Caenorhabditis elegans fungerar som ett utmärkt modellsystem med robusta och billiga metoder för att kartlägga hälsa, livslängd och motståndskraft mot stress.
Upptäckten och utvecklingen av Caenorhabditis elegans som modellorganism var inflytelserik inom biologin, särskilt inom åldrandet. Många historiska och samtida studier har identifierat tusentals livslängdsförändrande paradigmer, inklusive genetiska mutationer, transgent genuttryck och hormesis, en fördelaktig, låggradig exponering för stress. Med sina många fördelar, inklusive en kort livslängd, enkelt och billigt underhåll och helt sekvenserat genom med homologi till nästan två tredjedelar av alla mänskliga gener, har C. elegans snabbt antagits som en enastående modell för stress- och åldrandebiologi. Här kartläggs flera standardiserade metoder för att mäta livslängd och hälsospann som enkelt kan anpassas till nästan vilken forskningsmiljö som helst, särskilt de med begränsad utrustning och medel. Den otroliga nyttan av C. elegans presenteras, vilket belyser förmågan att utföra kraftfulla genetiska analyser inom åldrandebiologi utan att behöva omfattande infrastruktur. Slutligen diskuteras begränsningarna för varje analys och alternativa tillvägagångssätt för övervägande.
Sedan publiceringen av ‘The genetics of Caenorhabditis elegans‘, en av de mest inflytelserika artiklarna av Sydney Brenner 1974, har denna mikroskopiska mask ansetts vara ett enastående modellsystem för att studera biologiska mysterier1. 1977 publicerade Michael R. Klass metoden för att mäta livslängden hos C. elegans och etablerade detta modellsystem för att studera åldrande2. Undersökningen för att förstå sambandet mellan stress och livslängd har börjat med identifieringen av en enda mutation i ålder-1-genen, vilket resulterade i en livslängdsförlängning i C. elegans3. Dessutom har samtida studier identifierat andra livslängdshöjande mutationer, som avslöjade långlivade mutanta maskar som uppvisar ökad motståndskraft mot stress 4,5,6. Med sina många fördelar, inklusive en kort livslängd, enkelt underhåll, helt sekvenserat genom som innehåller homologi till cirka två tredjedelar av alla mänskliga sjukdomsframkallande gener, tillgänglighet och lätthet att använda RNA-interferensbibliotek (RNAi) och fysiologisk likhet med människor 7,8,9, har C. elegans snabbt antagits som en enastående modell för stress- och åldrandebiologi.
De kanske största verktygen för C. elegans är dess extremt låga underhållskostnader, enkla experiment och de olika genetiska verktyg som finns tillgängliga för studier. C. elegans odlas vanligtvis på ett fast agarmedium med en E. coli-matkälla. Två vanliga E. coli-stammar är standard OP50, en B-stam som kanske är den vanligaste10, och HT115, en K-12-stam som främst används för RNAi-experiment11,12. HT115 K-12-stammen bär en deletion i RNAIII RNase, en mutation som är väsentlig för RNAi-metoder, där plasmider som uttrycker dsRNA motsvarande enskilda C. elegans-gener används. DSRNA-matningsvektorerna möjliggör robust knockdown av C. elegans-gener utan behov av komplexa korsningar eller genomredigering, eftersom bakterier som bär dessa plasmider kan matas direkt till nematoder. Tusentals av dessa bakteriella RNAi-vektorer finns i HT115-bakgrunden, inklusive det mest populära Vidal RNAi-biblioteket med >19 000 enskilda RNAi-konstruktioner13 och Ahringer RNAi-biblioteket med 16 757 RNAi-konstruktioner14. Emellertid, OP50 och HT115 bakteriedieter har stora skillnader i metabolisk profil, inklusive skillnader i Vitamin B1215,16. Därför rekommenderas att utföra alla experiment på en enda bakteriekälla, om möjligt, för att undvika gen-dietinteraktioner som kan introducera flera förvirrande faktorer som tidigare beskrivits 17,18,19. På grund av sin lätthet upprätthålls djur på OP50 för alla experimentella förhållanden som beskrivs här, men alla experiment utförs på HT115 som tidigarebeskrivits 20. I korthet bibehålls djuren vid OP50 och överförs till HT115 efter synkronisering (efter blekning) för konsistens mellan RNAi kontra icke-RNAi-experiment. Alternativt kan en RNAi-kompetent OP50-stam som bär en liknande deletion av RNAIII RNas som finns i E. coli K12 HT115-stammen också användas21.
Kanske är en stor begränsning för RNAi-experiment i C. elegans oro för knockdown-effektivitet. Medan knockdown-effektivitet kan valideras via qPCR eller western blotting, kräver dessa dyr utrustning och reagenser och är begränsade till bulkanalys. Detta är ännu mer oroande att titta på specifika celler, såsom neuroner, som är eldfasta (mindre känsliga) för RNAi. Medan RNAi-effektiviteten i specifika celler kan förbättras via överuttryck av SID-1, transmembranproteinet som är viktigt för dsRNA-upptag22, är detta fortfarande begränsat till de celltypspecifika uttrycksmönstren för promotorerna som används för dessa konstruktioner, och därmed är gen knockouts och mutationer det mest idiotsäkra sättet att tömma genfunktioner. Utöver RNAi-medierad knockdown är C. elegans också mycket mottagliga för genomredigering med CRISPR-baserade strategier 23,24,25 och transgen konstruktionsöveruttryck genom mikroinjektioner, med möjlighet att integrera transgena konstruktioner genom bestrålning eller transposonbaserad integration 26,27,28,29 . Dessa metoder kräver dock dyr mikroinjektionsutrustning, och de höga kostnaderna för guide-RNA eller Cas9-enzym kan förbjuda dessa metoder i institutioner med begränsad finansiering. Istället är tusentals transgena linjer och mutanter lätt tillgängliga för några dollar både på Caenorhabditis Genetics Center (CGC) och National Bioresource Project (NBRP). NBRP erbjuder isolerade mutanter för ett stort antal C. elegans-gener, inklusive publicerade och därför verifierade mutantstammar, mutanter härledda från pilotprojekt och mutanter som ännu inte har karakteriserats. Däremot är CGC en förvaringsplats för mestadels publicerade och etablerade C. elegans-linjer från forskarsamhället. Båda skickar stammar över hela världen till mycket rimliga priser och erbjuder ett brett utbud av alternativ för dem med begränsad kapacitet att syntetisera stammar internt.
Här erbjuds en kurerad metodsamling, som sannolikt är de billigaste metoderna för att analysera livslängd och hälsospann i C. elegans. Alla metoder som presenteras här kräver billig utrustning och förnödenheter och använder endast stammar som är lätt tillgängliga från CGC. Kanske mest oöverkomligt för livslängd och överlevnadsanalyser i C. elegans är kostnaden för Nematode Growth Media (NGM) plattor. Eftersom C. elegans är hermafroditer och självbefruktade, kräver standardöverlevnadsanalyser att vuxna djur kontinuerligt flyttas bort från sin avkomma för att undvika kontaminering från avkomman. Denna process är inte bara tidskrävande, den kan bli dyr på grund av behovet av cirka 100 plattor per tillstånd för att köra en enda livslängdsanalys. Här tillhandahålls två alternativ: användning av den temperaturkänsliga bakterielösa mutanten, glp-4 (bn2) eller kemisk sterilisering med 5-fluor-2′-deoxiuridin (FUDR). glp-4 kodar för ett valylaminoacyl-tRNA-syntetas, och det temperaturkänsliga glp-4(bn2) är reproduktivt bristfälligt vid restriktiva temperaturer på grund av minskad proteinöversättning30,31. FUDR är en robust metod för att kemiskt sterilisera C. elegans genom att förhindra DNA-replikation och därmed hämma reproduktion32. Även om FUDR kan vara oöverkomligt dyrt för vissa laboratorier, krävs endast en liten mängd för att kemiskt sterilisera maskar, och dess stabilitet i pulverform kan göra det möjligt för de flesta grupper. Att använda den temperaturkänsliga glp-4 (bn2) mutanten är verkligen det billigaste alternativet, eftersom det enda kravet är en inkubator för att flytta djuren till de restriktiva 25 ° C; Det bör dock noteras att tillväxt vid 25 °C kan orsaka mild värmestress33,34. Oavsett metod kan användning av sterila djur avsevärt minska kostnaderna för förbrukningsvaror som krävs för åldersrelaterade analyser.
För att studera åldrande är standardlivslängdsanalyser konventionella eftersom paradigmer som förändrar livslängden har direkta effekter på åldrandet. Mätningar av healthspan och stresstolerans ger dock ytterligare information om organismens hälsa. Här erbjuds flera metoder för att mäta healthspan: 1) fecundity som ett mått på reproduktiv hälsa; 2) yngelstorlek som ett mått på utvecklingshälsa och livskraft hos lagda avkommor; och 3) lokomotoriskt beteende som ett mått på muskelfunktion och rörlighet, som båda är direkt korrelerade med åldrande. Dessutom erbjuds analyser av stresstolerans: överlevnad till ER-stress, mitokondriell / oxidativ stress och termisk stressöverlevnad. Faktum är att djur med ökad motståndskraft mot ER-stress35,36, mitokondriell stress37 och termisk stress38 uppvisar ökad livslängd. ER-stress appliceras genom att utsätta C. elegans för mantelmycin, vilket blockerar N-länkad glykosylering och orsakar ackumulering av felveckade proteiner39. Mitokondriell/oxidativ stress induceras genom exponering för parakvat, vilket inducerar superoxidbildning specifikt i mitokondrierna40. Värmespänning appliceras genom inkubation av djur vid 34–37 °C33,41. Alla analyser som beskrivs här kan utföras med minimal utrustning och medel och erbjuder en mängd olika verktyg för att studera åldrande i olika grupper.
Livslängd, som enklast definieras som livets varaktighet, är ett tydligt binärt fenomen i de flesta organismer – antingen lever en organism eller inte. Livslängden korrelerar emellertid inte alltid med en organisms hälsa. Till exempel är mitokondriella hormesismodeller där exponering för mitokondriell stress dramatiskt ökar livslängden i allmänhet några av de längsta levande djuren, men uppvisar hämmad tillväxt och minskad metabolisk funktion 37,54. På samma sätt uppvisar djur med hyperaktiva endoplasmatiska retikulumstressreaktioner också vissa beteenden och fenotyper som kan korreleras med minskad hälsa, trots att de dramatiskt har förbättrat proteinhomeostas och livslängd 36,49. Slutligen är många livslängdsparadigmer i modellorganismer inklusive ökad HSF-1-funktion55, ökad XBP-1-funktion56 och förändrad FoxO-signalering57 alla korrelerade med ökad cancerrisk, och det är obestridligt att förlängd livslängd inte är fördelaktigt om en organism är i en ständig kamp med cancer och andra hälsosjukdomar. Därför kan livslängden inte vara ett fristående mått i åldrandebiologin.
Således har begreppet healthspan varit ett växande fält inom åldrandebiologi. Healthspan, löst definierad som den livstid som man är frisk, är svårare att fastställa än livslängd. Men till skillnad från livslängd är begreppet “hälsa” komplicerat, eftersom det finns många olika avläsningar av organismens hälsa: på organismnivå finns det muskelfunktion / styrka, neuronal / kognitiv funktion, reproduktiv hälsa etc.; på cellulär nivå finns proteinhomeostas, lipidhomeostas, glukoshomeostas, metabolism etc. År 2014 har åldrande biologer definitivt karakteriserat biologiska kännetecken för åldrande med den strukturerade definitionen att det måste vara något som naturligt bryts ner under åldrandet och kan experimentellt förändras så att experimentell förvärring bör påskynda åldrandet och experimentell intervention bör sakta ner åldrandet. Dessa nio kännetecken för åldrande inkluderar genomisk instabilitet, telomerförstöring, epigenetiska förändringar, förlust av proteinhomeostas (proteostas), stamcellsutmattning, förändrad intercellulär signalering, mitokondriell dysfunktion, avreglerad näringsavkänning och cellulär åldrande58. Sedan dess hävdar många studier att andra faktorer bör inkluderas, inklusive extracellulära proteiner och systemisk fysiologi som immunitet och inflammation59. I slutändan kräver den komplexa definitionen av healthspan att organismens hälsa mäts med flera olika metoder.
Därför presenteras i detta manuskript flera metoder för att mäta olika aspekter av healthspan med hjälp av nematodmodellen, C. elegans. Vi analyserar lokomotoriskt beteende med hjälp av thrashing-analyser, reproduktiv hälsa med äggantal och yngelstorlek och känslighet för stress. Faktum är att lokomotoriskt beteende är en guldstandardmetod för att mäta healthspan, eftersom organismer uppvisar signifikant förlust av rörlighet och rörelse under åldrande51. Förlust av lokomotoriskt beteende kan tillskrivas flera kännetecken för åldrande, eftersom muskelfunktionen i C. elegans är beroende av korrekt proteostas60, mitokondriell dysfunktion61 och neuronmuskelsignalering62. Medan detta manuskript fokuserar på en mätning av lokomotoriskt beteende, är det viktigt att notera att många andra metoder finns, inklusive rörlighet hos djur på en fast agarplatta, svar på beröring51 och kemotaxianalyser63. Dessa metoder kräver dock i allmänhet mer sofistikerade inspelningsenheter, användning av maskspårningsprogramvara eller användning av dyra, farliga eller flyktiga kemikalier, som alla kan vara oöverkomliga i vissa forskningsinställningar.
Dessutom presenteras analyser för äggantal och yngelstorlek som en metod för att mäta reproduktiv hälsa och som den enklaste metoden för att mäta celldelning hos vuxna maskar, eftersom vuxna maskar är post-mitotiska och endast könsceller och embryon genomgår celldelning inom en vuxen mask64. Som ett mått på celldelning kan reproduktiv hälsa vara relevant för åldrandets kännetecken för cellulär åldrande och stamcellsutmattning. Reproduktiv hälsa kan påverkas av många faktorer, inklusive patogen infektion65 eller exponering för stress49, även om det inte finns något direkt samband mellan reproduktiv hälsa och livslängd. Faktum är att vissa långlivade djur uppvisar en signifikant minskning av yngelstorlek49, och det är till och med möjligt att det finns en omvänd korrelation mellan livslängd och yngelstorlek50. Detta är inte ett fenomen som är specifikt för C. elegans, eftersom skadliga effekter av reproduktion på livslängden länge har observerats hos människor66, följeslagare67 och möss68. Ändå tillhandahåller vi äggantal och yngelstorlek som en pålitlig och billig metod för att mäta reproduktiv hälsa med förbehållet att reproduktiv hälsa kanske inte korrelerar med livslängd eller hälsospann.
Slutligen erbjuds överlevnadsanalyser som ett indirekt mått på organismens hälsa. Viktigt är att cellulära stressreaktioner, inklusive svar på termisk stress69 och ER-stress35, snabbt minskar under åldringsprocessen och har direkt relevans för åldringskännetecknet för proteostas70,71. Däremot kan hyperaktiverande stressreaktioner avsevärt öka livslängden genom att främja motståndskraft mot stress 35,37,38. Medan denna studie fokuserar på de enklaste och billigaste metoderna, finns det ett stort antal alternativa metoder för stressresiliensanalyser för termotolerans41 och oxidativ stress66, var och en kräver en annan uppsättning utrustning och förbrukningsvaror. Utöver enkla exponeringsstudier för stressfaktorer kan andra fysiologiska metoder utföras beroende på tillgång till utrustning. Till exempel kan en extracellulär flödesanalysator övervaka mitokondriell funktion och cellulär andning73; fluorescerande dissektionsmikroskop möjliggör mätningar av transkriptionella reportrar för aktivering av stressrespons20; och högupplösta förenings- eller konfokalmikroskop kan användas för att mäta organellmorfologi med fluorescerande sonder för mitokondrier74, endoplasmatisk retikulum 75,76 och aktincytoskelett77.
Som en sista varningsberättelse för mätningar av livslängd, medan kemiska och genetiska metoder för sterilisering av maskar erbjuds för att avsevärt minska kostnaden, är det viktigt att notera att båda direkt kan påverka livslängden. Till exempel har exponering för FUDR tidigare rapporterats påverka både livslängd och termotolerans45. Och medan glp-4(bn2)-mutanten i sig inte har några direkta effekter på livslängden, är tillväxt vid 25 °C en mild värmestress33,34 och kan därmed påverkalivslängden 2. Det finns andra metoder för sterilisering av C. elegans, inklusive auxinmedierad sterilitet78 eller alternativa temperaturkänsliga spermiebristmutanter79. Alla metoder har dock vissa försiktighetsåtgärder, och man bör vara försiktig med att använda den minst skadliga analysen för varje laboratoriums vetenskapliga behov. En sista begränsning av livslängdsstudier är potentiell variabilitet som kan uppstå på grund av låga urvalsstorlekar eller helt enkelt av ett objektivt fel av utredaren. Detta kan kringgås eftersom ny teknik föds i automatiserad livslängdsteknik80, men återigen är dessa system kostsamma och kräver viss ingenjörs- och beräkningsutrustning och färdigheter. I slutändan är samlingen av metoder som tillhandahålls här en pålitlig uppsättning verktyg som snabbt kan anpassas och läras i nästan vilken institution som helst och ge en solid grund för åldrande biologi.
The authors have nothing to disclose.
G.G. stöds av T32AG052374 och R.H.S. stöds av R00AG065200 från National Institute on Aging. Vi tackar CGC (finansierat av NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) för stammarna.
APEX IPTG | Genesee | 18-242 | for RNAi |
Bacto Agar | VWR | 90000-764 | for NGM plates |
Bacto Peptone | VWR | 97064-330 | for NGM plates |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | for NGM plates |
Carbenicillin | VWR | 76345-522 | for RNAi |
Cholesterol | VWR | 80057-932 | for NGM plates |
DMSO | VWR | BDH1115-1LP | solvent for drugs |
LB Broth | VWR | 95020-778 | for LB |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | 97062-132 | for NGM plates, M9 |
Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | for oxidative/mitochondrial stress |
Potassium Chloride | VWR | 97061-566 | for bleach soluton |
Potassium phosphate dibasic | VWR | EM-PX1570-2 | for NGM plates |
Potassium phosphate monobasic | VWR | EM-PX1565-5 | for M9 |
S7E Dissecting Scope | Leica | 10450840 | Standard dissecting microscope |
Sodium Chloride | VWR | EM-SX0420-5 | for NGM plates, M9 |
Sodium hypochlorite | VWR | RC7495.7-32 | for bleach solution |
Sodium phosphate dibasic | VWR | 71003-472 | for M9 |
Tetracycline hydrochloride | VWR | 97061-638 | for RNAi |
Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | for ER stress |