van 10 dieren = 120 dieren).
      OPMERKING: Dieren kunnen ook in het L4-stadium naar FUDR worden verplaatst als het noodzakelijk is dat nageslachtsvorming volledig wordt vermeden, maar dieren mogen niet te vroeg worden verplaatst, omdat dit ertoe zal leiden dat dieren een hoger risico lopen op vulva / intestinale uitsteeksels en de censuur zal verhogen.
    5. Scoor om de dag de levensduur totdat alle dieren als dood of gecensureerd zijn gescensureerd. Verwijder alle dode of gecensureerde dieren van het bord om verwarring te voorkomen en hetzelfde dier te vertellen.
      OPMERKING: Voor FUDR-levensduur kan elk nageslacht worden genegeerd, omdat ze in het L1-stadium zullen arresteren en uiteindelijk zullen sterven.
  3. Levensduur met temperatuurgevoelige steriele mutanten
    1. Bereid NGM-agar platen voor door platen te zaaien met 100 μL bacteriën naar keuze. Zorg er voor consistentie voor dat dezelfde bacteriën in alle replicaties worden gebruikt. Zaai 8-12 platen per stam voor levensduurexperimenten en 2-4 platen per stam om dieren volwassen te maken. Laat de borden een nacht drogen.
    2. Verzamel een gesynchroniseerde populatie van C. elegans met behulp van een standaard bleektest zoals beschreven in stap 1.3 en 1.4. Vergeet niet om dieren te laten groeien bij de beperkende temperatuur van 25 °C om ervoor te zorgen dat dieren steriel zijn.
    3. Verplaats 10-15 dag 1 volwassen dieren op 8-12 borden elk. Begin voor een standaardlevensduur met ~ 120 dieren om ervoor te zorgen dat de steekproefgrootte niet te ver onder de 100 daalt na censuurgebeurtenissen (bijv. Acht platen van 15 dieren = 120 dieren; 12 platen van 10 dieren = 120 dieren).
    4. Scoor om de dag de levensduur totdat alle dieren als dood of gecensureerd zijn gescensureerd. Verwijder alle dode of gecensureerde dieren van het bord om verwarring te voorkomen en hetzelfde dier te vertellen.
      OPMERKING: Bij het omgaan met kortlevende stammen wordt aanbevolen om elke dag de levensduur te scoren, omdat de levensduur bij 25 °C veel korter is en het dynamische bereik dus beperkt is. Volgens de auteurs kunnen dieren na dag 2 weer op 20 °C worden gezet en blijven dieren steriel als het de voorkeur verdient om een levensduur bij 20 °C te scoren.

3. Meten van de gezondheidsspanne in C. elegans

  1. Metingen van locomotorisch gedrag via thrashing
    1. Verzamel een gesynchroniseerde populatie van C. elegans met behulp van een standaard bleektest zoals beschreven in stap 1.3 en 1.4.
    2. Verplaats een kleine kolonie volwassen wormen van dag 1 op een NGM-agarplaat onder een ontleedbare scoop op 10-20 μL M9-oplossing. 10-15 dieren worden aanbevolen als een beheersbaar aantal dieren om te tellen.
    3. Focus op één worm tegelijk en tel het aantal keren dat het monster in 15 s overschakelt van een concave naar bolle formatie. Gebruik een handteller en een timer, zodat de focus op de worm kan worden geplaatst voor de duur van de test.
      OPMERKING: Een video van de plaat kan worden opgenomen voor een grondigere / eenvoudigere analyse. Standaard microscoop oculairbevestigingen zijn bijvoorbeeld beschikbaar voor de meeste smartphones en digitale camera's ($ 15 - $ 30), en deze zijn een geweldige optie voor video-thrashing tegen lage kosten.
    4. Herhaal stap 3.1.3 voor de andere wormen in de vloeistof, met een gemiddelde totale beweeglijkheid voor 10-15 wormen. Voor een hogere steekproefgrootte herhaalt u stap 3.1.2-3.1.4.
    5. Verouder wormen tot de gewenste leeftijd. Vergelijkbare methoden voor levensduurtests die in stappen 2.1-2.3 worden beschreven, kunnen worden gebruikt voor veroudering van wormen. Herhaal stap 3.1.2-3.1.4 om de thrashing op de gewenste leeftijden te testen.
      OPMERKING: Een alternatieve methode voor stap 3.1.2 is om ~30 μL of meer M9-oplossing toe te voegen aan een groep wormen op een plaat. Dit bespaart tijd door wormen handmatig over te brengen, hoewel vanwege de willekeurige kans dat de wormen zich op een enkele plaat bevinden, er geen garantie is dat een groep wormen op een enkel punt op de plaat blijft.
  2. Metingen van de vruchtbaarheid (aantal eieren) in C. elegans
    1. Verzamel een gesynchroniseerde populatie van C. elegans met behulp van een standaard bleektest zoals beschreven in stap 1.3 en 1.4. Testen voor het aantal eieren beginnen in het L4-stadium, dat is ~ 1 dag voorafgaand aan dag 1 volwassenheid (~ 3 dagen bij 15 ° C of ~ 2 dagen bij 20 ° C na L1-arrestatie).
    2. Kies L4-wormen uit op afzonderlijke NGM-agarplaten bezaaid met bacteriën naar keuze. Het wordt aanbevolen om ~ 10-15 dieren te gebruiken voor een vruchtbaarheidstest.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de bacteriën van keuze met 50% te verdunnen (d.w.z. geen verzadigde cultuur) om de zichtbaarheid van het ei in het bacteriële gazon te verbeteren.
    3. Laat dieren 's nachts groeien bij 20 °C. Zorg ervoor dat een nieuw gezaaide partij borden klaar is voor de volgende dag.
    4. Breng op dag 1 van de volwassenheid volwassen wormen over op verse NGM-agarplaten bezaaid met de verdunde bacteriën naar keuze.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om vers gezaaide platen te gebruiken of om platen bij 4 °C te bewaren tot gebruik om dikke bacteriële gazons te voorkomen.
    5. Tel het totale aantal eieren dat op elke NGM-agarplaat is gelegd.
      OPMERKING: Om te helpen bij het scannen van de plaat, kan een raster op het deksel van een bord worden getekend en onder de plaat worden geplaatst die wordt gescoord voor eieren. De plaat kan vervolgens langs de rasterlijnen worden gescand om de oriëntatie te behouden terwijl de plaat wordt verplaatst en te voorkomen dat eieren opnieuw worden verteld.
    6. Herhaal stap 3.2.4-3.2.5 gedurende 7-8 dagen of totdat de eieren niet meer zichtbaar zijn op het bord.
      OPMERKING: Voor dagen 1-3 wanneer de legsnelheden van eieren hoog zijn, wordt aanbevolen om dieren minstens elke 12 uur te verplaatsen en twee keer per dag het aantal eieren te testen. Dit verhoogt echter de hoeveelheid werk en kosten van verbruiksgoederen, en dus kunnen het verplaatsen van dieren en metingen worden beperkt tot één keer per dag, maar er moet voor worden gezorgd dat alle eieren en uitgekomen dieren correct worden geteld. Alle uitgekomen dieren worden voor deze test als eieren geteld.
  3. Meting van de broedgrootte (ontwikkeling) van het nageslacht van C. elegans
    1. Verzamel een gesynchroniseerde populatie van C. elegans met behulp van een standaard bleektest zoals beschreven in stap 1.3 en 1.4. Testen voor broedgrootte beginnen in het L4-stadium, dat is ~ 1 dag voorafgaand aan dag 1 volwassenheid (~ 3 dagen bij 15 ° C of ~ 2 dagen bij 20 ° C na L1-arrestatie).
    2. Kies L4-wormen uit op afzonderlijke NGM-agarplaten bezaaid met bacteriën naar keuze. Het wordt aanbevolen om ~ 10-15 dieren te gebruiken voor een vruchtbaarheidstest.
    3. Laat dieren 's nachts groeien bij 20 °C. Zorg ervoor dat een nieuw gezaaide partij borden klaar is voor de volgende dag.
    4. Breng op dag 1 van de volwassenheid volwassen wormen over op verse NGM-agarplaten bezaaid met bacteriën naar keuze.
    5. Breng elke 12-24 uur (2x per dag of 1x per dag) volwassen wormen over op verse NGM-agarplaten bezaaid met bacteriën naar keuze gedurende 7-8 dagen of totdat nakomelingen niet langer zichtbaar zijn. Bewaar alle borden met eieren op 20 °C.
    6. Herhaal stap 3.3.5 gedurende 7-8 dagen of totdat nakomelingen niet langer zichtbaar zijn. Bewaar alle borden met eieren op 20 °C.
      OPMERKING: Nageslachtsplaten kunnen ook bij 15 °C worden bewaard om de tijd te verlengen voordat ze moeten worden gescoord.
    7. Twee dagen na het overbrengen van wormen, tel het ontwikkelde nageslacht op de platen. Tel ontwikkelende wormen in het L4-stadium (d.w.z. 2 dagen na het uitkomen bij 20 °C) of eerder om ervoor te zorgen dat de F2-generatie (d.w.z. nakomelingen van nakomelingen) de resultaten niet verstoort. Tel alle wormen die leven.
      1. Verwijder alle wormen van de plaat terwijl ze worden geteld. Houd de platen nog eens 1-2 dagen aan voordat u ze opnieuw scoort om ervoor te zorgen dat dieren met vertraagd uitkomen / ontwikkeling niet worden gemist.
    8. Herhaal stap 3.3.7 voor elke verzamelde legplaat.
      OPMERKING: De broedgroottetests kunnen worden uitgevoerd in combinatie met de eiceltelling (stap 3.2) om de arbeid en kosten van verbruiksartikelen te minimaliseren door twee sets gegevens van één experiment te verzamelen. Dit maakt ook een directe vergelijking van de broedgrootte en het aantal eieren binnen dezelfde dieren mogelijk.

4. Het meten van stressbestendigheid bij C. elegans

  1. Metingen van ER-stressgevoeligheid met tunicamycine
    1. Bereid NGM-agarplaten door platen met tunicamycine (zie stap 1.1.7, OPMERKING) te zaaien met 100 μL bacteriën naar keuze.
      LET OP: Handschoenen moeten worden gedragen bij het hanteren van tunicamycine.
    2. Zorg er voor consistentie voor dat dezelfde bacteriën in alle replicaties worden gebruikt. Zaad 8-12 tunicamycineplaten per stam voor overlevingstests en twee tot vier platen zonder tunicamycine per stam om dieren volwassen te maken. Laat de borden een nacht drogen.
    3. Verzamel een gesynchroniseerde populatie van C. elegans met behulp van een standaard bleektest zoals beschreven in stap 1.3 en 1.4.
      OPMERKING: Dieren moeten worden gekweekt op platen zonder tunicamycine tot dag 1 van de volwassenheid, omdat dieren zullen stoppen / sterven op tunicamycine.
    4. Verplaats 10-15 dag 1 volwassen dieren op 8-12 borden elk. Voor een standaard overlevingstest begint u met ~ 120 dieren om ervoor te zorgen dat de steekproefgrootte niet te ver onder de 100 daalt na censuurgebeurtenissen (bijv. Acht platen van 15 dieren = 120 dieren; 12 platen van 10 dieren = 120 dieren).
      OPMERKING: Net als fudr-assays kunnen tunicamycine-overlevingstests worden uitgevoerd zonder dieren te verplaatsen, omdat tunicamycine de dood / arrestatie van L1-dieren veroorzaakt. Bij het uitvoeren van een DMSO-controle zal zich echter nakomelingen ontwikkelen op DMSO-platen, dus dieren moeten dagelijks worden verplaatst of een sterilisatietechniek is vereist (identieke methoden die in sectie 2 voor levensduur worden gebruikt, kunnen worden gebruikt voor overlevingstests).
    5. Overlevingstests worden op dezelfde manier gescoord als de levensduur. Verwijder alle dode of gecensureerde dieren van het bord om verwarring te voorkomen en hetzelfde dier te vertellen.
      OPMERKING: Hoewel het mogelijk is om dieren om de andere dag te scoren, omdat de dood snel optreedt op tunicamycine, wordt het aanbevolen om dagelijks overlevingstests te scoren.
  2. Metingen van mitochondriale/oxidatieve stressgevoeligheid met behulp van paraquat
    1. Bereid NGM-agarplaten voor door platen te zaaien die paraquat bevatten (zie stap 1.1.7; OPMERKING) met 100 μL bacteriën naar keuze.
      LET OP: Handschoenen moeten worden gedragen bij het hanteren van paraquat, omdat dit een gevaar voor het milieu is. Controleer de milieugezondheid en -veiligheid van de instelling op vereisten voor weggooien, omdat veel onderzoeksinstellingen specifieke instructies voor het weggooien van milieugevaren vereisen.
    2. Zorg er voor consistentie voor dat dezelfde bacteriën in alle replicaties worden gebruikt. Zaai 8-12 platen per stam voor overlevingstests en twee tot vier platen zonder paraquat per stam om dieren volwassen te maken. Laat de borden een nacht drogen.
    3. Verzamel een gesynchroniseerde populatie van C. elegans met behulp van een standaard bleektest zoals beschreven in stap 1.3 en 1.4.
      OPMERKING: Vergeet niet om dieren op borden te laten groeien zonder paraquat tot dag 1 van de volwassenheid; het is echter noodzakelijk om een sterilisatietechniek uit te voeren of volwassenen weg te halen van nakomelingen, omdat sommige dieren zich kunnen ontwikkelen tot volwassenheid op paraquatplaten (zie stappen 2.2-2.3).
    4. Verplaats 10-15 dag 1 volwassen dieren op 8-12 borden elk. Voor een standaard overlevingstest begint u met ~ 120 dieren om ervoor te zorgen dat de steekproefgrootte niet te ver onder de 100 daalt na censuurgebeurtenissen (bijv. Acht platen van 15 dieren = 120 dieren; 12 platen van 10 dieren = 120 dieren).
    5. Overlevingstests worden op dezelfde manier gescoord als de levensduur. Verwijder alle dode of gecensureerde dieren van het bord om verwarring te voorkomen en hetzelfde dier te vertellen.
      OPMERKING: Hoewel het mogelijk is om dieren om de andere dag te scoren, omdat de dood snel optreedt op paraquat, wordt het aanbevolen om dagelijks overlevingstests te scoren. Dit geldt met name bij het gebruik van glp-4(bn2) dieren gekweekt bij 25 °C, omdat de dood zeer snel zal optreden.
  3. Metingen van hittestressgevoeligheid (thermotolerantie) met behulp van verhoogde temperaturen
    1. Verzamel een gesynchroniseerde populatie van C. elegans met behulp van een standaard bleektest zoals beschreven in stap 1.3 en 1.4.
    2. Verwarm NGM-agarplaten voor tot 37 °C voordat dieren op platen worden verplaatst door platen gedurende ten minste 1 uur in een incubator van 37 °C te plaatsen.
    3. Verplaats 10-15 dag 1 volwassen dieren op vier tot zes voorverwarmde platen elk. Voor een standaard thermotolerantie, begin met ~ 60 dieren (bijv. Vier platen van 15 dieren = 60 dieren; zes platen van 10 dieren = 60 dieren)
    4. Plaats dieren in een couveuse van 37 °C en scoor elke 2 uur op overlijden. De dood wordt gedefinieerd als dieren die geen beweging vertonen wanneer ze zachtjes worden aangeraakt met een plectrum. Verwijder alle dode of gecensureerde dieren van het bord om verwarring te voorkomen en hetzelfde dier te vertellen.
    5. Zorg ervoor dat platen zo min mogelijk uit de incubator van 37 °C worden verwijderd, omdat platen die tijdens het scoren langdurig bij omgevingstemperatuur worden gelaten, de thermotolerantieresultaten zullen veranderen.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om slechts één stam tegelijk uit te trekken om te scoren, omdat de temperatuur van de agar niet dramatisch mag veranderen in de tijd die nodig is om één stam te scoren.
    6. Mediane thermotolerantie wordt over het algemeen bereikt in 7-9 uur; zorg dus voor een goede test op 7 h, 9 h en 11 h.
      OPMERKING: Hoewel 1-5 uur kan worden overgeslagen, vanwege de variabiliteit van incubators, de dikte van platen en andere verstorende factoren in elk laboratorium, is het belangrijk dat de timing zorgvuldig wordt getitreerd in elk laboratorium als tijdspunten zijn gepland om te worden overgeslagen. Zie referentie 44 voor een volledige gids over thermotolerantie.
    7. U kunt ook de thermotolerantietest uitvoeren bij 34 °C in plaats van 37 °C.
      OPMERKING: Mediane thermotolerantie bij 34 °C treedt veel later op (10-14 uur in dit onderzoek), waardoor thermotolerantietests 's avonds laat kunnen worden bereid (geplaatst in een incubator van 34 °C) en dat de score de volgende dag vroeg kan beginnen. Dit zorgt voor ~ 8 uur continue scoren in plaats van de typische periode van 12 uur die nodig is voor een thermotolerantietest van 37 ° C.

Representative Results

C. elegans zijn een uitstekend modelorganisme voor verouderingsonderzoek vanwege een grote meerderheid van verouderingsmechanismen die bij mensen worden bewaard. Belangrijk is dat ze zeer lage kosten hebben in onderhoud en experimenten met minimale vereisten voor apparatuur en verbruiksartikelen, waardoor ze een felbegeerd modelsysteem zijn voor instellingen met beperkte middelen. Bovendien maakt een overvloed aan eenvoudige testen met ondiepe leercurves ze een uitstekend systeem voor zelfs de jongste onderzoeker met weinig tot geen ervaring. Al deze factoren in combinatie met de krachtige genetica van C. elegans , waaronder het gemak van genoombewerking, duizenden beschikbare mutanten en transgene dieren tegen nominale kosten, en beschikbare RNAi-bibliotheken voor genetische knockdown van vrijwel elk gen, maken ze een ideaal systeem voor niet-gegradueerde instellingen. Hier worden enkele van de goedkoopste methoden om veroudering in C. elegans te bestuderen onderzocht, voornamelijk gericht op testen met minimale apparatuur en verbruikskosten, evenals ondiepe leercurves. In feite werd het geheel van de protocollen en gegevensverzameling geschreven / uitgevoerd door junior onderzoekers met <5 maanden onderzoekservaring, meestal niet-gegradueerde studenten.

Levensduurstudies bij C. elegans zijn heel eenvoudig vanwege de korte levensduur van dieren, variërend van 14-20 dagen. Belangrijk is dat levensduurtests sterk gestandaardiseerd zijn en alleen een incubator, een standaard dissectiemicroscoop, een standaard wormpick en verbruiksartikelen vereisen voor het bereiden van NGM-agarplaten. Misschien wel het meest kostenonvriendelijke aspect van levensduurmetingen in C. elegans zijn verbruiksartikelen vereist. Dit komt omdat C. elegans hermafrodieten zijn die zichzelf bevruchten; daarom moeten volwassenen die worden gevolgd voor langleventests dagelijks worden verwijderd van nakomelingen. Dieren kunnen echter worden gesteriliseerd door ze bloot te stellen aan FUDR of door mutanten te gebruiken, zoals de temperatuurgevoelige kiembaanloze glp-4 (bn2) mutant gekweekt bij de prohibitieve 25 °C om de hoeveelheid benodigde verbruiksartikelen te verminderen 30,31,32. Hier werden levensduurtests uitgevoerd met FUDR of met de glp-4 (bn2) kiembaanloze mutanten, die vergelijkbare resultaten laten zien als standaardlevensduur uitgevoerd op niet-steriele dieren. Hoewel de levensduur van het wildtype niet identiek is vanwege de effecten van FUDR45 of groei bij 25 °C op levensduur2, vertoont het kortlevende hsf-1 knockdown-dier betrouwbaar een significante afname van de levensduur voor alle omstandigheden (figuur 1). hsf-1 codeert voor de heat-shock factor-1 transcriptiefactor, die betrokken is bij de regulatie van de thermische stressrespons, en de knockdown ervan resulteert in een significante afname van de levensduur38,46.

Hoewel een lang leven een belangrijke factor is om te overwegen in de verouderingsbiologie, correleert een lang leven vaak niet met een verhoogde gezondheid, zelfs niet in C. elegans47. Daarom bieden we als complementaire benadering verschillende methoden om de gezondheid van organismen te meten, waaronder reproductieve gezondheid, motorisch gedrag en stressbestendigheid. Reproductieve gezondheid kan op twee manieren worden gemeten. Ten eerste zullen metingen van het aantal eieren een directe meting geven van hoeveel eieren worden gelegd door een enkele zelfbevruchtende hermafrodiet. Omdat dieren echter meer eicellen produceren dan sperma, worden sommige onbevruchte eieren die nooit levensvatbare nakomelingen zouden produceren ook gelegd48. Daarom, om een beter begrip te krijgen van het ware voortplantingsvermogen van een dier, bieden metingen van de broedgrootte een maat voor hoeveel levensvatbare nakomelingen worden geproduceerd. Vaak kan verhoogde stressbestendigheid het voortplantingsvermogen verminderen, mogelijk als gevolg van het inherente effect van waargenomen stress op de voortplanting49. Evenzo wordt een significante afname van zowel het aantal gelegde eieren als de broedgrootte gevonden bij hsf-1 overexpressiedieren in vergelijking met wildtypecontroles (figuur 2A, B). In feite vertonen sommige hsf-1 overexpressiedieren volledige steriliteit, wat bewijs levert dat reproductieve gezondheid omgekeerd gecorreleerd kan zijn met een lang leven.

Hoewel reproductieve gezondheid belangrijk is voor het begrijpen van de gezondheid van de kiembaan, functionele meiose en reproductieve capaciteit, is er in het algemeen geen directe correlatie tussen levensduur en broedgrootte50. Dus, als een complementaire benadering, wordt locomotorisch gedrag aangeboden als een gouden standaardmethode voor het testen van C. elegans healthspan tijdens het ouder worden51. Er zijn veel methoden om locomotorisch gedrag te meten, maar de meeste methoden vereisen geavanceerde camera's, trackingsoftware of dure chemicaliën. Daarentegen vereisen thrashing-assays vrijwel geen apparatuur die verder gaat dan waar een standaard C. elegans-laboratorium mee is uitgerust: ontleedmicroscoop, wormpick, pipet en verbruiksartikelen voor het maken van NGM-agarplaten. Thrashing-percentages bieden een betrouwbare methode voor het meten van de gezondheid tijdens het ouder worden, zoals gemeten door een significante afname van thrashing bij oude dieren in vergelijking met jonge dieren (figuur 2C).

Ten slotte is survival to stress assays een extra fysiologische meting van veerkracht. Het vermogen om stressreacties te activeren neemt over het algemeen af tijdens het verouderingsproces, waardoor dieren minder veerkrachtig en gevoeliger voor stress worden. Stressbestendigheid kan dus worden gebruikt als een betrouwbare proxy voor de gezondheid van organismen. Hier worden methoden aangeboden voor het onderzoeken van de gevoeligheid voor 1) ER-stress als reactie op blootstelling aan tunicamycine, een chemisch middel dat N-gebonden glycosylering blokkeert en resulteert in accumulatie van verkeerd gevouwen eiwitten in de ER; 2) mitochondriale / oxidatieve stress door blootstelling aan paraquat, een chemisch agens dat superoxidevorming in mitochondriën induceert; en 3) thermische stress door blootstelling aan verhoogde temperaturen. Voor tunicamycine en paraquat assays wordt het medicijn opgenomen in de NGM-agarplaat tijdens de plaatproductie. Voor hoge concentraties tunicamycine ontwikkelt zich over het algemeen geen nakomelingen en daarom hoeven sterilisatietechnieken niet te worden gebruikt. Het hier gepresenteerde protocol beveelt 25 ng / μL aan als een uiteindelijke concentratie van tunicamycine, maar voor mensen met beperkte middelen toont 10 ng / μL ook een significante vermindering van de overleving (figuur 3A). Beide concentraties beperken de ontwikkeling van nakomelingen en er zijn dus geen sterilisatiemethoden nodig, hoewel de DMSO-controle een sterilisatietechniek of verplaatsing van dieren op nieuwe platen vereist. Dit komt omdat tunicamycine-toxiciteit de ontwikkeling van nakomelingen voorkomt, maar DMSO is vrijwel niet-toxisch, waardoor nakomelingen zich volledig kunnen ontwikkelen wanneer ze op tunicamycine worden gekweekt.

Voor paraquat-assays is een sterilisatietechniek of beweging van dieren vereist, omdat paraquatbehandeling niet voorkomt dat nakomelingen zich ontwikkelen tot volwassenheid. Hoge niveaus van paraquat (4 mM) verkorten de levensduur aanzienlijk, terwijl lage niveaus van paraquat (0,25 mM) de levensduur verlengen als gevolg van een hormetisch effect (figuur 3B), in overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten52. Ten slotte vereisen thermotolerantietests alleen een incubator die 30-37 °C kan bereiken en zijn er geen extra reagentia nodig. Overexpressie van hsf-1 verhoogt de thermotolerantie bij 37 °C (figuur 3C) zoals eerder gepubliceerd53. Zoals anderen echter eerder en uit de huidige gegevens hebben aangetoond, is het grootste probleem met thermotolerantietests hun variabiliteit. Veel factoren kunnen bijdragen aan variabiliteit binnen thermotolerantietests, waaronder verschillen tussen incubators en de tijd die dieren buiten de incubator doorbrengen terwijl ze elk uur thermotolerantie scoren. Voor een grondige richtlijn van thermotolerantie, zie de referentie 41.

Figure 1
Figuur 1: Vergelijking van levensduurmetingen met en zonder sterilisatie. (A) Levensduur van wild-type N2-nematoden gekweekt op NGM-agarplaten bezaaid met lege vector (ev) of hsf-1 RNAi-bacteriën bij 20 °C. Dieren werden op dag 1, 3, 5 en 7 van de volwassenheid uit het nageslacht verwijderd. (B) Levensduur van in het wild levende N2-nematoden gekweekt op NGM-agar-FUDR-platen bezaaid met lege vector (ev) of hsf-1 RNAi-bacteriën bij 20 °C. Dieren werden volwassen gemaakt op standaard ev- of hsf-1 RNAi-platen en vervolgens verplaatst naar FUDR-platen op dag 1 van de volwassenheid. C) Levensduur van glp-4(bn2) mutante dieren gekweekt op NGM-agar platen bezaaid met lege vector (ev) of hsf-1 RNAi bij 25 °C. Voor alle omstandigheden werden dieren elke 2 dagen gescoord voor de dood totdat alle dieren als dood of gecensureerd werden geregistreerd. Dieren met zakken, uitsteeksel of explosie van de vulva, of dieren die langs de zijkanten van de platen kropen en uitgedroogd waren, werden gecensureerd. Alle statistieken zijn uitgevoerd met behulp van Log-Rank Mantel-Cox-tests en zijn te vinden in tabel 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Aantal eieren, broedgrootte en thrashing als metingen van de gezondheidsspanne. (A) Thrashing-assays werden uitgevoerd op glp-4 (bn2) mutante dieren gekweekt op NGM-agar-platen bezaaid met lege vector bij 25 ° C op dag 1 (blauw), dag 4 (rood) en dag 9 (groen) dieren. Thrashing werd gescoord bij dieren die in M9-oplossing op een NGM-agarplaat werden geplaatst, video-opnamen met een standaard smartphonecamera gemonteerd op een oculair van een standaard ontleedbare scope en thrashing scoorde in slow motion voor nauwkeurigheid. n = 15 dieren per aandoening. (B) Het aantal eieren werd gemeten bij wilde N2 (blauw) en sur-5p::hsf-1 (rode) dieren. Dieren werden gekweekt bij 20 °C en verplaatst naar verse borden, en eieren werden elke 12 uur geteld. Het totaal aantal gelegde eieren werd opgeteld. n = 7 dieren voor wildtype en 9 dieren voor sur-5p::hsf-1. C) Broedproeven werden gemeten bij dezelfde dieren als (B), waar eieren gedurende 2 dagen bij 20 °C werden gekweekt om uit te komen, en alle uitgekomen eieren werden geteld. = p < 0,001 berekend met behulp van niet-parametrische Mann-Whitney-tests. Elke stip vertegenwoordigt een enkel dier en lijnen vertegenwoordigen het mediaan- en interkwartielbereik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Stressbestendigheid als proxy voor de gezondheid van het organisme. (A) Overlevingstest van N2-dieren gekweekt op de lege vector RNAi-bacteriën bij 20 °C. De dieren werden verplaatst naar platen met 1% DMSO, 10 ng/μL tunicamycine (TM) of 25 ng/μL TM op dag 1 van de volwassenheid. B) Overlevingstest van N2-dieren die zijn gekweekt op de lege vector RNAi-bacterie bij 20 °C. Dieren werden uit het luik gekweekt op platen met water, 0,25 mM paraquat (PQ) of 4 mM PQ. Voor A-B werden dieren elke 2 dagen gescoord voor de dood totdat alle dieren als dood of gecensureerd werden geregistreerd. Dieren met zakken, uitsteeksel of explosie van de vulva, of dieren die langs de zijkanten van de platen kropen en uitgedroogd waren, werden gecensureerd. Alle statistieken werden uitgevoerd met behulp van Log-Rank Mantel-Cox-tests (tabel 2). C) Gepoolde gegevens van alle thermotolerantietests van 37 °C voor dieren van het wildtype N2 versus overexpressie van hsf-1 (sur-5p::hsf-1). Gegevens worden weergegeven als percentage levend op tijd = 9 uur van een thermotolerantietest, waarbij elke lijn een gematcht experiment vertegenwoordigt dat op dezelfde dag is uitgevoerd. Dieren werden gekweekt op de lege vector RNAi-bacteriën bij 20 °C en verplaatst naar 37 °C op dag 1 van de volwassenheid voor de test. n = 60 dieren per stam per duplo. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Reagens Recept
Bleekoplossing 1,8% (v/v) natriumhypochloriet, 0,375 M KOH
Carbenicilline 100 mg/ml stamoplossing (1000x) in water. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden of -20 °C voor langdurige opslag
Fudr 10 mg/ml oplossing in water. Bewaren bij -20 °C.
Iptg 1 M oplossing in water.
Lysogenie Bouillon (LB) In dit protocol werd commerciële LB gebruikt (zie Tabel van Materialen), maar alle standaard LB zelfgemaakte recepten met Bacto-trypton, gistextract en NaCl zijn voldoende.
M9-oplossing 22 mM KH2PO4 monobasisch, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode GroeiMedia (NGM) 1 mM CaCl2, 5 μg/ml cholesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl
NGM RNAi platen 1 mM CaCl2, 5 μg/ml cholesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Pepton, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml carbenicilline/ampicilline. Bewaren bij 4 °C in het donker gedurende maximaal 3 maanden
NGM RNAi DMSO 1 mM CaCl2, 5 μg/ml cholesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Pepton, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml carbenicilline/ampicilline; 1% DMSO
(controle op tunicamycine)
NGM RNAi TM 1 mM CaCl2, 5 μg/ml cholesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Pepton, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml carbenicilline/ampicilline; 1% DMSO, 25 ng/μL tunicamycine
Paraquat 400 mM oplossing in water – moet vers worden bereid
Tetracycline 10 mg/ml stockoplossing (500x) in 100% ethanol. Bewaren bij -20 °C
Tunicamycine 2,5 mg/ml stamoplossing in 100% DMSO. Bewaren bij -80 °C voor langdurige opslag. Dit is een 100x oplossing (25 ng/μL werkoplossing)

Tabel 1. Recepten voor reagentia en media voor protocollen.

Corresponderend deelvenster Afbeelding Stam, Behandeling Mediane levensduur # Sterfgevallen/# Totaal p-waarde
(Log-Rank)
1a N2, vector RNAi, 20 °C 17 74/120 --
N2, hsf-1 RNAi, 20 °C 11 65/120 <0.001
1b N2, vector RNAi, FUDR, 20 °C 19 120/120 --
N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C 11 116/120 <0.001
1c N2, glp-4(bn2), vector RNAi, 25 °C 13 115/121 --
N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C 4 120/120 < 0,001
2A N2, vector RNAi, 20 °C, 1% DMSO 19 85/120 --
N2, vector RNAi, 20 °C, 10 ng/μL tunicamycine 15 109/120 <0.001
N2, vector RNAi, 20 °C, 25 ng/μL tunicamycine 12 117/120 <0.001
2B N2, vector RNAi, 20 °C 19 84/120 --
N2, vector RNAi, 20 °C, 0,25 mM paraquat 24 91/120 <0.001
N2, vector RNAi, 20 °C, 4 mM paraquat 6 50/120 <0.001

Tabel 2. Statistieken voor levensduur en stressbestendigheid.

Discussion

Levensduur, meestal eenvoudig gedefinieerd als de duur van het leven, is een duidelijk binair fenomeen in de meeste organismen - een organisme leeft of niet. Een lang leven correleert echter niet altijd met de gezondheid van een organisme. Bijvoorbeeld, mitochondriale hormesemodellen waarbij blootstelling aan mitochondriale stress de levensduur dramatisch verlengt, zijn over het algemeen enkele van de langstlevende dieren, maar vertonen een groeiachterstand en een verminderde metabole functie37,54. Evenzo vertonen dieren met hyperactieve endoplasmatische reticulumstressreacties ook bepaald gedrag en fenotypen die kunnen worden gecorreleerd met verminderde gezondheid, ondanks het feit dat ze de eiwithomeostase en levensduur dramatisch hebben verbeterd36,49. Ten slotte zijn veel levensduurparadigma's in modelorganismen, waaronder verhoogde HSF-1-functie55, verhoogde XBP-1-functie56 en veranderde FoxO-signalering57, allemaal gecorreleerd met een verhoogd risico op kanker, en het is onbetwistbaar dat een langere levensduur niet gunstig is als een organisme in een constante strijd is met kanker en andere gezondheidsproblemen. Daarom kan een lang leven geen op zichzelf staande meting zijn in de verouderingsbiologie.

Het concept van healthspan is dus een groeiend veld in de verouderingsbiologie. Healthspan, losjes gedefinieerd als de periode van het leven dat men gezond is, is moeilijker vast te stellen dan een lang leven. In tegenstelling tot een lang leven is het concept van "gezondheid" echter ingewikkeld, omdat er veel verschillende uitlezingen zijn voor de gezondheid van organismen: op het niveau van het organisme zijn er spierfunctie / kracht, neuronale / cognitieve functie, reproductieve gezondheid, enz.; op cellulair niveau zijn er eiwithomeostase, lipidehomeostase, glucosehomeostase, metabolisme, enz. In 2014 hebben ouder wordende biologen biologische kenmerken van veroudering definitief gekarakteriseerd met de gestructureerde definitie dat het iets moet zijn dat van nature afbreekt tijdens het ouder worden en experimenteel kan worden gewijzigd, zodat experimentele exacerbatie veroudering zou moeten versnellen en experimentele interventie veroudering zou moeten vertragen. Deze negen kenmerken van veroudering omvatten genomische instabiliteit, telomeerverloop, epigenetische veranderingen, verlies van eiwithomeostase (proteostase), stamceluitputting, veranderde intercellulaire signalering, mitochondriale disfunctie, gedereguleerde nutriëntdetectie en cellulaire senescentie58. Sindsdien beweren talloze studies dat andere factoren moeten worden opgenomen, waaronder extracellulaire eiwitten en systemische fysiologie zoals immuniteit en ontsteking59. Uiteindelijk schrijft de complexe definitie van gezondheidspan voor dat de gezondheid van organismen wordt gemeten met behulp van meerdere verschillende methoden.

Daarom worden in dit manuscript meerdere methoden gepresenteerd om verschillende aspecten van de gezondheid te meten met behulp van het nematodenmodel, C. elegans. We testen locomotorisch gedrag met behulp van thrashing assays, reproductieve gezondheid met behulp van het aantal eieren en de broedgrootte, en gevoeligheid voor stress. Inderdaad, locomotorisch gedrag is een gouden standaardmethode voor het meten van de gezondheid, omdat organismen een aanzienlijk verlies van beweeglijkheid en beweging vertonen tijdens het ouder worden51. Verlies van locomotorisch gedrag kan worden toegeschreven aan meerdere kenmerken van veroudering, omdat de spierfunctie bij C. elegans afhankelijk is van een goede proteostase60, mitochondriale disfunctie61 en neuron-spiersignalering62. Hoewel dit manuscript zich richt op één meting van locomotorisch gedrag, is het belangrijk op te merken dat er veel andere methoden bestaan, waaronder beweeglijkheid van dieren op een massieve agarplaat, respons op aanraking51 en chemotaxis-assays63. Deze methoden vereisen echter over het algemeen meer geavanceerde opnameapparaten, het gebruik van wormvolgsoftware of het gebruik van dure, gevaarlijke of vluchtige chemicaliën, die allemaal onbetaalbaar kunnen zijn in sommige onderzoeksinstellingen.

Bovendien worden testen voor het aantal eieren en de broedgrootte gepresenteerd als een methode om de reproductieve gezondheid te meten en als de eenvoudigste methode om celdeling bij volwassen wormen te meten, omdat volwassen wormen post-mitotisch zijn en alleen geslachtscellen en embryo's celdeling ondergaan binnen een volwassen worm64. Als een maat voor celdeling kan reproductieve gezondheid relevant zijn voor de verouderingskenmerken van cellulaire senescentie en stamceluitputting. Reproductieve gezondheid kan worden beïnvloed door vele factoren, waaronder pathogene infectie65 of blootstelling aan stress49, hoewel er geen directe correlatie is tussen reproductieve gezondheid en levensduur. In feite vertonen sommige langlevende dieren een significante afname van broedgrootte49, en het is zelfs mogelijk dat er een omgekeerde correlatie bestaat tussen levensduur en broedgrootte50. Dit is geen fenomeen dat specifiek is voor C. elegans, omdat schadelijke effecten van reproductie op de levensduur al lang zijn waargenomen bij mensen66, gezelschapshonden67 en muizen68. Toch bieden we het aantal eieren en de broedgrootte als een betrouwbare en goedkope methode voor het meten van reproductieve gezondheid met de kanttekening dat reproductieve gezondheid mogelijk niet correleert met een lang leven of gezondheidsspanne.

Ten slotte worden overlevingstests aangeboden als een indirecte maat voor de gezondheid van het organisme. Belangrijk is dat cellulaire stressreacties, inclusief respons op thermische stress69 en ER-stress35, snel afnemen tijdens het verouderingsproces en direct relevant zijn voor het verouderingskenmerk van proteostase70,71. Hyperactiverende stressreacties kunnen daarentegen de levensduur aanzienlijk verlengen door de veerkracht tegen stress te bevorderen 35,37,38. Hoewel deze studie zich richt op de eenvoudigste en goedkoopste methoden, bestaat er een groot aantal alternatieve methoden voor stressbestendigheidstests voor thermotolerantie41 en oxidatieve stress66, die elk een andere set apparatuur en verbruiksartikelen vereisen. Naast eenvoudige blootstellingsstudies aan stressoren, kunnen andere fysiologische methoden worden uitgevoerd, afhankelijk van de toegang tot apparatuur. Een extracellulaire fluxanalysator kan bijvoorbeeld de mitochondriale functie en cellulaire ademhaling controleren73; fluorescerende dissectiemicroscopen maken metingen van transcriptionele melders mogelijk voor activering van stressrespons20; en hoge resolutie samengestelde of confocale microscopen kunnen worden gebruikt om organelmorfologie te meten met fluorescerende sondes voor mitochondriën74, het endoplasmatisch reticulum 75,76 en actinecytoskelet77.

Als een laatste waarschuwingsverhaal voor metingen van de levensduur, terwijl chemische en genetische methoden voor het steriliseren van wormen worden aangeboden om de kosten aanzienlijk te verlagen, is het belangrijk op te merken dat beide de levensduur direct kunnen beïnvloeden. Eerder is bijvoorbeeld gemeld dat blootstelling aan FUDR zowel de levensduur als de thermotolerantiebeïnvloedt 45. En hoewel de glp-4(bn2)-mutant zelf geen directe effecten heeft op de levensduur, is groei bij 25 °C een milde hittestress33,34 en kan dus de levensduur beïnvloeden2. Er bestaan andere methoden voor het steriliseren van C. elegans, waaronder auxine-gemedieerde steriliteit78 of alternatieve temperatuurgevoelige sperma-deficiënte mutanten79. Alle methoden hebben echter enkele kanttekeningen en er moet voor worden gezorgd dat de minst schadelijke test wordt gebruikt voor de wetenschappelijke behoeften van elk laboratorium. Een laatste beperking van langlevenstudies is potentiële variabiliteit die kan optreden als gevolg van lage steekproefgroottes of gewoon door een objectieve fout van de onderzoeker. Dit kan worden omzeild omdat nieuwe technologieën worden geboren in geautomatiseerde levensduurtechnologieën80, maar nogmaals, deze systemen zijn duur en vereisen enige technische en computationele apparatuur en vaardigheden. Uiteindelijk is de verzameling methoden die hier wordt aangeboden een betrouwbare set hulpmiddelen die snel kunnen worden aangepast en geleerd in bijna elke instelling en een solide basis bieden voor verouderingsbiologie.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Acknowledgments

G.G. wordt ondersteund door T32AG052374 en R.H.S. wordt ondersteund door R00AG065200 van het National Institute on Aging. We bedanken de CGC (gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) voor de stammen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APEX IPTG Genesee 18-242 for RNAi
Bacto Agar VWR 90000-764 for NGM plates
Bacto Peptone VWR 97064-330 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin VWR 76345-522 for RNAi
Cholesterol VWR 80057-932 for NGM plates
DMSO VWR BDH1115-1LP solvent for drugs
LB Broth VWR 95020-778 for LB
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-132 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride VWR 97061-566 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
S7E Dissecting Scope Leica 10450840 Standard dissecting microscope
Sodium Chloride VWR EM-SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium hypochlorite VWR RC7495.7-32 for bleach solution
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tetracycline hydrochloride VWR 97061-638 for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing and Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  3. Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).
  4. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  5. Lithgow, G. J., White, T. M., Melov, S., Johnson, T. E. Thermotolerance and extended life-span conferred by single-gene mutations and induced by thermal stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7540-7544 (1995).
  6. Epel, E. S., Lithgow, G. J. Stress biology and aging mechanisms: toward understanding the deep connection between adaptation to stress and longevity. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 69, Suppl 1 10-16 (2014).
  7. Luo, Y. Long-lived worms and aging. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 9 (2), 65-69 (2004).
  8. Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
  9. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  12. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  13. Reboul, J., et al. Open-reading-frame sequence tags (OSTs) support the existence of at least 17,300 genes in C. elegans. Nature Genetics. 27 (3), 332-336 (2001).
  14. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).
  15. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  16. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
  17. Pang, S., Curran, S. P. Adaptive capacity to bacterial diet modulates aging in C. elegans. Cell Metabolism. 19 (2), 221-231 (2014).
  18. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLOS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
  19. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes & Development. 23 (4), 496-511 (2009).
  20. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61001 (2020).
  21. Xiao, R., et al. RNAi interrogation of dietary modulation of development, metabolism, behavior, and aging in C. elegans. Cell Reports. 11 (7), 1123-1133 (2015).
  22. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  23. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  24. Kim, H. -M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in C. elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106 (2019).
  25. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
  26. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19648/ (2006).
  27. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  28. Kaymak, E., et al. Efficient generation of transgenic reporter strains and analysis of expression patterns in Caenorhabditis elegans using Library MosSCI. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 245 (9), 925-936 (2016).
  29. Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (82), (2013).
  30. Rastogi, S., et al. Caenorhabditis elegans glp-4 encodes a valyl aminoacyl tRNA synthetase. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2719-2728 (2015).
  31. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), Cambridge, England. 755-766 (1992).
  32. Santi, D. V., McHenry, C. S. 5-Fluoro-2′-Deoxyuridylate: covalent complex with thymidylate synthetase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69 (7), 1855-1857 (1972).
  33. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), 270-276 (1994).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  35. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  36. Higuchi-Sanabria, R., et al. Divergent nodes of non-autonomous UPRER signaling through serotonergic and dopaminergic neurons. Cell Reports. 33 (10), 108489 (2020).
  37. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  38. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  39. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  40. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  41. Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  42. Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the effects of bacteria on C. Elegans behavior using an egg retention assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e51203 (2013).
  43. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a neuropeptide gene on behavioral states in Caenorhabditis elegans egg-laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  44. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), San Diego, Calif. 450-457 (2014).
  45. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset). PLOS ONE. 9 (1), 85964 (2014).
  46. Hsu, A. -L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
  47. Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 277-286 (2015).
  48. Hodgkin, J., Barnes, T. M. More is not better: brood size and population growth in a self-fertilizing nematode. Proceedings. Biological Sciences. 246 (1315), 19-24 (1991).
  49. Ozbey, N. P., et al. Tyramine Acts Downstream of Neuronal XBP-1s to coordinate inter-tissue UPRER activation and behavior in C. elegans. Developmental Cell. 55 (6), 754-770 (2020).
  50. Lee, Y., et al. Inverse correlation between longevity and developmental rate among wild C. elegans strains. Aging. 8 (5), Albany NY. 986-994 (2016).
  51. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  52. Lee, S. -J., Hwang, A. B., Kenyon, C. Inhibition of respiration extends C. elegans life span via reactive oxygen species that increase HIF-1 activity. Current Biology: CB. 20 (23), 2131-2136 (2010).
  53. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science. 346 (6207), 360-363 (2014).
  54. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  55. Carpenter, R. L., Gökmen-Polar, Y. HSF1 as a cancer biomarker and therapeutic target. Current Cancer Drug Targets. 19 (7), 515-524 (2019).
  56. Chen, S., et al. The emerging role of XBP1 in cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 127, 110069 (2020).
  57. Yadav, R. K., Chauhan, A. S., Zhuang, L., Gan, B. FoxO transcription factors in cancer metabolism. Seminars in Cancer Biology. 50, 65-76 (2018).
  58. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  59. Kennedy, B. K., et al. Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell. 159 (4), 709-713 (2014).
  60. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  61. Hewitt, J. E., et al. Muscle strength deficiency and mitochondrial dysfunction in a muscular dystrophy model of Caenorhabditis elegans and its functional response to drugs. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
  62. Gao, S., Zhen, M. Action potentials drive body wall muscle contractions in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2557-2562 (2011).
  63. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50069 (2013).
  64. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
  65. Madhu, B. J., Salazar, A. E., Gumienny, T. L. Caenorhabditis elegans egg-laying and brood-size changes upon exposure to Serratia marcescens and Staphylococcus epidermidis are independent of DBL-1 signaling. microPublication Biology. 2019, (2019).
  66. Westendorp, R. G., Kirkwood, T. B. Human longevity at the cost of reproductive success. Nature. 396 (6713), 743-746 (1998).
  67. Hoffman, J. M., Creevy, K. E., Promislow, D. E. L. Reproductive capability is associated with lifespan and cause of death in companion dogs. PLOS ONE. 8 (4), 61082 (2013).
  68. Garratt, M., Try, H., Smiley, K. O., Grattan, D. R., Brooks, R. C. Mating in the absence of fertilization promotes a growth-reproduction versus lifespan trade-off in female mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15748-15754 (2020).
  69. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the heat shock response is a programmed event at the onset of reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  70. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A futile battle? Protein quality control and the stress of aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  71. Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Hijacking cellular stress responses to promote lifespan. Frontiers in Aging. 3, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fragi.2022.860404 (2022).
  72. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring oxidative stress in Caenorhabditis elegans: paraquat and juglone sensitivity assays. Bio-protocol. 7 (1), 2086 (2017).
  73. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: mitochondrial function using the seahorse system. Methods in molecular biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).
  74. Daniele, J. R., et al. High-throughput characterization of region-specific mitochondrial function and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749 (2017).
  75. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  76. Daniele, J. R., et al. UPRER promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Science Advances. 6 (1), 1441 (2020).
  77. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).
  78. Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).
  79. Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (4), 145-156 (1994).
  80. Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).

Tags

Genetica C. elegans stress veroudering ongevouwen eiwitrespons endoplasmatisch reticulum mitochondriën hitteschokrespons
Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te <em>meten in Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro Torres, T., Moaddeli, D.,… More

Castro Torres, T., Moaddeli, D., Averbukh, M., Coakley, A. J., Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (183), e64091, doi:10.3791/64091 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter